JPH05501054A - 内部翻訳開始の防止 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内部翻訳開始の防止 発朋Ω背景 本発明は有用ペプチドの発現及び精製を最大にするための組換えＤＮＡ技術の用 途に関する。

蛋白質の発現の重要段階は翻訳の開始である。翻訳開始は、リポソーム、ｍＲＮ Ａ分子、負荷ｔＲＮＡ及び他の因子が適正な関係に集合して、合成されるべきポ リペプチドの最初のアミノ酸残基の挿入を可能にする時点である。

原核細胞においては翻訳の開始は、大部分、ｍＲＮＡ分子の配列にコードされる シグナルによりコントロールされる。原核細胞の翻訳開始は、ｍＲＮＡ分子へ三 つのポリペプチドをコードするポリジストロニックな原核細胞のメツセージは、 通常、その独立に合成される複数ポリペプチド産物の各々の直ぐ５°部分にリポ ソーム結合部位を有する。

リポソーム結合部位のコアであるシャインダルカッ配列のみが、種々のバクテリ ア遺伝子間で保存されており、しかもシャインダルガノ配列も不変ではない。

コンセンサスなシャインダルガノ配列はＡＧＧＡＧＧである。シャインダルガノ 配列は、３ＯＳリポソームサブユニツトの１６３リポソ一ムＲＮＡ成分のピリミ ジン豊富部分に相補性である。開始において最適に機能するためには、シャイン ダルカッ配列は一般に開始コドンから約４ないし２０ヌクレオチド上流に中心を 有する。バクテリアの開始コドンは一般にＡＵＧであるが、ＧＵＧまたはＵＵＧ もしくはＡＬＪＵでさえもあり得る。ポリペプチドの合成において最初に付加さ れるアミノ末端アミノ酸は、殆ど普遍的にＮ−ホルミルメチオニン（ｒＭＥＴ） である、ホルミル化は、メチオニンがそのｔＲＮＡに結合した後に生しる。ホル ミル基はメチオニンのアミノ基をブロックする。このことは、ポリペプチド鎖の 最初の位置でのＮ−ホルミルメチオニンの使用を妨げないが、ブロックされたア ミノ基はペプチド結合に関与できないので、メチオニンを任意の部分に挿入する ことが妨げられる。ポリペプチド鎖の合成開始の直ぐ後に、ホルミル基は通常、 デホルミラーゼによりアミノ末端メチオニンから除去される。多くの蛋白質の場 合二アミノ末端メチオニン自身は続いてアミノペプチダーゼにより除去される。

リポソーム結合部位への３ＯＳリポソームサブユニシトの結合に続いて、ｍＲＮ Ａ分子上の完全リポソームの集合が起こる。リポソームはシャインダルガノ配列 部分に集合すると、開始コドンに到達するまでメツセージをスキャンする。開始 コドンに到達すると、リポソームは構造変化を受けて、Ｎ−ホルミルメチオニン がアミノ酸鎖の最初の位置に挿入される。

開始ののち、リポソームはｍＲＮＡに沿ってコドンからコドンへと進み、生長す るポリペプチド鎖中ヘアミノ酸を挿入する。翻訳終了はｍＲＮＡ中において三つ のストップコドン、ＵＡＡ、ＵＡＣ；またはＵＧＡの形でコードされる配列によ り合図される。読み枠中のストップコドンに到達すると、リポソームはｍＲＮＡ から脱落してポリペプチド鎖へのアミノ酸残基の付加は終了する。

原核細胞の開始コドンとして作用するコドンは、開始位置のみならず、コード領 域の他の位置にも見出される。これらコドンの各々は、開始位置ではＮ−ホルミ ルメチオニンの挿入を指令するが、通常は何れの開始コドンも他の位置に存在す る場合は、Ｎ−ホルミルメチオニンの挿入をもたらさない、内部に、即ち先頭も しくは開始位置以外のいずれかの位置に存在する場合は、ＡＵＧ、ＧＵＣ，ＵＵ Ｃ及びＡＵＵの各コドンは、通常それぞれメチオニン、バリン、ロイシン及びイ ソロイシンの挿入を指令する。

二つのクラスのＬＲＮＡ”’が存在し、ｔ　ＲＨＡｒ　”’はＮ−ホルミルメチ オニンを運びそして、ｔ　ＲＮＡ）ｌ　”’はメチオニンを運ぶ。開始位置に結 合すると、リポソームはその１６ＳＲＮＡ成分とシャインダルガノ配列との間の 塩基対相互作用を生しる。この相互作用はリポソームの構造を変更して、リポソ ームの３ＯＳサブユニットに結合できる唯一のトランスファーＲＮＡがｔ、ＲＮ ＡＦ　”’となるようにすると考えられている。このリポソームがＡ、　Ｕ　Ｇ または開始コドンとして作用できる他のコドンの一つと遭遇すると、Ｎ−ホルミ ルメチオニンがポリペブチじの開始アミノ酸として挿入される。シ中インダルガ ノにより誘発される相互作用が存在しないと、即ち内部位置においては、ｔ　Ｒ ＮＡ、ｐ　”Ｌはリポソームに結合しない。そのような場合には、遭遇したコド ンに適当なｔＲＮＡ　（ＡｔｊＧの場合にはｔＲＮＡＩｌ”ｔ、ＣＵＣの場合に はｔＲＮＡ””、そしてＡＵｔｊの場合にはｔＲＮＡ””　’）がリポソームに 結合すると共に、担っているアミノ酸を挿入する。

発噸の概要 本発明は、適当な位置に配置されたシャインダルガノ配列の存在または不存在に 依存して、四つのコドン、ＡＵＧ、ＧＵＣ，ＵＵＧ及びＡ、ＩＪＵの一つが内部 コドンとしてａ能するという観察に基づく、翻訳開始に要求される必須配列は、 シャインダルガノ配列の下流の開始コドンである。したがって、内部のＡＵＧ、 ＧＵＣ，ＵＵＧ又はＡＵＵが、偶然にシャインダルガノ配列として作用出来る配 列の後にある場合、第二の位置もしくは内部開始位置になる。第二の位置もしく は内部開始位置は、この第二位置の出発コドンと読み枠内に最初に出会うストッ プコドンとの間の配列に相当する蛋白質の生産をもたらす。

−Ｉｌｆｆｌに、本発明は、内部開始コドンまたは内部ンヤインダルガノ配列の いずれかのＤＮＡに変化を生じさせることにより、内部シャインダルガノ配列の 後にある内部開始コドンからの不所望の翻訳開始を防止する方法に関する。その ような変化は、完全長の翻訳生成物のアミノ酸配列を変化させないものであるこ とが好ましい。

本発明は内部開始位置を消失させる多くの方法を提供する０個々の応用に用られ る方法は所望の完全長翻訳生成物をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の性質 及び所望の完全長翻訳生成物のアミノ酸配列の性質に依存する。

量も好ましい態様においては内部開始位置は、内部開始コドンが開始を指示しな いように、そして不適当なリポソームの結合の可能性が全て無くなるように、し かしこれらのすべては完全長の翻訳生成物のアミノ酸配列を変化させることのな いように、内部開始コドンの配列及びシャインダルガノ配列を変化させることに より削除される。

好ましさの劣る態様においては、完全長の翻訳生成物のアミノ酸配列を変化させ ることのないように内部開始位置の配列の変化なくシャインダルガノ配列のＤＮ Ａ配列の変化を生しる。この変化はンヤインダルガノ配列の機能が完全昼の翻訳 生成物のアミノ酸配列を変化させることなく、破壊されるように生じる。

他の好ましさの劣る態様に８いては、内部開始コドンの存在の消滅または不溶シ ャインダルガノ配列の機能を破壊する変化が、完全長の翻訳生成物のアミノ酸配 列を変化させうる。そのような態様においては、ＤＮＡ配列の変化は、元の完全 長の翻訳生成物からの最も保存的な変化を生したポリペプチドを生産するように 、内部開始位置を削除する。

本発明は内部開始位置から開始される非機能性短縮蛋白質フラグメントの生産を 防止することにより、組換え蛋白質の収率を向上させ、そして精製を助ける。

本発明の他の観点及び利点は好ましい態様に関する以下の記載及び請求の範囲の 記動・ら明らかにされる。

好末長兄態横■説朋 最初に図面を説明する。

図面 図Ｉはｌ−２毒素を発現するＤＮＡの配列である。ヌクレオチド５２６から開始 する内部ＣＴＣコドンも示されている。

図２はコドンの辞書である。

図３は保存的アミノ酸置換の表である。

図４は異なる番地に存在するシャインダルガノ配列とｍＲＮＡの読み枠コドンで ある。

１Ｖヨ］μリ力ｗＩｉＪ殆Ω肋止 ＩＬ−２毒素はハイブリッド遺伝子から発現された６８，１７０ダルトンの誘導 体である。この組換え遺伝子は、ジフテリア毒素遺伝子及びインターロイキン− ２（ＩＬｉ）遺伝子を含む。ジフテリア毒素の一般的真核細胞すセブター結合ド メインをコードするＤＮＡが、参照により本明細書に含まれるマーフィーの米国 特許４．６７５．３８２に記載されている組換えＤＮＡ方法を用いて、インター ロイキン−２（ＩＬ、−２）遺伝子に置換されている。参照により本明細書に含 まれるストＯ−ムらのＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１６６に記載されているように、 ■Ｌ−２毒素はＩＬ−２リセブター陽性細胞破壊剤として作用する。

ＩＬ−２毒素の精製は副産物として５９．０００ダルトンのポリペプチドを生し る。この同時に精製されるポリペプチドのアミノ酸配列分析により、この５９． ０００ダルトンのポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基はトレオニンであり、その 後は該ペプチドはｒ　Ｌ−２のＣ末端部分を含む５３４アミノ酸残基と同一であ ることがわかった。この５９．０００ダルトンのポリペプチドは抗−ジフテリア 毒素抗体及び抗−インターロイキン−２抗体と交差反応性であるにれら抗体の抗 原決定基はともに、ＩＬ−２毒素内において５９，０００ダルトンの内部開始ポ リペプチドに相当する領域に存在する。

ｒＬ−２毒素の配列は図１に示されている。１．Ｌ−２８素を特定するｍＲＮＡ 中の８４番目のコドンはＧＵＣであり、これはバリンをコードする。（８４番目 のコドンは［１において５２６から５２８のヌクレオチドに対応する）、【Ｌ〜 ２毒素を特定するｍＲＮＡ中の８５番目のコドンはＡ、ＣＧであり、これはトレ オニンをコードする。５９．０００ダルトンのポリペプチド夾雑物は、発明者ら の確信するところ、ＩＬ−２毒素ｍＲＮＡのニド２８４番目における内部翻訳開 始に由来する。ｔ＃訳の内部開始は、８４番目のＧＵＣコドンで生じるが、これ はおそら（該ＧＵＣコドンの１３塩基５“側に中心を有するＵＧＧＡＧＣがシャ インダルガノ配列に高度に似ているためと考えられる。ＧＵＣはバクテリアにお いて開始コドンとして作用することができる。ＣＵＣは通常はバリンを特定する が、８４番目の位置のＧＵＣコドンの５゛側のシャインダルガノ配列が、開始リ ポソーム結合、リポソーム集合及びそれに伴うＮ−ホルミルメチオニンの挿入を 生じる。この内部開始ポリペプチドの第一アミノ酸であるＮ−ホルミルメチオニ ン残基は、アミノペプチダーゼで開裂さ娠したがって最終的に回収される内部開 始夾雑物の最初のアミノ酸残基はトレオニンとなる。このトレオニンはＩＬ−２ ４素の８５番目の位置のトレオニンに相当する。

第二部位開始は多くの理由から好ましくない。第二部位開始は適性に開始するり ボソームからの翻訳を阻害し、並びにリポソームの真の開始位置における開始と 、リポソーム、開始因子、付加ｔＲＮＡ及び最終蛋白質産物の生産に必要な他の 全ての因子を競合的に奪い合うであろう。したがって、第二部位開始は蛋白質合 成の所望な生産の全体収率を減少させる可能性がある。他の産物は、追加の精製 工程の必要性を生じる可能性もある。同し読み枠にあるときは内部開始位の生放 物は、例えばサイズ、物理特性及び免疫学的特性が所望生成物に非常に類似する 。そのような類似性は、特に困難な精製の問題を提起する可能性がある。

第二部位開始または内部開始は、第二部位開始コドンとして用られるコドンの配 列内またはそれに最も近い位置に隣接するシャインダルガノ配列内またはその両 者に適当な変更を生じさせることにより、本発明により消失させることが可能で ある。最も好ましい変更は、所望翻訳生成物の配列を変更することなく、内部開 始及びリボンーム結合を確実に除去できるような変更である。もし、一つの変更 のみが可能な場合は、内部開始コドンにおける変更の方が内部ンヤインダルガノ 配列での変更よりも好ましいが、しかしながら両方の位置での変更が最も好まし い。

８４番目の位置のＧＵＣコドンの第三番目の「Ｇ」をｒ　ＣＪに変更するとバリ ンをコードするＧＵＣを生じるが、このものはシャインダルガノ配列の存在下で も開始コドンとして作用しない。

この変更は、大部分のアミノ酸を特定するコドンの最後のヌクレオチド′はその コドンの第−及び第二のヌクレオチドに比べて特異性がはるかに低い事実（図２ 参照）と一致している０例えば、バリンを特定するコドンは四つあり、ＣＵＣ５ ＧＵＡ、ＧＵＣ及びＧＵＵである。ＧＵＧコドンの第一または第二のヌクレオチ ドの変更はいずれも、ペプチドに挿入されるアミン変更をもたらすであろう。し かしながら、読み枠内のＧＵＧの最後のヌクレオチドは、Ａ、ＣまたはＵの任意 のものに変更し、得られたコドンが生成させるポリペプチド鎖にバリンの挿入を 指令させるようにすることができる。コト′ンＧＵＡ、ＧＵＣ及びＧＵＵは、た とえシャインダルガノ配列が前に存在しても、決して開始コドンとして作用しな い。したがって、ｒＬ−２毒素の８４番目の位置のＧＵＧコドンの第三のヌクレ オチドをいずれに置換しても、Ｉ　Ｌ−２毒素のアミノ酸配列の変更をもたらす ことなく、８４番目の位置の内部開始を除去するであろう、ＤＮＡ配列の内部に 所望の変更を行うｋめには、当業者に知られている、クローン化ＤＮＡ配列の掻 作のための標準的方法を採用することができる。

内部開始の開始コドンとして作用するコト′ンが、読み枠内のしＵＧまたはＡＵ Ｕである他の好ましい態様においては、類似のアプローチが用られる。通常はロ イシンをコードするＵＵＧを、同じくロイシンをコードするがたとえシャインダ ルガノ配列の存在下においても開始コドンとしては作用しない、ＵＵＡに変更す ることが可能である。同様に、通常はイソロイシンをコードするＡＵＵを、同じ くイソロイシンをコードするがたとえシャインダルガノ配列の存在下においても 開始コドンとしては作用しない、ＡＵＧに変更することが可能である。

他の好ましい態様は、第二部位開始が読み枠内のＡＵＧコドンで生しるものであ る。ＡＵＧはメチオニンの挿入を指令する唯一のコドンである。ＡＵＧコドンの 三つのヌクレオチドのどれを変更しても、完全長ポリペプチド中のメチオニンの 代わりに他のアミノ酸への置換を生しるであろう。

読み枠内のＡＵＧコドンの第二部位開始は、三つの方法の一つで削除できる。

好ましい態様においては、内部開始を除去するために、シャインダルガノ配列及 び内部開始コドンの機能の健全性を変更することができる。別法として、内部開 始位置のみを変更することもできる。第二部位開始コドンとして作用するＡＵＧ を、開始を指示しないコドンに変更することが可能である。上記のとおり、ＡＵ Ｇコドンの任意の変更は完全長ポリペプチドに発現される。変更の選択は、メチ オニンの特性に最も似ているアミノ酸をもたらすような変更に限定すべきである 、図３は最も保存的なアξ人酸室換の表を提供する。

他の態様において、機能的な内部シャインダルガノ配列を変更することにより内 部開始が削除されることが好ましい、シャインダルガノの正確な配列及び該配列 が翻訳生成物を特定する読み枠内コドン上に存在する状態に応じて、異なる変更 の選択がありうる。ある場合には、所望の完全長ポリペプチドのアミノ酸配列を 変更することなく、機能的シャインダルガノ配列を削除することが可能であろう 。図４は、相当するポリペプチドの読み枠内コドンとシャインダルガノ配列の可 能な位置関係を示す０図２に示すコドン辞書を参照すると、図４８のシャインダ ルカッ配列はアミノ酸配列の変更を生じることなしに破壊することができるが、 図４０においては、アミノ酸配列の変更を生じることのない変更はシャインダル ガノ配列を確実に破壊しないことが分かる。内部開始コドンまたはシャインダル ガノ配列内のいずれの変更もポリペプチドのアミ酸室配列に変更を生しる場合に は、得られる置換体の最も保存的なものを探すために、図３を参照することがで きる。

他の態様においては、内部開始コドンは、所望の完全長ポリペプチドの読み枠外 に存在するであろう。例えば、イソロイシン及びシスティンの挿入を特定する読 み枠内配列はＡＵＡ・ＵＧＵからなり得る。イソロイシンコドンの最後のヌクレ オチドは、システィンコドンの最初の二つのヌクレオチドと一緒になって、読み 枠内ＡＵＧを形成する。多くの場合に、所望の完全長ポリペプチド内に挿入され るアミノ酸に変化をもたらすことなく、読み枠内配列を変更して、このような読 み枠外開始部位を破壊することができる。直ぐ上に示した例においては、読み枠 内配列をＡＵＧ−ＵＧＵに変更すれば、読み枠外ＡＵＧがＣＵＧ変更されこれは 決して開始コドンとして作用しない。この新たな配列は、完全長のポリペプチド 内へ同じアミノ酸であるイソロイシン及びシスティンを挿入する。

他の好ましい態様においては、完全長のポリペブチ１′のアミノ酸配列への変更 を及ばずことなしに第二部位開始位置をｎｌｌ除することが不可能であろう、例 えばリジン及びシスティンを特定する読み枠内配列ＡＡＡ−ＵＧＵは、リジンコ ドンの最後のヌクレオチドとシスティンコドンの最初の二つのヌクレオチドから 、読み枠外ＡＵＧを形成する。読み枠内ポリペプチド内で発現されない読み枠内 コドンの６つのヌクレオチド内に行うことができる唯一の変更は、リジンコドン の第三のヌクレオチドの変更である（この部分でポリペプチドを変化させること なくＡをＧに変更できる）、この変更は読み枠外開始コドンを破壊するが、読み 枠外開始コドンを新たに形成する。このような情況または類似の情況において、 第二部位開始の削除は、読み枠外開始コドンを削除するが所望の完全長ポリペプ チド内に量も保存的変化のみしかもたらさないように、読み枠内配列を変更する ことにより行いうる。内部開始コドンでの変更の結果は、シャインダルカッ配列 での変更の結果と比較される４（に、アミノ酸配列に変化を生じないかまたは最 も保存的変更を生じる変更が選択される。

他の態様は請求の範囲内である。

浄書（内容に変更なし） アミノ酸　置換アミノ酸 アラニン　Ｇｌｙ アルギニン　Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ　工１ｅアスパラギン　Ａｓｐ、Ｇｌｕ、 Ｇｉｎアスパラギン酸　Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎシスティン　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ グルタミン　Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ グルタミン酸　Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎグ’Ｊシン　Ａｌａ、Ｐｒ。

イソロイシン　Ｖａｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔｏイシン　Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ ＋３ジン　Ａｒｇ、Ｍｅｔ、工１ｅ Ｊチ：ｔ＝＞　工１ｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌフｘ−ルアう：−ン　Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、 ＴｒｐＦＩＧ、３　保存的アミノ酸置換表 奈 ・へ Ｊ 日Ｉｌ１ 手続補正書 平成　４年　８月ｌ／日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．不都合な翻訳開始および／またはリボソームの結合が防止されるように、内 部翻訳開始コドンまたはその上流に位置するシャインダルガノ配列の一方または 両方を変更することにより、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列内に存在し且 つその上流にシャインダルガノ配列が存在する内部翻訳開始コドンからの不所望 な翻訳開始を防止する方法。
2. ２．内部開始コドンが、一つまたはそれ以上の塩基対の置換により変更される請 求項１記載の方法。
3. ３．シャインダルガノ配列が、一つまたはそれ以上の塩基対の置換により変更さ れる請求項１記載の方法。