KR20070090151A - 고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 i) 진핵 숙주세포에서 기능성인 선택성 마커 폴리펩티드 및 ii) 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 다중시스트론 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자로, 상기 관심의 폴리펩티드는 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 개시서열과는 별개의 번역 개시서열을 갖고, 상기 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 다중시스트론 전사 유니트에서 선택성 마커의 코딩 서열로부터 하류에 있고, 그리고 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포의 생성 방법을 제공하는데, 상기 숙주세포는 본 발명의 DAN 분자를 포함한다. 본 발명은 또한 관심의 폴리펩티드의 생성방법으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 DNA 분자를 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
고수준, 단백질, 발현, 숙주세포

Description

고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택{Selection of host cells expressing protein at high levels}
본 발명은 분자 생물학 및 생명공학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택을 향상시키기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.
단백질은 생물학 및 생명공학, 예를 들면 생물약제학에서의 광범위한 적용을 위해 다양한 숙주세포에서 생성될 수 있다. 진핵 및 특히 포유류의 숙주세포는 많은 단백질의 발현을 위한 이러한 목적을 위해, 예를 들면 그러한 단백질이 글리코실화와 같은 어떤 번역 후의 변형을 가질 때 바람직하다. 그러한 생성을 위한 방법은 잘 수립되어 있고, 일반적으로 관심의 단백질을 코딩하는 핵산 (또한 '트랜스유전자'이라 불림)의 숙주세포에서의 발현을 수반한다. 대개, 선택성 마커 유전자와 함께 트랜스유전자가 전구체 세포로 도입되고, 세포는 선택성 마커 유전자의 발현을 위해 선택되고, 관심의 단백질을 고수준으로 발현하는 하나 이상의 클론이 동정되고, 관심의 단백질의 발현을 위해 사용된다.
트랜스유전자의 발현과 연관된 하나의 문제는 트랜스유전자가 유전자 침묵(silencing) 때문에 불활성화되어질 가능성이 높음으로 예측 불가능하고 (McBurney et al., 2002), 따라서 트랜스유전자의 높은 발현을 위해 많은 숙주세포 클론이 시험되어야 한다는 것이다.
원하는 단백질을 상대적으로 높은 수준으로 발현하는 재조합 숙주세포를 선택하는 방법이 알려져 있다.
하나의 방법은 그들의 코딩 서열에, 마커의 기능을 감소시키지만 소실시키지는 않는 돌연변이를 갖는 선택성 마커 단백질의 사용을 설명한다 (예를 들면, WO 01/32901). 이론적 근거는, 선택 조건이 사용되면 더 높은 수준의 돌연변이 마커 유전자가 요구되고 따라서 마커의 높은 발현을 위한 선택이 달성되고, 그와 함께 관심의 유전자를 고수준으로 또한 발현하는 숙주세포가 수반되어 선택되는 것이다.
또 다른 방법은, 프로모터가 그것의 상응하는 야생형의 활성 수준보다 실질적으로 낮은 활성 수준을 갖도록 돌연변이된 프로모터 서열의 조절하에 선택 마커 유전자를 사용하는 것이다 (US 특허 5,627,033).
또 다른 방법은 스크리닝되어질 콜로니의 수를 감소시키고 지배적(dominant) 선택성 마커에 공동-연결된 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키도록, 손상된 컨센서스 코자크 서열을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은, 손상된 지배적 선택성 마커 서열의 사용을 개시한다 (US 특허 5,648,267 및 5,733,779). 바람직한 구현예에서, 관심의 유전자는 지배적 선택성 마커의 (인공) 인트론 내에 놓인다. 관심의 유전자 및 지배적 선택성 마커는 다른 전사 카세트들 내에 있고 각각은 이 방법에서 그 자신의 진핵세포 프로모터를 함유한다 (US 특허 5,648,267 및 5,733,779).
또 다른 방법은 선택성 유전자 내에 자연적으로 발생하지 않는 인트론을 함유하는 선택성 마커 유전자의 원리를 이용하는 것으로, 여기서 인트론은 선택성 단백질을 코딩하는 mRNA를 제공하도록 숙주세포에서 스플라이스될(spliced) 수 있고 여기서 선택성 유전자 내 인트론은 숙주세포 내 선택성 유전자로부터 생성된 선택성 단백질의 수준을 감소시킨다 (유럽 특허 0724639 B1).
또 다른 방법에서, 5' 스플라이스 공여부를 갖는 mRNA의 스플라이스 효율이 약 80~99%가 되도록 효율적인 스플라이스 수용부 서열을 포함하는 5' 스플라이스 공여부 부위, 및 3' 스플라이스 수용부로 정해진 인트론 내에 위치된 선택성 유전자와, 3' 스플라이스 수용부의 하류의 관심의 생성물을 코딩하는 생성물 유전자를 포함하는 DNA 구조체가 사용되고, 상기 선택성 유전자 및 생성물 유전자는 동일한 전사 조절 영역에 의해 조절된다 (US 특허 5,561,053).
어떤 방법에서는, 다중시스트론 발현 벡터 구조체가 이용된다. 이 원리의 이용에 관한 초기 보고서는 원하는 단백질 및 선택성 단백질을 모두를 코딩하는 서열을 함유하는 다중시스트론 발현 벡터를 기재하고, 그 코딩 서열은 동일한 프로모터에 의해 제어되고 전사 중단 및 개시 신호 코돈에 의해 분리된다(US 특허 4,965,196). US 4,965,196의 바람직한 구현예에서, 선택성 마커는 증폭가능한 DHFR 유전자이다. US 4,965,196에서 설명된 시스템의 특히 바람직한 구현예에서, 선택성 마커를 코딩하는 서열은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로부터 하류이고, 선택성 마커에 의해 형질전환된 세포를 위해 선택하도록 고안된 과정은 또한 원하는 단백질의 생성을 특히 강화하도록 선택된다.
다중시스트론 발현 벡터의 개념을 근거로 하는 추가의 개선에서, 2시스트론 벡터가 재조합 단백질을 발현하는 안정한 포유류 세포계의 급속하고 효율적인 창조를 위해 개시되었다. 이들 벡터들은 관심의 단백질을 위한 상류 코딩 서열과 선택 마커의 하류 코딩 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 함유한다 (Rees et al, 1996). 그러한 벡터는 예를 들면, Clontech (CLONTECHniques, October 1996)으로부터의 pIRES1 벡터와 같이, 상업적으로 입수가능하다. 숙주세포로의 도입을 위해 그러한 벡터를 사용하여, 하류 마커 단백질의 충분한 발현의 선택은 그 후 다중시스트론 mRNA의 높은 전사 수준을 위해 선택하고, 따라서 관심의 단백질의 높은 발현의 강하게 향상된 확률이 그러한 벡터를 사용하여 관찰된다.
그러한 방법에서 바람직하기는, 사용된 IRES는, 선택 마커 단백질의 발현을 위해 선택함으로써 관심의 단백질의 높은 발현 수준을 갖는 숙주세포를 선택하는 기회를 추가로 향상시키기 위해, 선택 마커 유전자의 전사의 상대적으로 낮은 수준을 부여하는 IRES이다. (예를 들면, 국제 공개 WO 03/106684 참조).
본 발명은 관심의 단백질을 고수준으로 발현하는 숙주세포를 선택하기 위한 개선된 수단 및 방법을 제공하는 것을 목표로 삼는다.
발명의 요약
본 발명은 관심의 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 숙주세포를 선택하기 위한 신규하고 독특한 개념을 이용하고, 그 개념은 '상호의존(reciprocal interdependent) 번역'으로 불리운다. 그것은 추가 수준의 조절이 다중시스트론 전사로부터의 번역 생성물의 양을 잘-조율하도록 이용된다는 점에서 선행기술의 접근법에 비해 독특하고, 그것에 의해 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 수준이 낮추어지고, 이로써 동일한 다중시스트론 전사 유니트 상에 코딩된 관심의 폴리펩티드의 번역의 수준을 증가시킨다. 즉, 관심의 폴리펩티드의 발현 수준은 선택성 마커 폴리펩티드의 발현 수준으로부터 직접적이고 그리고 다소 상호 의존적이다 (개략도: 도 13 참조). 대조적으로, 관심의 폴리펩티드를 위한 코딩 서열과 선택성 마커 폴리펩티드 사이에 IRES를 사용하는 접근 (예를 들면 Rees et al, 1996)은 둘 다의 폴리펩티드의 독립적 번역을 포함하여, 이와 같은 접근법에서, 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 번역 효율에 대한 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 효율의 직접적 효과는 없다.
한 양상으로, 본 발명은 i) 진핵 숙주세포에서 기능성인 선택성 마커 폴리펩티드 및 ii) 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 다중시스트론 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자를 제공하며, 상기 관심의 폴리펩티드는 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 개시서열과는 별개의 번역 개시서열 (및 개시코돈)을 갖고, 상기 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 다중시스트론 전사 유니트에서 선택성 마커의 코딩 서열로부터 하류에 있고, 그리고 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 바람직하기는 선택성 마커의 번역 개시 효율은 감소된다. 바람직한 구현예에서, 감소된 번역 개시 효율은 선택성 마커 폴리펩티드의 비-최적 번역 개시 서열을 가짐으로서 일어난다.
바람직한 구현예에서, 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 스트랜드에서 번역 개시 서열은 개시 코돈을 규정하는 ATG 서열을 포함하고, 상기 ATG 서열은 번역 개시를 위한 비-최적 상황(context)에 있다. 이것은 최적 상황에서의 ATG 개시코돈에 비교하여, 개시코돈으로서 ATG 사용의 감소를 가져온다.
더 바람직한 구현예에서, 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 스트랜드에서 번역 개시 서열은 GTG, TTG, CTG, ATT, 또는 ACG 서열과 같은 ATG 개시코돈과 다른 개시코돈을 포함하고, 그들 중 첫번째 2개가 가장 바람직하다. 그러한 비-ATG 개시코돈은 이들 개시코돈으로부터 적어도 일부 리보솜이 번역을 개시하도록, 바람직하기는 개시코돈과 같은 비-ATG 서열의 상대적으로 우수한 인식을 제공하는 서열에 의해 플랭크되고, 즉, 번역 개시 서열은 바람직하기는 서열 ACC[비-ATG 개시코돈]G 또는 GCC[비-ATG 개시코돈]G를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 서열은 관심의 폴리펩티드의 개시코돈에 뒤이어 그것의 종결코돈까지 코딩 스트랜드에서 ATG 서열을 갖지 않고, 상기 관심의 폴리펩티드의 종결코돈과 개시코돈 사이의 동일한 스트랜드의 어떤 서열에서도 없다 (개시코돈은 바람직하기는 동일한 코딩 스트랜드의 ATG에 의해 규정된다).
그것의 어떤 구현예에서, 프레임에 존재하고 야생형 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열에서 푸로마이신을 코딩하는 어느 ATG 서열은 발린, 트레오닌, 이소로이신 또는 로이신을 코딩하도록 변이되었다.
바람직한 구현예에서, 선택성 마커 단백질은 항생제와 같은 선택제의 치사 및/또는 성장-저해 효과에 대한 내성을 제공한다.
바람직하기는, 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 최적 번역 개시서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트를 추가로 제공하고, 상기 발현 카세트는 다중시스트론 발현 유니트의 상류이고 다중시스트론 발현 유니트의 전사의 개시를 위해 진핵 숙주세포에서 기능성인 프로모터를 포함하고, 상기 발현 카세트는 추가로 다중시스트론 발현 유니트의 하류에 전사 종결서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 발현 카세트는 매트릭스 또는 스카폴드 부착 영역 (MAR/SAR), 인술레이터 서열, 유비쿼터스 크로마틴 개방 요소 (UCOE), 및 항-억제자 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 크로마틴 조절 요소를 추가로 포함한다. 항-억제자 서열은 이 양상에서 가장 바람직하고, 바람직한 구현예에서 상기 항-억제자 서열은 a)SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중 어느 것; b) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중의 어느 것의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다; c) a) 또는 b)와 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 및 d) a)~c) 중 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구현예에서, 상기 항-억제자 서열은 STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), 및 이들 STAR 서열의 기능성 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 발현 카세트는 다중시스트론 유전자의 프로모터 구동 발현의 상류에 위치된, STAR67, 또는 그것의 기능성 단편 또는 유도체를 포함한다. 어떤 구현예에서, 다중시스트론 유전자는 적어도 하나의 항-억제자 서열 양쪽 옆에 플랭크된다. 어떤 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 제공되는 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음을 포함한다: 항-억제자 서열 A - 항-억제자 서열 B - [프로모터 - 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트 (기능성 선택성 마커 단백질 및 그것의 하류의 관심의 폴리펩티드를 코딩하는) - 전사 종결 서열] - 항-억제자 서열 C, 여기서 A, B 및 C는 동일하거나 다를 수 있다.
어떤 구현예에서, 관심의 폴리펩티드는 예를 들면 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄와 같은 다량체 단백질의 일부이다.
본 발명은 또한, 기능성 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하는데, 이와 같은 DNA 분자는 진핵생물 숙주세포에서 기능성 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 이와 같은 DNA 분자는: ⅰ) 다른 기능성 선택성 마커 코딩 서열이 뒤이어지는 비-최적 번역 개시 서열을 갖고, 그리고 ⅱ) 비-최적 개시코돈의 하류의 선택성 마커 폴리펩티드를 규정하는 서열의 코딩 스트랜드에 ATG 서열이 없다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포의 생성 방법을 제공하는데, 그 방법은 본 발명에 따른 발현카세트를 다수의 전구체 숙주세포로 도입하는 단계, 선택성 마커 폴리펩티드의 발현을 위해 선택하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계, 및 관심의 폴리펩티드를 생성하는 적어도 하나의 숙주세포를 선택하는 단계를 포함한다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 관심의 폴리펩티드의 생성방법을 제공하는데, 그 방법은 숙주세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 숙주세포는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하고, 그리고 관심의 폴리펩티드를 발현 카세트로부터 발현시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 관심의 폴리펩티드는 숙주세포 및/또는 숙주세포 배양배지로부터 추가로 단리된다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 분자의 전사 생성물의 서열을 갖는 RNA 분자를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 아미노산 서열에서 푸로마이신을 결핍하고 있는 기능성 선택성 마커 폴리펩티드를 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 본 발명에 따른 DNA 분자로부터 발현에 의해 얻어질 수 있다.
발명의 상세한 설명
하나의 양상에서, 본 발명은 ⅰ) 진핵 숙주세포에서 기능성인 선택성 마커 폴리펩티드 및 ⅱ) 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 다중시스트론 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자를 제공하는데, 상기 관심의 폴리펩티드는 선택성 마커 폴리펩티드의 것과 별개의 번역 개시서열을 갖고, 상기 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 다중시스트론 전사 유니트에서 선택성 마커의 코딩 서열로부터 하류에 있고, 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 이와 같은 DNA 분자는 선택성 마커 폴리펩티드의 발현에 대해 선택함에 의해, 관심의 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 진핵 숙주세포를 얻기 위해 사용될 수 있다. 이어서 또는 동시에, 관심의 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 숙주세포(들)이 동정될 수 있고, 추가로 관심의 폴리펩티드의 고수준의 발현을 위해 사용될 수 있다.
용어 "단일시스트론(성) 유전자"는 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로서 정의된다. 또한 다중시스트론(성) 유전자라고 불리는, "다중시스트론 전사 유니트"는 적어도 두 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로서 정의된다. 용어 "2시스트론(성) 유전자"는 두 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로서 정의된다. 2시스트론 유전자는 따라서 다중시스트론 유전자의 정의 내에 포함된다. 여기서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5의 아미노산을 포함하고, 예를 들면 단백질 또는 그것의 서브유니트와 같은, 일부분일 수 있다. 주로, 폴리펩티드 및 단백질이라는 용어는 여기서 교환가능하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 것과 같은 "유전자" 또는 "전사 유니트"는 염색체 DNA, cDNA, 합성 DNA, 그것의 조합 등을 포함할 수 있다. 여러 시스트론을 포함하는 전사 유니트는 단일 mRNA로서 전사된다. 이전의 당업계에서 사용된 접근법과는 대조적으로, 본 발명의 다중시스트론 전사에서, 그 RNA 상에 존재하는 두번째 코딩 영역의 번역 (즉, 관심의 단백질에 대한 것)은 두번째 코딩 영역의 번역 재개시 부위 또는 두번째 코딩 영역의 번역 개시을 위한 내부 리보솜 진입 부위의 사용에 의존하지 않지만, 다소 상호적인 방식으로 첫번째 코딩 영역(즉, 선택성 마커 단백질을 위한 것)의 번역의 효율에 의존한다: 선택성 마커의 번역 수준이 높으면 높을수록, 관심의 단백질은 전사 수준은 역으로 낮아진다.
본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트는 바람직하기는 선택성 마커 폴리펩티드 및 관심의 폴리펩티드의 5'에서 3'으로의 2시스트론 전사 유니트이다. 따라서, 관심의 폴리펩티드는 선택성 마커 폴리펩티드를 위한 코딩 서열로부터 하류에 코딩된다.
관심의 (첫번째) 폴리펩티드의 하류의, 동일한 전사 유니트 상에, 예를 들면 두번째 선택성 마커 폴리펩티드 또는 관심의 두번째 폴리펩티드를 코딩하는, 더 많은 코딩 서열을 포함하는 것도 가능하다. 관심의 첫번째 폴리펩티드를 위한 코딩 서열의 하류의 그러한 추가적인 코딩 서열은 그리고 나서 바람직하기는 번역 재개시 부위 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 서열이 선행되고, 또한 관심의 두번째 폴리펩티드 또는 두번째 선택 마커 폴리펩티드가, 이 경우 더 빠른 두 코딩 서열로부터 독립적으로 번역된다. 그러한 구현예에서, 예를 들면 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄과 같은, 다량체 단백질의 서브유니트를 위한 코딩 서열을 갖는 것이 가능하다. 단일 다중시스트론 발현 유니트 내에 다량체 단백질의 서브유니트를 코딩하기 위해 관심의 첫번째 및 두번째 폴리펩티드(어떤 순서로도)로서 코딩된, 예를 들면 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄인 다량체 단백질의 서브유니트에 대한 코딩 서열을 갖는 것이 가능하다. 그러나 이들이 다량체 단백질의 부분을 형성할 때에도, 관심의 다른 폴리펩티드의 발현을 위해 개별적인 전사 유니트를 사용하는 것이 바람직하다(예를 들면 실시예 13 참조: 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개별적인 전사 유니트에 의해 코딩되고, 이들 발현 유니트들의 각각은 본 발명에 따른 2시스트론 발현 유니트이다).
본 발명의 DNA 분자는 이중 가닥 DNA의 형태로 존재할 수 있고, 선택성 마커 폴리펩티드와 관심의 폴리펩티드와 관련하여 코딩 스트랜드 및 비-코딩 스트랜드를 갖고, 상기 코딩 스트랜드는 U 대신에 T의 존재를 제외하고는, 번역된 RNA와 동일한 서열을 갖는 스트랜드이다. 따라서, AUG 개시코돈은 ATG 서열에 의해 코딩 스트랜드에서 코딩되고 RNA에서 AUG 개시코돈에 상응하는 이러한 ATG 서열을 함유하고 있는 스트랜드는 DNA의 코딩 스트랜드로서 불린다. 개시코돈 또는 번역 개시서열이 RNA 분자에 실제 존재하지만, 이들이 그러한 RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자에 동일하게 구현된다고 간주될 수 있다는 것이 분명할 것이다; 따라서, 다른 구체적 특정이 있는 경우를 제외하고는, 역으로 본 발명이 개시코돈 또는 변역 개시 서열이라고 부르는 것이 어디든지, RNA 서열과 동일한 서열을 갖는 상응하는 DNA 분자 (단 상기 DNA 분자의 코딩 스트랜드에서 U 대신에 T 존재)가 포함되는 것으로 의미된다. 바꾸어 말하면, 개시코돈은 예를 들어서 RNA에서 AUG 서열이지만, DNA의 코딩 스트랜드에서 상응하는 ATG 서열은 본 발명에서 역시 개시코돈이라고 불린다. '프레임 내의' 코딩 서열, 즉 아미노산으로 번역되는 RNA 분자에서 트리플릿 (3 염기)의 의미는 또한 DNA 분자의 코딩 서열에서 상응하는 3뉴클레오티드 서열로서 해석되어 동일하게 사용될 수 있다.
다중시스트론 유전자에 의해 코딩된 선택성 마커 폴리펩티드 및 관심의 폴리펩티드 각각은 그들 자신의 번역 개시서열을 갖고, 따라서 각각은 그들 자신의 개시코돈 (종결코돈 뿐만 아니라)을 갖는다. 즉 그것들은 분리된 개방 리딩 프레임에 의해 코딩된다.
용어 "선택 마커" 또는 "선택성 마커"는 그것의 존재가 세포 내에서 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 유전자 및/또는 단백질, 예를 들면 선택 제제를 불활성화시키고 제제의 치사 또는 성장-저해 효과(예를 들면 항생제 내성전자 및/또는 단백질)로부터 숙주세포를 보호하는 폴리펩티드를 언급하기 위해 전형적으로 사용된다. 또 다른 가능성은 상기 선택 마커가 형광 또는 색 침착 (예를 들면 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 유도체 (예를 들면 d2EGFP), 루시페라아제, lacZ, 알칼리성 포스파타제, 등)을 유발한다는 것이고, 이것은 예를 들면 GFP를 발현하는 세포를 선택하기 위해 형광 활성화된 세포 분리기 (FACS)를 사용하여, 색 침착을 유발하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하기는, 본 발명에 따른 선택성 마커 폴리펩티드는 선택 제제의 치사 및/또는 성장-저해 효과에 대한 내항을 제공한다. 선택성 마커 폴리펩티드는 본 발명의 DNA에 의해 코딩된다. 선택성 마커 폴리펩티드는 진핵 숙주세포에서 기능성이어야 하고 따라서 진핵 숙주세포에서 선택될 수 있다. 이 기준을 충족시키는 어떤 선택성 마커 폴리펩티드라도 본 발명에 따라 원칙적으로 사용될 수 있다. 그러한 선택성 마커 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있고, 진핵 숙주세포 클론이 얻어져야 할 때 일상적으로 사용되고, 여러 예들이 여기서 제공되어 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명을 위해 사용된 선택 마커는 제오신이다. 다른 구현예에서 블라스티시딘이 사용된다. 당업자는 다른 선택 마커도 이용가능하고 예를 들면 네오마이신, 푸로마이신, 블레오마이신, 히그로마이신, 등이 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 다른 구현예에서, 카나마이신이 사용된다. 다른 구현예에서, DHFR 유전자가 선택성 마커로서 사용되고, 이것은 메토트레세이트에 의해, 특히 메토트레세이트의 농도를 증가시킴으로서 세포들이 DHFR 유전자의 증가된 복사체 수에 대해 선택될 수 있다. 유사하게, 글루타민 신테타제 (GS) 유전자가 사용될 수 있는데, 글루타민이 없는 배지에서 배양함으로써, 불충분한 GS (예를 들면 NS-O 세포)를 갖는 세포에서, 또는 대안으로 GS의 저해제, 푸로마이신 술폭시민 (MSX)을 첨가함으로서 충분한 GS (예를 들면 CHO 세포)를 갖는 세포에서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 선택성 마커 유전자, 및 그것들의 선택 제제는 예를 들면 US 특허 5,561,053의 표 1에 기술되어 있다; 이것들의 리뷰를 위해, 또한 Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-566 (1990) 참조.
두 다중시스트론 전사 유니트가 단일 숙주세포에서 본 발명에 따라 선택되야 할때, 각각은 둘 다의 다중시스트론 전사 유니트를 위한 선택을 허용하도록, 바람직하기는 다른 선택성 마커를 위한 코딩 서열을 함유한다. 물론, 둘 다의 다중시스트론 전사 유니트는 단일 핵산 분자 상에 존재할 수 있거나 대안으로 각각은 별개의 핵산 분자 상에 존재할 수 있다.
용어 "선택"은 특정한 유전자 특성을 가진 숙주세포를 확인하도록 선택 마커/선택성 마커 및 선택제를 사용하는 방법으로서 전형적으로는 정의된다(예를 들면 숙주세포는 그것의 게놈으로 통합되는 트랜스유전자을 함유한다). 선택 마커의 수 많은 조합이 가능하다는 것이 당업자에게 분명하다. 특히 이점이 있는 하나의 항생제는 제오신인데, 왜냐하면 제오신-내성 단백질 (zeocin-R)은 약물을 결합시킴으로서 그리고 그것에 무해하게 작용하기 때문이다. 그러므로 높은-발현체를 생존하도록 허용하면서, 낮은 수준의 제오신-R 발현을 갖는 세포를 죽이는 약물의 양을 적정하는 것은 쉽다. 일반 사용되는 모든 다른 항생제-내성단백질은 효소이고 따라서 촉매적으로 작용한다 (약물과 1:1이 아니다). 따라서, 항생제 제오신은 선택 마커로 바람직하다. 하지만, 본 발명은 또한 다른 선택 마커로 작업할 수 있다.
본 발명에 따른 선택성 마커 폴리펩티드는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 단백질인데, 상기 폴리펩티드는 예를 들면 그것이 항생제와 같은 선택제에 내성을 제공하기 때문에 검출될 수 있다. 따라서, 항생제가 선택제로서 사용될 때, DNA는 폴리펩티드가 선택성 마커인 선택제에 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다. 그러한 선택성 마커 폴리펩티드를 위한 DNA 서열 코딩이 알려져 있고, DNA 코딩 선택성 마커 단백질의 야생형 서열의 여러 예들이 여기에 제공된다 (도 26-32). 선택성 마커의 돌연변이 또는 유도체가 또한 본 발명에 따라 적절하게 사용될 수 있다는 것이 분명할 것이고, 그러므로 선택성 마커 단백질이 여전히 기능성인 한, '선택성 마커 폴리펩티드'라는 용어의 범위 내에 포함된다. 공식 명칭은 다를 수 있지만, 예를 들면 네오마이신 (G418 및 카나마이신 뿐만 아니라)에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자는 종종 네오마이신 (내성) (또는 Neor) 유전자로서 불리나, 공식 명칭은 아미노글리코시드 3'-포스포트란스페라제 유전자이지만, 여기뿐만 아니라 많은 공보에서, 편의를 위해 그리고 일반적으로 당업자에게 수용되듯이, 종종 선택 유전자에 대한 내성을 코딩하는 유전자 및 단백질이 각각 '선택성 제제 (내성) 유전자' 또는 '선택제 (내성) 단백질'로서 불린다.
본 발명에서 스트린전트 선택이 가능하도록, 선택성 마커 폴리펩티드의 낮은 수준의 발현을 갖는 것이 유익하다. 본 발명에서 이것은 비-최적 번역 효율을 갖는 선택성 마커 코딩 서열을 사용함으로서 일어난다. 선택시에, 그럼에도 불구하고 충분한 수준의 선택성 마커 폴리펩티드를 갖는 세포들만이 선택될 것인데, 이것은 그러한 세포들이, 다중시스트론 전사 유니트가 통합된 세포를 위한 선택을 제공하거나 그렇지 않으면 이러한 전사 유니트로부터의 발현 수준이 높은 숙주세포에 존재하는, 다중시스트론 전사 유니트의 충분한 전사 및 선택성 마커 폴리펩티드의 충분한 번역을 가져야 한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 마커의 번역 효율의 것으로부터 관심의 폴리펩티드의 번역의 (다소) 상호간에 의존적 성질은, 관심의 폴리펩티드의 높은 번역 수준을 가능하게 한다. 이러한 높은 수준의 번역은 스트린전트 선택 조건 (그리고 다중시스트론 전사 유니트의 전사를 구동하기 위해 숙주세포에서 강한 프로모터의 사용으로부터 유래하는)에 의해 선택된 높은 전사 수준 상에 덧붙여진다 (superimposed) .
본 발명에 따른 DNA 분자는, 관심의 폴리펩티드 및 선택성 마커 폴리펩티드의 상호 의존적 번역을 다중시스트론 전사체에 제공하도록, 관심의 폴리펩티드를 위한 코딩 서열의 상류의 선택성 마커 폴리펩티드를 위한 코딩 서열을 갖는다. 그리하여 다중시스트론 전사 유니트는 5'에서 3' 방향으로 (DNA의 전사된 스트랜드에서 및 그 결과의 전사된 RNA에서 둘 다) 선택성 마커 폴리펩티드 및 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명에 따라서, 다중시스트론 유전자의 코딩 영역은 바람직하기는 캡-의존성 ORF로부터 번역되고, 그러므로 선택성 마커 폴리펩티드는 원칙적으로 또한 풍족하게 생성될 것이다. 선택성 마커 시스트론의 그러한 높은 번역을 방지하기 위해, 본 발명에 따라 선택성 마커 폴리펩티드를 위한 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이 (개방 리딩 프레임 (ORF) 또는 ORF를 선행하는 번역 개시 서열에서, 또는 둘 다에서)를 포함한다. 번역 효율은 동일한 세포에서 상응하는 야생-형 서열의 것보다 더 낮아야 한다. 즉, 돌연변이는 세포/시간 당 더 적은 폴리펩티드를 초래해야하고 그리하여 덜 선택성 마커 폴리펩티드를 초래해야 한다. 이는 당업자에게 알려진 일상적 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들면 항생제 선택의 경우에, 돌연변이는 그러한 돌연변이가 없는 그리하여 일반적 번역 효율을 갖는 서열을 가지고서 얻어진 것보다 더 적은 내성을 초래하는데, 여기서 차이는, 번역 효율 감소 돌연변이가 존재할 때 더 낮아질 것인, 일반적 선택 기간 후에 생존하는 콜로니의 수를 측정함으로서 쉽게 검출될 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있듯이, 세포가 여전히 내성이 있는 선택 제제의 최대 농도, 주어진 농도에서 생존하는 콜로니의 수, 선택 제제의 존재에서 세포의 성장 속도 (배가 시간), 이들의 조합, 등과 같은 발현 수준 마커 폴리펩티드를 나타내는 많은 파라미터들이 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 번역 효율을 감소시키는 돌연변이는 번역 개시 효율을 감소시키는 돌연변이이다.
이것은 예를 들면 비-최적 번역 개시 서열을 선택성 마커 폴리펩티드 코딩 서열에 제공함으로써 본 발명에 따라 수립될 수 있다.
예를 들면, 진핵 세포에서 선택성 마커 유전자의 번역 개시 효율은, 비-최적 번역 개시서열을 제공하도록, 예를 들면 상응하는 DNA 서열의 코딩 스트랜드에서, 위치 -3에서 -1 및 +4 (ATG 개시코돈의 A가 nt +1이다)까지에서 개시코돈 및/또는 뉴클레오티드를 돌연변이시킴으로서 본 발명에 따라 적절하게 감소될 수 있다. 번역 개시서열은 '코자크(Kozak) 서열'로서 당해 분야에서 종종 불리고 최적 코자크 서열은 RCCATGG이고, 여기서 개시코돈은 밑줄이 그어져 있고, R은 퓨린, 즉 A 또는 G (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002 참조)이다. 따라서, 개시코돈 자신 이외에, 그것의 상황, 특히 뉴클레오티드 -3에서 -1 및 +4까지가 관련이 있고 최적인 번역 개시서열은 최적 상황 (즉 RCC에 의해 바로 선행되고 G에 의해 간접적으로 뒤따르는 ATG)에서 최적 개시코돈 (즉 ATG)를 포함한다. 비-최적 번역 개시서열은 진핵생물 세포(선택 마커 폴리펩티드가 검출가능하기 때문에 검출가능)에서 적어도 얼마의 검출가능한 번역을 부여하고, 컨센서스 서열 RCCATGG (개시코돈은 밑줄이 그어짐)를 갖지 않는 어떤 서열로서 여기에 정의된다. 리보솜에 의한 번역은 mRNA의 5'-캡으로부터 스캐닝할 때 그것이 만나는 첫번째 개시코돈에서 바람직하기는 개시하고(스캐팅 메커니즘), 최적 코자크 서열이 존재할 때 가장 효율적이다 (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002). 하지만, 작은 백분율의 경우로, 비-최적 번역 개시서열이 인식되고 번역을 개시하기 위해 리보솜에 의해 사용된다. 본 발명은 이러한 원리를 이용하고, 번역의 양의 감소와 심지어는 미세-선회(fine-tuning)를 허용하고 그리하여 그러므로 선택계의 스트린전시를 증가시키도록 사용될 수 있는 선택성 마커 폴리펩티드의 발현을 허용한다.
본 발명의 첫번째 구현예에서, (RNA 전사 생성물에서 상응하는 AUG 개시코돈을 위해 코딩하는 DNA의 코딩 스트랜드에서) 선택성 마커 폴리펩티드의 ATG 개시코돈은 그대로인 채로 남아 있지만, -3에서 -1 및 +4까지의 위치는 예를 들면 번역 개시 부위로서 서열 TTTATGT을 제공함으로서(ATG 개시코돈은 밑줄이 그어짐), 그것들이 최적 코자크 서열을 더 이상 충족시키지 못하도록 변이된다. 위치 -3에서 -1 및/또는 +4까지의 개시코돈 주위의 다른 돌연변이는 본 발명의 지침을 사용하여 유사한 결과로 사용될 수 있다는 것은, 당업자에 의해 일상적이고 쉽게 시험될 수 있듯이, 분명할 것이다. 이 첫번째 구현예의 발상은 ATG 개시코돈이 번역 개시를 위한 '비-최적' 상황에 놓인다는 것이다.
두 번째 바람직한 구현예에서, 선택성 마커 폴리펩티드의 ATG 개시코돈 자신이 돌연변이된다. 이것은 일반적으로 첫번째 구현예보다 훨씬 더 낮은 수준의 번역 개시를 초래할 것이다. 두 번째 구현예에서 ATG 개시코돈은 일부 번역 개시를 제공한다고 보고된, 또 다른 코돈 예를 들면 GTG, TTG, CTG, ATT, 또는 ACG(여기서는 '비-최적 개시코돈'으로서 집합적으로 불림)으로 변이된다. 바람직한 구현예에서, ATG 개시코돈은 GTG 개시코돈으로 돌연변이된다. 이것은 있는 그대로이지만 비-최적 상황에서의 ATG 개시코돈으로서 보다 훨씬 더 낮은 발현 수준 (더 낮은 번역)을 제공한다. 더 구체적으로는, ATG 개시코돈은 GTG 개시코돈 보다 훨씬 더 낮은 발현 수준의 선택성 마커 폴리펩티드를 제공하는 TTG 개시코돈으로 돌염변이된다 (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002; 또한 여기서 실시예 9-13 참조).
두 번째 구현예를 위해서, 즉 비-ATG 개시코돈이 사용되는 경우, 그러한 개시코돈을 위한 최적 상황을 제공하는 것이 아주 바람직하다. 즉 비-최적 개시코돈은 바람직하기는 위치 -3에서 -1까지의 뉴클레오티드 RCC에 의해 바로 선행되고 G 뉴클레오티드 (위치 +4)가 바로 뒤이어진다. 하지만, 서열 TTTGTGG (개시코돈은 밑줄쳐짐)를 사용하는 몇몇 개시는 적어도 생체 외에서 관찰되고, 그래서 매우 바람빅하지만 비-최적 개시코돈을 위한 최적 상황을 제공하기 위해 절대적으로 요구되지는 않는다는 것이 보고되었다.
ATG 개시서열을 제외한, 폴리펩티드를 위한 코딩 서열 내의 ATG 서열은 '내부 ATGs'로서 불리고, 이들이 ORF의 프레임에 있고 따라서 메티오닌를 코드한다면, 폴리펩티드에서 생성되는 메티오닌은 '내부 메티오닌'으로서 불린다. (개시코돈에 뒤이은, 필수적으로 개시코돈을 포함하지는 않는) 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역은 바람직하기는 관심의 폴리펩티드의 개시코돈에 이르기까지(그러나, 포함하지는 않음) DNA의 코딩 스트랜드에 ATG 서열을 갖지 않는다 (당연히, 관심의 폴리펩티드의 개시코돈은 ATG 개시코돈일 수 있고, 실제 바람직하기는 ATG 개시코돈이다). 이것은 그것의 개시코돈에 뒤이은, 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 서열 내의 어느 이와 같은 ATG 서열을 돌연변이시킴으로서 수립될 수 있다 (상기로부터 선택성 마커 폴리펩티드 자신의 개시코돈은 ATG 서열일 수 있지만, 필수적으로 그런 것은 아니라는 것이 분명하다). 바람직하기는 이러한 목적에 대해, 유전 코드의 축퇴(degeneracy)가 가능한 곳이면 어디든 선택성 마커 폴리펩티드 내 아미노산의 돌연변이를 피하기 위해 사용된다. 따라서, ATG가, 선택성 마커 폴리펩티드 ORF의 프레임에 있지 않고 따라서 선택성 마커 폴리펩티드 내 내부 메티오닌을 코드하지 않는, 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 코딩 스트랜드에 존재하는 곳이 어디든, ATG는 그 결과의 폴리펩티드가 그것의 내부 아미노산 서열 내 돌연변이가 없도록 변이될 수 있다. ATG가 내부 메티오닌의 코드하는 프레임 내 코돈인 경우, 코돈은 돌연변이될 수 있고 그 결과의 돌연변이된 폴리펩티드는 선택성 마커 폴리펩티드의 활성에 대해 통상적으로 검사될 수 있다. 이런 방식에서 돌연변이는 그렇듯이(정량적 차이가 존재할 수 있지만, 덜 관련이 있고, 실제 본 발명의 목적을 위해 덜 활성적인 변이체를 가지는 것이 심지어는 유익할 수 있다; 최소 요구는 선택성 마커 폴리펩티드가 여전히 진핵생물 세포에서 선택될 수 있다는 것이다) 여전히 활성인 돌연변이된 선택성 마커 폴리펩티드를 유도하게 선택될 수 있다. 아미노산 발린, 트레오닌, 이소로이신 및 로이신은 구조적으로 메티오닌과 유사하고, 그러므로 이들 아미노산 중 하나를 코드하는 코돈은 개시코돈 후 코딩 서열 내의 메티오닌 대신에 시험하기에 좋은 개시 후보자이다. 물론, 본 발명의 교시를 사용하여, 당업자는 코딩 DNA를 변이시키기 위해 통상적인 분자 생물학 기술, 및 선택성 마커 폴리펩티드의 기능성을 위한 통상적인 시험을 사용하여, 내부 메티오닌 대신에 또한 다른 아미노산을 시험할 수 있다. DNA를 돌연변이시키기 위한 통상의 분자 생물학 기술 이외에, 선택성 마커 폴리펩티드의 ORF를 위해 충분한 길이를 갖는 DNA 서열을 의지대로 (필요하다면 서브클로닝 단계를 사용하여) 합성하는 것이 현재 또한 가능하고, 그러한 합성 DNA 서열은 요즘 여러 회사로부터 상업적으로 주문될 수 있다. 따라서, 본 발명의 교시를 사용하여, 당업자는 (번역 개시을 감소시키고, 바람직하기는 내부 ATGs가 없는 돌연변이를 갖는) 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 적절한 서열을 설계할 수 있고, 이러한 서열을 합성하고, 진핵 숙주세포에 DNA 분자를 도입함으로서 코딩된 선택성 마커의 기능성에 대한 DNA 분자를 시험하고, 기능성 선택성 마커 폴리펩티드의 발현에 대해 시험할 수 있다. 그러한 서열의 상업적 이용가능성은 과도한 부담없이 내부 ATG 서열이 없는 선택 마커 코딩 서열의 제공을 용이하게 하고, 여기서 선택성 마커 폴리펩티드의 야생-형 코딩 서열은 여러 개의 이와 같은 내부 ATGs를 포함한다.
내부 ATG 서열이 없는 선택성 마커 폴리펩티드에 코딩 서열을 제공함으로써, 연이은 내부 ATG 트리뉴클레오티드에서 선택성 마커 폴리펩티드의 (첫번째, 비-최적) 번역 개시서열을 통과한 리보솜에 의해 우연적인 번역 개시의 기회가 감소되고, 따라서 리보솜은 첫번째 최적 번역 개시서열, 즉 관심의 폴리펩티드의 것에 대한 스캔을 계속할 것이다.
선택성 마커의 코딩 서열로부터 모든 내부 ATG 서열을 제거하는 것은, 리보솜의 대다수가 번역 개시 부위와 같은 그러한 내부 ATG 서열을 사용하지 않는 한, 예를 들어서 그러한 내부 ATGs는 대개 번역 개시을 위한 최적 상황에 있지 않기 때문에, 필수적으로 엄격하게 요구되지 않는다는 것은 분명할 것이다. 그러나, 비-최적의 상황에서의 ATG 서열조차도 의미있는 번역 개시 상황을 초래한다는 사실의 관점에서(일반적으로 최적의 상황에서의 비-ATG 개시코돈으로부터 보다 훨씬 더 높은), 여러 내부 ATG 서열들이 선택성 마커의 코딩 영역에 존재하면, 이들의 각각은 ATGs에서 번역을 개시하는 리보솜들의 분획을 공제한다는 것이 또한 분명할 것인데, 이것은 그것들이 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 하류 번역 유니트에 도달하는 것을 막아서, 관심의 폴리펩티드의 발현을 감소를 가져온다. 이것이, 서열이 내부 ATG 서열이 없는, 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가지는 것이 왜 바람직한가 이유이다. 가능하게는, 요구된다면, 관심의 폴리펩티드를 번역하는 리보솜의 비율은 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 서열 내의 어떤 비-최적 잠재적 번역 개시를 돌연변이시킴으로서 추가로 향상될 수 있을 것이다.
명백히, 선택성 마커의 종결코돈과 관심의 폴리펩티드의 개시코돈 사이의 코딩 스트랜드에 존재하는 어느 서열은 그것이 ATG 서열, 또는 다른 비-최적 잠재적 번역 개시코돈을 포함하지 않도록 쉽게 설계될 수 있다.
명백히, 관심의 폴리펩티드의 번역 개시서열이 최적 번역 개시서열, 즉 공통 서열(consensus sequence) RCCATGG (개시코돈은 밑줄이 쳐짐)을 갖는것이 매우 바람직하다. 이것은 관심의 폴리펩티드의 매우 효율적인 번역을 초래할 것이다.
이들 측정의 결과로서, 본 발명의 상호 의존적인 번역 메커니즘이 제공된다: 리보솜은 다중시스트론 전사 유니트를 함유한 mRNA의 캡으로부터 스캔하고, 작은 백분율의 리보솜이 첫번째 개방 리딩 프레임, 즉 선택성 마커 단백질을 번역할 것인데, 왜냐하면 이것은 번역 효율을 감소시키는 돌연변이가 제공되고, 리보솜의 대다수가 개방 리딩 프레임을 통과하고 관심의 폴리펩티드의 최적 번역 개시부위에서 번역을 개시할 것이기 때문이며, 이것은 낮은 수준의 선택성 마커 단백질 및 높은 수준의 관심의 폴리펩티드를 초래한다. 여러 수준의 감소된 번역 효율을 가져오는 다른 돌연변이를 마커의 코딩 서열에 제공함으로서, 선택의 스트린전시가 증가되고 상호적으로 관심의 폴리펩티드의 발현 수준이 상승해서, 파인-튜닝이 가능하다: 예를 들면 선택 마커 폴리펩티드를 위한 TTG 개시코돈을 사용하여, 매우 소수의 리보솜만이 이 개시코돈으로부터 번역하여, 매우 낮는 수준의 선택성 마커 단백질, 따라서 높은 스트린전시의 선택을 초래하고, 동시에 거의 모든 리보솜이 관심의 폴리펩티드를 번역할 것이다.
이것은 매우 강한(robust) 선택계에서 사용되어, 바라는 것과 같이 고수준으로 관심의 폴리펩티드를 발현하는 매우 큰 백분율의 클론을 가져올 수 있다는 것이 본 명세서에서 입증된다. 게다가, 관심의 폴리펩티드에 관해 얻어진 발현 수준은 훨씬 더 많은 콜로니들이 지금까지 알려진 선택계를 사용하여 스크린될 때 얻어진 것보다 상당히 더 높을 것으로 보인다.
감소된 번역 개시효율에 더불어, 마커 폴리펩티드의 번역 수준을 추가로 감소시키기 위해 그리고 원한다면, 훨씬 더 스트린전트 선택 조건을 허용하기 위해, 예를 들면 숙주세포의 비-바람직한 코돈들을 포함하도록 그 코딩 서열을 돌여변이시킴으로써, 선택성 마커 폴리펩티드의 감소된 번역 연장 효율을 제공하는 것이 유익할 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 번역 효율을 감소시키는 돌연변이(들) 이외에, 선택성 마커 폴리펩티드는 그것의 야생-형 대응물에 비교하여 선택성 마커 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 돌연변이를 추가로 포함한다. 이것은 선택의 엄격성을 훨씬 더 증가시키는데 사용될 수 있다. 비-제한적 실시예로서, 제오신 내성 폴리펩티드에서 위치 9에 있는 프롤린이 예를 들면, Thr 또는 Phe로 변이될 수 있고 네오마이신 내성 폴리펩티드에 대해서는, 아미노산 잔기 182 또는 261이나 둘 다가 추가로 변이될 수 있다(예를 들면 WO 01/32901 참조).
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 소위 스페이서 서열은 선택성 마커 폴리펩티드의 개시코돈을 코딩하는 서열의 하류에 위치되고, 여기서 스페이서 서열은 바람직하기는 개시코돈을 갖는 프레임 내의 서열이고 몇 개의 아미노산을 코딩하고, 이차 구조를 함유하진 않고 (Kozak, 1990), 서열 ATG를 함유하지 않는다. 그러한 스페이서 서열은 이차구조가 선택성 마커 (예를 들면, 제오신에 대해, 가능하게는 블라스티시딘에 대해) 폴리펩티드의 RNA(Kozak, 1990)에 존재하면 번역 개시빈도를 추가로 감소시키도록 사용될 수 있고, 그리하여 본 발명에 따른 선택계의 엄격성을 증가시킨다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 선택성 마커 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 여기서 DNA 분자는 진핵생물 숙주세포에서 기능적인 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이가 제공되어 있다. 바람직한 이것의 구현예에서, 코딩 스트랜드에서의 상기 DNA 분자는 ⅰ) 서열 ATG가 기능성 선택성 마커 단백질의 개시코돈이 뒤따르는 코딩 영역으로부터 상기 기능성 선택성 마커 단백질 개방 리딩 프레임의 종결코돈까지 존재하지 않도록, 상기 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 야생-형 서열에 비교하여 돌연변이 되었고; ⅱ) 기능성 선택성 마커 폴리펩티드의 비-최적 번역 개시 서열을 갖는다. 특징 ⅰ) 및 ⅱ)는 상기 설명에 따라 다시 제공될 수 있다. 그러한 DNA 분자는 본 발명에 따른 유용한 중간체 생성물을 포함한다. 이들 분자는 우선 제조되고, 원핵생물 숙주세포에 도입되고, 그리고, 필요하다면 (반)-정량적인 방법으로, 선택성 마커 폴리펩티드의 기능성에 대해 시험된다 (몇몇 마커의 경우, 이것은 진핵 숙주세포에서도 가능하다). 그리고 나서 이들은 본 발명에 따라, 다중시스트론 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자를 제조하는데 더욱 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양상은, 다중시스트론 전사 유니트를 갖는, 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트를 제공하는 것이다. 이와 같은 발현 카세트는 관심의 서열을, 예를 들면 숙주세포에서 발현시키는데 유용하다. 여기서 사용되는 것과 같은 '발현 카세트'는 발현이 요구되는 서열에 기능성으로 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산 서열이다. 바람직하기는, 발현 카세트는 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열을 추가로 함유한다. 인핸서와 같은 다른 조절 서열이 또한 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기 순서로 다음을 포함하는 발현 카세트를 제공한다: 선택성 마커 폴리펩티드 및 그것의 하류 관심의 폴리펩티드를 코딩하는, 본 발명에 따른 5'-프로모터-다중시스트론 전사 유니트 - 전사 종결서열- 3'. 프로모터는 진핵 숙주세포에서 기능할 수 있어야 한다. 즉, 그것은 다중시스트론 전사 유니트의 전사를 구동시킬 수 있어야 한다. 발현 카세트는 당업계에 알려진 다른 요소, 예를 들면 인트론 등을 포함하도록 스플리스 부위를 임의로 추가로 함유할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 인트론은 프로모터 뒤에 그리고 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열 앞에 존재한다.
단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 얻기 위해, 그러한 발현을 구동할 수 있는 서열이, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 기능성으로 연결어서, 발현가능한 포맷으로 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 가져올 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 발현 카세트는 다중시스트론 전사 유니트를 포함한다. 일반적으로, 프로모터 서열은 발현되어야 하는 서열의 상류에 위치된다. 많이 사용된 발현 벡터는, 예를 들면 Invitrogen의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Sciences로부터의 pMSCV 및 pTK-Hyg, Stratagene로부터의 pCMV-Script 등과 같이, 당업계에서 입수가능하고, 그것은 적절한 프로모터 및/또는 전사 터미네이터 서열, polyA 서열 등을 얻는데 사용될 수 있다.
관심의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 코딩된 폴리펩티드의 전사와 번역을 통제하는 서열과 관련하여 적절하게 삽입되는 경우, 그 결과의 발현 카세트는 발현이라고 불리는, 관심의 폴리펩티드를 생성하기에 유용하다. 발현을 구동시키는 서열은 프로모터, 인핸서 등, 및 그것의 조합을 포함할 수 있다. 이들은 숙주세포에서 기능해서, 그것들에 기능성으로 연결된 핵산 서열의 발현을 구동시킬 수 있어야 한다. 당업자는 여러 프로모터들이 숙주세포에서 유전자의 발현을 얻기 위해 사용될 수 있다는 것을 알고 있다. 프로모터는 구조적(constitutive)이거나 조절될 수 있고, 바이러스, 원핵 생물, 또는 진핵 생물 소스를 포함하는 여러 소스로부터 얻어질 수 있거나 인공적으로 설계될 수 있다. 관심의 핵산의 발현은 천연 프로모터 또는 그것의 유도체 또는 완전히 이종의 프로모터로부터 일 수 있다(Kaufman, 2000). 진핵 생물 세포에서의 발현을 위한 몇몇 잘-알려지고 많이 사용되는 프로모터들은 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들면, E1A 프로모터, CMV 최초기(immediate early, IE) 프로모터와 같은, 시토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터(여기서 CMV 프로모터라고 불림) (예를 들면 pcDNA, Invitrogen으로부터 얻을 수 있음), Simian 바이러스 40로부터 유래된 프로모터 (SV40) (Das et al, 1985) 등을 포함한다. 적절한 프로모터는 메탈로티오네인 (MT) 프로모터, 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터(Gill et al., 2001), 유비퀴틴 C 또는 UB6 프로모터 (Gill et al., 2001; Schorpp et al, 1996), 액틴 프로모터, 이뮤노글로불린 프로모터, 열 쇼크 프로모터 등으로부터 또한 유래될 수 있다. 본 발명에서 적절한 프로모터인, 진핵생물 세포에서의 발현을 얻기 위한 몇몇 바람직한 프로모터는, CMV-프로모터, 포유류 EF1-알파 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터와 같은 포유류 유비퀴틴 프로모터, 또는 SV40 프로모터 (예를 들면 pIRES, cat.no. 631605, BD Sciences로부터 얻을 수 있음)이다. 프로모터 기능 및 프로모터의 강도를 위한 시험은 당업자에게 통상적인 것이고, 일반적으로 프로모터 서열 뒤의, 예를 들면 lacZ, 루시페라제, GFP, 등과 같은 시험 유전자를 클로닝하고 시험 유전자의 발현에 관해 시험하는 것을 포함할 수 있다. 물론, 프로모터는 그 안의 서열의 결실, 첨가, 변이에 의해 변경되거나, 새롭고, 약화되거나, 개선된 프로모터 서열을 발견하기 위해, 기능성에 대해 시험될 수 있다. 본 발명에 따라, 진핵생물에서 높은 전사 수준을 제공하는 강한 프로모터의 선택이 바람직하다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 분자는 벡터, 예를 들면 플라스미드의 부분이다. 이와 같은 벡터들은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 쉽게 조작될 수 있고, 예를 들면 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 게다가, 많은 벡터들이 직접 또는 그것으로부터의 단리된 원하는 단편의 형태로, 진핵생물 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 그러한 세포의 게놈으로 통합되어, 그것들의 게놈에서 원하는 핵산을 포함하는 안정한 숙주세포를 가져올 것이다.
종래의 발현계는 재조합 플라스미드 또는 재조합 바이러스의 게놈의 형태의 DNA 분자이다. 플라스미드 또는 바이러스 게놈은 (진핵생물 숙주) 세포로 도입되고 바람직하기는 당업계에 알려진 방법에 의해 그것들의 게놈으로 통합된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 그것의 개선된 트랜스유전자 발현계를 전달하도록 DNA 분자의 이들 형태를 또한 사용한다. 본 발명의 바람직한 구현예는 발현계의 전달을 위한 플라스미드 DNA의 사용이다. 플라스미드는 많은 성분들을 함유한다: 당업계에 알려진, 종래의 성분들은 박테리아 세포 내 플라스미드의 증식을 위한 복제의 기원이고 선택성 마커; 통합된 트랜스유전자 발현 시스템을 지니는 숙주세포를 확인하고 단리하기 위해 진핵생물 세포에서 작용하는 선택성 마커; 관심의 단백질, 그것의 고-수준의 전사는 진핵생물 세포(예를 들면 인간 시토메갈로바이러스 주요 최조기 프로모터/인핸서, pCMV (Boshart et al., 1985))에서 기능적인 프로모터에 의해 얻어진다; 그리고 관심의 트랜스유전자 및 선택성 마커를 위한 바이러스 전사 터미네이터 (예를 들면, SV40 폴리아데닐화 부위 (Kaufman & Sharp, 1982)).
사용된 벡터는 DNA를 클로닝하기에 적절하고 관심의 핵산의 전사를 위해 사용될 수 있는 어떤 벡터일 수 있다. 숙주세포가 사용될 때, 벡터는 통합 벡터인 것이 바람직하다. 대안으로, 벡터는 에피솜적으로(episomally) 복제하는 벡터일 수 있다.
크로마틴 구조 및 다른 후성적(epigenetic) 조절 메커니즘은 진핵생물 세포에서의 트랜스유전자의 발현에 영향을 끼칠 수 있다고 널리 이해된다(예를 들면, Whitelaw et al, 2001). 본 발명에 따른 다중시스트론 발현 유니트는 약간 엄격한(rigourous) 선택 요법과 함께 선택계의 일부를 형성한다. 이것은 일반적으로 숙주세포에서 높은 전사 수준의 선택을 요구한다. 엄격한 선택 요법에서 살아남은 숙주세포의 클론을 발견할 기회를 증가시키기 위해, 그리고 가능하게는 얻어진 클론들에서 발현의 안정성을 증가시키기 위해, 일반적으로 전사의 예견가능성을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 그러므로 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 적어도 하나의 크로마틴 조절 요소를 포함한다. 여기서 사용되는 것과 같은 '크로마틴 조절 요소'는 어쨋든 크로마틴 구조에 대해 영향을 끼치고 진핵생물 세포 내 그것들의 근처에 트랜스유전자의 발현 수준 및/또는 발현의 안정성(그것들은 '시스로(in cis)' 기능하고, 그에 따라 트랜스유전자로부터 바람직하기는 5 kb, 더 바람직하기는 2 kb, 훨씬 더 바람직하기는 1 kb 이내에 위치된다)에 영향을 끼친다. 그러한 요소들은 때로는 트랜스유전자 발현의 원하는 수준을 갖는 클론의 수를 증가시키기 위해 사용되었다. 이들 요소가 작동하는 메커니즘은 그러한 요소들의 다른 부류들과, 그리고 심지어는 그것들 중에서도 다를 수 있고, 그러한 요소들의 모든 유형들에 대해 완전히 알려져 있지는 않다. 하지만, 그러한 요소들은 설명되었고, 본 발명의 목적을 위해 크로마틴 조절 요소들은 매트릭스 또는 스카폴드 부착 영역 (MARs/SARs) (예를 들면 Phi-Van et al, 1990; WO 02/074969, WO 2005/040377), 베타-글로빈 인술레이터 요소 (치킨 베타-글로빈 로커스의 5' HS4), scs, scs', 등과 같은 인술레이터 (West et al, 2002) (예를 들면 Chung et al, 1993, 1997; Kellum and Schedl, 1991; WO 94/23046, WO 96/04390, WO 01/02553, WO 2004/027072), 유비퀴터스 크로마틴 오프닝 요소 (UCOE) (WO 00/05393, WO 02/24930, WO 02/09989, WO 02/099070), 및 항-억제자 서열(또한 'STAR' 서열이라고 불림) (Kwaks et al, 2003; WO 03/004704)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 MAR/SAR 서열의 비-제한적 예들은 다음과 같다: 치킨 리소자임 5' MAR (Phi-Van et al, 1990) 또는 그것의 단편, 예를 들면, WO 02/074969에 기술된 바와 같은 B, K 및 F 영역; 적어도 하나의 굽은 DNA 요소 및 적어도 하나의, 바람직하기는 적어도 10%의 디뉴클레오디드 TA, 및/또는 100개의 인접한 염기 쌍의 스트레치 상의 적어도 12%의 디뉴클레오티드 AT를 포함하는 DNA 결합 단백질을 위한 결합 부위를 포함하는 DNA 서열, 예를 들면, 서열은 WO 2005/040377의 서열 SEQ ID Nos 1~27, 길이가 적어도 100의 뉴클레오티드이고 MAR 활성을 가진, WO 2005/040377의 SEQ ID Nos 1~27 중의 어느 하나의 단편, WO 2005/040377의 SEQ ID Nos 1~27의 어느 하나 또는 그것의 단편과 뉴클레오티드 서열에서 적어도 70% 동일하고 MAR 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 MAR 활성은 생체 외에서 핵 매트릭스/스카폴드에 부착할 수 있고 그리고/또는 프로모터에 기능적으로 연결된 코딩 서열의 발현을 변경시킬 수 있는 것으로서 정의된다; WO 02/074969의 SEQ ID NO: 1~5 중의 어느 것에서 선택된 서열, MAR 활성을 갖는 WO 02/074969의 SEQ ID NO:1~5의 어느 하나의 단편, WO 02/074969의 SEQ ID NO: 1~5의 어느 하나의 서열과 뉴클레오티드 서열의 적어도 70%가 동일하고 MAR 활성을 갖는 서열 또는 그것의 단편; WO 2004/027072의 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2, 그것의 기능적 유도체 및 그것과 적어도 70%가 동일한 서열로부터 선택된 서열. 본 발명에 사용될 수 있는 인술레이터 서열의 비제한적인 예는 WO 01/02553의 SEQ ID NO:1을 포함하는 서열이다. 본 발명에 사용될 수 있는 UCOE의 비제한적인 예는 WO 02/24930의 도 2와 7에 나타낸 서열 및, 그것의 기능적 단편 및 반응성을 여전히 유지하면서 적어도 70%가 그것과 동일한 서열; US 2005/0181428의 SEQ ID NO: 28을 포함하는 서열, 그것의 기능적 단편 및 여전히 반응성을 유지하면서 적어도 70%가 그것과 동일한 서열이다.
바람직하기는, 상기 크로마틴 조절 요소는 항-억제자 서열이고, 바람직하기는: a) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66의 어느 하나; b) SEQ. ID. NO. 1 내지 SEQ. ID. NO. 66 중의 어느 하나의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다('기능성 단편'); c) a) 또는 b)와 뉴클레오티드 서열에서 적어도 70% 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성('기능성 유도체')를 갖는다; 및 d) a)~c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하기는, 상기 크로마틴 조절 요소는 STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), 또는 기능성 단편 또는 상기 STAR 서열의 유도체이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 STAR 서열은 STAR 67 (SEQ. ID. NO. 66) 또는 기능성 단편 또는 그것의 유도체이다. 어떤 바람직한 구현예에서, STAR67 또는 기능성 단편 또는 그것의 유도체는 다중시스트론 전사 유니트의 발현을 작동시키는 프로모터의 상류에 위치된다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 적어도 하나의 항-억제자 서열에 의해 양쪽에 플랭크된다.
여기서 사용되는 항-억제자 활성을 갖는 서열은 HP1 또는 HPC2 단백질의 억제 효과를, 이들 단백질이 DNA에 매일 때(tethered) 적어도 부분적으로 대항할 수 있는 서열이다. 본 발명에 적절한 항-억제자 활성을 갖는 서열(때때로 또한 여기서 항-억제자 서열 또는 항-억제자 요소로 불린다)은 본 명세서에 참조로 병합된 WO 03/004704에 기재되어 있고, 그 안의 "STAR" 서열이 주조되어(coined) 있다 (서열이 여기서 STAR 서열로서 불리는 경우마다, 이 서열은 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는다). 비-제한적인 예로서, STAR1-65(WO 03/004704) 및 STAR 67로 명명된 66 항-억제자 요소들의 서열은 본 명세서에 각각 SEQ ID NOs 1-65 및 66으로 존재한다.
본 발명에 따르면, 주어진 항-억제자 요소의 기능적 단편 또는 유도체는 이것이 여전히 항-억제자 활성을 갖는다면, 상기 항-억제자 요소와 동등하다고 간주된다. 이와 같은 항-억제자 활성의 존재는 예를 들면, 하기의 조사에 의해, 당업자에게 쉽게 확인될 수 있다. 기능적 단편 또는 유도체는 분자 생물학 분야의 당업자에 의해, 주어진 항-억제 서열로 출발하여, 결실, 첨가 치환, 역위 등을 만들어 쉽게 얻어질 수 있다(예를 들면, WO 03/004704 참조). 기능적 단편 또는 유도체는 또한 다른 종으로부터의 오쏘로그를 포함하고, 이것은 당해 분야의 당업자에 의해 알려진 방법에 의해 공지의 항-억제자 서열을 사용하여 발견될 수 있다(WO 03/004704 참조). 따라서, 본 발명은 항-억제자 서열의 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 여전히 항-억제자 활성을 갖는다. 본 발명은 또한, 적어도 70% 동일한 서열이 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는 한, 상기의 항-억제자 활성을 갖는 서열 또는 항-억제자 활성을 갖는 그들의 단편과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 바람직하기는 상기 서열은 참조 천연 서열 또는 그것의 기능적 단편과 적어도 80% 동일하고, 바람직하기는 적어도 90% 동일하고 더욱 바람직하기는 적어도 95% 동일하다. 주어진 서열의 단편의 경우, 동일성 비율은 단편에서 발견되는 참조 천연 서열의 부분을 말한다.
본 발명에 따른 항-억제자 서열 활성을 갖는 서열은 인간 게놈 또는 또 다른 유기체의 게놈으로부터의 클로닝을 포함하지만 이것에 한정되지는 않는, 여러 방법에 의해, 또는 서열의 지식을 사용함에 의해, 예를 들면 PCR에 의해, 그러한 게놈으로부터 직접 알려진 항-억제자 서열을 증폭시키는 것에 의해, 얻어질 수 있거나, 부분적으로 또는 전체적으로, 화학적으로 합성될 수 있다.
항-억제자 서열을 갖는 서열, 및 기능성 단편 또는 그것의 유도체는 그것들의 서열에 의해 여기에서 구조적으로 정의되고 게다가 하기에 기술된 분석으로 측정될 수 있는, 항-억제자 활성을 갖는 서열로서 기능적으로 정의된다.
본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는 서열은 적어도 하기 기능성 분석에서 생존할 수 있어야 한다 (WO 03/004704, 실시예 1, 참고로서 여기에 병합됨).
인간 U-2 OS 세포 (ATCC HTB-96)는 pTet-Off 플라스미드 (Clontech K1620-A) 및 Tet-Off 전사 조절계의 조절 하에 LexA DNA 결합 도메인과 HP1 또는 HPC2 (DNA에 속박될 때 유전자 발현을 억제하는 초파리 폴리콤(polycomb) 군 단백질; 분석은 융합 단백질로 작업한다)의 코딩 영역을 함유한 LexA-억제자 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로 안정하게 트랜스펙션된다 (Gossen and Bujard, 1992). 이들 세포는 하기에서 항-억제자 활성 분석을 위한 리포터 세포로 불리운다. 히그로마이신 내성을 제공하는 리포터 플라스미드는 4개의 LexA 오퍼레이터 부위 및 제오신 내성 유전자를 조절하는 SV40 프로모터 사이에 위치된 폴리링커 서열을 함유한다. 항-억제자 활성에 대해 시험될 서열은 상기 폴리링커에 클로닝될 수 있다. pSelect와 같은 적절한 리포터 플라스미드의 구조체가 WO 00/004704의 실시예 1 및 도 1에 기술되어 있다. 리포터 플라스미드는 리포터 세포로 트랜스펙션되고, 세포는 히그로마이신 선택(25 ㎍/ml; 리포터 플라스미드의 존재를 위한 선택) 및 테트라사이클린 억제 (독시사이클린, 10 ng/ml; LexA-억제자 융합 단백질의 발현을 방지한다) 하에 배양된다. 이들 조건 하에서 성장 1주 후, 독시사이클린 농도는 LexA-억제자 유전자를 유발하도록 0.1 ng/ml로 감소되고, 2일 후 제오신이 250 ㎍/ml로 첨가된다. 세포는 조건 배양물 (빈 리포터 플라스미드로 트랜스펙션된, 즉 폴리링커에 클론된 항-억제자 서열이 없는)이 제오신에 의해 사멸될 때까지(이러한 대도구 플라스미드에서, SV40 프로모터는 제오신 선택에 생존하도록 그러한 세포에서 불충분한 제오신 발현을 가져오는, LexA 오퍼레이팅 부위에 속박된 LexA 억제자 융합 단백질에 의해 억압된다), 5주 동안 배양된다. 서열은 만약, 상기 서열이 리포터 플라스미드의 폴리링커에 클로닝될때, 리포터 세포가 제오신 하에 5주 선택에서 생존한다면, 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는다. 그러한 콜로니로부터의 세포는 5주 제오신 선택 후에 제오신을 함유하는 새로운 배지 상으로 여전히 증식될 수 있고, 반면에 항-억제자 서열이 없는 리포터 플라스미드로 트랜스펙션된 세포는 제오신을 함유한 새로운 배지 상으로 증식될 수 없다. 이러한 분석에서 제오신에 대한 5주 후 그러한 성장을 부여할 수 없는 서열은 본 발명에 따른 항-억제자 활성, 기능성 단편 또는 그것의 기능성 유도체를 갖는 서열로서 자격을 갖추지 못한다. 예로서, 초파리 scs (Kellum and Schedl, 1991), 치킨 β-글로빈 로커스의 5'-HS4 (Chung et al, 1993, 1997) 또는 매트릭스 부착 영역 (MARs) (Phi-Van et al., 1990)을 포함하는, Van Der Vlag et al (2000)에 의해 시험된 것들과 같은 다른 알려진 크로마틴 조절 요소는 이 분석에서 생존하지 못한다.
게다가, 항-억제자 서열 또는 그것의 기능성 단편 또는 유도체는 U-2 OS 또는 CHO 세포의 게놈으로 통합되는 리포터 유전자(예를 들면, 루시퍼라제, GFP)가 플랭킹될 때, 상기 리포터 유전자가 항-억제자 서열에 의해 플랭킹되지 않거나 또는 Drodophila scs와 같은 약한 억제 블로킹 서열에 의해 플랭킹될 때와 비교하여, 더 높은 비율의 리포터 과-발현 클론을 제공한다. 이것은 예를 들면, WO 03/004704의 실시예 1과 도2에 기재된 바와 같은, pSDH 벡터 또는 유사 벡터를 사용하여 확인할 수 있다.
항-억제자 요소는 단백질 생산에 관한 3가지 결과 중 적어도 하나를 갖는다:(1) 이들은 산업적으로 허용가능한 수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포주를 동정하는 예측가능성을 증가시킨다(이들은 트랜스유전자를 침묵시키는 이웃의 헤테로크로마틴의 능력을 악화시켜, 병합의 위치는 발현에 덜 중요한 효과를 갖는다); (2)이들은 숙주세포주가 증가된 단백질 수득률을 갖도록 한다; 그리고/또는 (3)이들은 연장된 배양 동안 숙주세포주가 더욱 안정한 단백질 생산을 나타내도록 한다.
어떠한 STAR 서열도 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용될 수 있지만, 특히 다음의 STAR 서열들이 유용하다: STAR67 (SEQ ID NO. 66), STAR7 (SEQ ID NO. 7), STAR9 (SEQ ID NO. 9), STAR17 (SEQ ID NO. 17), STAR27 (SEQ ID NO. 27), STAR29 (SEQ ID NO. 29), STAR43 (SEQ ID NO. 43), STAR44 (SEQ ID NO. 44), STAR45 (SEQ ID NO. 45), STAR47 (SEQ ID NO. 47), STAR61 (SEQ ID NO. 61), 또는 이들 STAR 서열의 기능성 단편 또는 유도체.
특정 구현예에서, 상기 항-억제자 서열, 바람직하기는 STAR67은 상기 프라이머의 상류에 놓이고, 바람직하기는 2kb 미만이 항-억제자 서열의 3'말단과 프로모터 서열의 개시 사이에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 1kb 미만, 더욱 바람직하기는 500 뉴클레오티드(nt) 미만, 가장 바람직하기는 약 200, 100, 50, 또는 30 nt가 항-억제자 서열의 3' 말단과 프로모터 서열의 개시 사이에 존재한다. 특정의 바람직한 구현예에서, 항-억제자 서열은 프로모터의 바로 상류에 클론되어서, 항-억제자 서열의 3' 말단과 프로모터 서열의 개시 사이에 겨우 약 0~20 nt를 초래한다.
다량체 단백질의 생산을 위해, 2개 이상의 발현 카세트가 사용될 수 있다. 바람직하기는, 2개의 발현 카세트는 본 발명에 따른 다량체 발현 카세트이고, 각각은 다른 선택성 마커 단백질에 대해 코딩하고, 따라서 두 발현 카세트에 대한 선택이 가능하다. 이 구현예는 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현에 대해 양호한 결과를 가져온다는 것을 증명한다. 2개의 발현 카세트 모두는 그들이 숙주세포에 도입되기 전에, 하나의 핵산 분자 상에 놓이거나 또는 둘 다 분리된 하나의 핵산 분자에 존재할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 하나의 핵산 분자에 그들을 위치시키는 것의 이점은 두 개의 발현 카세트가 숙주세포에 도입될 때 단일의 정해진 비율(예를 들면 1:1)로 존재하는 것이다. 한편, 2개의 다른 핵산 분자에 존재하면, 이것은 그들이 숙주세포에 도입될 때 2개의 발현 카세트의 몰 비가 변할 가능성을 허용하고, 이것은 바람직한 몰 비가 1:1과 다르거나 무엇이 바람직한 몰비 인지 미리 알지 못한 경우에 이점일 수 있고, 그래서 몰비의 변화 및 최적치를 실험적으로 밝히는 것은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 바람직하기는 발현 카세트 중 적어도 하나, 그러나 더욱 바람직하기는 그들 각각은 크로마틴 조절 요소, 더욱 바람직하기는 항-억제자 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 다량체 단백질의 다른 서브유니트 또는 부분들이 단일의 발현 카세트에 존재한다.
발현 카세트에서 프로모터의 상류에 놓인 STAR 서열 대신 또는 추가로, 발현 카세트의 양쪽에 STAR 서열을 제공하여 트랜스유전자를 포함하는 발현 카세트가, 특정 구현예에서 서로 본질적으로 동일한, 2개의 STAR 서열에 의해 플랭크되는 것이 매우 유리하다는 것이 증명되었다.
프로모터 상류의 제 1 항-억제자 요소와 2개의 다른 항-억제자 서열에 의한 발현 카세트의 플랭킹의 조합이 더 우수한 결과를 제공한다고 알려져 있다.
적어도 몇몇의 항-억제자 서열은 지향적(directional)일 수 있으므로(WO 00/004704), 발현 카세트를 플랭킹하는 항-억제자 서열 (항-억제자 A 및 B)는 서로에 대해 반대 방향으로 유익하게 놓여서, 이들 항-억제자 서열의 3' 말단은 발현 카세트의 안쪽으로(및 서로에 대해) 마주한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 항-억제자 요소의 5'측은 트란스 유전자에 대한 영향이 상기 항-억제자 요소에 의해 감소되도록 DNA/염색질을 향한다. 발현 카세트에서 프로모터 상류의 항-억제자 서열 상류에 대해, 3' 말단은 프로모터를 향한다. 서열 리스트에서 항-억제자 요소의 서열은 다른 언급이 없는 한 5'에서 3' 방향으로 주어진다 (SEQ ID NO 1-66).
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 전사 단위 또는 발현 카세트가 제공되고, 이것은 추가로: a) 다중시스트론 전사 유니트의 전사를 구동하는 프로모터의 상류의 전사 중지(TRAP) 서열, 여기서 상기 TRAP는 5'에서 3'의 방향; 또는 b) 상기 관심의 폴리펩티드의 개방 리딩 프레임의 하류 및 바람직하기는 상기 다중시스트론 전사 유니트의 전사 종결 서열의 하류의 TRAP 서열, 여기서 상기 TRAP는 3'에서 5'의 방향으로 있고; 또는 c) a)와 b) 둘 다를 포함하고, 여기서 TRAP 서열은 기능적으로 전사 유니트에 놓일 때 TRAP의 5' 측의 핵산에서 관찰되는 전사의 수준과 비교하여 TRAP의 3' 측에 존재하는 핵산에서의 전사 수준의 감소를 초래하는 서열로서 기능적으로 정의된다. TRAP의 비-제한적 예는 전사 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호이다. TRAP 서열의 하나의 비-제한적 예는 SEQ ID NO: 142이다. 다른 TRAP 서열, 이들을 발견하는 방법, 및 그것의 용도에 관한 예는 WO 2004/055215에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 다중시스트론 유니트 및/또는 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는 핵산의 발현을 개선하기 위해, 바람직하기는 숙주세포에서 사용될 수 있다. 용어 "세포"/"숙주세포" 및 "세포주"/"숙주세포주"는 통상적으로 각각 당해 분야에 알려진 방법에 의해 세포 배양물에 유지될 수 있고, 이종의 또는 동종의 단백질을 발현하는 능력을 갖는 세포 및 그것의 균질한 개체군으로서 각각 정의된다.
원핵 숙주세포는 특히 박테리아와 같은 원핵 숙주세포에서 복제가능한 플라스미드 상에 존재할 때, 본 발명의 DNA 분자로 증식 및/또는 유전공학의 실시에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 숙주세포는 진핵 세포, 더욱 바람직하기는 설치류 세포 또는 인간세포와 같은 포유동물 세포 또는 다른 세포들 간의 융합세포이다. 특정 비-제한적인 구현예에서, 상기 숙주세포는 U-2 OS 골육종, CHO(중국 햄스터 난소), HEK 293, HuNS-1 골수종, WERI-Rb-1 망막아종, BHK, 베로, 비-선택성 마우스 골육종 Sp2/0-Ag 14, 비-선택성 마우스 골육종 NS0, NCI-H295R 부신 육종 또는 PER.C6® 세포이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 숙주세포는 적어도 아데노바이러스의 E1A, 그리고 바람직하기는 또한 E1B를 발현하는 세포이다. 비-제한적인 예로서, 예를 들면, 인간세포, 예를 들면 신장(예: HEK 293 세포, Graham et al, 1997 참조), 폐(예: A549, WO 98/39411 참조) 또는 망막(예: 상표명 PER.C6®의 HER 세포, US 특허 5,994,128 참조), 또는 암니오사이트(amniocyte) (예: N52.E6, 미국특허 6,558,948) 및 유사하기는 다른 세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 이와 같은 세포를 얻는 방법은 예를 들면, US 특허 5,994,128 및 US 6,558,948에 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위한 PER.C6 세포는, ECACC 제 96022940으로 기탁된 세포의 상류 또는 하류 계대 또는 이들 세포의 특성을 갖는 상류 또는 하류의 계대의 자손으로부터의 세포를 의미한다. 이와 같은 세포는 고수준의 단백질 발현이 가능하다는 것이 이미 알려져 있다(예를 들면, WO 00/63403, 및 Jones et al, 2003). 다른 바람직한 구현예에서, 숙주세포는 CHO 세포, 예를 들면 CHO-K1, CHO-S, CHO-DG44, CHO-DUKXB11 등이다. 특정 구현예에서, 상기 CHO 세포는 dhfr- 페노타입을 갖는다. 이와 같은 원핵 숙주세포는 원하는 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 종종 그 목적을 위해 사용된다. 이들은 본 발명의 DNA 분자의, 바람직하기는 발현 카세트의 형태로 세포에 도입함에 의해 얻을 수 있다. 바람직하기는, 발현 카세트는 숙주세포의 게놈에 통합되고, 이것은 여러 숙주세포에서 다른 위치에 있을 수 있고, 선택은 트랜스유전자가 적절한 위치에 통합되는 클론을 제공하여, 숙주세포 클론이 발현 수준, 안정성, 성장 특성 등의 원하는 성질을 갖도록 한다. 선택적으로, 다중시스트론 전사 유니트는 게놈에 존재하는 프로모터 후방과 같은 전사적으로 활성인 염색체 영역으로 병합되도록 표적되거나 또는 임의로 선택될 수 있다. 본 발명의 DNA를 함유하는 세포에 대한 선택은 당해 분야의 당업자에게 알려진 통상의 방법을 사용하여 선택성 마커 폴리펩티드를 선택함으로써 수행될 수 있다. 이와 같은 다중시스트론 전사 유니트가 게놈의 프로모터 뒤에 통합되면, 본 발명에 따른 발현 카세트는 숙주세포의 게놈 내에 인시츄 생성될 수 있다.
바람직하기는 숙주세포는 당해 분야의 당업자에게 알려진 표준 방법에 따라 선택되고 증식된 안정한 클론으로부터 유래할 수 있다. 이와 같은 클론의 배양물은 세포가 본 발명의 다중시스트론 전사 유니트를 포함한다면, 관심의 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 무-혈청 배지의 현탁 배양물 중에서 성장할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 다중시스트론 전사 유니트를, 바람직하기는 발현 카세트의 형태로 포함하는 DNA 분자는 본 발명에 따른 원핵 숙주세포의 게놈에 통합된다. 이것은 다중시스트론 전사 유니트의 안정한 유전을 제공한다.
선택성 마커 폴리펩티드의 존재를 위한, 그리고 따라서 발현을 위한 선택은 세포의 초기 수득 중에 실시될 수 있고, 안정한 클론이 얻어진 후 함께 낮아지거나 또는 멈출 수 있다. 그러나, 이후의 단계 동안 선택제를 계속적으로 또는 오직 가끔, 가능하기는 숙주세포의 초기 선택 동안 보다 낮은 수준으로 공급하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 관심의 폴리펩티드는 어느 단백질일 수 있고, 단량체 단백질 또는 다량체의 단백질(의 일부)일 수 있다. 다량체 단백질은 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명에 따른 관심의 단백질의 비-제한적 예는 효소, 호르몬, 면역글로불린 사슬, 항암 단백질과 같은 치료적 단백질, 인자 Ⅷ과 같은 혈액응고 단백질, 에리트로포이에틴과 같은 다기능성 단백질, 진단 단백질, 또는 백신 목적에 유용한 단백질 또는 그들의 단편이고, 이들은 모두 당해 분야의 당업자에게 알려져 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 또는 그들의 항원 결합부, 유도체 및/또는 동족체이다. 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심의 단백질은 면역글로불린 중쇄이다. 또 다른 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심의 단백질은 면역글로불린 경쇄이다. 이들 2개의 단백질 발현 유니트가 동일한 (숙주)세포 내에 존재할 때, 다량체 단백질 또는 더욱 특별히는 면역글로불린이 조립된다. 따라서, 특정 구현예에서, 관심의 단백질은 항체과 같은 면역글로불린이고, 이것은 다량체 단백질이다. 바람직하기는, 이와 같은 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 그것의 특정 구현예에서, 이것은 IgG, IgA 또는 IgM 항체이다. 면역글로불린은 다른 발현 카세트 상에서 또는 단일 발현 카세트 상에서, 중쇄 및 경쇄에 의해 코딩될 수 있다. 바람직하기는 중쇄와 경쇄는 각각 개별적인 발현 카세트 상에 존재하고, 각각은 자신의 프로모터를 가지고(이것은 2개의 발현 카세트에 대해 같거나 또는 다를 수 있다), 각각은 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트를 포함하고, 중쇄 및 경쇄는 관심의 폴리펩티드이고, 그리고 바람직하기는 각각은 다른 선택성 마커 단백질을 코딩하여, 중쇄과 경쇄 발현 카세트 둘 다에 대한 선택은 발현 카세트가 원핵 숙주세포에 도입 및/또는 존재할 때 수행될 수 있다.
관심의 폴리펩티드는 어느 기원으로부터도 가능하고, 특정 구현예에서는 포유동물 단백질, 인공 단백질 (예를 들면, 융합 단백질 또는 돌연변이된 단백질)이고, 바람직하기는 인간 단백질이다.
당연히, 본 발명의 발현 카세트의 입체배치는 긍극적 목적이 관심의 폴리펩티드의 생산이 아니라, 예를 들면 발현 카세트로부터 RNA의 증가된 양의 생산을 위한, RNA 자체일 때 사용될 수 있고, 이것은 다른 유전자의 조절(예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA), 유전자 치료법, 생체 외 단백질 제조 등과 같은 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 발생시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 본 발명에 따른 발현 카세트를 다수의 전구 세포에 도입하는 단계, 및 b) 선택성 마커 폴리펩티드의 발현을 위해 생성된 세포를 선택 조건하에서 배양하는 단계, 및 c) 관심의 폴리펩티드를 생성하는 적어도 하나의 숙주세포를 선택하는 단계를 포함한다. 이 신규의 방법은 원하는 폴리펩티드의 고발현을 갖는 클론 대 얻어진 클론의 비에서 매우 양호한 결과를 제공한다. 가장 스트린전시 조건, 즉 (가장 약한 번역 개시서열을 사용한) 선택성 마커 폴리펩티드에 대한 가장 약한 번역 효율을 사용하여, 동일한 농도의 선택제를 사용하여 공지의 선택계보다 훨씬 더 적은 클로니들이 얻어지고, 얻어진 클론의 상대적으로 높은 백분률이 높은 수준으로 관심의 폴리펩티드를 생산한다. 이에 더하여, 발현의 얻어진 수준은 공지의 선택계를 사용하여 더 많은 수의 클론이 사용되었을 때 얻어진 것보다 더 높게 나타난다.
선택계는, 이것은 트랜스유전자의 복사체 수 증폭을 요구하지 않으므로 신속하다(swift)는 이점이 있다. 그러므로 다중시스트론 전사 유니트의 복사체 수가 낮은 세포는 이미 높은 발현 수준을 제공한다. 트랜스유전자의 높은 트랜스유전자 복사체 수는 유전적 불안정성과 반복-유도 침묵의 경향이 있다(예를 들면, Kim et al, 1998; McBurney et al, 2002). 그러므로, 비교적 낮은 트란스 유전자 복사체 수를 갖는 본 발명의 구현예의 추가의 이점은 더 적은 수의 복사체가 재조합과 반복-유도 침묵의 경향을 줄인다고 기대되고, 따라서 이와 관련하여, 세포의 게놈에 수백 또는 수천개의 선택성 마커 및 서열을 코딩하는 관심의 단백질의 복사체가 존재하는 증폭계를 사용하여 얻어지는 숙주세포와 비교하여, 제한된 수의 트랜스유전자의 복사체를 갖는 숙주세포를 사용하였을 때, 문제가 덜 예상된다는 것이다. 본 발명은, 트랜스유전자의 복사체 수가 비교적 낮을 때, 예를 들면 세포당 30개 미만의 복사체 또는 세포당 20개 미만의 복사체일 때, 다중시트론성 전사 유니트 선택계를 사용하여, 고발현 수준의 예를 제공한다. 따라서, 본 발명은 숙주세포의 게놈에 다중시스트론 전사 유니트의 30개 미만의 복사체, 바람직하기는 25개 미만, 더욱 바람직하기는 20개 미만의 복사체를 포함하는 본 발명에 따른 숙주세포의 생성을 허용하고, 동시에 상업적 목적을 위해, 예를들면 항체의 15pg/세포/일 초과 또는 20pg/세포/일 초과의 관심의 펩티드의 충분한 발현 수준을 제공한다.
다중시스트론 전자 유니트의 비교적 낮은 복사체 수와 높은 발현 수준을 갖는 클론이 얻어질 수 있는 반면, 그럼에도 불구하고 본 발명의 선택계는 발현 수준의 추가의 개선을 위해 증폭 방법과 조합될 수 있다. 이것은 예를 들면, 메토트레세이트를 이용한 공동-통합된 dhfr 유전자의 증폭에 의해, 예를 들면, 본 발명의 다중시스트론 전자 유니트와 동일한 핵산분자 상에 dhfr를 위치시킴에 의해, 또는 dhfr이 개별적인 DNA 분자 상에 있을 때 공-트랜스펙션에 의해 수행될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 관심의 펩티드를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 숙주세포를 배양하는 것을 포함하고, 상기 숙주세포는 다중시스트론 발현 유니트 또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하고, 관심의 폴리펩티드를 위한 코딩서열로부터 관심의 폴리펩티드를 발현한다.
이 양상에서 숙주세포는 진핵 숙주세포, 바람직하기는 CHO 세포와 같은, 포유동물 세포이고, 추가로 상기와 같다.
세포에서 발현되어질 핵산의 도입은 여러 방법 중 하나에 의해 실시될 수 있고, 그 자체로 당해 분야의 당업자에게 알려진 것으로, 도입되어질 핵산의 포맷에 의존한다. 상기 방법은 트랜스펙션, 감염, 주입, 형질전환 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관심의 폴리펩티드를 발현하는 적절한 숙주세포는 상기와 같은 선택에 의해 얻어질 수 있다.
특정 구현예에서, 선택제는 선택성 마커 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하기에 충분한 농도로 또는 낮은 농도로, 배양중 적어도 일부 시간 동안 배양 배지에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 선택제는 폴리펩티드가 발현될 때 생산 상(phase) 동안 배양 배지에 더 이상 존재하지 않는다.
세포를 배양하는 것은 세포가 대사 및/또는 성장 및/또는 분할 및/또는 관심의 재조합 단백질의 생성을 가능하게 행해진다. 이것은 당해 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 세포에 영양을 제공하는 것을 포함하지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다. 본 방법은 표면에 접착되는 성장, 현탁물 중의 성장 또는 그들의 조합을 포함한다. 배양은 예를 들면, 디쉬, 롤러병 또는 생물반응기에서, 배치, 공급-배치, 관류시스템과 같은 연속 시스템 등을 사용하여 실시될 수 있다. 새포 배양물을 통한 재조합 단백질의 대규모 (연속) 생산을 달성하기 위해, 본 발명에서, 현탁물 중 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 동물- 또는 인간-유래된 혈청 또는 동물- 또는 인간-유래된 혈청 성분의 부재하에 배양될 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하다.
세포를 성장 또는 번식시키기 위한 조건(예를 들면, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors(1973)) 및 재조합 생성물의 발현을 위한 조건은 당해 분야의 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, 포유동물 세포 배양물의 생산성을 최대로 하기 위한 원리, 프로토콜, 및 실질적 기술은 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)에서 발견될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 발현 단백질은 세포로부터 또는 배양 배지로부터 또는 둘 다로부터 수집(단리)될 수 있다. 그리고 나서, 추가로 공지의 방법, 예를 들면, 여과, 칼럼 크로마토그래피 등 당해 분야의 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 선택 방법은 크로마틴 조절 요소의 부재에서 작동하지만, 개선된 결과는 다중시스트론 발현 단위에 이와 같은 요소들이 제공될 때 얻어진다. 본 발명에 따른 선택방법은 적어도 하나의 항-발현 서열을 포함하는 본 발명에 따른 발현 카세트가 사용될 때 특히 잘 작동한다. 선택제 및 조건에 따라, 선택은 특정 경우에 매우 스트린전시로 제조되어, 항-억제자 서열이 존재하지 않는 한, 선택에서 생존하는 숙주세포는 매우 소량이거나 또는 없다. 따라서, 신규한 선택법과 항-억제자 서열의 조합은 관심의 폴리펩티드의 고발현 기회를 크게 증가시키면서 오직 제한된 수의 콜로니를 얻기 위한 매우 매력적인 방법을 제공하고, 동시에 얻어진 클론들은 관심의 폴리펩티드의 안정한 발현을 제공하기 위한 항-억제자 서열을 갖는 발현 카세트를 포함하고, 즉, 그들은 침묵 및 통상의 발현 카세트보다 발현이 낮은 다른 메카니즘의 경향이 덜하다.
특정 구현예에서, 항-억제자 서열이 매우 스트린전트 선택을 제공하는, 본 발명에 따른 발현 카세트에 존재하지 않을 때 클론은 거의 얻어지지 않는다. 그러므로 여기에 기재된 신규한 선택계는, 선택 조건 하에서 본 발명의 발현 카세트에 존재할 때 이와 같은 서열의 효과를 분석함에 의해, 항-억제자 요소의 일부를 기능성에 대해 시험할 수 있는 가능성을 또한 제공한다. 많은 경우에 거의 또는 심지어 완전히 검고 흰 차이를 제공하는 이 용이한 분석은, 그러므로 항-억제자 서열로부터의 기능성 부분 또는 유도체를 동정하는데 기여할 수 있다. 공지의 항-억제자 서열을 시험할 때, 이 분석은 그들을 더욱 특성화하는데 사용할 수 있다. 공지의 항-억제자 서열의 단편이 시험될 때, 분석은 이와 같은 공지의 항-억제자 서열의 기능성 단편을 제공할 것이다.
본 발명의 실시는 다른 언급이 없는 한, 면역, 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 적용할 것이고, 이것은 당해 분야 내이다. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning:A laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988 참조.
도 1은 STAR 요소가 없는 그리고 있는 전사 유니트의 개략도이다.
A) CMV 프로모터 조절하에, (5'에서 3'로) 트랜스유전자 (예를들면 d2EGFP 유전자를 코딩하는), IRES 및 선택성 마커 (제오신 내성을 이르는 zeo)를 함유하는 2시스트론성 유전자. 발현 유니트는 그것의 3' 끝 (t)에 SV40 전사 터미네이터를 갖는다. 구조체의 이름은 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV 대조구)이다.
B) A에서와 같은 구조체, 그러나 이제 STAR67은 CMV 프로모터의 상류에 클론되어 있다. 구조체의 이름은 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)이다.
C) B에서와 같은 구조체, 그러나 STAR7 요소의 상류 및 하류에 전체 구조체가 플랭크되도록 클론되어 있다. 구조체의 이름은 STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)이다.
도 2: STAR67은 CHO 세포에서 CMV 구동된 d2EGFP 발현을 증진시킨다.
10 독립 안정 콜로니에 대한 d2EGFP 신호의 평균이 CHO 세포에서 지시된 주조체들에 대해 플롯되어 있다. A) CMV 대조구; B) STAR67-CMV. X(10) : 10 콜로니 의 평균 d2EGFP 발현 수준. 상세한 사항은 실시예 2 참조.
도 3: STAR67은 CHO 세포에서 EF1α 구동된 d2EGFP 발현을 증진시킨다.
도 2에서와 같으나, 이제 EF1α 프로모터를 가진다. A) EF1α 대조구; B) STAR67-EF1α.
도 4: STAR67은 CHO 세포에서 UB6 구동된 d2EGFP 발현을 증진시킨다.
도 2 및 도 3에서와 같으나, 이제 UB6 프로모터를 가진다. A) UB6 대조구; B) STAR67-UB6.
도 5: STAR67은 PER.C6 세포에서 CMV 구동된 d2EGFP 발현을 증진한다.
도 2에서와 같으나, 이제 PER.C6 세포에서다. A) CMV 대조구; B) STAR67-CMV.
도 6: STAR67은 PER.C6 세포에서 EF1α 구동된 d2EGFP 발현을 증진한다.
도 3에서와 같으나, 이제 PER.C6 세포에서다. A) EF1α 대조구; B) STAR67-EF1α.
도 7: STAR67은 PER.C6 세포에서 UB6 구동된 d2EGFP 발현을 증진한다.
도 4에서와 같으나, 이제 PER.C6 세포에서다. A) UB6 대조구; B) STAR67-UB6.
도 8: STAR67은 또 다른 STAR 요소와 조합하여 CHO-K1 세포에서 SV40 구동된 d2EGFP 발현을 증진한다. 도 2에서와 유사하나, 이제 CHO 세포에서 SV40 프로모터 및 지시된 구조체를 사용한다. 트랜스펙션 60일 후에 18-20 독립 안정 콜로니에 대해 d2EGFP 신호의 평균이 플롯되어 있다. A) SV40 대조구, SV40-STAR67, SV40- STAR7/7; B) SV40 대조구 및 SV40-STAR 7/7. 상세한 사항은 실시예 4 참조.
도 9: STAR67은 CHO-K1 세포에서 UB6 구동된 EpCAM 항체의 발현 수준을 증진한다. 상세한 사항은 실시예 5 참조. A) STAR 요소가 없는 구조체; B) 프로모터의 상류에 그리고 STAR7 요소에 플랭크하는 STAR67을 갖는 구조체. 항-EpCAM 항체 농도는 pg/세포/일로서 존재한다. X(18): 18 콜로니의 평균 생성 수준.
도 10: STAR67은 인핸서 차단자(blocker)는 아니나, 반면에 STAR6 및 7은 차단자이다. 상세한 사항은 실시예 6 참조.
도 11: STAR67은 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포에서 UB6 및 CMV-구동된 항체의 발현 수준을 증진한다. 상세한 사항은 실시예 7 참조. A) 항-EpCAM 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) (각각 프로모터 뒤에, 및 각각 다른 선택성 마커 유전자 (동시 선택은 두 마커에 대해 사용되었다))를 함유하는 단일 DNA 분자 : STAR 요소가 없는 구조체. 콜로니는 발견되지 않았다; B) 두 프로모터 사이에 STAR67을 갖는 동일한 구조체. 항-EpCAM 항체 농도는 pg/세포/일로서 존재된다. X(19): 19 콜로니의 평균 생성 수준.
도 12는 본 발명에 따른 선택 마커 유전자 (제오신 내성 유전자)의 사용의 개략도이다. A. 그것의 정상 번역 개시부위 (ATG 개시코돈) 및 메티오닌을 코드하는 하나의 내부 ATG 코돈을 갖는, 야생형 제오신 내성 유전자. B. 돌연변이 제오신 내성 유전자, 여기서 내부 ATG는 로이신의 코돈으로 돌연변이 되었다; 이 돌연변이체는 기능성 제오신 내성 유전자이다. C. B에서와 같으나, 돌연변이된 번역 개시부위를 포함하고, 여기서 ATG 개시코돈의 상황(context)은 번역 개시를 감소시키기 위해 돌연변이 되었다. D. B에서와 같으나, 돌연변이된 개시코돈 (GTG)를 포함한다. E. B에서와 같으나, TTG 개시코돈을 갖는다. 도 C-E 하의 숫자들은 리보솜에 의한 개시빈도 (개시코돈 하에)의 상대적인 양 및 '스캔-스루스(scan-through)' 빈도 (코딩 서열 하에)의 상대적인 양을 개략적으로 나타내지만, 단지 반-양적 방식 (semi-quantitative manner)으로이다. 즉, 그들은 서로에 비교된 번역 개시의 효율을 나타내나, 양적인 수들은 완전히 다를 수 있다: 그 숫자들은 발명을 설명하기 위해서만 역활을 하는 것이다. 상세한 사항은 실시예 8 참조.
도 13은 더 또는 덜 상호의존적(reciprocal interdependent) 번역 효율을 갖는, 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트의 개략도이다. 상세한 설명은 도 12에서와 같으나, 이제 dEGFP 유전자 (여기서 관심의 유전자를 예시화하는)는 선택성 마커 폴리펩티드 코딩 서열의 하류에 위치되었다. 제오신 내성 유전자는 내부 Met →Leu 돌연변이를 포함한다 (도 12B 참조). 상세는 실시예 9 참조.
도 14는 STAR 요소가 있는 그리고 없는, 본 발명에 따른 선택계의 결과이다. A. 나쁜 환경(context)에서 ATG 코돈을 갖는 제오신 내성 유전자 (도면에서 "ATGmut"로서 언급되어 있으나, 나쁜 상황에서 ATG 뒤에 스페이서 서열을 포함하여서, 여기서 일반적으로 "ATGmut/space"로 언급된다). B. GTG 개시코돈을 갖는 제오신 내성 유전자. C. TTG 개시코돈을 갖는 제오신 내성 유전자. 독립 콜로니의 d2EGFP 신호는 수직축 상에서 보여진다. 상세한 사항은 실시예 9 참조.
도 15는 규모가 커진 실험에서 본 발명에 따른 선택계의 결과 (A), 및IRES를 사용하는 선행 기술에 따른 선택계와 비교 (B). 독립 콜로니의 d2EGFP 신호는 수직 축에 나타내져 있다. 상세한 사항은 실시예 10 참조.
도 16은 선택성 마커로서 블라스티시딘을 사용하는, 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트를 갖는 선택계의 결과. A. GTG 개시코돈을 포함하도록 돌연변이된 블라스티시딘 내성 유전자. B. TTG 개시코돈을 포함하도록 돌연변이된 블라스티신딘 내성 유전자. 블라스티신딘 내성 유전자는 모든 내부 ATG 서열을 제거하기 위해 추가로 돌연변이 되었다. 독립 콜로니의 d2EGFP 신호는 수직 축에 나타내져 있다. 상세한 사항은 실시예 11 참조.
도 17은 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트를 갖는 여러개의 클론의 발현 안정성 (TTG 개시코돈을 갖는 제오신을 포함하는). 선택압(selection pressure) (100㎍/ml 제오신)은 완전 실험 중에 존재한다. 독립 콜로니의 d2FGFP 신호는 수직축에 나타내져있다. 상세한 사항은 실시예 12 참조.
도 18은 도 17에서와 같으나, 제오신 농도는 클론의 수립 후에 20㎍/ml으로 낮췄다.
도 19는 도 17에서와 같으나, 제오신은 클론 수립 후에 배양 배지로부터 존재하지 않게 되었다.
도 20은 본 발명에 따른 다중시스트론 전사 유니트를 갖는 선택계를 사용하는 항체 (항-EpCAM)의 발현. 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)는 이 실시예에서 관심의 폴리펩티드이다. 이들 각각은 별개의 전사 유니트에 존재하는데, 이 실시예 내에 단일 핵산 분자 상에 둘다 있다. HC는 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 제오신 내성 유전자에 의해 선행되고, 반면에 LC는 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 블라스 티시딘 내성 유전자에 의해 선행된다. 두 내성 유전자는 비-최적 상황에서 ATG 개시코돈을 포함하도록 돌연변이 되었다 (도면에서 "mutATG", 그러나 스페이서 서열을 포함하고, 그리고 그래서 "ATGmut/space"로서 일반적으로 언급된다). 각각의 다중시스트론 전사 유니트는 CMV 프로모터의 조절 하에 있다. 지적된 바와 같이 STAR 서열을 갖는 구조체는 STAR 서열이 없는 구조체와 비교되었다, 이들 구조체가 숙주세포로 도입된 때 얻어진 항체 수준은 수직 축 상에 다양한 독립 클론들에 대해서 pg/세포/일로서 주어진다. 상세한 사항은 실시예 13 참조.
도 21은 도 20에서와 같으나, 선택 마커 유전자는 GTG 개시코돈이 제공되어 있다. 상세한 사항은 실시예 13 참조.
도 22는 도 20에서와 같으나, 선택 마커 유전자는 TTG 개시코돈이 제공되어 있다. 상세한 사항은 실시예 13 참조.
도 23은 선택압 없이 서브-클론에서 발현 안정성 (선택 압 하에서 콜로니 수립 후에, 배지에 서브-클론된 일부 콜로니들은 제오신을 함유하지 않는다). 상세한 사항은 실시예 12 참조.
도 24는 본 발명의 하나의 구현예의 발현 수준의 복사체-수 의존성. 상세한 사항은 실시예 12 참조.
도 25는 도 12에서와 같으나, 블라스티시딘 내성 유전자에 대한 것이다. 이 유전자에서 4 내부 ATG's의 어느 것도 메티오닌 코딩 프레임 내에 존재하지 않고, 그리므로 유전 코드의 중복은 코딩된 단백질의 내부 아미노산 서열을 돌연변이 없이 이들 ATG's를 돌연변이 하기 위해 사용되었다.
도 26은 야생형 제오신 내성 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 108). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다.
도 27은 야생형 블라스티시딘 내성 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 110). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다. 서열에서 다른 ATG's는 밑줄쳐져 있다: 이들 내부 ATG's는 프레임에 있지 않기 때문에 메티오닌을 코드하지는 않는다.
도 28은 야생형 푸로마이신 내성 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 112). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다.
도 29는 야생형 마우스 DHFR 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 114). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다. 서열에서 다른 ATG's는 밑줄쳐져 있다: 이들 내부 ATG's는 프레임에 있지 않기 때문에 메티오닌을 코드하지는 않는다.
도 30은 야생형 하이그로마이신 내성 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 116). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다. 서열에서 다른 ATG's는 밑줄쳐져 있다: 이들 내부 ATG's는 프레임에 있지 않기 때문에 메티오닌을 코드하지는 않는다.
도 31은 야생형 네오마이신 내성 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 118). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다. 서열에서 다른 ATG's는 밑줄쳐져 있다: 이들 내부 ATG's는 프레임에 있지 않기 때문에 메티오닌을 코드하지는 않는다.
도 32는 야생형 인간 글루타민 합성효소 (GS) 유전자의 코딩 서열 (SEQ. ID. NO. 120). 굵은 ATG's는 메티오닌을 코드한다. 첫번째 굵은 ATG는 개시코돈이다. 서열에서 다른 ATG's는 밑줄쳐져 있다: 이들 내부 ATG's는 프레임에 있지 않기 때문에 메티오닌을 코드하지는 않는다.
도 33은 본 발명에 따른 GTG 개시코돈을 갖는 몇몇 추가 변형된 제오신 내성 선택 마커 유전자의 개략도인데, 선택 스트린전시의 추가 미세-선회 (fine-turning)을 허용한다. 상세한 사항은 실시예 14 참조.
도 34는 추가 변형된 제오신 내성 선택 마커 유전자를 함유하는 발현 시스템의 결과. 상세한 사항은 실시예 14 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들 (또한 도 33을 참조)은 수평축 상에 나타내져 있고 (구조체 이름의 끝에 7/67/7의 첨가는 프로모터 상류에 STAR 서열 7 및 67 및 전사 종결부위의 하류에 STAR7의 존재를 나타낸다), 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 35는 본 발명에 따른 TTG 개시코돈을 갖는 몇몇 추가 변형된 제오신 내성 선택 마커 유전자의 개략도인데, 선택 스트린전시의 추가 미세-선회를 허용한다. 상세한 사항은 실시예 15 참조.
도 36은 추가 변형된 제오신 내성 선택 마커 유전자를 함유하는 발현 시스템의 결과. 상세한 사항은 실시예 15 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 37은 도 12에서와 같으나, 푸로마이신 내성 유전자에 대한 것이다. 모두 3 내부 ATG's는 메티오닌은 코드하고 (패널 A), 로이신 코딩 CTG 서열에 의해 대체되어 있다 (패널 B). 상세한 사항은 실시예 16 참조.
도 38은 TTG 개시코돈을 갖고 내부 ATG 코돈이 없는 푸로마이신 내성 유전자를 함유하는 발현 구조체의 결과. 상세한 사항은 실시예 16 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 39는 도 12에서와 같으나, 네오마이신 내성 유전자에 대한 것이다. 상세한 사항은 실시예 17 참조. A. 야생형 네오마이신 내성 유전자; ATG 서열들이 나타내져 있다, 메티오닌 코딩 ATGs는 ATG 위에 Met로 나타내져 있다. B. ATG 서열들이 없는, 그리고 GTG 개시코돈을 갖는 네오마이신 내성 유전자. C. ATG 서열들이 없는 그리고 TTG 개시코돈을 갖는 네오마이신 내성 유전자.
도 40은 도 12에서와 같으나, dhfr 유전자에 대한 것이다. 상세한 사항은 실시예 18 참조. A. 야생형 dhfr 유전자; ATG 서열들이 나타내져 있다, 메티오닌 코딩 ATGs는 ATG 위에 Met로 나타내져 있다. B. ATG 서열들이 없는, 그리고 GTG 개시코돈을 갖는 dhfr 유전자. C. ATG 서열들이 없는 그리고 TTG 개시코돈을 갖는 dhfr 유전자.
도 41은 PER.C6 세포에서 본 발명에 따른 발현 구조체 (제오신 선택성 마커) 의 결과. 상세한 사항은 실시예 20 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 42는 PER.C6 세포에서 본 발명에 따른 발현 구조체 (블라스티시딘 선택성 마커)의 결과. 상세한 사항은 실시예 20 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 43은 추가로 전사 중지 (TRAP) 서열을 포함하는, 본 발명에 따른 발현 구조체의 결과. 상세한 사항은 실시예 21 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 44는 본 발명에 따른 전사 유니트를 사용하는 항체의 발현의 복사체수 의존성. 상세한 사항은 실시예 22 참조.
도 45는 본 발명에 따른 발현 구조체를 함유하는 콜로니로부터의 항체 발현, 여기서 발현 구조체의 복사체 수는 메토트렉세이트(methotrexate)에 의해 증폭된다. 상세한 사항은 실시예 23 참조. 흰색 막대: 제오신 및 블라스티시딘으로 선택; 검은 막대: 제오신, 블라스티시딘 및 메토트렉세이트 (MTX)로 선택. 시험된 콜로니 들의 수는 수평 축에 묘사되어 있다.
도 46은 다른 프로모터들을 가진 결과들이다. 상세한 사항은 실시예 24 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 47은 다른 STAR 요소들을 가진 결과들이다. 상세한 사항은 실시예 25 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다; 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
도 48은 다른 크로마틴 조절 요소들을 가진 결과들이다. 상세한 사항은 실시예 26 참조. 점들은 개개의 데이터 포인트를 나타내고; 선들은 평균 발현 수준들을 나타내고; 사용된 구조체들은 수평축 상에 나타내져 있고, 그리고 그래프 위에 개략적으로 묘사되어 있다 (검은 삼각형은 다른 시험된 크로마틴 조절 요소들을 나타낸다); 수직 축은 d2EGFP 신호를 나타낸다.
본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 설명된다. 실시예들은 어느 방법으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 그들은 단지 본 발명을 명확히 하도록 제공된다.
실시예 1-7은 다양한 배치(configuration)로 그리고 다양한 환경에서 STAR67 및 다른 STAR 서열들의 시험을 기술한다. 실시예 8 및 추가는 본 발명의 신규한 선 택계를 기술한다.
실시예 1: STAR67 벡터의 축조
신규한 항-억제자 (STAR) 서열은 WO03/004704에 기술된 바와 같이 유전적 검색을 사용하여 단리되었고, 이 신규한 서열이 주조된(coined) STAR67 이었다. 포유동물 세포주에서 트랜스유전자의 발현에의 STAR67의 효과가 시험되었다. 여기서 우리는 다양한 구조체의 축조를 기술한다.
재료 및 방법
3 플라스미드가 창조되었다 (도 1):
A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV 대조구)
B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)
C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)
구조체 A의 축조는 하기에서 기술된다. 플라스미드 pd2EGFP (Clontech 6010-1)은 pd2EGFP-링크를 산출하도록 BsiWI 부위에 링커의 삽입에 의해 변형되었다. 이 링커는 올리고뉴클레오티드 GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) 및 GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68)을 어닐링 함에 의해 만들어지고, PacI, BglII, 및 EcoRV 제한 엔도뉴클레아제의 부위들이 도입되어 있다. 이것은 STAR 요소의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위 MCSII를 창조했다. 그리고 나서 프라이머 GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG (SEQ. ID. NO. 69) 및 AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG (SEQ. ID. NO. 70)이, pIRES-stuf를 산출하기 위하여 pIRES (Clontech 6028-1)의 BglII 부위로 삽입되는, pd2EGFP로부 터의 0.37kb 영역을 증폭하기 위하여 사용되었다. 이것은 MCSI에 AscI 및 SwaI 제한 엔도뉴클레아제를 위한 부위들을 도입하였고, STAR 요소들과 인접한 프로모터들과의 사이에 유력한 개입을 피하기 위한 "스터퍼(stuffer) 단편"으로서 작용한다. pIRES-stuf는 BglII 및 FspI으로 소화되어 스터퍼 단편, CMV 프로모터, IRES 요소 (다중 클로닝 부위 MCS A 및 MCS B에 의해 플랭크된), 및 SV40 폴리아데닐화 신호로 구성된 DNA 단편을 유리시킨다. 이 단편은 BamHI 및 StuI로 소화함에 의해 생성된 pd2EGFP-링크의 벡터 백본과 결찰되어, pIRES-링크를 산출하였다.
제오신-내성 유전자의 개방 리딩 프레임은 하기와 같은 pIRES의 하류 BamHI/NotI-부위로 삽입되었다: 제오신-내성 ORF는, 플라스미드 pCMV/zeo (Invitrogen, cat.no. V50120)으로부터 유래된 프라이머 GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ. ID. NO. 71) 및 AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72)로 PCR에 의해 증폭되고, BamHI 및 NotI으로 소화되고, 그리고 BamHI/NotI-소화된 pIRES-링크와 결찰되어 pIRES-링크-zeo를 산출하였다. d2EGFP 리포터 ORF는 프라이머 GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG (SEQ. ID. NO. 73) 및 AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG (SEQ. ID. NO. 74)로 pd2EGFP (Clontech 6010-1)의 증폭, 및 pIRES-링크-zeo 플라스미드에 EcoRI 부위로 EcoRI-소화된 dEGFP 카세트의 삽입에 의해 pIRES-링크-zeo로 도입되었다. 이것은 구조체 A, CMV-d2EGFP-IRES-링크-zeo (CMV 대조구)를 생성했다.
STAR67은 AscI 부위 (STAR67과 프로모터 사이에 남아있는 약 15 nt)에, CMV 프로모터의 상류에 클론되었다. 이것은 구조체 B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-zeo (CMV-STAR67)을 생성했다.
STAR67은 또한 STAR7을 함유하는 카세트의 상황에서 시험되었고, 5' SalI 및XbaI 부위들과 3' BglII 및 PacI 부위들에 방향성으로 클론되어 STAR7을 갖는 전체 카세트를 플랭크하였다. 이것은 구조체 C (CMV-STAR67 7/7)였다.
실시예 2: STAR67 은 안정하게 트랜스팩션된 CHO 세포들에서 CMV , EF1 α 및 UB6 프로모터들로부터의 발현 수준을 향상시킨다.
우리는 CMV, EF1α 및 UB6 프로모터들에 인접한 STAR67의 존재가 CHO 세포에서 이들 프로모터들의 발현 수준에 영향을 미치는지 아닌지 시험하였다. 실시예 1에 기술된 구조체 A 및 B (도 1)은 이 목적을 위하여 사용되었고, 각각의 프로모터를 위하여 변형되었다:
1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV 대조구)
2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)
3 EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α 대조구)
4 STAR67-EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α-STAR67)
5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 대조구)
6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67)
재료 및 방법
UB6 및 EF1α 프로모터들은 도 1에 기재된 플라스미드들에서 CMV 프로모터를 위해 치환되었다. UB6 프로모터는 다음과 같이 클론되었다. pd2EGFP 플라스미드로부터의 DNA 0.37 kb 스터퍼(stuffer)가 실시예 1에 기재된 바와 같이, SEQ. ID. NOS. 69 및 70로 동정된 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 증폭되었다. 결과의 DNA 스터퍼는 pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20]의 BglII 부위에 클론되어 pUB6-stuf를 생성하였다. pUB6-stuf로부터 AscI-SacI 단편이, CMV 프로모터가 제거된, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo로 클론되었다.
EF1α 프로모터가 주형으로서 pEF1α/V5-His [Invitrogen V920-20]을 가지고, 프라이머 GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ. ID. NO. 79) 및 AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ. ID. NO. 80)을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 단편은, CMV 프로모터가 제거된, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo의 AscI 및PpuMI 부위에 클론되었다.
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은 2mM 글루타민, 10 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 HAMS-F12 배지 + 10% 소 태아 혈청 중에서 37℃/5% CO2 하에서 배양되었다. 세포들은 제조자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙트아민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 플라스미드로 트랜스팩트되었다. 간략하게는 세포들은 배양관들에 접종되었고 70-90% 컨플루언스로 밤새 배양되었다. 리포펙트아민 시약은 마이크로그람당 6마이크로리터의 비로 플라스미드 DNA와 복합되었고 (예를들면 10cm 페트리디쉬를 위해, 20 마이크로그램 DNA 및 120 마이크로리터 리포펙트아민) 세포들로 첨가되었다. 밤새 인큐베이션 후에, 트랜스펙션 혼합물은 신선한 배지로 대체되고, 트랜스펙션된 세포들은 추가로 인큐베이션 되었다. 밤새 배양 후에, 세포들은 트립신화되었고 신선한 배지를 갖는 신선한 배양관으로 접종되었다. 또 다른 하룻밤 인큐베이션 후에, 제오신은 50㎍/ml의 농도로 첨가되고 세포들은 추가로 배양되었다. 또 다른 3일 후에, 배지를 제오신 함유(100㎍/ml) 신선한 배지에 의해 대체되고 추가 배양되었다. 개개의 콜로니가 눈에 보이게 되었을때 (트랜스펙션 후 약 10일), 배지가 제거되고 제오신 없는 신선한 배지로 대체되었다. 개개의 클론은 단리되고 제오신이 없는 배지의 24-웰 플레이트로 전달되었다. 콜로니들의 단리 1일 후에, 제오신이 배지에 첨가되었다. d2EGFP 리포터 유전자의 발현은 트랜스펙션 약 3주 후에 평가되었다. 콜로니들에서 dEGFP 발현 수준은 2주의 기간 후에 측정되었다. 트랜스펙션 후 초기 2주 후에, 첫번째 d2EGFP 측정이 수행되었을때, 콜로니들은 제오신 또는 다른 항생제 없는 배지에서 배양되었다. 이것은 실험의 나머지를 위해 계속되었다.
결과
도 2는 CMV 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, CMV 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 CHO 콜로니를 초래했다. CMV 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 25일 후에 측정되었을때, 34였다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 13으로 감소되었는데, 이것은 발현이 시간을 초과하여 안정되지 않았다는 것을 가르킨다. 반면에, STAR67-CMV 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호 의 평균은 트랜스펙션 25일 후에 측정시에 42, 60일 후에 측정시에 32였다. 그리하여 트랜스펙션 60일 후에, STAR67-포함 CMV 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 CMV 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 2.5배 더 높게 전달하였다. 중요하게, 트랜스펙션 25일 후에, 첫번째 측정 후에, 선택압은 제오신 없이 배지 중에 콜로니를 배양함에 의해 제거되었다. 그리하여 STAR67 구조체를 함유하는 콜로니들은 STAR67 구조체를 함유하지 않는 콜로니들 보다 선택 압의 부재하에서 시간을 초과하여 더 안정하였다.
도 3은 EF1α- 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, EF1α 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 CHO 콜로니를 초래했다는 것을 보여준다. EF1α 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 25일 후에 측정되었을때, 31이었다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 26이었다. 반면에, EF1α-STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 25일 후에 측정시에 60, 60일 후에 측정시에 76이었다. 그리하여 트랜스펙션 25일과 60일후 둘다에, STAR67-포함 EF1α 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 2.5배 더 높은 CMV EF1α 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 전달하였다.
도 4는 UB6 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, UB6 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 CHO 콜로니를 초래했다. UB6 대조구 플라스미드 로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 25일 후에 측정되었을때, 51이었다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 29로 감소되었는데, 이것은 발현이 시간을 초과하여 안정되지 않았다는 것을 가르킨다. 반면에, UB6-STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 25일 후에 측정시에 218, 60일 후에 측정시에 224였다. 그리하여 트랜스펙션 25일 후에, STAR67-포함 UB6 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 2.5배 더 높은 UB6 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 전달하였다. 중요하게, 트랜스펙션 25일 후에, 첫번째 측정 후에, 선택압은 제오신 없이 배지 중에 콜로니를 배양함에 의해 제거되었다. 그리하여 STAR67 구조체를 함유하는 콜로니들은 STAR67 구조체를 함유하지 않는 콜로니들 보다 선택압의 부재하에서 시간을 초과하여 더 안정하였다.
결론적으로, STAR67은 3가지 다른, 비-관련된 프로모터들로부터의 발현을 증가시켰다.
실시예 3: STAR67 은 안정하게 트랜스팩션된 PER. C6 세포들에서 CMV , EF1 α 및 UB6 프로모터들로부터 발현 수준을 향상시킨다.
우리는 CMV, EF1α 및 UB6 프로모터들에 인접한 STAR67의 존재가 CHO 세포 이외의 다른 세포 타입 즉, 인간 PER.C6 세포들에서 이들 프로모터들의 발현 수준에 영향을 미치는지 아닌지 시험하였다. 실시예 1에서와 동일한 구조체들이 사용되었다.
재료 및 방법
PER. C6 세포들의 트랜스펙션 , 배양 및 분석
PER.C6
Figure 112007033851337-PCT00001
세포들은 8.9mM MgCl2, 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지 + 피리독신 + 9% 소 태아 혈청 (비-열 불활성화된) 중에서 37℃/10% CO2 하에서 배양되었다. 세포들은 제조자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙트아민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 플라스미드로 트랜스팩트되었다. 간략하게는 세포들은 6-웰에 접종되었고 70-90% 컨플루언스로 밤새 배양되었다. 리포펙트아민 시약은 3 마이크로그람당 15 마이크로리터의 비로 플라스미드 DNA와 복합되었고 (예를들면 10cm 페트리디쉬를 위해, 20 마이크로그램 DNA 및 120 마이크로리터 리포펙트아민) 그리고 25℃에서 30분 인큐베이션 후에 세포들로 첨가되었다. 6시간 인큐베이션 후에, 트랜스펙션된 혼합물은 신선한 배지로 대체되고, 트랜스펙션된 세포들은 추가로 인큐베이션 되었다. 밤새 배양 후에, 세포들은 트립신화되었고 100㎍/ml의 농도로 첨가된 제오신을 갖는 신선한 배지를 갖는 신선한 페트리 디쉬 (90mm)으로 접종 (1:15, 1:30, 1:60, 1:120 희석)되었고, 세포들은 추가로 배양되었다. 콜로니가 눈에 보이게 되었을때, 개개의 콜로니는 긁어서 단리되고 제오신이 없는 배지의 24-웰 플레이트로 전달되었다. ~70% 컨플루언스로 자랐을때, 세포들을 6-웰 플레이트로 이송시켰다. d2EGFP 신호가 XL-MCL Beckman Coulter Flowcytometer 상에서 결정되기 전에, 6-웰 플레이트에서 2 주 동안 안정한 콜로니들은 팽창되었다. d2EGFP 신호의 평균은 dEGFP 발현 수준을 위한 측정으로서 취해 졌다. 콜로니들은 2 주 후에 두번째를 위해 측정되었다. 그리고 나서 콜로니들은 제오신 없이 추가로 배양되었다.
결과
도 5는 CMV 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, CMV 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 PER.C6 콜로니를 초래했다. CMV 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 30일 후에 측정되었을때, 37이었다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 14로 감소되었는데, 이것은 발현이 시간을 초과하여 안정되지 않았다는 것을 가르킨다. 반면에, STAR67-CMV 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 30일 후에 측정시에 101, 60일 후에 측정시에 45였다. 그리하여 트랜스펙션 60일 후에, STAR67-포함 CMV 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 2.5배 더 높은 CMV 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 전달하였다.
도 6은 EF1α- 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, EF1α 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 PER.C6 콜로니를 초래했다. EF1α 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 30일 후에 측정되었을때, 5이었다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 6이었다. 반면에, EF1α-STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로 니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 30일 후에 측정시에 25, 60일 후에 측정시에 20이었다. 그리하여 트랜스펙션 30일과 60일후 둘 다에, STAR67-포함 EF1α 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 4배 더 높은 EF1α 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 전달하였다.
도 7은 UB6 프로모터의 상류에 클론된 STAR67을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 없는 "빈(empty)" 대조구, UB6 대조구에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 많은 PER.C6 콜로니를 초래했다. UB6 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 30일 후에 측정되었을때, 4이었다. 트랜스펙션 60일 후에, 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 2이었다. 반면에, UB6-STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 30일 후에 측정시에 27, 60일 후에 측정시에 18이었다. 그리하여 트랜스펙션 30일과 60일후 둘 다에, STAR67-포함 UB6 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 클론들에서 7 ~ 9배 높은 UB6 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 전달하였다.
그리하여 프로모터의 상류에 STAR67을 위치시키는 것은 STAR67-부족 구조체와 비교시에, 또한 PER.C6 세포에서 상당히 더 높은 단백질 발현 수준을 초래했다. 그리하여 STAR67은 다른, 비관련된 세포 타입들에서 기능한다.
실시예 4: CHO 세포들에서 SV40 프로모터를 향상시키기 위해서 다른 STAR 요소들과 결합된 STAR67 의 신규한 배치.
우리는 SV40 프로모터에 인접한 STAR67의 존재는, 이 실시예 STAR7에서, 이 프로모터의 발현 수준에, 홀로 또는 다른 STAR 요소와 조합하여, 영향을 미치는지 아닌지 시험하였다. 이 목적을 위하여 사용된 구조체 (도 8 참조)는 다음과 같다:
1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40 대조구)
2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)
3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)
4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)
재료 및 방법
pIRES를 주형으로 해서 프라이머 TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACC TCTGAAAGAGG (SEQ. ID. NO. 81) 및 TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAA AAAGCCTCCTC (SEQ. ID. NO. 82)을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 단편은, CMV 프로모터가 제거된, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo의 AscI 및 SacI 부위에 클론되었다.
실시예 2에서와 같이 CHO 세포들은 트랜스펙션되고, 콜로니들이 단리되고 증식되고 분석되었다.
결과
도 8은 SV40 프로모터의 상류에 클론된 STAR67 (SV40-STAR67) 또는 전체 구조체를 플랭크하도록 클론된 STAR7 (SV40-STAR 7/7)을 함유하는 구조체의 트랜스펙션은, STARs 없는 "빈(empty)" 대조구 (SV40 대조구)에 비교할때, d2EGFP 단백질의 상당히 고 수준으로 발현하는 CHO 콜로니들을 초래하지 않았다. SV40 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은, 트랜스펙션 40일 후 에 측정되었을때, 86이었다. 반면에, SV40-STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 40일 후에 측정시에 82였고, SV40-STAR 7/7 플라스미드로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 신호의 평균은 트랜스펙션 40일 후에 측정시에 91이었다. 그리하여, CHO 세포에서 SV40 프로모터 상의 이들 STAR 요소들의 상당한 효과는 관찰되지 않았다.
이들 세포들에서 SV40 프로모터로부터의 발현 수준은 이미 꽤 높고, 매우 강한 프로모터로 생각되었던, CMV 프로모터에서 관찰된 것들 보다 훨씬 더 높은 것으로 보인다. CHO 세포에서 SV40 프로모터를 사용하는 STAR 요소의 부재하에 이 높은 백그라운드 발현은 STAR67 홀로, 또는 트랜스유전자를 플랭크하는 STAR7이 왜 상당한 효과를 보이지 않았는지를 설명할 것이다.
그러나 SV40-STAR67 7/7로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 dEGFP 신호의 평균은 40일후 콜로니들을 측정하였을때 209였는데, 이것은 18 콜로니의 평균 (86) 보다 2.4배 더 높은 것이다. 따라서, STAR67 요소가 다른 STAR 요소와 조합하여 사용될때, 이것은 상당히 더 높은 d2EGFP 발현 수준을 보이는 많은 안정하게 트랜스펙션된 CHO 콜로니들을 초래한다.
그러므로 이 신규한 배치 (5'-STAR 서열 A - STAR 서열 C - 프로모터 - 관심의 단백질을 코드화하는 핵산 - STAR 서열 B -3', 여기서 이 실시예에서 STAR 서열 A 및 B는 STAR7이고 STAR 서열 C는 STAR67이다), STAR 요소들은 지금까지 개시된 배치들에서 훨씬 더 좋은 기능을 하는 것으로 보인다.
우리는 플랭킹 STAR7 요소들이 플랭킹 STAR6 요소들에 의해 또는 플랭킹 STAR4 요소들에 의해 대체되고, SV40 프로모터의 상류에 STAR 67과 조합하여 (각각SV40 - STAR67 6/6 및 SV40-STAR67 4/4, 상기와 같이 동일한 명명을 사용하여) 실험을 행했고, 이들 조합으로 또한 발현이 향상된다는 것을 관찰했다. 이것은 플랭킹 STAR7 요소들은 다른 STAR 서열들로 정말로 치환될 수 있고, STAR 서열을 가진 발현 카세트의 신규한 배치의 향상은 여전히 관찰된다는 것을 증명한다.
실시예 5: STAR67 과 STAR7 의 조합은 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포들에서 UB6-구동된 항체 발현 수준을 증진시킨다.
실시예 4에서, 우리는 STAR67과 STAR7의 조합은 CHO 세포에서 d2EGFP 단백질의 발현 수준을 향상시켰다는 것을 보였다. 여기서 우리는 STAR67과 STAR7의 조합이 항체의 생산을 위해 사용될 수 있는지를 시험하였다. 우리는 시험 단백질로서 EpCAM 분자에 대한 항체 (Huls et al, 1999)을 선택하였고 UB6 프로모터를 사용하였다.
재료 및 방법
플라스미드
중쇄 cDNA (HC-EpCAM)을 UB6 프로모터를 포함하는 구조체에 클론하였다. HC-EpCAM은 IRES 서열에 의해 제오신 내성 유전자에 커플되었다. 경쇄 cDNA (LC-EpCAM)은 또한 UB6 프로모터를 포함하는 구조체에 클론되었다. LC-EpCAM은 IRES 서열에 의해 푸로마이신 내성 유전자에 커플되었다. 이들 두 플라스미드는 함께 UB6 (HC+LC) 대조구를 나타낸다 (도 9).
STAR67 및 STAR7의 효과를 시험하기 위해서, STAR67은 UB6 프로모터의 상류에, HC+LC 구조체 둘 다에 클론되었다. STAR7은 전체 카세트를 5' 및 3' 말단 둘다에사 플랭크하도록 클론되었다 (도 9). 이들 두 플라스미드는 STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7을 나타낸다.
CHO 세포의 트랜스펙션과 배양
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은, 선택을 위하여 제오신 (100 ㎍/ml) 및 푸로마이신 (2.5 ㎍/ml)을 사용하여 실시예 2에서와 같이 트랜스펙션되고 배양되었다. 트랜스펙션 1일 후, 제오신은 배양배지에 첨가되었다. 첫번째 콜로니들이 눈에 보이게 되었을때 (제오신 첨가후 약 7일), 배양배지가 제거되고 푸로마이신을 함유하는 배양배지로 대체되었다. 약 7일 후에, 콜로니들은 단리되었고 제오신 만을 함유하는 배양배지의 24 웰 플레이트로 이송되었다.
결과
도 9는 UB6 프로모터 상류에 클론된 STAR67 및 전체 카세트를 플랭크하도록 클론된 두 STAR7 요소들을 함유하는 항체 구조체의 트랜스펙션은, STAR67 및 STAR7 없는 "빈(empty)" 대조구, UB6 (HC+LC) 대조구에 비교할때, EpCAM 항체 (항-인간 IgG 항체를 사용하는 ELISA에 의해 측정된)의 훨씬 더 높은 수준으로 발현하는 많은 CHO 콜로니를 초래했다. UB6 (HC+LC) 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 EpCAM 생성의 평균은, 트랜스펙션 25일 후에 측정되었을때, 2.7pg/세포/일 이었다. 선택제 제오신 및 푸로마이신은 25일 후에 제거되었다. 트랜스펙션 45일 후에, 이들 18 콜로니에서 EpCAM 생성 신호의 평균은 2.7pg/세포/일 이었다. 반 면에, STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 플라스미드로 트랜스펙션된 18 콜로니에서 EpCAM 생성 신호의 평균은 트랜스펙션 25일 후에 측정시에 6.7, 45일 후에 측정시에 7.7pg/세포/일이었다. 그리하여 트랜스펙션 30일 및 45일후 둘 다에, STAR67/STAR7-함유 UB6 구조체는, 안정하게 트랜스펙션된 CHO 클론들에서 2.5 ~ 2.9배 더 높은 UB6 프로모터 구동된 EpCAM 발현 수준을 전달하였다.
그리하여 프로모터의 상류에 STAR67과 카세트를 플랭크하도록 두 STAR7 요소들을 위치시키는 것은, STAR67/STAR7-부족 구조체와 비교하여, CHO에서 상당히 더 높은 EpCAM 항체 발현 수준을 초래했다.
실시예 6: STAR67 은 인핸서 차단자가 아니나, 반면에 STAR6 및 STAR7 은 차단자이 다.
STAR6 및 STAR7을 포함하여, 그 성질에 대해 시험된 모든 이제까지 알려진 STAR 요소들은 인핸서 차단자이다 (WO 03/004704, Kwarks et al, 2003). 인핸서 차잔자 활성은 강한 인핸서와 프로모터 사이에 STAR 요소를 위치시킴에 의해 시험된다. 여기서 우리는 또한 STAR67이 인핸서 차단자인가를 시험하였다.
재료 및 방법
d2EGFP 유전자가 프라이머 TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC (SEQ. ID. NO. 75) 및 ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGCAGAAGCAC (SEQ. ID. NO. 76)을 사용하여 PCR-증폭되었고 NcoI 및 XbaI 제한부위를 사용하여 루시페라제 유전자를 대체하도록 플라스미드 pGL3-프로모터 (Promega)로 클론되어 플라스미드 pGL3-프로모터-GFP를 창조하였다. 올리고 CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ. ID. NO. 77) 및 GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT (SEQ. ID. NO. 78)을 어닐링 함에 의해 만들어진 링커는, SacI 및 BglII 부위들에 클론되어 다중 클로닝 부위를 만들었다. 원래의 BglII 부위는 링커 DNA의 결찰 시에 파괴되었고, 링커 DNA 내에 새로운 유일한 BglII 부위를 창조하였다. SV40-인핸서는 BsaBI 및 BamHI을 사용하여 플라스미드 pGL3-basic (Promega)로부터 삭제되었고, EcoRV 및 BglII 부위들을 사용하여 pGL3-링커-프로모터-GFP로 클론되어 플라스미드 pGL3-인핸서-프로모터-GFP를 창조했다. STAR40 요소는 상류 서열 상의 인핸서의 작용을 막기 위하여 KpnI 및 SacI 부위들을 사용하여 SV40 인핸서의 상류에 위치되었다. 마지막으로 STAR 요소들 6, 7 및 67은 SpeI 및 AscI 제한 부위들을 사용하여 SV40 인핸서와 SV40 최소 프로모터 사이에 위치되었다.
CHO 세포들의 트랜스펙션 및 배양
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은 실시예 2에서와 같이 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 1일 후, d2EGFP 수준은 Epics XL 플로우사이토메터 (Beckman Coulter)로 측정되었다.
결과
도 10은 STAR67은 인핸서 차단자가 아니나 반면에 STAR6 및 STAR7은 동일 분석에서 인핸서 차단자로 작용한다는 것을 보여준다. STAR6, STAR7 및 STAR67은 d2EGFP 유전자의 상류에 SV40 인핸서와 최소 SV40-프로모터 사이에 클론되었다. STAR 요소가 인핸서와 프로모터 사이에 클론되지 않았을때, 강한 전사성 활성이 일어났다 (임의로 100%로 설정). STAR6 및 STAR7이 인핸서와 프로모터 사이에 위치되었을때, 전사는 백그라운드 수준을 떨어졌고, 이것은 STAR6 및 STAR7이 유력한 인핸서 차단자 라는 것을 나타낸다. 반대로, STAR67이 인핸서와 프로모터 사이에 클론되었을때, 상대적 전사 수준은 여전히 대조구의 80%였는데 이것은 다른 STAR 요소들 뿐만아니라, 이미 기술된 바와 같이 (WO 03/004704, Kwarks et al, 2003), STAR67이 좋은 인핸서 차단자가 아니고, 이것은 STAR6 및 STAR7과 반대라는 것을 나타낸다.
실시예 7: STAR67 은 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포들에서 UB6 및 CMV -구동된 항체 발현 수준을 향상시킨다.
실시예 5에서, 우리는 STAR67과 STAR7의 조합은 중쇄와 경쇄를 함유한 두 다른 플라스미드에 관하여, CHO 세포에서 EpCAM 항체의 발현 수준을 향상시켰다는 것을 보였다. 이 실시예에서 우리는 STAR67이, 경쇄와 중쇄 둘 다가 하나의 플라스미드에 위치될때, EpCAM 항체의 생산을 위해 사용될 수 있는지를 시험하였다. 우리는 각각의 선택성 마커를 위한 동시 선택을 사용하였다.
재료 및 방법
플라스미드
중쇄 cDNA (HC-EpCAM)는 UB6 프로모터의 조절하에 있고, IRES 서열에 의해 제오신 내성 유전자에 커플되었다. 경쇄 cDNA (LC-EpCAM)은 CMV 프로모터의 조절하 에 있고, IRES 서열에 의해 푸로마이신 내성 유전자에 커플되었다. 기본적으로 이들은 실시예 5에서 사용된 구조체들이다. 이들 두 발현 카세트는, 두 발현 유니트의 전사가 반대 방향을 갖는 방식으로, 하나의 플라스미드에 위치되었다. 대조구 플라스미드에서, UB6 및 CMV 프로모터가 500bp (EpCAM 대조구)의 스터퍼에 의해 분리되었다 (도 10). 다른 플라스미드에서 STAR67은 UB6와 CMV 프로모터 사이에 위치되었다 (EpCAM STAR67) (도 10).
CHO 세포의 트랜스펙션과 배양
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은, 선택을 위하여 제오신 (100 ㎍/ml) 및 푸로마이신 (2.5 ㎍/ml)을 사용하여 실시예 2에서와 같이 트랜스펙션되고 배양되었다. 실시예 5에서 두 선택 마커들을 위한 연속적인 선택이 사용되었다. 반대로 여기에 선택제 둘 다 동시에 배양배지에 존재하였다. 트랜스펙션 1일 후, 제오신 및 푸로마이신은 배양배지에 첨가되었다. 선택 배지는 콜로니들이 단리될때 까지 존재하였다 (트랜스펙션 후 약 14일), 콜로니들은 단리되고 24-웰 플레이트로 이송된 후에, 세포들은 제오신 및 푸로마이신의 존재하에서 배양되었다.
결과
도 11은 UB6 및 CMV 프로모터 사이에 클론된 STAR67을 함유하는 항체 구조체의 트랜스펙션은, EpCAM 항체 (항-인간 IgG 항체를 사용하는 ELISA에 의해 측정된)를 발현하는 많은 CHO 콜로니를 초래했다. EpCAM STAR67 플라스미드로 트랜스펙션된 19 콜로니에서 EpCAM 생성의 평균은, 트랜스펙션 25일 후에 측정되었을때, 9.8pg/세포/일 이었다.
반면에, 놀랍게도 EpCAM 대조구 플라스미드로 트랜스펙션된 콜로니는 살아남지 않았다. 선택이 제오신 또는 푸로마이신 단독으로 수행되었을때, EpCAM 대조구 콜로니들은 살았다. 그러나 선택 압이 중쇄 및 경쇄 둘다 상에 선택 압을 위치시킴에 의해 증가되었을때, 이들 조건들은 단지 트랜스펙션된 플라스미드에 존재하는 STAR67을 갖는 콜로니만을 살아남게 하였다.
결과들은 또한 STAR67의 병입은 하나의 STAR67 요소의 상류 및 하류에 위치된, UB6 및 CMV 프로모터인 두 프로모터들에 이로운 효과를 가진다는 것을 보여준다. 이것은 STAR67은 이-방향성 방식으로 조작(operate)할 수 있다는 것을 가르킨다.
EpCAM 대조구와 EpCAM STAR67 플라스미드 사이의 차이는, EpCAM STAR67의 트랜스펙션 만이, 선택압이 높을때, 콜로니의 수립을 가져온다는 의미로, 검고-흰 것이다. 이것은 이 효과를 중재할 수 있는 STAR67 내의 영력을 동정하기 위하여 이플라스미드 배치를 사용할 기회를 개방한다. 더 작은, 중복되는 STAR67의 부분이 EpCAM 분자를 구동하는 UB6와 CMV 프로모터 사이에 위치된다. STAR67 부분이 기능성일때, 콜로니들은 제오신과 푸로마이신 둘 다가 동시에 선택제로 사용될때 생존할 것이다. STAR67 부분이 기능성이지 않을때, 동일한 선택 조건 하에서 생존하는 콜로니는 없을 것이다.
그리하여 프로모터의 상류에 STAR67를 위치시키는 것은, STAR67-부족 구조체와 비교하여, CHO에서 상당히 더 높은 EpCAM 항체 발현 수준을 초래했다.
실시예 8: 내부 메티오닌이 없는 제오신 내성 유전자 생성물의 구성 및 시험
신규한 선택계의 개발의 뒤에 있는 기본적 생각은 관심의 유전자의 상류에 내성 유전자를 코드화하는 유전자를 위치시키는 것이고, 하나의 프로모터가 이 2시스트론성 mRNA의 발현을 구동하는 것이다. 2시스트론성 mRNA의 번역은 단지 번역의 작은 백분률로, 내성 유전자가 단백질로 번역될 것이고, 대부분의 시간에 관심의 하류 유전자가 단백질로 번역될 것이다. 그리하여 상류 내성 유전자의 번역 효율은 관심의 하류 유전자의 번역 효율에 비하여, 심하게 방해됨이 틀림없다. 이것을 달성하기 위하여, 3 단계가 본 발명에 따라서 취해질 수 있다:
1) mRNA 상의 내성 유전자 내에, 검색 리보솜은 바람직하게는 또 다른 하나의 AUG를 만나면 안된다, 왜냐하면 하류의 AUG는 번역코돈으로 역할하여 두번째, 관심의 하류 유전자의 낮은 번역 효율을 초래할 수 있기 때문이다. 그리하여, 바람직하게는 내성 유전자 mRNA에 모든 AUG는 치환되어야만 할 것이다, 이 AUG가 메티오닌을 코드화하는 기능성 코돈일 경우, 이 아미노산은 다른 아미노산에 의해, 예를들면 로이신에 의해 치환되어야만 할 것이다 (도 12A 및 B).
2) 내성 유전자의 개시 코돈은 나쁜 상황(context) (비-최적 번역 개시 서열의 일부)를 가져야만 한다; 즉, 리보솜은 제한된 수의 경우(events)로만 이 개시 코돈에서 번역을 개시해야만 하고, 그리하여 많은 경우가 더 좋은, 더 최적의 개시 코돈을 위해 검색을 계속한다 (도 12C-E). 3가지 다른 스트린전시가 구별될 수 있다: a) 통상의 ATG 개시코돈, 그러나 나쁜 상황에 놓인 (TTTATGT)(ATGmut로 불림) (도 12C), b) 바람직하게는 최적 상황에 놓였을 때, GTG는 개시코돈으로서 역할을 할 수 있고 (ACCGTGG) (도 12D), 그리고 c) 바람직하게는 최적 상황에 놓였을때, TTG는 개시코돈으로서 역할을 할 수 있다 (ACCTTGG) (도12E). 가장 스트린전트 번역 조건은 TTG 코돈이고, GTG 코돈이 뒤따른다 (도 12). 개시 코돈으로서 TTG를 갖는 Zed mRNA는 최소 제오신 내성 단백질을 생성할 것으로 기대되고, 그리하여 가장 낮은 기능성 제오신 내성을 세포들에 전달할 것이다 (도 12, 13).
3) 바람직하게는, 관심의 하류 유전자의 통상의 개시 코돈 (ATG)은 최적 번역 상황 (예를들면 ACCATGG)를 가져야만 한다 (도 13A-D). 이것은, 단계 1 및 2가 취해진 후에, 대부분의 경우에 관심의 유전자의 개시코돈이 2시스트론성 mRNA의 개시 코돈으로서 작용할 것임을 보증한다.
실시예 8에서, 단계 1이 수행되고, 즉, 제오신 내성 유전자에서 하나의 존재하는 내부 메티오닌은 또 다른 하나의 아미노산에 의해 치환된다 (도 12B-E). 그러한 치환 후에, Zeo 단백질은 여전히 트랜스펙션된 세포로 제오신 내성을 부여한다는 것이 중요하다. 아미노산이 이 기준(criterium)을 충족할 것이라고는 이전에 알려져 있지 않았기 때문에, 3개의 다른 아미노산이 시도되었다: 로이신, 트레오닌 및 발린. 다른 아미노산들을 가진 다른 구조체들은 트랜스펙션된 세포에 제오신 내성을 여전히 부여하는 그들의 능력에 대해서 시험되었다.
재료 및 방법
플라스미드의 구성
원래의 Zeo 개방 리딩 프레임은 개시코돈 주위에 하기 서열을 가진다: AA ACC ATG G CC(굵은 글씨 개시코돈; SEQ. ID. NO. 83). 이것은 최적 번역 상황의 개 시코돈이다 (도 12A). 먼저 Zeo 개방 리딩 프레임의 개시 코돈의 최적 상황은, 프프라이머 쌍, ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84): GATCTCGCGATACAGGA TTT ATG T TGGCC AAGTTGACCAGTGCCGTTCCG 및 ZEO-WTreverse (WT=야생형; SEQ. ID. NO. 85): AGGCGAATTCAGTCCTGCTCCTCGGC을 가지고, 주형으로서 pCMV-ZEO (Invitrogen; V50120)을 사용하여, 플라스미드 pCMV-zeo [Invitrogen V50120]으로부터 증폭을 통하여 변화되었다. 증폭된 생성물은 NruI-EcoRI으로 절단되고 pcDNA3으로 결찰되어 pZEOATGmut를 생성하였다.
원래의 Zeo 개방 리딩 프레임은 프레임에 아미노산 위치 94 (124로부터)의 메티오닌을 코드화하는 ATG를 함유한다. 위치 94에서 메티오닌을 코드화하는 내부 ATG는, 각각 메티오닌이 로이신, 트레오닌 또는 발린으로 치환되는 방식으로 변화되었다:
1) Zeo 개방 리딩 프레임에서 메티오닌을 위한 내부 코돈을 로이신으로 치환하기 위하여 (도 12B), Zeo 개방 리딩 프레임의 일부가 프라이머 쌍, ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) 및 ZEO-LEUreverse (SEQ. ID. NO. 86): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGT CAA GGCCGGC을 사용하여 증폭되었다. PCR 생성물은 BamHI-BglI로 절단되었고 pZEOATGmut로 결찰되었다. 이것은 pZEO(leu)을 초래했다. Zeo 개방 리딩 프레임에서 메티오닌을 위한 내부 코돈을 트레오닌으로 치환하기 위하여 (도시되지 않았으나, 도 12B에서와 같이), Zeo 개방 리딩 프레임의 일부가 프라이머 쌍, ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) 및 ZEO-THRreverse (SEQ. ID. NO. 87): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGT GGT GGCCGGC을 사용하여 증폭되었다. PCR 생성물은 BamHI-BglI로 절단되었고 pZEOATGmut로 결찰되었다. 이것은 pZEO(thr)을 초래했다. Zeo 개방 리딩 프레임에서 메티오닌을 위한 내부 코돈을 발린으로 치환하기 위하여 (도시되지 않았으나, 도 12B에서와 같이)(GTG), Zeo 개방 리딩 프레임의 일부가 프라이머 쌍, ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) 및 ZEO-VALreverse (SEQ. ID. NO. 88): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTC CAC GCCGG을 사용하여 증폭되었다. PCR 생성물은 BamHI-BglI로 절단되었고 pZEOATGmut로 결찰되었다. 이것은 pZEO(val)을 초래했다.
세포의 트랜스펙션 및 배양
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 HAMS-F12 배지 + 10% 소 태아 혈청 중에서 37℃/5% CO2 하에서 배양되었다. 세포들은 제조자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙트아민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 플라스미드로 트랜스팩트되었다. 간략하게는 세포들은 배양관들에 접종되었고 70-90% 컨플루언스로 밤새 배양되었다. 리포펙트아민 시약은 마이크로그람당 6마이크로리터의 비로 플라스미드 DNA와 복합되었고 (예를들면 10cm 페트리디쉬를 위해, 20 마이크로그램 DNA 및 120 마이크로리터 리포펙트아민) 세포들로 첨가되었다. 밤새 인큐베이션 후에, 트랜스펙션 혼합물은 신선한 배지로 대체되고, 트랜스펙션된 세포들은 추가로 인큐베이션 되었다. 밤새 배양 후에, 세포들은 트립신화되었고 제오신 (100㎍/ml)를 함유하는 신선한 배지를 갖는 신선한 배양관으로 접종되었다. 개개의 콜로니가 눈에 보이게 되었 을때 (트랜스펙션 후 약 10일), 콜로니들의 수를 셌다.
결과
4개의 플라스미드가 CHO-K1 세포들로 트랜스펙션되었다, 1) pZEO(WT), 2) pZEO(leu), 3) pZEO(thr), 및 4) pZEO(val). 세포들은 100㎍/ml 제오신에서 선택되었다. pZEO(leu)의 트랜스펙션은 대조구 pZEO(WT)와 비교시에 동일한 수의 제오신 내성 콜로니를 초래했다. pZEO(thr) 및 pZEO(val)은 더 적은 콜로니를 주었으나, 그 차이는 거의 같은 정도 (in the order of a magnitude)는 아니었다. 그리하여 내부 메티오닌의 로이신, 트레오닌 또는 발린으로의 치환은 모두 트랜스펙션된 세포로 제오신 내성을 여전히 부여할 수 있는 제오신 내성 단백질을 초래한다고 결론지워졌다. 오히려 임의로, pZEO(leu)이 Zeo 개방 리딩 프레임에서 다른 개시코돈을 만들어 내기 위하여 개시점으로서 선택되었다. 그리하여 하기 실시예들에서 내부 메티오닌 뿐만아니라 개시 메티오닌은 제오신을 위하여 또한 다른 선택성 마커 유전자들을 위하여, 로이신으로 항상 치환되고, 이것은 추가 실시예들로부터 분명해질 것이다.
실시예 9: 다른 번역 효율로 제오신- d2EGFP 2시스트론성 구조체의 생성 및 시험
더 낮은 번역 효율을 갖는 돌연변이된 제오신 내성 mRNA 및 관심의 하류 유전자로서 dEGFP 유전자를 포함하는 2시스트론성 mRNA를 생성하기 위하여, d2EGFP 유전자의 개시 코돈이 첫번째로 최적화되었다 (실시예 8에서 단계 3). 그 후에, 제 오신 내성 유전자의 다른 버전들이 생성되었다. 이들 버전 사이의 차이는 그것들이 별개의 번역 효율을 가진 다른 개시 코돈을 갖는 것이다 (실시예 9에서 단계 2, 도 12C-E). 이들 다른 제오신 내성 유전자 버전들은 변형된 d2EGFP 유전자의 상류에 클론되었다 (도 13).
재료 및 방법
플라스미드의 생성
d2EGFP 리포터 ORF가 pcDNA3으로 도입되었다. 이 d2EGFP cDNA의 개시코돈 주위의 서열은 GAA TTC ATG G G (굵은 글씨로 개시코돈; SEQ. ID. NO. 89)인데, 최적은 아니다. 첫번째 단계로, d2EGFP는 프라어머, d2EGFPforwardBamHI (SEQ. ID. NO. 90): GATCGGATCCTATGAGGAATTCGCCACC ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG 및 d2EGFPreverseNotI (SEQ. ID. NO. 91): AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACACATTGATCCTAGCAGAAG을 가지고 pd2EGFP (Clontech 6010-1)로부터 증폭되었다. 이 생성물은 이제 최적번역 상황 (ACC ATG G)을 갖는 개시코돈을 함유한다. 이 생성된 pd2EGFP 및 연이어 Zeo 개방 리딩 프레임은 pd2EGFP로 결찰되어 pZEO-d2EGFP를 초래했다. 여기서 관심의 유전자 (여기서: 모델 유전자로서 EGFP)의 번역 개시 서열의 최적화는 필수적이지는 않으나 여전히 추가의 관심의 유전자에 대한 번역 개시 빈도를 왜곡(skew)하기 위해서는 바람직하다.
이제 3 클래스의 구조체가 만들어졌다:
1)최적 ATG (도 13A) 대신에, Zeo 내성 유전자에 개시코돈으로서 ATG, 그러나 나쁜 상황 ( TTT ATG T )(도시되지는 않았으나, 도 13B에서와 같이)에서, 그리고 스 페이서 서열에 의해 뒤따름.
스페이서 서열은 ATG 서열의 하류에 위치된다. 제오신에서 (그리고 가능하게는 블라스티시딘에서) RNA, 2차 구조가 존재하여, 리보솜이 일시적으로 지연되게 한다. 이 때문에, 빈약한(poor) 개시코돈은, 나쁜 개시코돈이거나 또는 번역 개시의 비-최적 상황에 있음에도 불구하고, 리보솜에 의해 일부 경우에서는 사용될 수 있다. 이것은 번역의 기회를 증가시키고, 그러므로 본 발명의 경우에 선택의 스트린전시를 더 낮게 해준다. 이 효과를 줄이기 위해서, 그리고 그리하여 번역 개시 효율을 추가로 감소시키기 위해, 2차 구조를 함유하지 않는 스페이서 서열이 도입된다 (Kozak, 1990). 그리하여 용어 "space"가 도입되고, 플라스미드에서 사용되고 프라이머는 그러한 스페이서 서열의 존재를 나타내도록 이름짓는다. 스페이서는 개시 코돈의 이웃으로부터 "리보솜 지연 서열"을 제거하고, 이에 의해 리보솜이 낮은 빈도로 번역을 개시하게 하고, 그리하여 본 발명에 따른 선택의 스트린전시를 증가시키게 한다. 스페이서는 코딩 서열에서 몇몇 여분의 아미노산을 도입한다. 이것은 제오신 및 블라스티시딘 둘 다의 몇몇 경우에서 행해졌고 또한 실시예들로부터 분명할 것이다. 다음에서 플라스미드와 프라이머의 명명은 일반적으로 이들 방침을 따른다: 선택성 마커 폴리펩티드의 이름은 약자로 언급된다 (예를들면, Zeo, Blas, 등); 개시코돈이 언급된다 (예를들면, ATG, GTG, TTG); 이 개시코돈이 번역 개시를 위한 비-최적 상황에 위치될 때, 추가 "mut"가 사용된다 (이것은 통상적으로 ATG 개시코돈을 위해서만 행해졌는데, 비-최적 상황과 비-ATG 개시코돈의 결합은 통상적으로 선택을 허용하도록, 충분한 번역 개시를 초래하지 않기 때문이다); 스페이 서 서열이 개시코돈 뒤에 사용될 때, 추가 "space"가 사용된다 (이것은 Zeo 또는 Blas 선택성 마커를 위한 "ATGmut" 개시코돈을 위해 통상적으로 행해진다).
Zeo 개방 리딩 프레임은 프라이머 쌍, ZEOforwardBamHI- ATG mut/space (SEQ. ID. NO. 93): GATCGGATCCTTGGTTT ATG TCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGAGATTTTCAGGAGC TAAGGAAGCTAAAGCCAAGTTGACCAGTGAAGTTC (여기서 밑줄친 서열 뒤이은 서열은 스페이서 서열을 포함한다) 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO.85)로 증폭되었고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI으로 절단되었고, EcoRI-BamHI으로 절단된 pd2EGF로 결찰되어 pZEO- ATGmut/space -d2EGFP를 생성하였다.
2) ATG 대신에, Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로서 GTG (도 13C). Zeo 개방 리딩 프레임은 프라이머 쌍, ZEOforwardBamHI- GTG (SEQ. ID. NO. 94): GATCGGATCCACC GTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 증폭되었고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI으로 절단되었고, EcoRI-BamHI으로 절단된 pd2EGF로 결찰되어 pZEO- GTG -d2EGFP를 생성하였다.
3) ATG 대신에, Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로서 TTG (도 13D). Zeo 개방 리딩 프레임은 프라이머 쌍, ZEOforwardBamHI- TTG : GATCGGATCCACC TTG GCCAAGTTGA CCAGTGCCGTTC (SEQ. ID. NO. 95) 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 증폭되었고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI으로 절단되었고, EcoRI-BamHI으로 절단된 pd2EGF로 결찰되어 pZEO- TTG -d2EGFP를 생성하였다.
CHO 세포의 트렌스펙션 , 배양 및 분석
중국 햄스터 난자 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)은 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 HAMS-F12 배지 + 10% 소 태아 혈청 중에서 37℃/5% CO2 하에서 배양되었다. 세포들은 제조자에 의해 기술된 바와 같이 리포펙트아민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 플라스미드로 트랜스팩트되었다. 간략하게는 세포들은 배양관들에 접종되었고 70-90% 컨플루언스로 밤새 배양되었다. 리포펙트아민 시약은 3 마이크로그람당 15 마이크로리터의 비로 플라스미드 DNA와 복합되었고 (예를들면 10cm 페트리디쉬를 위해, 20 마이크로그램 DNA 및 120 마이크로리터 리포펙트아민) 25℃에서 30분 인큐베이션 후에 세포들로 첨가되었다. 밤새 인큐베이션 후에, 트랜스펙션 혼합물은 신선한 배지로 대체되고, 트랜스펙션된 세포들은 추가로 인큐베이션 되었다. 밤새 배양 후에, 세포들은 트립신화되었고 신선한 배지를 갖는 신선한 배양관으로 접종되었다. 또 다른 하룻밤 인큐베이션 후에, 제오신은 50㎍/ml의 농도로 첨가되고 세포들은 추가로 배양되었다. 또 다른 3일 후에, 배지를 제오신 함유(100㎍/ml) 신선한 배지에 의해 대체되고 추가 배양되었다. 개개의 콜로니가 눈에 보이게 되었을때 (트랜스펙션 후 약 10일), 배지가 제거되고 제오신 없는 신선한 배지로 대체되었다. 개개의 콜로니는 단리되고 제오신이 없는 배지의 24-웰 플레이트로 전달되었다. 콜로니들의 단리 1일 후에, 제오신이 배지에 첨가되었다. d2EGFP 리포터 유전자의 발현은 트랜스펙션 약 3주 후에 평가되었다. 콜로니들에서 dEGFP 발현 수준은 2주의 기간 후에 측정되었다.
결과
CHO-K1 세포들은, 선택 유전자로서 ATGmut/space Zeo (도 13B), GTG Zeo (도 13C) 및 TTG Zeo (도 13D) 유전자 (모두 dEGFP 리포터 유전자의 상류에 클론된다)를 함유하는 구조체들로 트랜스펙션되었다. 이들 3 구조체들은 STAR 요소가 없거나 (대조구), 또는 CMV 프로모터의 상류에 STAR 요소 7 및 67을 그리고 d2EGFP 유전자의 하류에 STAR 7을 갖는다 (도 14). 도 14는 ATGmut/space Zeo (STAR가 없는)(A)와 GTG Zeo (B)를 가진 대조구 구조체 둘다 d2EGFP 단백질을 발현한 콜로니를 산출하였음을 보여준다. 24 ATGmut/space Zeo 콜로니의 평균 d2EGFP 발현 수준은 46이었고, GTG Zeo 콜로니의 것은 75이었다. GTG Zeo 콜로니에서 이 더 높은 평균 발현 수준은 ATGmut/space와 비교하여, GTG의 더 높은 스트린전시를 반영할 것이다 (실시예 8). 구조체에 STAR 요소 7 및 67의 첨가는 더 높은 평균 d2EGFP 발현 수준을 가진 콜로니를 초래했다. ATGmut/space Zeo STAR 7/67/7 구조체의 트랜스펙션은 대조구 세포들에서의 평균(46) 보다 2.6배 더 높은, 118의 평균 d2EGFP 발현 수준을 가진 콜로니를 초래했다. GTG Zeo 구조체에 STAR 요소의 첨가는 대조구 세포들에서의 평균(75) 보다 1.3배 더 높은, 99의 평균 d2EGFP 발현 수준을 초래했다.
중요하게는, TTG Zeo 구조체가 트렌스팩션되었을때, 콜로니는 수립되지 않았다. 그러나, STARs 7 및 67가 플랭크된, TTG Zeo을 가진 구조체는 576의 평균 d2EGFP 발현 수준을 가진, 6 콜로니의 수립을 초래했다 (도 14C). 따라서 TTG 개시코돈에 의해 일으켜진, 가장 높은 번역 스트린전시 (도 12)는, 도 13에서 예측된 바와 같이, 가장 높은 d2EGFP 발현 수준을 산출한다. 이 결과는 또한 TTG Zeo 단독 (STAR 요소가 없는)의 스트린전시는 적어도 몇몇 실험에서 콜로니가 생존하기에는 너무 높다는 것을 또한 나타낸다. 그러나, 그 후의 독립 실험에서 (하기 참조), 몇 몇 콜로니들은 STAR 요소를 갖지 않는 이 구조체를 갖는 것으로 확인되었는데, 이는 제오신 선택 마커에서 TTG 개시코돈을 가진 선택계의 스트린전시는 STAR 요소가 존재하지 않을때 콜로니의 발견을 필수적으로 배제하지는 않고, 얻어진 콜로니의 수는 실험들 간에 변할 수 있다는 것을 가르킨다.
본 발명에 따른 스트린전트 선택계와 조합하여 STAR 요소의 사용은 관심의 유전자의 높은 생산자를 용이하게 동정할 수 있게 한다는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 10 : 더 높은 수의 TTG Zeo STAR 콜로니들의 수립과 IRES- Zeo 구조체와의 비교.
실시예 9에서의 결과들은 TTG Zeo가 극히 스트린전트 번역 효율을 가짐을 나타내며, 이는 세포들에 제오신 내성의 전달을 높일 것이다. 트랜스펙션은 그들이 생존하는 그러한 높은 발현 수준을 가지는 몇몇 콜로니가 있을 수 있을지 없을지에 대해 시험하기 위해 규모가 늘여졌다(scaled up). 실험의 규모를 늘리는 것은 더 많은 콜로니들이 분석될 때 TTG Zeo STAR 7/67/7의 높은 평균이 더 높아질 것인지 아닌지에 관한 의문을 또한 해소할 것이다.
재료 및 방법
CHO-K1 세포는 STAR 요소 7과 6이 있는 또는 없는(도 15), 선택성 마커로써 TTG Zeo 유전자를 가지는 구조체로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션, 선택, 배양 등등은, 6배의 더 많은 세포, DNA와 리포펙트아민 2000이 사용된 것을 제외하면, 실 시예 9에 있는바 대로다. 트랜스펙션과 선택은 페트리 디쉬에서 행해졌다.
결과
도 15A는 TTG Zeo STAR 7/67/7 구조체로 트랜스펙션이 560의 평균 d2EGFP 신호를 가진 많은 콜로니들의 발생에서 초래함을 보여준다. 이것은 이제 58 콜로니들이 분석된 것을 제외하면, 실시예 9에서 만큼이나 높다. 구조체를 IRES 서열(도 15B)의 뒤에 위치한 제오신 내성 유전자와 비교할 때, 평균 d2EGFP 발현 수준은 61이며, STAR 인자 7과 67이 그러한 구조체에 더해졌을 때 평균 d2EGFP 발현 수준은 125이었고, 대조구의 2배 이상이다(도 15B). TTG Zeo STAR 7/67/7 콜로니들의 평균은 따라서 STAR 없는 IRES-Zeo(STAR-less IRES-Zeo) 콜로니들보다 9.2배 높았고 STAR7/67/7 IRES Zeo 콜로니들보다 4.5배 높았다.
모든 발현 콜로니들이 커브의 형태는 TTG Zeo STAR7/67/7과 IRES-Zeo STAR 7/67/7 사이에 다르다는 것이 관찰된다. 두번째 사례(IRES-Zeo)에서 커브가 더 '대수적'(exponential) 형태를 보이는 데 반하여, 첫번째 사례(TTG Zeo)에서 커브는 평평하다. TTG Zeo 커브에서 고원(plateau)은 세포들이 d2EGFP 발현 수준의 최고치에 도달했음을 나타낼 수 있으며, 그 이상이면 d2EGFP 발현 수준은 독성을 가지고 세포들은 죽는다. 그러나, 그 높은 값들은 FACS 분석기의 검출자의 세팅으로 검출될 수 있는 최대값에 가깝다는 것이 나중에 드러났다. 후의 실험들에서, FACS 분석기의 세팅은 더 높은 값을 검출할 수 있도록 변경되었고, 정말로 몇몇 예에서 나중의 독립된 실험에서 여기에서 관측한 것보다 더 높은 값이 측정되었다(아래를 보라).
트랜스펙션의 업-스케일링 덕분에 STAR 없는 TTG Zeo 구조체를 가진 세 개의 클로니들이 선택될 수 있었다. 이들 클로니들의 d2EGFP 발현 수준은 475, 158 그리고 43이었다. 마지막 콜로니는 첫번째 측정 후에 곧 죽었다. 이 결과는 TTG Zeo 구조체가 몇몇 예에서 높은 발현 수준 또한 줄 수 있는 콜로니들을 초래하는 제오신 내성을 전달할 수 있음을 나타낸다. 그리하여, 비록 적어도 하나의 그러한 요소를, 바람직하게는 STAR 요소를 포함하는 발현 카세트를 사용하는 것이 명백히 바람직하지만, 본 발명에 따른 신규한 선택법이 크로마틴 조절 요소들을 함유하지 않는 발현 카세트가 적용될 수 있다.
이 결과들은, 본 실시예에서 예시되는 바와 같이, 매우 높은 평균 단백질 발현 수준을 가지는 콜로니들의 선발을 초래하는 STAR 요소들이 본 발명에 따른 더 스트린전트 선택계를 허용한다는 것을 나타낸다.
실시예 11 : 차등(differential) 번역 효율을 가진 블라스티시딘 - d2EGFP 2시스트론성 구조체의 생성과 시험.
블라스티시딘 내성 유전자에는 네 개의 내부 ATG들이 있고, 그중 어느 것도 메티오닌을 코드하지 않는다(도 25A). ATG 개시 코돈(또는 그것의 상황)이 변경될 때 개시 코돈으로써 작용하고, 이것은 블라스티시딘 내성 단백질과 닮지 않은 펩티드로 귀결될 것이기 때문에, 이들 ATG들은 제거되어야 한다 (도 25B). 더 중요한 점은, 이러한 ATG들이, 예시의 목적으로 본 실시예에서 d2EGFP에 의해 대표되는, 관심의 유전자의 효율적인 번역을 방해할 것이다. 내부 ATG들을 제거하기 위해, 블 라스티시딘 내성 단백질 개방 리딩 프레임은 4개 블라스티시딘 내성 단백질 단편을 발생시키는, 네 개 프라이머 쌍들로 먼저 증폭되었다. 그 프라이머 쌍들은 다음과 같다 :
A) BSDBamHIforward (SEQ. ID. NO. 96):
GATCGGATCCACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG
BSD150reverse (SEQ. ID. NO. 97) :
GTAAAATGATATACGTTGACACCAG
B) BSD150forward (SEQ. ID. NO. 98):
CTGGTGTCAACGTATATCATTTTAC
BSD250reverse (SEQ. ID. NO. 99):
GCCCTGTTCTCGTTTCCGATCGCG
C) BSD250forward (SEQ. ID. NO. 100):
CGCGATCGGAAACGAGAACAGGGC
BSD350reverse (SEQ. ID. NO. 101):
GCCGTCGGCTGTCCGTCACTGTCC
D) BSD350forward (SEQ. ID. NO. 102):
GGACAGTGACGGACAGCCGACGGC
BSD399reverse (SEQ. ID. NO. 103):
GATCGAATTCTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC
A 내지 D의 단편들은 아가로오스 겔로부터 단리되었고, 함께 섞었다. 다음으 로, 프리머 BSDBamHIforward와 BSD399reverse 만이 모든 치환된 내부 ATG들을 가진 완전한 길이의 블라스티시딘 내성 단백질 cDNA를 창조하는데 사용되었다. 재구성된 블라스티시딘은 그리고 나서 EcoRI-BamHI로 절단되고, EcoRI-BamHI(Zeo를 방출하는)로 절단된 pZEO- GTG -d2EGFP로 클론되어, pBSDmutㅡd2EGFP를 생성한다. 전체 블라스티시딘 내성 단백질 개방 리딩 프레임은 모든 ATG들이 치환된 것을 검증하기 위해 서열화되었다.
이 돌연변이된 유전자 코딩 블라스티시딘 내성 단백질(Blas)로, 3가지 종류의 구조체가 만들어진다 (도 25C-E) :
1) 개시 코돈으로써 ATG, 그러나 나쁜 상황에 있고 스페이서 서열이 뒤따름. pBSD-d2EGFP에서 돌연변이된 블라스티시딘 내성 단백질 개방 리딩 프레임은 프라이머들, BSDforwardBamHIAvrII- ATGmut /space (SEQ. ID. NO. 104): GATCGGATCCTAGGTTG GTTT ATG TCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG, 및 BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO.105): GATCGAATTCCCTAGGTTAG CCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC을 사용해서 증폭되었고, PCR 생성물은 BamHI-EcoRI로 절단되고, EcoRI-BamHI와 절단된 pZEO- GTG -d2EGFP에 결찰되었다. 이것은 pBSD- ATGmut/space -d2EGFP을 생성한다.
2)ATG 대신에 개시 코돈으로서 GTG. pBSD-d2EGFP에서 돌연변이된 블라스티시딘 개방 리딩 프레임은 프라이머들, BSDforwardBamHIAvrII- GTG (SEQ. ID. NO. 106): GATCGGATCCTAGGACC GTG GCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG 및 BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105)을 사용하여 증폭되었으며, PCR 생성물은 BamHI-EcoRI로 절단되 었고, EcoRI-BamHI로 절단된 pZEO- GTG -d2EGFP에 결찰되었다. 이것은 pBSD- GTG -d2EGFP를 생성한다.
3)ATG 대신에 개시 코돈으로서 TTG. pBSD-d2EGFP에 있는 돌연변이된 블라스티시딘 개방 리딩 프레임은 프라이머들, BSDforwardBamHIAvrII- TTG (SEQ. ID. NO. 107): GATCGGATCCTAGGACC TTG GCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG 및 BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105)을 사용하여 증폭되었으되며, PCR 생성물은 BamHI-EcoRI로 절단되고, EcoRI-BamHI로 절단된 pZEO- GTG -d2EGFP에 결찰되었다. 이것은 pBSD- TTG -d2EGFP를 생성한다.
결과
CHO-K1 세포들은, 모두 d2EGFP 리포터 유전자의 상류로 클론된, 선택 유전자로써 GTG Blas(도 16A)와 TTG Blas(도 16B)를 포함하는 구조체들로 트랜스펙트되었다. 선택은 20 ㎍／㎖의 블라스티시딘 존재하에 일어났다. 두 구조체들은 STAR 요소가 없거나(대조구) 또는 CMV 프로모터의 상류에 STAR 요소 7 및 67과 d2EGFP 유전자로부터의 하류에 STAR7을 가진다(도 16). 도 16은 GTG Blas(A) 및 TTG Blas(B)를 가지는 두 대조구(STAR 요소 없는) 구조체들이 d2EGFP 단백질을 발현하는 콜로니들을 부여하는 것을 보여준다. 24 GTG Blas의 평균 d2EGFP 신호는 14.0이었고(도 16A) TTG Blas 콜로니들의 것은 81이었다(도 16B). TTG Blas 콜로니들에서의 이 더 높은 평균 발현 수준은, GTG와 비교해 볼 때, TTG의 더 높은 스트린전시를 반영할 것이다(실시예 9 또한 보라). 그러나 더 스트린전트 TTG 조건 하에서는 단지 8개의 콜로니들만 살아남았다.
구조체들에 STAR 요소 7과 67을 추가하는 것은 더 높은 d2EGFP 발현 수준을 가진 콜로니들에 초래한다. GTG Blas STAR 7/67/7 구조체의 트랜스펙션은 97.2의 평균 d2EGFP 발현 수준의 콜로니들에 초래하며(도 16A), 이는 대조구 세포들에서의 평균(14.0)보다 6.9배 더 높다. TTG Blas 구조체에 STAR 요소 추가는 234.2의 평균 d2EGFP 신호를 초래했으며(도 16B), 이는 대조구 세포들에서의 평균(81)보다 2.9배 더 높다. 그러나 TTG Blas의 심한(harsh) 선택 환경들에서 8개의 콜로니들만 살아남았다고 또다시 기록됐는데, 반면에 TTG STAR Blas 7/67/7을 가진 48 콜로니들이 살았다. 단지 5개의 가장 높은 값들을 비교했을 때, 5개의 가장 높은 TTG Blas의 평균은 109.1이었고 5개의 가장 높은 TTG Blas STAR 7/67/7의 평균은 561.2인데, 이는 5.1배 더 높은 것이다.
그 결과는 STAR 요소들이 매우 높은 평균 단백질 발현 수준을 가진 콜로니들의 선발을 초래하는, 더 스트린전트 선택계를 허용함을 나타낸다. 그들은 또한 이 선택이 제오신 내성 단백질 단독으로 제한되는 것이 아니라, 또한 다른 선택성 마커 폴리펩타이드, 이 경우에서는 블라스티시딘 내성 단백질이 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 12 : 신규한 선택계에서 d2EGFP 발현의 안정성
실시예 10에서 묘사된 콜로니들은 d2EGFP 발현의 안정성을 평가하기 위해 여러 조건하에서 확장된 기간을 넘어 더 배양되었다.
결과
도 15A에서 콜로니들을 포함한 TTG Zeo STAR 7/67/7은 100 ㎍／㎖ 제오신의 존재하에 70일간을 더 추가하여 배양되었다. 도 17에서 보여지는 바와 같이, 평균 d2EGFP 신호는 35일 후에 560.2에서 105일 후에 677.2까지 올라갔다. 몇몇 드문 콜로니들을 제외하면, 모든 콜로니들은 더 높은 d2EGFP 발현 수준을 가졌다.
제오신의 수준을 20 ㎍／㎖ 제오신으로 낮추었을 때, 평균 d2EGFP 발현 수준에서 여전히 증가가 있었으며, 즉 35일 후에 560.2에서 105일 후에 604.5로 되었다(도 18).
배양 배지에서 제오신의 제거로 인해 선택 압이 전혀 존재하지 않을 때, 대략 50%의 콜로니들이 모자이크(mosaic)가 되었고, 이로써 한 콜로니 내에서 어떤 d2EGFP도 발현하지 않는 세포들이 식별되었다. 이것은 원래 수준의 50% 미만으로 d2EGFP 발현 수준을 낮추는 결과를 가져왔다. 신호가 원래의 신호로부터 67% 미만으로 된다면(최소한 1/3의 감소), 콜로니는 d2EGFP 발현에 대하여 불안정한 것으로 간주된다. 원래 콜로니들 57개 중의 27개 콜로니들이 이 규준(criterion)에 따를 때 안정하게 남아있다 ; 35일 후에(여전히 선택압 하에 있는 동안) 이들 콜로니들의 평균 d2EGFP 신호는 425.6이었으며, 반면에 65일 후에 선택압 없이는 평균 d2EGFP 신호가 290.0이었다. 105일 후에 측정되었을 때, 27개 콜로니들에서 평균 신호는 300.9였다. 그래서, 처음의 감소 이후에 27개 콜로니들에서 발현 수준은 이 규준에 따라 안정하게 남아있었다(도 19).
6개의 콜로니들은 서브 클로닝의 한 순환을 행했다. 세포들은 각 웰이 대략적으로 0.3개 세포들을 함유하도록 96-웰 플레이트들에 뿌려졌다. 제오신이 배지 내에 존재하지 않아서, 개시부터 서브 클론들은 선택압 없이 자랐다. 각각의 원래 콜로니들의, 여섯 개 서브 클론은 무작위로 단리되고 분석 때까지 6-웰 플레이트들에서 자랐다. 도 23에서 우리는 원래 클론의 원래 값을, 이미 도 15A에서 보여진 바와 같이, 서브 클론의 것과 비교했다. 6개 클론들 중 하나에서(클론 25), 원래 클론의 범위에 있는 d2EGFP 신호를 가진 서브 클론이 존재하지 않았다. 그러나 여섯 경우 중에서 5개는 적어도 하나의 서브 클론은 모 클론과 같은 d2EGFP 발현 수준을 가졌다. 이들 발현 수준들은 선택 압 없이 50일 후에 결정되었다. 우리는 서브-클로닝의 한 순환이 선택 압의 부재에서 높은 발현에 안정하게 남아있는 높은 수의 콜로니들을 얻기에 충분하다고 결론지었다. 이것은 유사한 실험에서 확고해졌다(제시하지는 않았다).
우리는 TTG Zeo STAR 7/67/7 콜로니에서 통합된 복사체의 수를 비교했다. DNA는 콜로니들이 제오신 선택압 하에서 105일 있었을 때 단리되었다 (도 17). 도 24에서 보여지는 바와 같이, 두 집단은 구별될 수 있다. 도 24에서 컷 오프는 20개 복사체에서 이루어졌고 R2 값이 계산되고 보여진다. 또한 20개 복사체보다 더 높은 데이터로부터 R2값이 보여진다. 100 내지 800 신호까지의 범위에서, 0.5685의 상대적으로 높은 R2에 의해 나타내진(도 24), 복사체 수 의존성의 높은 정도가 있다. 그러나 800의 d2EGFP 신호를 오르내리는 콜로니들의 집단에서, 0.0328의 낮은 R2으로 나타내진, 복사체 숫자에서의 높은 변동이 관찰되었다(도 24). 동시에 데이터는 새 로운 선택계에서 TTG Zeo STAR 7/67/7 구조체를 함유하는 콜로니들에서 ~20 복사체에 이르기까지 복사체 수 의존적 d2EGFP 발현이라는 것을 보여준다. 또한, 비록 >20 의 복사체가 존재할 때, 복사체 수 의존성이 없어지기는 하지만, 높은(>800) d2EGFP 신호를 가진 콜로니들의 실질적 비율은 여전히 30개 복사체보다 큰 값을 가지지는 않는다(도 24). 높은 d2EGFP 발현과 상대적으로 낮은 복사체 수(10과 30사이) 간의 이 조합은 선택압 없이 상대적으로 안정하게 남아있는 콜로니들을 동정하는데 중요할 것이다. 높은 발현수준을 주는 상대적으로 낮은 복사체 수(약 30이하, 더 바람직하게는 약 20이하)인 클론을 가지는 것은 이득인데, 왜냐하면 그러한 클론들은 유전적 불안정성에 덜 따르는 것으로 믿어지기 때문이다. 본 선택계는 CHO 세포로부터의 것을 포함하여, 그러한 클론을 발생시키는 것을 허용한다.
실시예 13 : 차등 번역 효율을 가진 제오신- 블라스티시딘 - EpCAM 2시스트론성 구조체의 생성과 시험
항체의 생산에 있어 선택계를 시험하기 위해, 항-EpCAM 항체(실시예 5도 보라)가 실시예로써 취해졌다.
결과
각각 독립된 전사 단위로서, 중쇄(HC)와 경쇄(LC) 모두가 위치된 플라스미드가 생성되었다(도 20-22). 두 쇄의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동되었다. EpCAM 중쇄의 상류에, 개시 코돈으로서 ATGmut/space(도 20), GTG(도 21) 또는 TTG(도 22)를 가진, 제오신 내성 유전자가 위치되었다.(실시예 9를 보라). EpCAM 경쇄의 상류에, 개시 코돈으로서 ATGmut/space(도 20), GTG(도 21) 또는 TTG(도 22)를 가진 블라스티시딘 내성 유전자가 위치되었다(실시예 11을 보라). 두 가지 유형의 구조체가 만들어졌는데, STAR 요소가 없는 하나의 구조체(대조구)와 STAR 7과 67 요소들의 조합을 가진 한 구조체이다. STAR 요소는 다음과 같이 위치되었다: 각각의 CMV 프로모터의 상류(즉, HC를 포함하는 전사 단위를 위한 하나와 LC를 포함하는 전사 단위를 위한 하나)에, STAR 67은 위치되었고 결과의 구조체는 5'와 3' STAR 7 요소가 플랭크되었다(도 20-22). 모든 구조체들은 CHO-K1 세포들로 트랜스펙트되었고, 제오신 100 ㎍／㎖와 블라스티시딘 20 ㎍／㎖로(동시에) 선택되었다. 선택 후에 독립적 콜로니들은 단리되었고, 지속적인 선택압 하에서(제오신 100 ㎍／㎖와 블라스티시딘 20 ㎍／㎖을 사용함) 증식되었다. 도 20은 STAR 7/67/7 조합이 EpCAM 생산에서 이로운 효과를 가짐을 보여준다. ATGmut/space Zeo와 ATGmut/space Blas는 STAR 요소를 함유하거나 하지않는 플라스미드로 형성된 콜로니들의 수에 아무 영향도 미치지 않는다. 그러나, STAR 7/67/7 콜로니들에 대한 24 대조구의 평균 EpCAM 발현 수준은 대조구에서 0.61 pg/세포/일로부터 STAR 7/67/7 구조체에서의 3.44 pg/세포/일까지의 범위에 있었다(도 20). 이것은 5.6배 증가이다. 0 pg/세포/일의 ATGmut/space 대조구에 많은 콜로니들이 있기 때문에, 가장 높은 5개 콜로니들에서 평균 EpCAM 생산이 또한 비교된다. ATGmut/space STAR 7/67/7 구조체에서 7.8 pg/세포/일에 대해 대조구 ATGmut/space에서 이는 3.0 pg/세포/일로서, 2.6배 증가이다.
도 21은 또한 STAR 7/67/7 조합이 마커를 위한 GTG 개시 코돈을 사용하는, EpCAM 생산에서 이로운 효과를 가졌음을 보여준다. GTG Zeo와 GTG Blas STAR 7/67/7 구조체로 대략 2배 많은 콜로니가 형성되었다. 또한, STAR 7/67/7 콜로니들에 대한 24 대조구의 평균 EpCAM 발현 수준은 대조구에서의 2.44 pg/세포/일에서 STAR 7/67/7 구조에서의 6.51 pg/세포/일까지의 범위에 있었다(도 21). 이것은 2.7 배 증가이다. 또한 가장 높은 5개 콜로니들에 있어 평균 EpCAM 생산이 비교되었다. 대조구 GTG에서 이것은 5.7 pg/세포/일로서, 이는 GTG STAR 7/67/7 구조체의 13.0 pg/세포/일에 대하여, 2.3배 증가이다. 또한, 선택성 마커를 위한 GTG 개시 코돈에 의해 중재된 평균 EpCAM 생성이 ATGmut/space 개시 코돈의 경우보다 훨씬 더 높았다는 것을 주목하라.
도 22는 실시예 9에서와 유사하게, TTG Zeo와 TTG Blas 대조구 구조체를 가진 어떤 콜로니도 형성되지 않았음을 보여준다. STAR 7/67/7 TTG 구조체를 가진 콜로니들이 형성되었다. STAR 7/67/7 TTG 콜로니들의 평균 EpCAM 발현 수준은 10.4 pg/세포/일이었다(도 22). 이는 또한 개시 코돈으로서 ATGmut/space와 GTG를 가진 경우보다 더 높다(비교로서 도 20, 21을 보라). 가장 높은 5개 TTG STAR 7/67/7 콜로니들의 평균 EpCAM 생산은 22.5 pg/세포/일이었다.
그 결과들은 또한 선택계가 두 개의 동시에 생성된 두 폴리펩티드(이 경우는 다량체 단백질의 두 폴리펩티드이다), 또는 항체에 적용될 수 있음을 보여준다. EpCAM 생성은 d2EGFP로 달성된 결과들을 밀접하게 따른다. 개시 코돈으로서 TTG는 GTG 개시 코돈보다 더 스트린전트하며, 차례로 이는 ATGmut/space보다 더 스트린전트하다(도 12와 13). 더 높은 스트린전트는 콜로니들 수의 감소에, STAR 요소들을 가지지 않는 TTG 대조구의 경우에서는 콜로니들이 없음을 초래하고, 그리고 선택성 마커의 더 높은 스트린전트는 관심 단백질의 더 높은 발현에 커플된다.
실시예 14: 차등 번역 효율을 가진 추가적인 GTG 제오신- d2EGFP 2시스트론성 구조체의 생성과 시험
돌연변이된 개시 코돈을 가진 제오신 내성 유전자의 다른 변형은 실시예 8에서 기술되었다. 기술된 GTG 코돈(실시예 8, 도 33A) 외에도, 별개의 번역 효율을 가진 추가적인 변형 개시 코돈이 가능하다. 이러한 다른 제오신 내성 유전자 버전들은 실시예 9에서처럼, 변형된 d2EGFP 유전자의 상류에 만들어지고(도 33) 클론되었다.
재료 및 방법
플라스미드의 생성
4개의 추가 GTG 구조체들이 만들어졌다:
1) Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로써 GTG(도 33A), 단 스페이서 서열이 뒤따름(도 33B). mutspace-Zeo 개방 리딩 프레임은 프라이머 쌍, GTGspaceBamHIF (SEQ. ID. NO. 122):GAATTCGGATCCACC GTG GCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG (여기에서 밑줄그어진 서열을 뒤따르는 서열이 스페이서 서열을 포함함) 및 ZEOWTreverse(SEQ. ID. NO. 85)로 증폭되었으며, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되고 EcoRI-BamHI로 절단된 pd2EGFP에 결찰되어, pZEO- GTGspace -d2EGFP를 생성했다.
2) Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로써 GTG, 단 나쁜 상황( TTTGTG )에 있음 (도 33C). Zeo 개방 리딩 프레임은 프라이머 쌍, ZEOTTTGTGBamHIF (SEQ. ID. NO. 123): GAATTCGGATCC TTTGTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 증폭되었으며, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되고 EcoRI-BamHI와 절단된 pd2EGFP에 결찰되어, pZEO(leu)- TTTGTG -d2EGFP를 생성했다.
3) Zeo 내성 유전자에서, ATG(도 33A)를 대신한, 개시 코돈으로써 GTG, 단 Zeo 개방 리딩 프레임에서 Pro9에 트레오닌(Thr)으로 치환된 추가적인 돌연변이를 가진다(도 33D). Thr9 돌연변이는 프라이머 쌍, ZEOForwardGTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 124): AATTGGATCCACC GTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTT ACC GTGCTC 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)도 Zeo 개방 리딩을 증폭하는 것에 의해 도입되고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI으로 절단되며 EcoRI-BamHI로 절단된 pd2EGFP에 결찰되어 pZEO- GTG -Thr9-d2EGFP를 생성했다.
4) Zeo 내성 유전자에서 ATG(도 33A) 대신에, 개시 코돈으로써 GTG, 단 Zeo 개방 리딩 프레임에서 pro9에 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 추가적인 돌연변이를 가진다.(도 33E). Phe9 돌연변이는 프라이머 쌍, ZEOForward GTG-Phe9 (SEQ. ID. NO. 125): AATTGGATCCACC GTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTT TTC GTGCTC 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 Zeo 개방 리딩을 증폭하는 것에 의해 도입되고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되며 EcoRI-BamHI로 절단된 pd2EGFP에 결찰되어, pZEO- GTG -Phe9-d2EGFP를 생성했다.
CHO 세포들의 트랜스펙션, 배양 그리고 분석
CHO-K1 세포들의 트랜스펙션, 배양 그리고 분석은 실시예 8와 같이 시행되었 다.
결과
CHO-K1 세포들은 선택성 유전자로써 GTG Zeo(도 33A), GTGspace(도 33B), TTT GTG Zeo(또한 다음으로도 불림 : GTGmut Zeo)(도 33C), GTG Thr9 Zeo(leu)(도 33D) 및 GTG Phe9 Zeo(leu)(도 33D)를 포함하는 구조체들로 트랜스펙트되었다. 이들 다섯가지 구조체는 STAR 요소없이 있거나(대조구) CMV 프로모터의 상류에 STAR 요소 7과 67과 d2EGFP 유전자로부터 하류에 STAR 7을 가지고 있다(도 33). 도 34는 STAR 요소 없는 대조구 구조체에서의 STAR 요소 없는 GTG Zeo 구조체만 d2EGFP 단백질을 발현하는 콜로니를 주었다는 것을 보여준다. 대조적으로, STAR 요소를 함유하는 모든 구조체들은 d2EGFP 단백질을 발현하는 콜로니들을 주었다. 11개 GTG Zeo 대조구 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호는 20.3이고, STAR 7/67/7을 가진 13개 GTG Zeo 콜로니들은 104.9, 24개 GTG space Zeo 7/67/7 콜로니들은 201.5, 6개 TTT GTG Zeo 7/67/7 콜로니들은 310.5, 22개 GTG Thr9 Zeo 7/67/7 콜로니들은 423, 그리고 16개 GTG Phe9 Zeo 콜로니들은 550.2였다(도 34).
새로운 GTG 돌연변이들의 더 높은 스트린전시는 평균 형광 신호가 더 높다는 것과 관련이 있다(도 34). 그러나 TTT GTG Zeo 7/67/7은 단지 두 개의 높게 발현 하는 콜로니들과 약간의 낮게 발현하는 콜로니들을 주었다. 이것은 이 돌연변이가, 세포가 배양 배지에 더해지는 제오신의 고정된 농도를 견딜 수 있는 스트린전시의 정상에 있음을 나타낼 것이다.
Thr9와 Phe9 돌연변이들은 Zeo 돌연변이의 번역 효율에 영향을 주지 않는다. 대신에 그들은 제오신 내성 단백질의 두 절반들에 최상의 상호작용을 막음으로써, 제오신 내성 단백질의 기능성을 줄인다(Dumas et al, 1994). 이것은 배양 배지에서 제오신에 대항하는 내성을 달성하기 위해 더 많은 단백질이 생산되어야 함을 암시한다. 결과로서, 전체 카세트는 더 높은 수준으로 전사되어야 하며, 결국에 더 높은 d2EGFP 발현 수준에 초래해야 한다.
기술된 제오신 내성 mRNA의 번역 효율의 이용은 d2EGFP 단백질의 더 높은 발현 수준을 초래한다고 결론지어지며, STAR 요소의 조합에 있어서도 그렇다.
본 실시예는 본 발명의 선택계의 스트린전시의 미세 조정(fine tuning)을 제공할 가능성, 관심의 단백질의 최적의 발현 수준을 달성하기 위한 가능성을 추가로 증명한다. 명백하게, 당업자들은 간단한 시험을 통해 그러한 미세 조정을 제공하기 위해 여기에서 개시된 개념들 안에서 이들과 다른 가능성들을 조합할 수 있을 것이며 (예를 들어, 위치 9에서 제오신을 다른 아미노산으로 변화시키거나, 다른 위치에의 그것을 돌연변이시키는 것 ; 제오신 또는 다른 선택성 마커들을 위한 비-최적 번역 개시 상황에서 GTG나 다른 개시 코돈을 사용하기 ; 그들의 기능성을 줄이는 다른 선택성 마커로 돌연변이시키기, 예를 들어 아미노산 잔기 182 또는 261 또는 둘 다에서 돌연변이를 가지는 네오마이신 내성 유전자 코딩 서열의 사용. 예 WO 01/32901을 보라), 단순히 시험에 의해, 선택성 마커를 위한 적합한 특징들의 조합을 결정할 수 있어, 관심 폴리펩티드의 향상된 발현으로 이끌 수 있을 것이다.
실시예 15: 차등 번역 효율을 가진 추가적인 TTG 제오신- d2EGFP 2시스트론성 구조체의 생성과 시험
돌연변이된 개시 코돈을 가진 제오신 내성 유전자의 다른 버전들은 실시예 8에서 기술되었다. 기술된 TTG 코돈(도 35A) 외에도, 다른 번역 효율을 가진 추가 변형된 개시 코돈이 가능하다. 이러한 다른 제오신 내성 유전자 버전들은 변형된 d2EGFP 유전자의 상류에 생성되고 클론되었다(도 35).
재료 및 방법
플라스미드의 생성
세 개의 추가 TTG 구조체가 만들어졌다 :
1) Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로써 TTG(도 35A), 단 스페이서 서열이 뒤따름(도 35B). Zeo 개방 리딩 프레임(스페이서 서열을 가진)은 프라이머 쌍, TTGspaceBamHIF (SEQ. ID. NO. 126):GAATTCGGATCCACCTTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO.85)로 증폭되었으며, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되고, EcoRI-BamHI로 절단된 pd2EGFP에 결찰되어 pZEO- TTGspace -d2EGFP를 생성했다.
2) ATG 대신에, Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로써 TTG(도 35A), 단 Zeo 개방 리딩 프레임에서 Pro9에 트레오닌(Thr)으로 치환된 추가적인 돌연변이를 가진다(도 35C). Thr9 돌연변이는 프라이머 쌍, ZEOForwardTTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 127):AATTGGATCCACC TTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTT ACC GTGCTC 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 Zeo 개방 리딩을 증폭하는 것에 의해 도입되었고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되어, EcoRI-BamHI로 절단된 pd2EGFP에 결찰되어 pZEO- TTG -Thr9- d2EGFP를 생성했다.
3) ATG 대신에, Zeo 내성 유전자에서 개시 코돈으로써 TTG(도 35A), 단 Zeo 개방 리딩 프레임에서 Pro9에 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 추가적인 돌연변이를 가진다(도 35D). Phe9 돌연변이는 프라이머 쌍, ZEOForwardTTG-Phe9 (SEQ. ID. NO. 128): AATTGGATCCACC TTG GCCAAGTTGACCAGTGCCGTT TTC GTGCTC 및 ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85)로 Zeo 개방 리딩을 증폭하는 것에 의해 도입되었고, PCR 생성물은 EcoRI-BamHI로 절단되어, EcoRI-BamHI와 절단된 pd2EGFP에 결찰되어 pZEO- TTG -Phe9-d2EGFP를 생성했다.
결과
CHO-K1 세포들은 선택성 유전자로써 TTG Zeo(도 35A), TTGspace(도 35B), TTG Thr9 Zeo(도 35C), TTG Phe9 Zeo(도 35D)를 함유하는 구조체로 트랜스펙트되었고, 이들 모두는 d2EGFP 리포터 유전자의 상류에 클론되었다. 이들 4개의 구조체들은 STAR 요소가 없거나(대조구) CMV 프로모터의 상류에 STAR 요소 7과 67과 d2EGFP 유전자로부터 하류에 STAR 7을 가지고 있다 (도 35). 도 36은 STAR 요소가 없는 대조구 구조체에서 STAR 요소 없는 TTG Zeo 구조체만 d2EGFP 단백질을 발현하는 콜로니를 주었다는 것을 보여준다. 대조적으로, STAR 요소를 함유하는 모든 구조체들은 d2EGFP 단백질을 발현하는 콜로니들을 주었다. 3개 TTG Zeo 대조구 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호는 26.8이었고, STARs 7/67/7을 가진 24개 TTG Zeo 콜로니들은 426.8, 24개 TTG space Zeo 7/67/7 콜로니들은 595.7, 2개 TTG Thr9 Zeo 7/67/7 콜로니들은 712.1, 그리고 3개 TTG Phe9 Zeo 콜로니들은 677.1 이었다(도 36).
새로운 TTG 돌연변이들의 더 높은 스트린전시는 평균 형광 신호가 더 높다는 것과 관련이 있다(도 36). 그러나 TTG Thr9 Zeo 7/67/7과 TTG Phe Zeo 7/67/7 구조체들은 단지 두 개의 높게 발현하는 콜로니들과 약간의 낮게 발현하는 콜로니들을 주었다. 이것은 이들 돌연변이가, 세포가 배양 배지에 더해지는 제오신의 고정된 농도를 견딜 수 있는 스트린전시의 정상에 있음을 나타낼 것이다.
기술된 제오신 내성 mRNA의 번역 효율의 이용은 d2EGFP 단백질의 더 높은 발현 수준을 초래한다고 결론지어지며, STAR 요소의 조합에 있어서도 그렇다.
실시예 16: 차등 번역 효율을 갖는 푸로마이신 - d2EGFP 2시스트론성 구조체의 생성 및 시험
푸로마이신 내성 유전자에는 3개의 내부 ATG들이 있고, 이들 각각은 메티오닌을 코드화한다(도 28, 도 37A). 이들 ATG들은 제거되어야 하는데(도 37B, C), 이들은 ATG 개시 코돈 (또는 그들의 상황)이 변형되었을 때 개시 코돈으로 작용할 것이고, 이것은 푸로마이신 내성 단백질을 닮지 않은 펩티드를 초래할 것이기 때문이다. 더욱 중요하기는, 이들 ATG들은, 본 실시예에서 예시를 위해 d2EGFP로 표시되는 바와 같이, 관심의 유전자의 효율적인 번역을 방해할 것이다. 메티오닌은 제오신 내성 단백질에서와 같이(실시예 8) 로이신으로 변화되었다. 그러나, (예를 들면, 실시예 8의 제오신에서와 같이) 로이신을 위한 TTG 코돈을 사용하는 대신, 이제 로이신을 위한 CTG 코돈을 선택하였다 (인간에서, 로이신을 위한 CTG 코돈이 TTG 코돈보다 더욱 자주 사용된다). 내부 ATG들을 제거하기 위해, 푸로마이신 내성 단백질 개방 리딩 프레임을 4개의 프라이머 쌍으로 우선 증폭시켜 4 푸로마이신 내성 단백질 단편들을 생성하였다. 프라이머 쌍들은 다음과 같다:
PURO BamHI F (SEQ. ID. NO. 129):
GATCGGATCCATGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGT,
PURO 330 R LEU (SEQ. ID. NO. 130):
CAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCAGGCGCGGGC; 및
PURO300FLEU(SEQ.ID.NO.131):
CGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGCTGGAAGGCCTC,
PURO600RLEU (SEQ.ID.NO. 132):
AAGCTTGAATTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCAGGCACCAGGTC.
이것은, 푸로마이신 내성 유전자의 5' 및 3' 부분에 대응하는, 2개의 PCR 생성물을 생성한다. 2개의 생성물을 함께 첨가하였고 PURO BamHI F(SEQ. ID. NO. 129)-PURO600RLEU (SEQ. ID. NO.132)로 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물은 BamHI-EcoRI로 절단하고 결찰되어, pCMV-ATGPURO (leu)를 생성하였다. 이 클론의 서열화는 모든 3개의 내부 ATG들을 전환되었음을 입증하였다. 그리고나서 전체 푸로마이신 개방 리딩 프레임을 PUROBamHI TTG1F(SEQ. ID. NO. 133): GAATTCGGATCCACC TTG G TTACCGAGTACAAGCCCACGGTG 및 PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132)로 증폭시켰다. 뉴클레오티드 +4에 'G'는 최적 상황을 위해 도입되기 때문에, 이 프라이머는 TTG 개시코돈 직후에 엑스트라 코돈(GTT)을 도입하고, 따라서 2개 이상의 뉴클레오티드는 리딩 프레임을 유지하기 위해 도입된다.
결과
CHO-K1 세포를 d2EGFP 리포터 유전자의 상류에 클론된, 선택 유전자로서 TTG Puro(도 38)을 함유하는 구조체로 트랜스펙션시켰다. 선택은 푸로마이신 10μg/㎖하에서였다. 구조체는 STAR 요소가 없거나(대조구) 또는 CMV 프로모터의 상류에 STAR 요소 7과 67 및 d2EGFP 유전자로부터 하류에 STAR 7가 있었다(도 38). 도 38은 24 TTG Puro 대조구 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호가 37.9이고 STAR 7/67/7을 갖는 24 TTG Puro 콜로니들은 75.5임을 나타낸다. 더우기, 5개의 최고치의 평균을 취했을 때, TTG Puro 대조구 콜로니들의 d2EGFO 형광 신호는 69.5이고, STAR 7/67/7을 갖는 TTG Puro 콜로니들은 186.1이었고, d2EGFP 형광신호에서 거의 3배가 증가하였다. 이것은 상기의 푸로마이신 내성 mRNA의 변형된 번역 효율이 d2EGFP 단백질의 더 높은 발현을 가져온다는 것을 나타내는데, STAR 요소들의 조합에사도 마찬가지이다.
이 실험은 푸로마이신 내성 유전자가 기능은 유지하면서, 그것으로부터 ATG 서열을 제거하도록 돌연변이될 수 있다는 것을 설명한다. 더우기, 이것은 본 발명의 선택법이 또 다른 선택 마커, 푸로마이신으로도 수행된다고 결론지워 진다.
실시예 17: 차등 번역 효율을 갖는 네오마이신 구조체의 생성 및 시험
네오마이신 내성 유전자에는 16개의 내부 ATG들이 있고, 그 중 5개는 네오마이신 개방 리딩 프레임에서 메티오닌을 코딩한다(도 31, 도 39A). 이들 16개 ATG들 모두는 제거되어야 하는데(도 39B, C), 이들이 ATG 개시 코돈 (또는 그들의 상황) 이 변형되었을 때 개시 코돈으로 작용할 것이고, 그리고 이것은 네오마이신 내성 단백질과 닮지 않은 펩티드를 초래할 것이고, 이것은 본 발명의 전사 유니트에서 관심의 폴리펩티드에 대한 하류 개방 리딩 프레임으로부터의 번역을 감소시킬 것이기 때문이다. 이 내부 ATG들을 제거하기 위해, 네오마이신 내성 단백질 개방 리딩 프레임을 시판되는 공급자(Gene Art, Germany)에 의해 완전히 합성되었고, 여기서 모든 내부 코딩 ATG(Met의)를 CTG(Leu 코딩)의해 치환되었고 그리고 비-코딩 ATGs를 축퇴 코돈이 사용되고 생성된 단백질 서열에서 돌연변이가 없도록 치환되었고; 네오마이신의 합성된 서열을 SEQ. ID. NO. 134로 제공되었다. ATG 개시 코돈을 GTG(도 39B) 또는 TTG(도 39C)로 치환하기 위해, 합성된 네오마이신 유전자를 프라이머 쌍 NEO-F-HindⅢ (SEQ. ID. NO. 136): GATCAAGCTTTTGGATCGGCCATTGAAAC AAGACGGATTG 및 NEO EcoRI 800R (SEQ. ID. NO. 137): AAGCTTGAATTCTCAGAAGAA CTCGTCAAGAAGGCG로 증폭시켰다.
결과
모든 ATG가 제거된 네오마이신 내성 단백질의 기능성을 시험하기 위해 E.coli 박테리아를 사용하였다. E.coli 박테리아를 선택 유전자로서 GTG Neo (도 39B) 또는 TTH Neo (도 39C) 유전자를 함유하는 구조체로 형질전환시켰다. 선택은 카나마이신 상에서 박테리아를 성장시킴으로써 수행되었다. 오직 기능성 네오마이신 내성 유전자만이 카나마이신에 대한 내성을 제공할 수 있다. 변형된 Neo 유전자에 의한 형질전환은 E.coli 콜로니의 형성을 가져왔고, 그것으로부터 유전자를 함유하는 플라스미드를 단리할 수 있었다. 이것은 Neo 개방 리딩 프레임으로부터 모 든 ATG의 제거 뿐 아니라, 상기의, 네오마이신 내성 mRNA의 변형된 번역 효율이 기능성 네오마이신 내성 단백질의 생산을 가져온다는 것을 나타낸다.
돌연변이된 네오마이신 내성 유전자는 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트드에 병합되고, 진핵 숙주세포에서 G148 또는 네오마이신으로의 선택에 사용된다.
실시예 18: 차등 번역 효율을 갖는 dhfr 구조체의 생성 및 시험
dhfr 유전자에는 8개의 내부 ATG들이 있고, 그들 중 6개는 dhfr 개방 리딩 프레임 중의 메티오닌에 대해 코딩한다(도 29, 도 40A). 이들 모든 ATG들은 제거되어야만 하는데(도 40B,C), 이들은 ATG 개시 코돈 (또는 그들의 상황)이 변형되었을 때 개시코돈으로 작용할 것이고, 이것은 dhfr 단백질과 닮지않은 펩티드가 되도록하고, 본 발명의 전사 유니트에서 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 하류 개방 리딩 프레임으로부터의 번역을 감소시킬 것이기 때문이다. 내부 ATG를 제거하기 위해, 네노마이신에 대한 상기와 같이, dhfr 단백질 개방 리딩 프레임을 완전히 합성하였다(SEQ. ID. NO. 138). ATG 개시 코돈을 GTG(도 40B) 또는 TTG(도 40C)로 치환하기 위해, 합성된 DHFR 유전자를 프라이머 DHFR-F-HindⅢ(SEQ. ID. NO. 140): GATCAAGCTTTTGTTCGACCATTGAACTGCATCGTC 및 DHFR-EcoRI-600-R (SEQ. ID. NO. 141): AGCTTGAATTCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTTC로 증폭시켰다.
결과
모든 ATG가 제거된 dhfr 단백질의 기능성을 시험하기 위해 E.coli 박테리아 를 사용하였다. E.coli 박테리아를 GTG dhfr (도 40B) 또는 TTH dhfr (도 40C) 유전자를 함유하는 구조체로 형질전환시켰다. 선택은 트리메토프림(Sigma T7883-56) 상에서 박테리아를 성장시킴으로써 수행되었다. 오직 기능성 dhfr 유전자만이 트리메토프림에 대한 내성을 제공할 수 있다. 변형된 dhfr 유전자에 의한 형질전환은 E.coli 콜로니의 형성을 가져왔고, 그것으로부터 유전자를 함유하는 플라스미드를 분리할 수 있었다. 이것은 dhfr 개방 리딩 프레임으로부터 모든 ATG의 제거뿐 아니라, 상기의, dhfr mRNA의 변형된 번역 효율이 기능성 dhfr 단백질의 생산을 가져온다는 것을 나타낸다.
돌연변이된 dhfr 유전자는 본 발명의 다중시스트론성 전사 유니트에 병합되고, 진핵 숙주세포에서의 메토트레세이트로의 선택에 사용되었다.
실시예 20: PER. C6 세포에서 차등 번역 효율을 갖는 제오신- 및 블라스티시 딘 구조체의 시험
돌연변이된 개시코돈을 갖는 여러가지 제오신과 블라스티시딘 유전자 (모두 d2EGFP 유전자의 상류에 클론된) PER.C6 세포계에서 시험하였다.
결과
GTC 제오신과 GTGspace 제오신 내성 유전자 변형(실시예 14; 도 41 참조) 및 GTG 블라스티시딘과 TTG 블라스티시딘 내성 유전자 변형(또한 실시예 11; 도 42 참조) (모두 d2EGFP 유전자의 상류에 클론된) PER.C6 세포에 트랜스펙션시켰다. 도 41에 나타낸 바와 같이, GTG 제오신과 GTGspace 제오신 유전자 둘 다에 의한 트랜 스펙션은 d2EGFP를 발현하는 클로니를 가져왔다. 20개의 GTG Zeo 클로니들의 d2EGFP 형광 신호의 평균은 63.8이고, 반면 20 GTGspace Zeo 클로니들의 d2EGFP 신호 평균은 185이었고 이것은 PER.C6 세포에서도 역시 GTGspace Zeo가 GTG Zeo mRNA 보다 더 높은 번역 스트린전시를 갖는다는 것을 입증한다.
도 42에 나타낸 바와 같이, GTC 블라스티시딘과 TTG 블라스티시딘 유전자 둘 다에 의한 트랜스펙션은 d2EGFP를 발현하는 콜로니를 가져왔다. 20개의 GTG 블라스티시딘 클로니들의 d2EGFP 형광 신호의 평균은 71.4이었고, 반면 20 TTG 블라스티시딘 클로니들의 d2EGFP 신호 평균은 135이었고 이것은 PER.C6 세포에서도 역시 TTG 블라스티시딘이 GTG 브라스티시딘 mRNA보다 더 높은 번역 스트린전시를 갖는다는 것을 입증한다.
이 실험은 본 발명의 선택계는 또한 CHO 세포 이외의 다른 세포에서도 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 21: TTG 제오신- d2EGFP 구조체에 전사 중지 신호의 첨가 시험
전사중지(TRAP) 서열은, 적어도 부분적으로, 안티센스 RNA의 형성을 막거나, 적어도 부분적으로, 상기 단백질 발현 유니트에 들어가기 위한 전사를 막는다고 생각된다(WO 2004/055215 참조). TRAP 서열은 기능적으로 전사 유니트에 놓일 때 TRAP의 5' 측면 상의 핵산에서 관찰되는 전사 수준과 비교하였을 때 TARP의 3' 측면 상에 존재하는 핵산에서의 전사 수준을 감소하는 서열로 정의되고, TRAP 서열의 비-제한적인 예는 전사 종결 신호이다. 전사 유니트로 들어가기 위한 전사를 막거 나 또는 감소시키는 기능을 위해, TRAP는 전사 유니트의 프로모터 구동 발현의 상류에 놓이게 되고 TRAP는 5'에서 3' 방향이어야 한다. 안티센스 RNA의 적어도 부분적인 형성을 막기 위해, TRAP는 전사 유니트의 개방 리딩 프레임의 하류에 위치해야하고 3'에서 5' 방향으로 (즉, 일반적으로 전사 유니트에서 개방 리딩 프레임 뒤에 존재하는 전사 종결 서열의 정상적인 배향과 반대의 배향으로)존재한다. 5'에서 3' 배향으로 프로모터의 TRAP 상류와 3'에서 5' 배향의 개방 리딩 프레임의 TRAP 하류의 조합이 바람직하다. TRAP 서열을 STAR 요소에 첨가하는 것은 트랜스유전자 발현에 대한 STAR 요소들의 효과를 증진시킨다(WO 2004/055215). 여기서, 본 발명자들은 TTG Zeo 내성 유전자의 상황에서 TRAP 서열의 효과를 시험하였다.
결과
STAR7 요소(도 43)로 플랭크된 TTG 제오신-d2EGFP 카세트 (도 43)를 SPA/중지 TRAP 서열(WO 2004/055215 참조; SEQ. ID. NO. 142)을 5' STAR7의 상류(5'에서 3' 방향으로) 및 3' STAR7의 하류(3'에서 5' 방향으로) 둘 다에 첨가함에 의해 변형시켰다(도 43). 벡터를 함유하는 STAR7/7과 TRAP-STAR7/7-TRAP 둘 다를 CHO-K1으로 트랜스펙션 시켰다. 안정한 콜로니들을 단리하고 d2RGFP 형광 강도를 측정하였다. 도 43에 나타낸 바와 같이, 23 TTG Zeo STAR 7/7 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호는 455.1이었고, 반면 23 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호는 642.3이었다. 가장 높은 5 TTG Zeo STAR 7/7 콜로니에서 평균 d2EGFP 형광 신호는 705.1인 반면, 5 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP 콜로니들의 평균 d2EGFP 형광 신호는 784.7이었다.
이 결과는 TRAPs의 첨가가 가장 높은 콜로니들의 d2EGFP 형광 신호를 강화하는 것이 아니라, 고 발현 클로니들의 수를 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다. 반면, 오직 5 TTG Zeo STAR 7/7 콜로니만이 600을 넘는 d2EGFP 신호를 갖고, 17 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP 콜로니는 600을 넘는 d2EGFP 형광 신호를 가졌다.
실험에서, 각 플라스미드의 DNA 3μg을 트랜스펙션하였다. 그러나, 트랜스펙션 효율은 유사한 반면, TTG Zeo STAR 7/7 플라스미드를 갖는 콜로니들의 총 수는 62였고, 반면 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP 플라스미드를 갖는 콜로니들의 총 수는 116으로, 거의 두배였다.
본 발명자들은 변형된 제오신 내성 유전자 번역 코돈을 갖는 SRAR 함유 플라스미드를 TRAP 요소들의 첨가는 콜로니들의 총 수의 상당한 증가를 가져오고, 더 많은 수의 콜로니들이 가장 높은 발현 수준으로 존재한다는 결론을 얻었다.
실시예 22: 발현의 복사체-수 의존도
본 발명자들은 EpCAM 항체 발현 수준을 병합된 EpCAM DNA 복사체의 수와 관련하여 분석하였다.
결과
시험된 구조체는 TTG-Zeo-경쇄(LC)-TTG-Blas-중쇄(HC)였고, 두 발현 유니트들은 CMV 프로모터의 조절하에 있었다(도 44 참조). 이 구조체는 STAR 7과 67을 함유하였다(도 44 참조). 선택 조건은 배양 배지에서 제오신 200μg/㎖ 및 블라스티시딘 20μg/㎖으로 생존한 대조구 콜로니가 없고 (STAR 없음) 오직 STAR 7/67/7 콜 로니만이 생존하도록 한 것이다.
콜로니들이 제오신과 블라스티시딘 선택압 하에 60일 있었을 때 DNA를 단리하였다(도 44 참조). R2값을 계산하고 나타내었다. 5~40pg/세포/일 EpCAM의 전체 범위에서 높은 정도의 복사체 수 의존도가 있었고, 비교적 높은 R2 0.5978으로 나타났다(도 44). 이 데이터는 신규한 선택계에서, TTG Zeo-TTG Blas EpCAM STAR 7/67/7 구조체를 함유하는 콜로니에서, 복사체 수는 의존 EpCAM 발현이라는 것을 나타낸다.
실시예 23: 더 높은 EpCAM 발현의 메토트레세이트 유도
본 발명자들은 메토트레세이트(MTX)를 갖는 클론을 배양한 후 EpCAM 항체 발현 수준을 분석하였다. 이 실험의 목적은 STAR-함유 구조체의 증폭이 더 높은 EpCAM 발현을 가져오는가를 결정하는 것이었다. MTX는 dhfr 유전자 생성물의 억제를 통해 작용한다. dhfr-결핍인 몇몇 CHO 균주가 기재되고, CHO-K1은 dhfr+이다. 그러므로, 배양 배지에서 MTX의 비교적 높은 농도는 CHO-K1 세포에서 증가된 MTX 농도에 의해 증폭을 위해 선택되도록 존재하여야만 한다.
결과
시험된 구조체는 TTG-Zeo-중쇄(HC)-TTG-Blas-경쇄(LC)였고, 두 발현 유니트들은 CMV 프로모터의 조절하에 있었다. 각각의 CMV 프로모터 상류에 STAR 67이 위치되었고 STAR7은 전체 카세트에 플랭크 하도록 사용되었다 (또한, 구조체에 관하 여 실시예 13, 도 22 참조). 이 구조체를 HC와 LC 카세트 사이, 제2 STAR67의 상류에 SV40-dhfr 카세트(SV40 프로모터의 조절 하의 마우스 dhfr 유전자)를 위치시킴으로써 추가로 변형시켰다 (도 45). CHO-K1 세포를 트랜스펙션 시켰다. 선택은 배양 배지에서 제오신 100μg/㎖과 블라스티시딘 10μg/㎖으로 실시하였다. 생존한 대조구 콜로니(STAR 요소 없음)는 없었고 오직 STAR 요소를 함유하는 구조체를 갖는 콜로니들 만이 생존하였다. 콜로니들이 분리되었고 EpCAM 발현 수준을 측정하기 전에 증식시켰다. 20~35pg/세포/일 사이로 생성된 6개의 콜로니들을 100 nM MTX를 함유하는 배지로 이송하였다. 이 농도는 각 단계 사이가 2주 간격인 기간으로, 500 nM, 1000 nM 및 최종적으로 2000 nM로 증가되었다. 2000mM MTX 상에서 2주 후, EpCAM 농도를 측정하였다. 도 45에 나타낸 바와 같이, 4개의 콜로니들이 향상된 EpCAM 생산을 나타내었다. 콜로니 13: 22~30; 콜로니 14: 28~42; 콜로니 17: 20~67 및 콜로니 19: 37~67 pg/세포/일. 콜로니 4와 16은 향상된 EpCAM 발현을 나타내지 않았다. 본 발명자들은 본 발명의 선택계로 생성된 CHO-K1 콜로니들의 배양 배지에 메토트레세이트의 첨가는 향상된 단백질 발현을 가져올 수 있다고 결론지었다. 따라서, 본 발명의 STAR 요소 및 선택법은 단백질 발현 수준의 MTX-유도 강화와 조합될 수 있고 양립될 수 있다.
실시예 24: TTG - Zeo 선택이 다른 프로모터 상황에 구동한다
본 발명자들은 TTG Zeo 선택 마커의 다른 프로모터에서의 상황에서 d2EGFP 발현수준을 분석하였다. 본 발명자들은 CMV 인핸서/프로모터, SV40 인핸서/프로모 터 및 CMV 인핸서/β-액틴 프로모터의 상황에서의 STAR 요소들의 작용을 비교하였다.
결과
도 46에서, 본 발명자들은 TTG Zeo 선택 마커의 상황에서 시험된 프로모터를 나타내었다. 시험된 플라스미드들은 3개의 다른 프로모터를 갖는 나타낸 대조구 구조체과 5' 말단의 STAR7과 STAR 67 그리고 3' 말단의 STAR 7으로 플랭킹된 STAR 구조체로 구성되었다. 구조체는 CHO-K1 세포로 트랜스펙션되었고 선택은 배양 배지에서 제오신 200μg/㎖으로 수행되었다. 최대 23개까지의 독립적인 콜로니들을 단리하였고 d2EGFP 발현 수준의 분석 전에 증식시켰다. 도 46에 나타낸 바와 같이, CMV 인핸서/프로모터, SV40 인핸서/프로모터 또는 CMV 인핸서/β-액틴 프로모터를 갖는 구조체에 STAR 요소의 병합은 상응하는 대조구 구조체보다 더 높은 d2EGFP 발현 수준을 갖는 콜로니의 형성을 가져왔다. 이것은 본 발명의 선택계가 STAR 요소들과 조합하여, 다fms프로모터의 상황에서도 잘 구동한다는 것을 나타낸다. 추가의 분석은 CMV-유도된 d2EGFP값의 평균이 SV40-유도된 d2EGFP 값의 평균(p<0.05) 보다 상당히 더 높았다는 것을 나타냈다. 이와 반대로, CMV-유도된 d2EGFP 값의 평균은 CMV/β 액틴-유도된 d2EGFP값(p=0.2)과 크게 다르지 않았다.
실시예 25: TTG - Zeo 선택계에서 다른 STAR 요소들의 비교
본 발명자들은, STAR 요소들이 이 상황에서 최고의 결과를 제공한다는 더 많은 인식을 얻기 위해, CMV 프로모터-TTG Zeo 선택 마커와 53개의 다양한 STAR 요소 들의 상황에서 d2EGFP 발현 수준을 분석하였다.
결과
본 발명자들은 CMV 프로모터-TTG Zeo d2EGFP 카세트의 상류 및 하류에 53 STAR 요소들을 클론시켰다. 이와 같은 구조체에서 다음의 STAR 요소들을 시험하였다: STAR-12, 14, 15, 17-20, 26-34, 36, 37, 39, 40, 42-49, 51, 52, 54, 55, 57-62, 64, 65, 67. 구조체들을 CHO-K1 세포로 트랜스펙션되었고 배양 배지에서 제오신 200μg/㎖으로 선택을 수행하였다. 최대 24개의 독립적인 콜로니들을 단리하였고 d2EGFP 발현 수준을 분석하기 전에 증식시켰다. 구조체에 STAR 요소들의 병합은 대조구와 비교하여 다른 정도의 향상된 d2EGFP 발현을 가져왔다. 이 실험에서 STAR 요소 14, 18 그리고 55의 병합은 대조구(STAR 요소 없음) 이상의 평균 d2EGFP 발현의 증가를 가져오지 않았다. 비록 이 실험의 몇몇 구조체(STAR 요소 2, 3, 10, 42, 48 그리고 49를 갖는)에서 겨우 몇 개의 콜로니들을 생성하지만, 14, 18 그리고 55를 제외한 모든 시험된 STAR 요소들은 대조보다 높은 평균 d2EGFP 발현 수준을 가져왔다. 몇몇 STAR 요소들은 더 많은 세포 타입 특이 방식으로 작용할 것이고, STAR 14, 18 그리고 55가 여기서 시험된 조건의 특별한 세트와 다른 프로모터, 다른 선택 마커, 또는 다른 상황 또는 배치를 갖는, 다른 세포 타입에서 더 나은 작업을 할 수 있다는 것을 명심해야 한다. 10개의 STAR 요소들, 즉 STAR 요소 7, 9, 17, 27, 29, 43, 44, 45, 47 및 61의 첨가는 대조구의 평균 d2EGFP 발현 수준보다 5배 높은 평균 d2EGFP 발현 수준을 유도하였다. 본 발명자들은 대조구와 7개의 구조체를 STAR 요소들로 재형질변환시키고 실험을 반복하였다. 결과를 도 47에 나타 내었다. 구조체에의 STAR 요소들의 병합은 대조구와 비교하여 다른 정도의 향상된 d2EGFP 발현을 가져왔다(도 47). 대조구 구조체로 트랜스펙션된 콜로니에서 평균 d2EGFP 발현 수준은 29였다. 7 다른 STAR 구조체를 갖는 콜로니에서 d2EGFP 발현 수준 평균은 151(STAR 67) 내지 297(STAR 29)의 범위였다. 이것은 대조구 콜로니에서의 평균보다 5 내지 10배의 높았다. 본 발명자들은 a) SATAR 요소들의 거대한 다수성(vast majority)이 유전자 발현 수준에 긍정적인 효과를 가지고, b) 다fms STAR 요소에 의해 유도되는 긍정적 효과의 정도는 변화하며, 그리고 c) 시험된 STAR 요소들 53개 중 10개는 대조와 비교하여, 5배 이상 높은 평균 d2EGFP 발현 수준을 유도하고 STAR 요소는 대조와 비교하여 10배 이상의 평균 d2EGFP 발현 수준을 유도할 수 있다고 결론지었다.
실시예 26: 본 발명의 선택계의 상황에서 다른 크로마틴 조절 요소들
치킨 β-글로빈 좌(locus)의 좌 조절 영역(Chung et al, 1997), 매트릭스 부착 영역(MAR)(Stief et al, 1989) 및 유비쿼터스 크로마틴 개방 요소(UCOE)(Williams et al, 2005)에서의 HS4 초민감 부위와 같은 DNA 요소들이, 이들 DNA 요소들이 벡터에 병합될 때 유전자 발현에 대한 유리한 효과를 갖는다는 것이 보고되어 있다. 본 발명자들은 본 발명의 선택계에 이들 DNA 요소들을 결합하였다.
결과
1.25kb HS4 요소들을 CMV 프로모터, TTG Zeo 및 d2EGFP를 포함하는 카세트에 3방식 결찰 단계에 의해 클론시켜 2 HS4 요소들의 직렬을 갖는 구조체를 얻었다 (Chung et al, 1997). 이 단계를 CMV 프로모터, TTG Zeo 및 d2EGFP를 포함하는 카세트의 5' 및 3' 둘다에 실시하였다. 2959 bp 긴(long) 치킨 이소자임 MAR(Stief et al, 1989)를 CMV 프로모터, TTG Zeo 및 d2EGFP를 포함하는 카세트의 5' 및 3'에 클론시켰다.
2614 bp 긴 UCOE(William et al., 2005)는 뉴클레오티드 29449 내지 32063에 대응하는, 인간 BAC 클론(RP11-93D5)로부터 절개된 NotI-KpnI 단편이었다. 이 단편은 CMV 프로모터의 5'에 클론되었다.
STAR 구조체는 CMV 프로모터의 STAR7과 STAR67 5'와 카세트의 STAR 3'를 함유했다. 이들 4개의 구조체는 플랭킹 크로마틴 조절 DNA 요소들이 없는 대조구 구조체과 마찬가지로, CHO-K1 세포에 트랜스펙션되었다. 선택은 배양 배지에서 제오신 200μg/㎖으로 수행하였다. 콜로니들을 단리시키고, 증식시키고 d2EGFP 발현 수준을 측정하였다. 도 48에 나타낸 바와 같이, 모든 DNA 요소들을 갖는 구조체는 d2EGFP 발현 콜로니의 형성을 가져왔다. 그러나, 2xHS4 요소와 UCOE의 병합은, 대조구 콜로니들과 비교하여, 더 높은 d2EGFP 발현 수준을 나타내는 콜로니의 형성을 가져오지 않았다. 반대로, 리소자임 MAR의 병합은 d2EGFP를 상당히 높게 발현하는 콜로니를 형성하였다. MAR 함유 구조체에 의해 유도된 평균 발현 수준은 대조구 콜로니에서 보다 4배 높았다. 그러나 최고의 결과는 구조체에 STAR 7과 67을 병합하였을 때 얻어졌다. 대조구 콜로니와 비교하여, 평균 d2EGFP 발현 수준에서 거의 10배의 증가가 관찰되었다. 본 발명자들은 MAR과 같은 다른 크로마틴 조절 DNA 요소들이 본 발명의 선택계의 상황에서 사용될 수 있다고 결론지었다. 그러나, 최고의 결과는 STAR 요소들이 크로마틴 조절 요소로 사용되었을 때 얻어졌다.
참 고 문 헌
Figure 112007033851337-PCT00002
Figure 112007033851337-PCT00003
Figure 112007033851337-PCT00004
Figure 112007033851337-PCT00005
Figure 112007033851337-PCT00006
SEQUENCE LISTING <110> ChromaGenics B.V. Otte, Arie P. Kwaks, Theodorus H.J. Sewalt, Richard G.A.B. van Blokland, Rik <120> Selection of host cells expressing protein at high levels <130> 0117 US P01 PRO <160> 142 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 749 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR1 <400> 1 atgcggtggg ggcgcgccag agactcgtgg gatccttggc ttggatgttt ggatctttct 60 gagttgcctg tgccgcgaaa gacaggtaca tttctgatta ggcctgtgaa gcctcctgga 120 ggaccatctc attaagacga tggtattgga gggagagtca cagaaagaac tgtggcccct 180 ccctcactgc aaaacggaag tgattttatt ttaatgggag ttggaatatg tgagggctgc 240 aggaaccagt ctccctcctt cttggttgga aaagctgggg ctggcctcag agacaggttt 300 tttggccccg ctgggctggg cagtctagtc gaccctttgt agactgtgca cacccctaga 360 agagcaacta cccctataca ccaggctggc tcaagtgaaa ggggctctgg gctccagtct 420 ggaaaatctg gtgtcctggg gacctctggt cttgcttctc tcctcccctg cactggctct 480 gggtgcttat ctctgcagaa gcttctcgct agcaaaccca cattcagcgc cctgtagctg 540 aacacagcac aaaaagccct agagatcaaa agcattagta tgggcagttg agcgggaggt 600 gaatatttaa cgcttttgtt catcaataac 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cgnngnnacn aannnnttcc c 1701 <210> 32 <211> 771 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR32 <400> 32 gatcacacag cttgtatgtg ggagctagga ttggaacccc agaagtctgg ccccaggttc 60 atgctctcac ccactgcata caatggcctc tcataaatca atccagtata aaacattaga 120 atctgcttta aaaccataga attagtagcg taagtaataa atgcagagac catgcagtga 180 atggcattcc tggaaaaagc ccccagaagg aattttaaat cagctttcgt ctaatcttga 240 gcagctagtt agcaaatatg agaatacagt tgttcccaga taatgcttta tgtctgacca 300 tcttaaactg gcgctgtttt tcaaaaactt aaaaacaaaa tccatgactc ttttaattat 360 aaaagtgata catgtctact tgggaggctg aggtggtggg aggatggctt gagtttgagg 420 ctgcagtatg ctactatcat gcctataaat agccgctgca ttccagcttg ggcaacatac 480 ccaggcccta tctcaaaaaa ataaaaagta atacatctac attgaagaaa attaatttta 540 ttgggttttt ttgcattttt attatacaca gcacacacag cacatatgaa aaaatgggta 600 tgaactcagg cattcaactg gaagaacagt actaaatcaa tgtccatgta gtcagcgtga 660 ctgaggttgg tttgtttttt cttttttctt ctcttctctt ctcttttctt tttttttgag 720 acggagcttt gctctttttg cccaggcttg attgcaatgg cgtgatctca g 771 <210> 33 <211> 1368 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR33 <400> 33 gcttttatcc tccattcaca gctagcctgg cccccagagt acccaattct ccctaaaaaa 60 cggtcatgct gtatagatgt gtgtggcttg gtagtgctaa agtggccaca tacagagctc 120 tgacaccaaa cctcaggacc atgttcatgc cttctcactg agttctggct tgttcgtgac 180 acattatgac attatgatta tgatgacttg tgagagcctc agtcttctat agcactttta 240 gaatgcttta taaaaaccat ggggatgtca ttatattcta acctgttagc acttctgttc 300 gtattaccca tcacatccca acatcaattc tcatatatgc aggtacctct tgtcacgcgc 360 gtccatgtaa ggagaccaca aaacaggctt tgtttgagca acaaggtttt tatttcacct 420 gggtgcaggt gggctgagtc tgaaaagaga gtcagtgaag ggagacaggg gtgggtccac 480 tttataagat ttgggtaggt agtggaaaat tacaatcaaa gggggttgtt ctctggctgg 540 ccagggtggg ggtcacaagg tgctcagtgg gagagccttt gagccaggat gagccagaag 600 gaatttcaca aggtaatgtc atcagttaag gcagggactg gccattttca cttcttttgt 660 ggtggaatgt catcagttaa ggcaggaacc ggccattttc acttcttttg tgattcttca 720 cttgcttcag gccatctgga cgtataggtg caggtcacag tcacagggga taagatggca 780 atggcatagc ttgggctcag aggcctgaca cctctgagaa actaaagatt ataaaaatga 840 tggtcgcttc tattgcaaat ctgtgtttat tgtcaagagg cacttatttg tcaattaaga 900 acccagtggt agaatcgaat gtccgaatgt aaaacaaaat acaaaacctc tgtgtgtgtg 960 tgtgtgtgag tgtgtgtgta tgtgtgtgtg tgtgtattag agaggaaaag cctgtatttg 1020 gaggtgtgat tcttagattc taggttcttt cctgcccacc ccatatgcac ccaccccaca 1080 aaagaacaaa caacaaatcc caggacatct tagcgcaaca tttcagtttg catattttac 1140 atatttactt ttcttacata ttaaaaaact gaaaatttta tgaacacgct aagttagatt 1200 ttaaattaag tttgttttta cactgaaaat aatttaatat ttgtgaagaa tactaataca 1260 ttggtatatt tcattttctt aaaattctga acccctcttc ccttatttcc ttttgacccg 1320 attggtgtat tggtcatgtg actcatggat ttgccttaag gcaggagg 1368 <210> 34 <211> 755 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR34 <400> 34 actgggcacc ctcctaggca ggggaatgtg agaactgccg ctgctctggg gctgggcgcc 60 atgtcacagc aggagggagg acggtgttac accacgtggg aaggactcag ggtggtcagc 120 cacaaagctg ctggtgatga ccaggggctt gtgtcttcac tctgcagccc taacacccag 180 gctgggttcg ctaggctcca tcctgggggt gcagaccctg agagtgatgc cagtgggagc 240 ctcccgcccc tccccttcct cgaaggccca ggggtcaaac agtgtagact cagaggcctg 300 agggcacatg tttatttagc agacaaggtg gggctccatc agcggggtgg cctggggagc 360 agctgcatgg gtggcactgt ggggagggtc tcccagctcc ctcaatggtg ttcgggctgg 420 tgcggcagct ggcggcaccc tggacagagg tggatatgag ggtgatgggt ggggaaatgg 480 gaggcacccg agatggggac agcagaataa agacagcagc agtgctgggg ggcaggggga 540 tgagcaaagg caggcccaag acccccagcc cactgcaccc tggcctccca caagccccct 600 cgcagccgcc cagccacact cactgtgcac tcagccgtcg atacactggt ctgttaggga 660 gaaagtccgt cagaacaggc agctgtgtgt gtgtgtgcgt gtatgagtgt gtgtgtgtga 720 tccctgactg ccaggtcctc tgcactgccc ctggg 755 <210> 35 <211> 1193 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR35 <220> <221> misc_feature <222> (312)..(312) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (355)..(355) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> 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gggcagtatg gccattttca caatgttgat tcttcctatc catgatgatg gaatgttctt 180 ccattagttt gtatcctctt ttatttcctt gagcagtggt ttgtagttct ccttgaagag 240 gtccttcaca tcccttgtaa gttggattcc taggtatttt attctctttg aagcaaattg 300 tgaatgggag tncactcacg atttggctct ctgtttgtct gctgggtgta taaanaatgt 360 ngtgatnttn gtacattgat ttngtatccn tgagacttng ctgaatttgc ttnatcngct 420 tnngggaacc ttttgggctg aaacnatggg attttctaaa tatacaatca tgtcgtctgc 480 aaacagggaa caatttgact tcctcttttc ctaattgaat acactttatc tccttctcct 540 gcctaattgc cctgggcaaa acttccaaca ctatgntngn aataggagnt ggtgagagag 600 ggcatccctg ttcttgttgc cagnttttca aagggaatgc ttccagtttt ggcccattca 660 gtatgatatg ggctgtgggt ngtgtcataa atagctctta tnattttgaa atgtgtccca 720 tcaataccta atttattgaa agtttttagc atgaangcat ngttgaattt ggtcaaaggc 780 tttttctgca tctatggaaa taatcatgtg gtttttgtct ttggctcntg tttatatgct 840 ggatnacatt tattgatttg tgtatatnga acccagcctn ncatcccagg gatgaagccc 900 acttgatcca agcttggcgc gcngnctagc tcgaggcagg caaaagtatg caaagcatgc 960 atctcaatta gtcagcaccc atagtccgcc cctacctccg cccatccgcc cctaactcng 1020 nccgttcgcc cattctcgcc catggctgac taatnttttt annatccaag cggngccgcc 1080 ctgcttganc attcagagtn nagagnnttg gaggccnagc cttgcaaaac tccggacngn 1140 ttctnnggat tgaccccnnt taaatatttg gttttttgtn ttttcanngg nga 1193 <210> 36 <211> 1712 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR36 <400> 36 gatcccatcc ttagcctcat cgatacctcc tgctcacctg tcagtgcctc tggagtgtgt 60 gtctagccca ggcccatccc ctggaactca ggggactcag gactagtggg catgtacact 120 tggcctcagg ggactcagga ttagtgagcc ccacatgtac acttggcctc agtggactca 180 ggactagtga gccccacatg tacacttggc ctcaggggac tcaggattag tgagccccca 240 catgtacact tggcctcagg ggactcagga ttagtgagcc ccacatgtac acttggcctc 300 aggggactca ggactagtga gccccacatg tacacttggc ctcaggggac tcagaactag 360 tgagccccac atgtacactt ggcttcaggg gactcaggat tagtgagccc cacatgtaca 420 cttggacacg tgaaccacat cgatgtgctg cagagctcag ccctctgcag atgaaatgtg 480 gtcatggcat tccttcacag tggcacccct cgttccctcc ccacctcatc tcccattctt 540 gtctgtcttc agcacctgcc atgtccagcc ggcagattcc accgcagcat cttctgcagc 600 acccccgacc acacacctcc ccagcgcctg cttggccctc cagcccagct cccgcctttc 660 ttccttgggg aagctccctg gacagacacc ccctcctccc agccatggct ttttcctgct 720 ctgccccacg cgggaccctg ccctggatgt gctacaatag acacatcaga tacagtcctt 780 cctcagcagc cggcagaccc agggtggact gctcggggcc tgcctgtgag gtcacacagg 840 tgtcgttaac ttgccatctc agcaactagt gaatatgggc agatgctacc ttccttccgg 900 ttccctggtg agaggtactg gtggatgtcc tgtgttgccg gccacctttt gtccctggat 960 gccatttatt tttttccaca aatatttccc aggtctcttc tgtgtgcaag gtattagggc 1020 tgcagcgggg gccaggccac agatctctgt cctgagaaga cttggattct agtgcaggag 1080 actgaagtgt atcacaccaa tcagtgtaaa ttgttaactg ccacaaggag aaaggccagg 1140 aaggagtggg gcatggtggt gttctagtgt tacaagaaga agccagggag ggcttcctgg 1200 atgaagtggc atctgacctg ggatctggag gaggagaaaa atgtcccaaa agagcagaga 1260 gcccacccta ggctctgcac caggaggcaa cttgctgggc ttatggaatt cagagggcaa 1320 gtgataagca gaaagtcctt gggggccaca attaggattt ctgtcttcta aagggcctct 1380 gccctctgct gtgtgacctt gggcaagtta cttcacctct agtgctttgg ttgcctcatc 1440 tgtaaagtgg tgaggataat gctatcacac tggttgagaa ttgaagtaat tattgctgca 1500 aagggcttat aagggtgtct aatactagta ctagtaggta cttcatgtgt cttgacaatt 1560 ttaatcatta ttattttgtc atcaccgtca ctcttccagg ggactaatgt ccctgctgtt 1620 ctgtccaaat taaacattgt ttatccctgt gggcatctgg cgaggtggct aggaaagcct 1680 ggagctgttt cctgttgacg tgccagacta gt 1712 <210> 37 <211> 1321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR37 <400> 37 aggatcacat ttaaggaagt gtgtggggtc cctggatgac accagcaccc agtgcggctc 60 tgtctggcaa ccgctcccaa ggtggcagga gtgggtgtcc cctgtgtgtc agtgggcagc 120 tcctgctgag cctacagctc actggggagc ctgacagcgg ggccatgtgc ctgacactcc 180 tctctgcttg tggacctggc aaggcaggga gcagaaaaca gagccacttg aaggctttct 240 gtctgcgtct gtgtgcagtg tggatttagt tgtgcttttt tcttgctggg agagcacagc 300 caccatttac aagcagtgtc accctcatgg gtggcgagga cagaacagga gcctctgctc 360 tctgtaccta tctgggcccg gtgggctccc ttgtcctggc ttccatctct gtctcagcga 420 ccattcagcc ctgcgcagga acacatgttg cttagaaaag ccaaattcag cccttgtctc 480 tgcctcctct ggtctcatga tgtgcatctg ttaccttgaa actggaaacc agtctatcaa 540 tgtctgtgcc aattttttat tccctcccca acctccttcc ccatacgact ttttatttat 600 gtaggatgtg tgctgtctaa tgatgggatg accacatttt tccatgttct aaaagtgctc 660 ctctcccgca gggtcccagg gctggtggtt gctttgggtc tacagctacg tcttacccgc 720 ctcctgcctc aacagcctgt gtggtggcaa agccggtgtg gggctgggga acgcagcgtt 780 ctccaggagg gggacccggc tctccttctg cagtgcaggc gaaggcctag atgccagtgt 840 gacctcccac aaggcgtggc ttccagactc cccggctgga agtgatgctt ttttgcctcc 900 ggccctgggt ttgaagcagc ctggctttct cttggtaagt ggctggtgtc ttagcagctg 960 caatctgagc tcagccacct acacaccacc gtggccgaca ctttcattaa aaagtttcct 1020 gagacgactt gcgtgcatgt tgacttcatg atcagcgccg ctgggaagaa cccctgagcc 1080 ggtggggtgg ggctggaagc agcaggtgca gtgatggggc tgggtgccca ggaggcctca 1140 gtgctcaatc aggccaaggt ggccaagccc aggctgcagg gaaggccggc ctgggggttg 1200 tgggtgagca caggcaggca ccagctgggc agtgttagga tgctggagca gcatccgtaa 1260 ccccactgag 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ctgtaagggg aaggtgtgcc aggtgcaagt ggagctctaa 1740 tgtaaaatcg cacctgagtc tcctggtctt atgagtnctg ggtgtacccc agtgaaaggt 1800 cctgctgcca ccaagtgggc catggttcag ctgtgtaagt gctgagcggc agccggaccg 1860 cttcctctaa cttcacctcc aaaggcacag tgcacctggt tcctccagca ctcagctgcg 1920 aggcccctag ccagggtccc ggcccccggc ccccggcagc tgctccagct tccttcccca 1980 cagcattcag gatggtctgc gttcatgtag acctttgttt tcagtctgtg ctccgaggtc 2040 actggcagca ctagccccgg ctcctgt 2067 <210> 61 <211> 1470 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR61 <220> <221> misc_feature <222> (130)..(130) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (196)..(196) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (205)..(205) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (220)..(220) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (262)..(262) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (332)..(332) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (856)..(856) 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atttgctttt ttcaagaggt caagagaaag gaaagtgtga 840 ggtttctgtt ttttactgac aatttgtttg ttgatttgtt ttcccaccca gaggttcctt 900 gccactttgc caggctggaa ggcagacttc ttctggtgtc ctgttcacag acggggcagc 960 ctgcggaagg ccctgccaca tgcagggcct cggtcctcat tcccttgcat gtggacccgg 1020 gcgtgactcc tgttcaggct ggcacttccc agagctgagc cccagcctga ccttcctccc 1080 atactgtctt cacaccccct cctttcttct gatacctgga ggttttcctt tctttcctgt 1140 cacctccact tggattttaa atcctctgtc tgtggaattg tattcggcac aggaagatgc 1200 ttgcaagggc caggctcatc agccctgtcc ctgctgctgg aagcagcaca gcagagcctc 1260 atgctcaggc tgagatggag cagaggcctg cagacgagca cccagctcag ctggggttgg 1320 cgccgatggt ggagggtcct cgaaagctct ggggacgatg gcagagctat tggcagggga 1380 gccgcagggt cttttgagcc cttaaaagat ctct 1414 <210> 65 <211> 1310 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR65 <400> 65 gtgaatgttg atggatcaaa tatctttctg tgttgtttat caaagttaaa ataaatgtgg 60 tcatttaaag gacaaaagat gaggggttgg agtctgttca agcaaagggt atattaggag 120 aaaagcagaa ttctctccct gtgaagggac agtgactcct attttccacc tcatttttac 180 taactctcct aactatctgc ttaggtagag atatatccat gtacatttat aaaccacagt 240 gaatcatttg attttggaat aaagatagta taaaatgtgt cccagtgttg atatacatca 300 tacattaaat atgtctggca gtgttctaat tttacagttg tccaaagata atgttagggc 360 atactggcta tggatgaagc tccaatgttc agattgcaaa gaaacttaga attttactaa 420 tgaaaccaaa tacatcccaa gaaatttttc agaagaaaaa aagagaaact agtagcaaag 480 taaagaatca ccacaatatc atcagatttt ttttatatgt agaatattta ttcagttctt 540 ttttcaagta caccttgtct tcattcattg tactttattt tttgtgaagg tttaaattta 600 tttcttctat gtgtttagtg atatttaaaa tttttattta atcaagttta tcagaaagtt 660 ctgttagaaa atatgacgag gctttaattc cgccatctat attttccgct attatataaa 720 gataattgtt ttctcttttt aaaacaactt gaattgggat tttatatcat aattttttaa 780 tgtctttttt tattatactt taagttctgg gatacatgtg cagaacgtgc aggtgtgtta 840 catagatata cacgtgccat ggtggtttgc tgcacccact aacctgttat cgacattagg 900 tatttctcct aatgctatca ccccctattt ccccaccccc cgagaggccc cagtgtgtga 960 tgttctcctc cctgtgtcca tgtgttctca ttgttcatct cccacttatg gtatctacca 1020 taaccttgaa attgtcttat gcattcactt gtttggttgt tatatagcct ccatcaggac 1080 agggatattt gctgctgctt cttttttttt tctttttgag acagtcttgc tccgtcatcc 1140 aggctggagt gcttctcggc tcaatgcaac ctccacctcc caggtttaag cgattctcca 1200 acttcagcct cccaaatggc tgggactgca ggcatgcacc actacacctg gctaattttt 1260 gtatttgtaa tagagacaat gtttcaccat gttggccagg ctggtctcga 1310 <210> 66 <211> 1917 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR67 <400> 66 aggatcctaa aattttgtga ccctagagca agtactaact atgaaagtga aatagagaat 60 gaaggaatta tttaattaag tccagcaaaa cccaaccaaa tcatctgtaa aatatatttg 120 ttttcaacat ccaggtattt tctgtgtaaa aggttgagtt gtatgctgac ttattgggaa 180 aaataattga gttttcccct tcactttgcc agtgagagga aatcagtact gtaattgtta 240 aaggttaccc atacctacct ctactaccgt ctagcatagg taaagtaatg tacactgtga 300 agtttcctgc ttgactgtaa tgttttcagt ttcatcccat tgattcaaca gctatttatt 360 cagcacttac tacaaccatg ctggaaaccc aagagtaaat aggctgtgtt actcaacagg 420 actgaggtac agccgaactg tcaggcaagg ttgctgtcct ttggacttgc ctgctttctc 480 tctatgtagg aagaagaaat ggacataccg tccaggaaat agatatatgt tacatttcct 540 tattccataa ttaatattaa taaccctgga cagaaactac caagtttcta gacccttata 600 gtaccacctt accctttctg gatgaatcct tcacatgttg atacatttta tccaaatgaa 660 aattttggta ctgtaggtat aacagacaaa gagagaacag aaaactagag atgaagtttg 720 ggaaaaggtc aagaaagtaa ataatgcttc tagaagacac aaaaagaaaa atgaaatggt 780 aatgttggga aagttttaat acattttgcc ctaaggaaaa aaactacttg ttgaaattct 840 acttaagact ggaccttttc tctaaaaatt gtgcttgatg tgaattaaag caacacaggg 900 aaatttatgg gctccttcta agttctaccc aactcaccgc aaaactgttc ctagtaggtg 960 tggtatactc tttcagattc tttgtgtgta tgtatatgtg tgtgtgtgtg tgtgtttgta 1020 tgtgtacagt ctatatacat atgtgtacct acatgtgtgt atatataaat atatatttac 1080 ctggatgaaa tagcatatta tagaatattc ttttttcttt aaatatatat gtgcatacat 1140 atgtatatgc acatatatac ataaatgtag atatagctag gtaggcattc atgtgaaaca 1200 aagaagccta ttacttttta atggttgcat gatattccat cataggagta tagtacaact 1260 tatgtaacac acatttggct tgttgtaaaa ttttggtatt aataaaatag cacatatcat 1320 gcaaagacac ccttgcatag gtctattcat tctttgattt ttaccttagg acaaaattta 1380 aaagtagaat ttctgggtca agcagtatgc tcatttaaaa tgtcattgca tatttccaaa 1440 ttgtcctcca gaaaagtagt aacagtaaca attgatggac tgcgtgtttt ctaaaacttg 1500 catttttttc cttattggtg aggtttggca ttttccatat gtttattggc attttaattt 1560 tttttggttc atgtctttta ttcccttcct gcaaatttgt ggtgtgtctc aactttattt 1620 atactctcat tttcataatt ttctaaagga atttgacttt aaaaaaataa gacagccaat 1680 gctttggttt aatttcattg ctgctttttg aagtgactgc tgtgttttta tatactttta 1740 tattttgttg ttttagcaaa ttcttctata ttataattgt gtatgctgga acaaaaagtt 1800 atatttctta atctagataa aatatttcaa gatgttgtaa ttacagtccc ctctaaaatc 1860 atataaatag acgcatagct gtgtgatttg taattagtta tgtccattga tagatcc 1917 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for making linker containing MCSII of pd2EGFP-link <400> 67 gtacggatat cagatcttta attaag 26 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for making linker containing MCSII of pd2EGFP-link <400> 68 gtaccttaat taaagatctg atat 24 <210> 69 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of 0.37 kb from pd2EGFP <400> 69 gatcagatct ggcgcgccat ttaaatcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac gg 52 <210> 70 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of 0.37 kb from pd2EGFP <400> 70 aggcggatcc gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg g 41 <210> 71 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying zeocin resistance gene ORF <400> 71 gatcggatcc ttcgaaatgg ccaagttgac cagtgc 36 <210> 72 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying zeocin resistance gene ORF <400> 72 aggcgcggcc gcaattctca gtcctgctcc tc 32 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP ORF <400> 73 gatcgaattc tcgcgaatgg tgagcaagca gatcctgaag 40 <210> 74 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP ORF <400> 74 aggcgaattc accggtgttt aaacttacac ccactcgtgc 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ctcgccgatc tcggtggtgg ccggc 45 <210> 88 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ZEO-VALreverse <400> 88 aggccccgcc cccacggctg ctcgccgatc tcggtccacg ccgg 44 <210> 89 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence around startcodon of wt d2EGFP <400> 89 gaattcatgg g 11 <210> 90 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer d2EGFPforwardBamHI <400> 90 gatcggatcc tatgaggaat tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggag 49 <210> 91 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer d2EGFPreverseNotI <400> 91 aaggaaaaaa gcggccgcct acacattgat cctagcagaa g 41 <210> 92 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 92 tcgatccaaa gactgccaaa tctagatccg agattttcag gagctaagga agctaaa 57 <210> 93 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ZEOforwardBamHI-ATGmut/space <400> 93 gatcggatcc ttggtttatg tcgatccaaa gactgccaaa tctagatccg agattttcag 60 gagctaagga agctaaagcc aagttgacca gtgaagttc 99 <210> 94 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> 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Leu Ser Gln Glu Glu Ser Thr Leu Ile Glu Arg Ala 1 5 10 15 acg gct aca atc aac agc atc ccc atc tct gaa gac tac agc gtc gcc 96 Thr Ala Thr Ile Asn Ser Ile Pro Ile Ser Glu Asp Tyr Ser Val Ala 20 25 30 agc gca gct ctc tct agc gac ggc cgc atc ttc act ggt gtc aat gta 144 Ser Ala Ala Leu Ser Ser Asp Gly Arg Ile Phe Thr Gly Val Asn Val 35 40 45 tat cat ttt act ggg gga cct tgt gca gaa ctc gtg gtg ctg ggc act 192 Tyr His Phe Thr Gly Gly Pro Cys Ala Glu Leu Val Val Leu Gly Thr 50 55 60 gct gct gct gcg gca gct ggc aac ctg act tgt atc gtc gcg atc gga 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asn Leu Thr Cys Ile Val Ala Ile Gly 65 70 75 80 aat gag aac agg ggc atc ttg agc ccc tgc gga cgg tgc cga cag gtg 288 Asn Glu Asn Arg Gly Ile Leu Ser Pro Cys Gly Arg Cys Arg Gln Val 85 90 95 ctt ctc gat ctg cat cct ggg atc aaa gcc ata gtg aag gac agt gat 336 Leu Leu Asp Leu His Pro Gly Ile Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp 100 105 110 gga cag ccg acg gca gtt ggg att cgt gaa ttg ctg ccc tct ggt tat 384 Gly Gln Pro Thr Ala Val 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atg ctc cgc att ggt ctt gac 816 Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp 260 265 270 caa ctc tat cag agc ttg gtt gac ggc aat ttc gat gat gca gct tgg 864 Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp 275 280 285 gcg cag ggt cga tgc gac gca atc gtc cga tcc gga gcc ggg act gtc 912 Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val 290 295 300 ggg cgt aca caa atc gcc cgc aga agc gcg gcc gtc tgg acc gat ggc 960 Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly 305 310 315 320 tgt gta gaa gta ctc gcc gat agt gga aac cga cgc ccc agc act cgt 1008 Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg 325 330 335 ccg gag gca aag gaa ttc ggg aga tgg ggg agg cta act gaa aca cgg 1056 Pro Glu Ala Lys Glu Phe Gly Arg Trp Gly Arg Leu Thr Glu Thr Arg 340 345 350 aag gag aca ata ccg gaa gga acc cgc gct atg acg gca ata aaa aga 1104 Lys Glu Thr Ile Pro Glu Gly Thr Arg Ala Met Thr Ala Ile Lys Arg 355 360 365 cag aat aaa acg cac 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His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 ttg cat cgt gtg tgt gaa gac ttt gga gtg ata gca acc ttt gat cct 720 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 aag ccc att cct ggg aac tgg aat ggt gca ggc tgc cat acc aac ttc 768 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 agc acc aag gcc atg cgg gag gag aat ggt ctg aag tac atc gag gag 816 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 gcc att gag aaa cta agc aag cgg cac cag tac cac atc cgt gcc tat 864 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 gat ccc aag gga ggc ctg gac aat gcc cga cgt cta act gga ttc cat 912 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 gaa acc tcc aac atc aac gac ttt tct ggt ggt gta gcc aat cgt agc 960 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Gly Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 gcc agc ata cgc att ccc cgg act gtt ggc cag gag aag aag ggt tac 1008 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 ttt gaa gat cgt cgc ccc tct gcc aac tgc gac ccc ttt tcg gtg aca 1056 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ser Val Thr 340 345 350 gaa gcc ctc atc cgc acg tgt ctt ctc aat gaa acc ggc gat gag ccc 1104 Glu Ala Leu Ile Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 ttc cag tac aaa aat ta 1121 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 121 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> wt glutamine synthase gene (human) <400> 121 Met Thr Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Val 1 5 10 15 Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Ile Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Ser Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Leu Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Val 65 70 75 80 Pro Ala Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Arg Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Thr Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Arg Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Ala Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Ser Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Gly Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ser Val Thr 340 345 350 Glu Ala Leu Ile Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 122 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GTGspaceBamHIF <400> 122 gaattcggat ccaccgtggc gatccaaaga ctgccaaatc tag 43 <210> 123 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ZEOTTTGTGBamHIF <400> 123 gaattcggat cctttgtggc caagttgacc agtgccgttc cg 42 <210> 124 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer ZEOForwardGTG-Thr9 <400> 124 aattggatcc accgtggcca agttgaccag tgccgttacc gtgctc 46 <210> 125 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pimer ZEOForward GTG-Phe9 <400> 125 aattggatcc accgtggcca agttgaccag tgccgttttc gtgctc 46 <210> 126 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer TTGspaceBamHIF <400> 126 gaattcggat ccaccttggc gatccaaaga ctgccaaatc tag 43 <210> 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<212> DNA <213> Artificial <220> <223> modified neomycin resistance gene lacking internal ATG sequences <220> <221> CDS <222> (1)..(804) <400> 134 atg gga tcg gcc att gaa caa gac gga ttg cac gca ggt tct ccg gcc 48 Met Gly Ser Ala Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala 1 5 10 15 gct tgg gtg gag agg cta ttc ggc tac gac tgg gca caa cag aca atc 96 Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile 20 25 30 ggc tgc tct gac gcc gcc gtg ttc cgg ctg tca gcg cag ggg cgc ccg 144 Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro 35 40 45 gtt ctt ttt gtc aag acc gac ctg tcc ggt gcc ctg aac gaa ctg cag 192 Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln 50 55 60 gac gag gca gcg cgg cta tcg tgg ctg gcc acg acg ggc gtt cct tgc 240 Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys 65 70 75 80 gca gct gtg ctc gac gtt gtc act gaa gcg gga agg gac tgg ctg cta 288 Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu 85 90 95 ttg 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200 205 ttc atc gac tgt ggc cgg ctg ggt gtg gcg gac cgc tat cag gac ata 672 Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile 210 215 220 gcg ttg gct acc cgt gat att gct gaa gag ctt ggc ggc gag tgg gct 720 Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala 225 230 235 240 gac cgc ttc ctc gtg ctt tac ggt atc gcc gct ccc gat tcg cag cgc 768 Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg 245 250 255 atc gcc ttc tat cgc ctt ctt gac gag ttc ttc tga 804 Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 265 <210> 135 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified neomycin resistance gene lacking internal ATG sequences <400> 135 Met Gly Ser Ala Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile 20 25 30 Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro 35 40 45 Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys 65 70 75 80 Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro 100 105 110 Ala Glu Lys Val Ser Ile Leu Ala Asp Ala Leu Arg Arg Leu His Thr 115 120 125 Leu Asp Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile 130 135 140 Glu Arg Ala Arg Thr Arg Leu Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp 145 150 155 160 Leu Asp Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg 165 170 175 Leu Lys Ala Arg Leu Pro Asp Gly Asp Asp Leu Val Val Thr His Gly 180 185 190 Asp Ala Cys Leu Pro Asn Ile Leu Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile 210 215 220 Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala 225 230 235 240 Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg 245 250 255 Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 265 <210> 136 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer NEO-F-HindIII <400> 136 gatcaagctt ttggatcggc cattgaaaca agacggattg 40 <210> 137 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer NEO EcoRI 800R <400> 137 aagcttgaat tctcagaaga actcgtcaag aaggcg 36 <210> 138 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> modified dhfr gene lacking internal ATG sequences <220> <221> CDS <222> (1)..(564) <400> 138 atg gtt cga cca ttg aac tgc atc gtc gcc gtg tcc caa aat ctg ggg 48 Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 att ggc aag aac gga gac cta ccc tgg cct ccg ctc agg aac gag ttc 96 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30 aag tac ttc caa aga ctg acc aca acc tct tca gtg gaa ggt aaa cag 144 Lys Tyr Phe Gln Arg Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 aat ctg gtg att ctg ggt agg aaa acc tgg ttc tcc att cct gag aag 192 Asn Leu Val Ile Leu Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 aat cga cct tta aag gac aga att aat ata gtt ctc agt aga gaa ctc 240 Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 aaa gaa cca cca cga gga gct cat ttt ctt gcc aaa agt ttg gac gac 288 Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp 85 90 95 gcc tta aga ctt att gaa caa ccg gaa ttg gca agt aaa gta gac ctg 336 Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Leu 100 105 110 gtt tgg ata gtc gga ggc agt tct gtt tac cag gaa gcc ctg aat caa 384 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Leu Asn Gln 115 120 125 cca ggc cac ctc aga ctc ttt gtg aca agg att ctg cag gaa ttt gaa 432 Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Leu Gln Glu Phe Glu 130 135 140 agt gac acg ttt ttc cca gaa att gat ttg ggg aaa tat aaa ctt ctc 480 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 cca gaa tac cca ggc gtc ctc tct gag gtc cag gag gaa aaa ggc atc 528 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 aag tat aag ttt gaa gtc tac gag aag aaa gac taa 564 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 139 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified dhfr gene lacking internal ATG sequences <400> 139 Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30 Lys Tyr Phe Gln Arg Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Leu Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Leu 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Leu Asn Gln 115 120 125 Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Leu Gln Glu Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 140 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer DHFR-F-HindIII <400> 140 gatcaagctt ttgttcgacc attgaactgc atcgtc 36 <210> 141 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer DHFR-EcoRI-600-R <400> 141 aagcttgaat tcttagtctt tcttctcgta gacttc 36 <210> 142 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> combined synthetic polyadenylation sequence and pausing signal from the human alpha2 globin gene <220> <221> synthetic polyadenylation sequence <222> (1)..(49) <220> <221> cloning site <222> (50)..(62) <220> <221> pausing signal from the human alpha2 globin gene <222> (63)..(154) <400> 142 aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 60 ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 120 cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctct 154

Claims (40)

  1. i) 진핵 숙주세포에서 기능성인 선택성 마커 폴리펩티드 및 ii) 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 다중시스트론 전사 유니트를 포함하는 DNA 분자로, 상기 관심의 폴리펩티드는 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 번역 개시서열과는 별개의 번역 개시서열을 갖고,
    상기 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 다중시스트론 전사 유니트에서 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 서열로부터 하류에 있고, 그리고 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 핵산 서열은 진핵 숙주세포에서 선택성 마커의 번역 개시효율을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 선택성 마커의 번역 효율을 감소시키는 돌연변이는 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 비-최적 번역 개시 서열을 초래하는 것인 DNA 분자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 스트랜드에서 결과의 번역 개시 서열은 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자:
    a) 번역 개시에 비-최적 상황에서의 ATG 코돈;
    b) GTG 개시코돈;
    c) TTG 개시코돈;
    d) CTG 개시코돈;
    e) ATT 개시코돈; 및
    f) ACG 개시코돈.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩 스트랜드에서 결과의 번역 개시 서열은 GTG 개시코돈 또는 TTG 개시코돈을 포함하는 것인 DNA 분자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 코딩하는 서열은 상기 선택성 마커 폴리펩티드의 개시코돈에 뒤이어 관심의 폴리펩티드의 개시코돈 까지 코딩 스트랜드에서 ATG 서열을 갖지 않은 것인 DNA 분자.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임에 존재하고 야생형 마커 폴리펩티드의 코딩 서열에서 메티오닌을 코딩하는 모든 ATG 서열이 발린, 트레오닌, 이소로이신 또는 로이신의 코드로 돌연변이된 것인 DNA 분자.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택성 마커 단백질은 선택제의 치사 또는 성장 저해 효과에 대한 내성을 제공하는 것인 DNA 분자.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 선택제는 항생제인 것인 DNA 분자.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 선택제는 제오신, 푸로마이신, 블라스티시딘, 하이그로마이신, 네오마이신, 메토트레세이트, 메티오닌, 술폭시민 및 카나마이신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 선택제는 제오신인 것인 DNA 분자.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 선택제는 블라스티시딘인 것인 DNA 분자.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 선택제는 푸로마이신인 것인 DNA 분자.
  14. 제 8항에 있어서, 상기 선택성 마커 단백질은 네오마이신 내성 유전자에 의해 코딩되는 것인 DNA 분자.
  15. 제 8항에 있어서, 상기 선택성 마커 단백질은 dhfr 내성 유전자에 의해 코딩되는 것인 DNA 분자.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드는 추가로 그것의 야생형 대응물에 비하여 선택성 마커 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 것인 DNA 분자.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 선택성 마커 폴리펩티드는 제오신 내성 폴리펩티드이고 여기서 9번 위치의 프롤린은 다른 아미노산으로 변경된 것인 DNA 분자.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 폴리펩티드의 코딩 서열은 최적 번역 개시 서열을 포함하는 것인 DNA 분자.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트로, 상기 발현 카세트는 추가로 상기 다중시스트론 발현 유니트의 상류이고 다중시스트론 발현 유니트의 전사를 개시하기 위해 진핵 숙주세포에서 기능성인 프로모터를 포함하고, 상기 발현 카세트는 추가로 다중시스트론 발현 유니트의 하류에 전사 종결 서열을 포함하는 것인 발현 카세트.
  20. 제 19항에 있어서, 매트릭스 또는 스카폴드 부착 영역 (MAR/SAR), 인술레이터 서열, 유니버설 크로마틴 개방 요소 (UCOE), 및 항-억제자 (STAR) 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 크로마틴 조절 요소를 추가로 포함하는 것 인 발현 카세트.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 크로마틴 조절 요소는 항-억제자 서열인 것인 발현 카세트.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 억제자가 서열은
    a) SEQ. ID. NO. 1 ~ SEQ. ID. NO. 66 중에서 어느 것;
    b) SEQ. ID. NO. 1 ~ SEQ. ID. NO. 66 중에서 어느 것의 단편 (여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다);
    c) a) 또는 b)에 뉴클레오티드 서열로 70% 이상 동일한 서열 (여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다); 및
    d) a) 내지 c)중 어느 것에 상보체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 발현 카세트.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 발현 카세트는
    a) SEQ. ID. NO. 66;
    b) 항-억제자 활성을 갖는 a)의 단편;
    c) a) 또는 b)에 뉴클레오티드 서열로 70% 이상 동일한 서열 (여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다) 중에서 하나를 포함하고,
    여기서 a), b) 또는 c)는 다중시스트론 유전자의 전사를 구동하는 프로모터 의 상류에 위치되는 것인 발현 카세트.
  24. 제 19항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중시스트론 유전자는 하나 이상의 항-억제자 서열에 의해 양 측에 플랭크되어 있는 것인 발현 카세트.
  25. 제 24항에 있어서, 5'-항-억제자 서열 A - 항-억제자 서열 B - 프로모터 - 기능성 선택성 마커 단백질 및 그것의 하류에 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 다중시스트론 유전자 - 전사 종결 서열 - 항-억제자 서열 C-3'를 포함하고,
    여기서 항-억제자 서열 A 및 C는 동일하거나 다를 수 있고, 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되고:
    a) SEQ. ID. NO. 1 ~ SEQ. ID. NO. 65 중에서 어느 것;
    b) a) 서열 중에서 어느 것의 단편 (여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다);
    c) a) 또는 b)에 뉴클레오티드 서열로 70% 이상 동일한 서열 (여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다);
    그리고 여기서 항-억제자 서열 B는 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되는 발현 카세트:
    i) SEQ. ID. NO. 66;
    ii) 항-억제자 활성을 갖는 i)의 단편;
    iii) i) 또는 ii)에 뉴클레오티드 서열로 70% 이상 동일한 서열 (여기서 상 기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다).
  26. 제 25항에 있어서, 항-억제자 서열 A 및 C는 하기로부터 선택되는 것인 발현 카세트:
    a) SEQ. ID. NO. 7;
    b) a) 서열 중 하나의 단편 (여기서 단편은 항-억제자 활성을 갖는다);
    c) a) 또는 b)에 뉴클레오티드 서열로 70% 이상 동일한 서열 (여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다).
  27. 제 19항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 폴리펩티드는 다량체 단백질의 부분인 것인 발현 카세트.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 관심의 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄인 것인 발현 카세트.
  29. 제 12항 ~ 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로
    a) 상기 프로모터의 상류에 그리고 5'에서 3' 방향으로 있는 전사 중단 (TRAP) 서열; 또는
    b) 상기 전사 종결 서열의 하류에 그리고 3'에서 5' 방향으로 있는 TRAP 서열; 또는
    c) a) 및 b) 둘 다를 포함하고,
    여기서 TRAP 서열은 전사 유니트로 위치될 때, TRAP의 5'측 상의 핵산에서 관찰된 전사 수준에 비교될 때, TRAP의 3'측 상에 존재하는 핵산에서 전사의 감소된 수준을 초래하는 서열인 것인 발현 카세트.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 TRAP는 SEQ. ID. NO. 142인 것인 발현 카세트.
  31. 기능성 선택성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 분자로, 상기 DNA 분자는:
    i) 다른 기능성 선택성 마커 코딩 서열이 뒤이어지는 비-최적 번역 개시 서열을 갖고, 그리고
    ii) 비-최적 개시코돈의 하류에 그리고 종결코돈 까지의 선택성 마커 폴리펩티드를 규정하는 서열의 코딩 스트랜드에 ATG 서열이 없는 것인 DNA 분자.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포.
  33. 제 32항에 있어서, 진핵 숙주세포인 것인 숙주세포.
  34. 제 33항에 있어서, 포유동물 숙주세포인 것인 숙주세포.
  35. 제 34항에 있어서, 중국 햄스터 난자 (CHO) 세포인 것인 숙주세포.
  36. 관심의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포의 생성 방법으로, 상기 방법은
    a) 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 제 19항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 다수의 전구 세포로 도입하는 단계, 및
    b) 선택성 마커 폴리펩티드의 발현을 위한 선택 조건 하에서 생성된 세포를 배양하는 단계, 및
    c) 상기 관심의 폴리펩티드를 생성하는 하나 이상의 숙주세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  37. 관심의 폴리펩티드의 생성 방법으로,
    숙주세포를 배양하고, 여기서 상기 숙주세포는 제 19항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하고, 그리고 상기 발현 카세트로부터 관심의 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 관심의 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자의 전사 생성물의 서열을 갖는 RNA 분자.
  40. 제 31항에 따른 DNA 분자에 의해 코딩되는 선택성 마커 폴리펩티드로,
    상기 선택성 마커 폴리펩티드는 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되는 선택제의 치사 또는 성장-저해 효과에 대한 내성을 제공하고:
    제오신, 푸로마이신, 블라스티시딘, 하이그로마이신, 네오마이신, 메토트레세이트, 메티오닌, 술폭시민, 및 카나마이신,
    단, 상기 선택성 마커 폴리펩티드는 첫번째 아미노산으로서 메티오닌을 갖는 블라스티시딘 내성 단백질 (SEQ. ID. NO. 111)은 아닌 것인 선택성 마커 폴리펩티드.
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654442A (en) * 1989-11-14 1997-08-05 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
DK1573058T3 (da) * 2002-12-18 2012-01-16 Chromagenics Bv Fremgangsmåde til forbedring af proteinproduktion
EP1572994B1 (en) 2002-12-20 2007-02-21 Chromagenics B.V. Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors
NZ553700A (en) * 2004-11-08 2010-09-30 Chromagenics Bv Selection of host cells expressing protein at high levels using a selectable marker with a non-optimal start codon
US8039230B2 (en) 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8999667B2 (en) 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20060195935A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
EP1910550A4 (en) 2005-07-21 2009-11-04 Abbott Lab MULTIGENIC EXPRESSION COMPRISING SORF CONSTRUCTS AND METHODS USING POLYPROTEINS, PRO-PROTEINS, AND PROTEOLYSIS
PT1987150E (pt) * 2006-02-21 2011-09-08 Chromagenics Bv Selecção de células hospedeiras expressando níveis elevados de proteína
EP1996705B1 (en) 2006-03-20 2011-08-31 ChromaGenics B.V. Expression augmenting dna fragments, use thereof, and methods for finding thereof
EP2064337B1 (en) * 2006-09-20 2012-07-18 Genzyme Corporation A facs-and reporter protein-based system for high throughput development of therapeutic proteins
US20080274137A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-06 Jean Christophe Francis Audonnet DNA plasmids having improved expression and stability
AU2009218069B2 (en) * 2008-02-27 2014-05-01 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Expression vector for mass production of foreign gene-derived protein using animal cell and use thereof
WO2010026443A1 (en) * 2008-09-08 2010-03-11 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a glutamine synthetase gene and uses thereof
KR101655492B1 (ko) * 2008-12-22 2016-09-07 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 동물세포를 사용해서 외래유전자 유래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현 벡터, 및 그의 이용
US9284563B2 (en) 2009-06-15 2016-03-15 Cellagenics B.V. Stringent selectable markers
WO2011113841A1 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Robert Steinfeld Eukaryotic vector
WO2011159157A1 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Cellagenics B.V. Novel intergenic elements for enhancing gene expression
US9650630B2 (en) 2010-09-01 2017-05-16 Cellagenics B.V. Nucleic acid fragments from a ribosomal protein promoter for enhancing gene expression
ES2716577T3 (es) 2012-07-31 2019-06-13 Agex Therapeutics Inc Células HLA-G modificadas y métodos
MA40902B1 (fr) 2014-11-04 2018-12-31 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccins hpv16 thérapeutiques
WO2017029360A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv18 vaccines
WO2017062722A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Genzyme Corporation Improved flare (flow cytometry attenuated reporter expression) technology for rapid bulk sorting
US10517944B2 (en) 2016-05-02 2019-12-31 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic HPV vaccine combinations
US20180119192A1 (en) 2016-10-07 2018-05-03 Genzyme Corporation Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production
AU2019273200B2 (en) * 2018-05-24 2024-10-31 Fuso Pharmaceutical Industries,Ltd. Novel vector and use thereof
WO2020036181A1 (ja) * 2018-08-13 2020-02-20 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団
WO2020068631A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for eukaryotic expression systems
IL302786A (en) 2020-11-19 2023-07-01 Genzyme Corp Flow cytometry Attenuated reporter expression (flaring) Multi-reporter system and methods of using it

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700633A (en) * 1971-05-05 1972-10-24 Shell Oil Co Selectively hydrogenated block copolymers
US3821148A (en) * 1973-09-28 1974-06-28 Exxon Research Engineering Co Plasticized thermoplastic block copolymers
US4122134A (en) * 1974-02-13 1978-10-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transparent block copolymer resin
US3965830A (en) * 1974-12-05 1976-06-29 Usm Corporation Assembly for automatic bar tacking
US4267284A (en) * 1977-01-07 1981-05-12 Phillips Petroleum Company Tough, transparent articles from styrene polymers blended with certain block-random copolymers
US4965196A (en) 1983-01-19 1990-10-23 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
US4835200A (en) * 1986-12-19 1989-05-30 Shell Oil Company Color stable hot melt adhesive
US4882384A (en) * 1988-02-01 1989-11-21 Shell Oil Company Modified block copolymers
EP0484411A4 (en) * 1989-07-24 1992-06-17 Seragen, Inc. Prevention of internal initiation
US5256568A (en) * 1990-02-12 1993-10-26 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Vectors and transformed most cells for recombinant protein production with reduced expression of selectable markers
ES2153358T3 (es) 1991-03-29 2001-03-01 Genentech Inc Procedimientos para la seleccion de celulas huespedes recombinantes que expresan altos niveles de una proteina deseada.
US6319707B1 (en) * 1991-08-12 2001-11-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Board Regents Of The University Of Washington Cap-independent multicistronic retroviral vectors
JP2686025B2 (ja) * 1992-08-25 1997-12-08 理化学研究所 ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
AU6498294A (en) 1993-04-07 1994-10-24 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Dna sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from (cis)-acting regulatory sequences in mammalian cells
US5610053A (en) 1993-04-07 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
US5561053A (en) 1994-08-05 1996-10-01 Genentech, Inc. Method for selecting high-expressing host cells
US5627033A (en) 1995-03-28 1997-05-06 Research & Diagnostics Systems, Inc. Mammalian expression vectors
DE69633565T3 (de) 1995-06-15 2013-01-17 Crucell Holland B.V. Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
DE19523585A1 (de) * 1995-06-29 1997-01-02 Basf Ag Schlagzähe Formmasse aus Styrolpolymeren
US5773695A (en) * 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
DE19621688A1 (de) * 1996-05-30 1997-12-04 Basf Ag Transparente, nicht-blockende Folie
US6107477A (en) * 1996-09-26 2000-08-22 Aurora Biosciences Corporation Non-optimal Kozaks sequences
WO1998039411A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US5888809A (en) * 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
DE19832245A1 (de) 1998-07-17 2000-01-20 Heidelberger Druckmasch Ag Verfahren zum Bedienen von Geräten in der Reproduktionstechnik
US6689606B2 (en) 1998-07-21 2004-02-10 M.L. Laboratories Plc Polynucleotide
AU771111B2 (en) 1998-07-21 2004-03-11 Emd Millipore Corporation A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (UCOE)
EP1104490B8 (en) * 1998-08-14 2008-02-13 Chromagenics B.V. Method of detecting a dna sequence, a dna sequence, a method of making a dna construct and the use thereof
US6521419B1 (en) * 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6800457B2 (en) * 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
WO2000023606A1 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Medical College Of Georgia Institute, Inc. Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors
PT1161548E (pt) 1999-04-15 2005-06-30 Crucell Holland Bv Producao de proteinas recombinantes numa celula humana utilizando sequencias codificando a proteina e1 de adenovirus
US6391981B1 (en) * 1999-04-23 2002-05-21 Kraton Polymers Us Llc Increased throughput in the manufacture of anionic polymers by reduction in polymer cement viscosity through the addition of metal alkyls
JP2003504016A (ja) 1999-06-30 2003-02-04 アメリカ合衆国 遺伝子発現の制御のための特異的エンハンサー遮断活性を有する絶縁体としてのｄｎａ結合タンパク質および配列
US6413744B1 (en) * 1999-08-25 2002-07-02 Immunex Corporation Methods and host cells for improved cell culture
EP2278021A3 (en) * 1999-11-01 2011-05-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
US6558948B1 (en) 1999-11-23 2003-05-06 Stefan Kochanek Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors
US6586205B1 (en) * 2000-02-11 2003-07-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 43239 a novel GPCR-like molecule and uses thereof
WO2001059117A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Seven-transmembrane proteins/g-protein coupled receptors
CA2422533A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Ml Laboratories Plc Artificial ubiquitous chromatin opening elements (ucoe)
JP4307079B2 (ja) 2001-01-26 2009-08-05 セレキス エスアー マトリックス付着領域およびその使用方法
US20020155540A1 (en) * 2001-02-14 2002-10-24 Malla Padidam Method to reduce transcriptional interference between tandem genes
FR2821855B1 (fr) * 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
TWI377253B (en) * 2001-04-16 2012-11-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
WO2002099089A1 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Corixa Corporation Compositions and methods for high-level, large-scale production of recombinant proteins
ATE466941T1 (de) * 2001-07-04 2010-05-15 Chromagenics Bv Dns-sequenzen mit anti-repressor-aktivität
US20040038304A1 (en) * 2002-03-28 2004-02-26 Gala Design, Inc. Antibody libraries
DE60336228D1 (de) * 2002-06-14 2011-04-14 Chromagenics Bv Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von multiplen proteinen; vektoren und zellen, die hierfür verwendung finden
WO2003106674A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Chromagenics B.V. Means and methods for regulating gene expression
AU2003263161A1 (en) 2002-09-20 2004-04-08 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
DK1573058T3 (da) * 2002-12-18 2012-01-16 Chromagenics Bv Fremgangsmåde til forbedring af proteinproduktion
EP1572994B1 (en) * 2002-12-20 2007-02-21 Chromagenics B.V. Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors
KR101269656B1 (ko) 2003-10-24 2013-05-30 셀렉시스 에스. 에이. Ｍａｒ 서열의 복합 트랜스펙션 방법에 의한 포유동물 세포에서의 고효율 유전자 전달 및 발현
ES2296201T3 (es) * 2004-07-08 2008-04-16 Chromagenics B.V. Secuencia novedosa para mejorar la expresion de acido nucleico.
US8999667B2 (en) * 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
NZ553700A (en) * 2004-11-08 2010-09-30 Chromagenics Bv Selection of host cells expressing protein at high levels using a selectable marker with a non-optimal start codon
US20100136616A1 (en) * 2004-11-08 2010-06-03 Chromagenics B.V. Selection of Host Cells Expressing Protein at High Levels
US20060195935A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8039230B2 (en) * 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
EP1996705B1 (en) * 2006-03-20 2011-08-31 ChromaGenics B.V. Expression augmenting dna fragments, use thereof, and methods for finding thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008518613A (ja) 2008-06-05
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