JP2008289483A5

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Publication number: JP2008289483A5
Application number: JP2008134696A
Authority: JP
Filing date: 2008-05-22
Publication date: 2011-07-07

Claims

ベクター核酸を同定し及び／又は単離するための方法であって、ここで、各核酸は少なくとも１つの所定の機能性を有する発現産物（EPPF）をコードし、かつ、該EPPFを哺乳動物細胞中で発現させるための十分な遺伝因子を含んでおり、該方法は以下のステップ：
ａ）ベクター核酸の複数のサンプルを提供し、ここで、該サンプルのそれぞれは単一のベクター核酸種を含み、
ｂ）各異なるサンプルからの核酸を、ローリングサークル型分子増幅法において増幅して、前記ベクター核酸種のコンカテマーである増幅産物を生成し、
ｃ）前記各増幅産物を、別個の哺乳動物細胞集団中へ直接トランスフェクトし、
ｄ）前記増幅産物の発現を促進する条件下で、前記別個の哺乳動物細胞集団をそれぞれ培養し、
ｅ）続いて、前記哺乳動物細胞培養中の前記EPPFの存在について試験し、そして
ｆ）ステップｅ）において存在が見出されたEPPFがそれに由来する、ステップａ）の少なくとも１つのベクターを同定及び／又は単離する、
を含む、前記方法。
ベクター核酸を同定及び／又は単離するための方法であって、ここで、各核酸が少なくとも１つの所定の機能性を有する発現産物（EPPF）をコードし、かつ、該EPPFを哺乳動物細胞中で発現させるための十分な遺伝因子を含んでおり、該方法は以下のステップ：
Ａ）EPPFをコードすると推定されるヌクレオチド配列をそれぞれが含む、複数の核酸を提供し、
Ｂ）前記複数の核酸の各メンバーのうち、少なくともEPPFをコードすると推定されるヌクレオチド配列をローリングサークル型分子増幅法において増幅して、哺乳動物細胞中で上記ヌクレオチド配列を発現させるための十分な遺伝因子と作動可能に連結した上記ヌクレオチド配列をそれぞれが含むコンカテマーである増幅産物を生成し、
Ｃ）前記増幅産物のそれぞれを哺乳動物細胞中に直接トランスフェクトし、
Ｄ）前記増幅産物の発現を促進する条件下で前記哺乳動物細胞を培養し、
Ｅ）続いて、前記哺乳動物細胞中の前記EPPFの存在について試験し、そして、
Ｆ）ステップＥ）においてその存在が見出されたEPPFをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを同定及び／又は単離する、
を含む、前記方法。
ステップE）において見出された前記EPPFのコード配列が、前記哺乳動物細胞中に存在する前記増幅産物を切除しそして配列決定することによって決定される、請求項２に記載の方法。
前記ベクター核酸が、ステップE）において見出された前記EPPFのコード配列を、哺乳動物細胞中での前記EPPFの発現を達成するために十分な残りの必須遺伝因子と組み合わせることによって同定される、請求項２又は３に記載の方法。
前記少なくとも１つの所定の機能性が、以下の：
前記発現産物による物理的効果の発揮；
前記発現産物のリガンド又は抗原への結合；
前記発現産物による触媒活性の発揮；
触媒活性に対する前記発現産物の感受性；
前記発現産物による、生体膜を横切る作用物質の輸送の変更の促進；
前記発現産物による、細胞内コンパートメント中の作用物質の転位の変更の促進；
前記発現産物の、哺乳動物細胞集団中での少なくとも１つの遺伝子の発現に対する影響；
前記発現産物の、哺乳動物細胞集団の増殖又は代謝に対する影響；
前記発現産物の、標的細胞への影響；
前記発現産物の、病原性の作用物質に対する影響；及び
前記発現産物の、二次免疫効果への影響、
からなる群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記発現産物が、RNA、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、単量体タンパク質及び多量体タンパク質から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
ステップｅ）における試験が、前記培養上清中の前記ＥＰＰＦの存在及び／又は活性についてのアッセイを含む、請求項１、５及び６のいずれか１項に記載の方法。
ステップｅ）において前記EPPFの存在が見出された哺乳動物細胞集団が明らかにステップａ）の１つのベクター核酸種に由来することを、ステップａ）〜ｅ）が保証する、請求項１及び５〜７のいずれか１項に記載の方法。
ステップａ）中の前記ベクター核酸種並びにそれらの派生産物が、
各ステップにおいてお互いに物理的に分離されるか；若しくは
ステップａ）の前記ベクター核酸並びにそれらの派生産物が独自に標識されるか；又は
ステップｆ）における同定を容易化するように、ステップａ）の前記複数のサンプル及び／又はベクター核酸並びにそれらの派生産物が整列化及び／又は目録化される、請求項８に記載の方法。
ステップａ）のベクター核酸又はステップＡ）の核酸が、環状ＤＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記環状DNAが、細菌プラスミド又は細菌染色体である、請求項１０に記載の方法。
前記ローリングサークル型増幅が、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを利用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ローリングサークル型増幅法が、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、エキソヌクレアーゼ活性を除去したＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Bstポリメラーゼ由来の断片、SEQUENASE 1.0、SEQUENASE 2.0、T5 DNAポリメラーゼ、Vent_R(exo-)ポリメラーゼ、ThermoPhi及びバクテリオファージPhi29 DNAポリメラーゼから成る群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼを利用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記DNAポリメラーゼが、バクテリオファージphi29DNAポリメラーゼ、又は機能的に等価なポリメラーゼである、請求項１３に記載の方法。
前記分子増幅法が等温であり、そして、前記分子増幅法の間の温度が１５〜５０℃の範囲に保たれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
ステップｅ）又はＥ）が、培地中に分泌されたEPPFの存在についての試験を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記EPPFが、所定の抗原に結合する、抗体、抗体断片、又は合成若しくは半合成の抗体若しくは抗体アナログである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
ステップａ）又はＡ）中の核酸が、その中の少なくともいくつかがEPPFをコードすると予想される核酸でトランスフェクトされた細菌から得られる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
EPPFをコードする複数のベクター核酸種が、単離された単一細胞に由来する別個のテンプレートを用いるマルチプレックス分子増幅法を介して得られ、ここで、該分子増幅法は、可変領域をコードする配列の同系の対を、可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することによって生成することを含み、各同系の対は単離された単一細胞に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
ステップａ）又はステップＡ）のベクター核酸が、塩基による変性に供される二重鎖ベクターである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
哺乳動物細胞中で、少なくとも１つの所定の機能性を有する発現産物（EPPF）を生産するための方法であって、該方法は、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法によってベクター核酸を同定し、そして、該ベクター核酸が由来するベクターで好適な哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし、該トランスフェクトされた哺乳動物細胞を、前記EPPFをコードする核酸の発現を促進する条件下で培養し、そして該培養から前記EPPFを回収することを含む、前記方法。
前記EPPFが、抗体、抗体断片又は抗体アナログである、請求項２１に記載の方法。