JP2008231101A

JP2008231101A - 抗糖尿病剤

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Publication number: JP2008231101A
Application number: JP2008041661A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Kumazawa; 智熊沢; Tsumoru Watanabe; 積渡邉; Nobuyuki Kusano; 信之草野; Yoshiharu Ito; 義治伊藤; Atsuko Ezawa; 敦子江澤
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: JP5255862B2

Abstract

【課題】食後の過血糖状態を抑制して、糖尿病の予防及び治療に優れた効果を発揮する抗糖尿病剤の提供。
【解決手段】フラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を有効成分として含有する抗糖尿病剤。６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）は、α−グルコシダーゼ阻害活性及び／又は抑制活性を有する。また、上記抗糖尿病剤を配合した糖尿病の予防剤及び／又は治療剤や抗糖尿病食品組成物をも提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗糖尿病剤に関する。より詳しくは、優れた抗糖尿病活性を有するフラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）に関する。

近年、摂取カロリーの過多が生活習慣病の原因となっていることから、摂取カロリーの制限が求められている。代表的な生活習慣病のうち、特に糖尿病は我が国において最も患者数が多い生活習慣病の一つである。糖尿病の特徴は、食事により摂取された炭水化物由来の糖分が消化管から吸収されて血中に入ったときに、血糖値が高過ぎたり、高血糖状態が持続したりすることである。従って、炭水化物の消化を抑え、生体内でエネルギーに変換されるのを阻止することは糖尿病など生活習慣病の予防・治療に有効であると考えられ、血糖値の上昇を抑制する物質は、糖尿病の予防・治療薬となり得ると考えられる。

ここで、本発明に関連のある事項として、フラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）について、以下説明する。

6‐ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド(6-hydroxykaempferol-3-O-glucoside)は、化学式Ｃ₂₁Ｈ₂₀Ｏ₁₂のフラボノイド配糖体、ケンフェロール（kaempferol；3,4',5,7-tetrahydroxyflavonol）の６位に水酸基を有する化合物、いわゆる６−ヒドロキシケンフェロール（6-hydroxykaempferol）の3位にグルコースが結合した配糖体のことである。

６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）に関して、例えば、以下の文献がある。

非特許文献１には、エジプトの植物（Ononis serrata Forssk (Leguminosae)）からの６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）の単離が、特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３には、ベニバナ花弁からの単離が開示されている。また、非特許文献４及び非特許文献５には、ベニバナ花弁中における６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）の生合成に関する報告がなされており、非特許文献６には、ベニバナ花弁中の６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を、薄層クロマトグラフィーを用いて同定する方法が、非特許文献７には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて含有率測定を行う方法が記載されている。

さらに、特許文献２には、脳血管障害の予防・治療薬剤のためのケンフェロール誘導体として６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）が例示されている。また、非特許文献８では、ベニバナ花弁のメタノール抽出物が培養菌に与える影響についての報告がなされている。しかし、これまでに６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）に関して、その抗糖尿病活性が報告されたことはない。
印国特許出願公開第１８３７７３号明細書中国特許出願公開第１４０３０８０号明細書 Alexandria Journal of Pharmaceutical Sciences (2001), 15(2), 99-102 Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2000), 64(8), 1588-1599 Phytochemistry (1992), 31(11), 4001-4004 Foods & Food Ingred. J. Jpn (2000), No.189, 5-14 Yaoxue Xuebao (1998), 33(8), 626-628 Zhongguo Zhongyao Zazhi(2003), 28(11), 1086-1087 Zhongcaoyao (2001), 32(8), 707-708 Shoyakugaku Zasshi (1992), 46(3), 210-16

本発明の目的は、食後の過血糖状態を抑制して、糖尿病の予防及び治療に優れた効果を発揮する抗糖尿病剤を提供することである。

本発明者は、上記のような抗糖尿病剤を、副作用の少ない天然植物から得るため、種々の未知の植物を探索し、各種評価を行なった結果、キク科植物ベニバナ（学名「Carthamus tinctorius L.」、以下同じ）の花弁粗抽出物に抗糖尿病作用があることを見出し、この花弁粗抽出物を吸着剤に接触させて精製し、抗糖尿病組成物を得た（ＷＯ２００５／０９４８５８号公報参照）。

この抗糖尿病組成物は、例えば、水、炭素数１〜８のアルコール類、前記アルコールと水との混合溶媒、酢酸エチル、アセトンのいずれかの抽出溶媒を用いて、ベニバナの花弁を抽出し、次に、そのベニバナ花弁粗抽出液を吸着剤に接触させた後、有機溶媒、水、有機溶媒と水との混合溶液、酸又はアルカリの水溶液のいずれか又は複数を用いてクロマトグラフィーを行い段階的に溶出させ、画分を回収することにより得ることができるが、その有効成分については不明であった。

そこで、本発明者は、上記抗糖尿病組成物中に含まれる種々の成分から有効成分を単離精製するため、ベニバナの花弁の抽出方法及び花弁粗抽出物の精製方法について鋭意検討を行った結果、有効成分としてフラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を分離するに至った。

すなわち、本発明は、食後の過血糖状態を抑制して、糖尿病の予防及び治療に優れた効果を発揮する抗糖尿病剤としてのフラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を提供するものである。

６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）については、これまで、脳血管障害の予防・治療薬剤として報告がなされているものの、食後血糖上昇抑制作用に関しては、現在まで知られていなかった。

６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）は、下記「化２」で示される構造を有し、炭水化物消化酵素であるα−グルコシダーゼの阻害活性及び／又は抑制活性を発揮するものである。従って、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を有効成分として含有する抗糖尿病剤を配合した糖尿病の予防剤及び／又は治療剤や食品組成物は、食後の過血糖状態を抑制することにより、糖尿病の予防、治療に寄与し得るものである。

本発明に係る抗糖尿病剤は、糖尿病の予防及び治療に有効である。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

本発明に係る抗糖尿病剤の適用量は、年齢、症状等によって異なるが、例えば、成人１回につき６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）１〜５００ｍｇ程度、好ましくは５〜３００ｍｇ程度が挙げられる。

本発明に係る抗糖尿病剤を糖尿病の予防剤及び／又は治療剤として用いる場合、この薬剤には、本発明に係る抗糖尿病剤のほかに、医薬分野において常用される既知の他の化合物、及び、経口投与に適した形態に成型するのに必要な化合物、例えば、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどを含有させてもよい。また、この薬剤には、この抗糖尿病剤を医薬的に受容な塩の形態で含有させてもよく、また、賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤などを適宜含有させてもよい。その他、医薬品又は食品の製造分野において公知の方法によって、経口投与に適した形状、例えば、粉末、液剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の種々の形態で用いてもよい。

本発明に係る抗糖尿病剤は、健康食品に適用することができる。健康食品とは、通常の飲食物よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進などの目的とした食品組成物を意味し、認可された特定機能性食品や、認可のないいわゆる健康食品が含まれる。具体的には、例えば、液体又は半固形、固形の製品であって、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅうなどの菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープなどが挙げられる。また、そのままお湯や水に溶かして飲用してもよい。これらの飲食物の製造工程において、あるいは最終製品に、抗糖尿病剤を混合又は塗布、噴霧などして添加して、健康食品とすることができる。これらの抗糖尿病食品組成物には、必要に応じて、糖尿病の予防及び／又は改善に用いられるものである旨が表示される。

以下に、本発明の抗糖尿病剤としての効果を示す実施例を以下に詳しく説明する。

＜本発明に係る抗糖尿病剤の調製＞
ベニバナ乾燥花弁の85％エタノール抽出物20ｇから、ヘキサン可溶部および酢酸エチル可溶部を取り除き、水可溶部を得た。これを、ポリアミドカラムで水溶出部、メタノール・エタノール溶出部、1％アンモニア/メタノール溶出部に順次分画し、水溶出部13.5ｇ、メタノール・エタノール溶出部1.10ｇおよび1％アンモニア/メタノール溶出部2.10ｇを得た。

前述の操作を繰り返すことで得られたメタノール・エタノール溶出部2.3ｇをセファデックスLH-20カラムで60%メタノール、80％メタノール、100％メタノールに順次展開溶媒を変えながら溶出させ、80％メタノールで溶出したHPLC保持時間10minの目的物（１）をHPLCで確認し濃縮した。さらにこのサンプルを、水：メタノール＝70：30〜80：20の含水メタノールで再結晶を行い、目的とする6-ヒドロキシケンフェロール-3-Ｏ-グルコシド（１）を146mg得た。

HPLC測定とUV測定の結果を、それぞれ図１及び図２に示す。なお、測定条件は、それぞれ次の通りである。

（１）HPLC測定条件
Column：Inertsil ODS-3 4.6mmφx250mm
Eluent：MeOH / H₂O / AcOH=40 / 60 / 0.5
Detecter：HITACHI Diode Array L-7455
Detect：350nm
Sample inject Volume：10μl
（２）UV測定条件
機種：HITACHI 150-20形ダブルビーム分光光度計
Mode：Abs
Limts：0.0 to 1.50
WL scan speed：200nm/min
WL Limts：200.0 ton 600.0nm
Back round：no
No. of Repeat：1
Cycle Time：0
Response：Medium
Lamp Chane：Auto
Recording：no
WL Scale：nm/cm
Line：Solid
Cell：石英ガラスセル10mm

次に、単離精製した６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）について、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）により構造を決定した。１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル及び１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルデータは以下の通りである。また、単離精製された６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）は、無色結晶であり、融点は257~261℃であった。分子式はＣ₂₁Ｈ₂₀Ｏ₁₂で示され、分子量は分子式で464.41、高速原子衝撃質量分析法（Fast Atom Bombardment MassSpectrometry：FAS-MAS）による解析で463[M-H]^-であった。

（１）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル
1H-NMR（500MHz, DMSO-ｄ6）δ：
6.53(1H,s)8-H
8.04(2H,dd,J=8.9Hz, 2.1Hz)2’-H,6’-H
6.89(2H,dd,J=8.9Hz, 2.1Hz)3’-H,5’-H
5.48(1H,d,J=7.7Hz) 3-O-Glc ,1-H
3.23〜3.16 (1H,m) 3-O-Glc, 2-H
3.10〜3.09(1H,m) 3-O-Glc, 3-H
3.23〜3.16(1H,m) 3-O-Glc, 4-H
3.10〜3.09(1H,m) 3-O-Glc, 5-H
3.72(1H,d,J=10.3) 3-O-Glc, 6a-H
3.34(1H,d,J=6.8Hz) 3-O-Glc, 6b-H
（２）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル
13C-NMR（125MHz, DMSO-ｄ6）δ：
156.0 (C-2)
132.7 (C-3)
177.4 (C-4)
146.3 (C-5)
128.9 (C-6)
153.5 (C-7)
93.4 (C-8)
148.8 (C-9)
104.2 (C-10)
121.1 (C-1’)
130.7 (C-2’,C-6’)
114.9 (C-3’,C-5’)
159.7 (C-4’)
100.8 (3-O-Glc ,C-1)
74.1 (3-O-Glc ,C-2)
76.3 (3-O-Glc ,C-3)
69.7 (3-O-Glc ,C-4)
77.4 (3-O-Glc ,C-5)
60.7 (3-O-Glc ,C-6)

＜α−グルコシダーゼ阻害活性の測定＞
実施例１で調製した６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を用いて、α−グルコシダーゼ活性阻害試験を行った。

ラットアセトン粉末（ＳＩＧＭＡ社製）に9倍量の0.05Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ6.0）を加え、超音波処理後、3000ｒｐｍ・10分間遠心、上清を酵素液とした。マレイン酸緩衝液（ｐＨ6.0）に所定の濃度で溶解させた試験物質50μLに、マレイン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した2%ショ糖50μLを加え、37℃・5分間プレインキュベート後、マレイン酸緩衝液（pH6.0）で２倍希釈した酵素液を50μL加え、37℃・60分間反応した。反応終了後、95℃・10分間で酵素を失活させ、15000rpm・10分間遠心後、上清中のグルコース量をシンクロンＣＸ（ベックマン社）にて測定した。

コントロールとしては、前記試料溶液としてマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のみの溶液を使用したもの（ネガティブコントロール）を用いた。また、前記試料溶液として、α-グルコシダーゼ阻害薬であり食後過血糖改善薬として用いられるアカルボースの溶液を用い、ポジティブコントロールとした。

結果を「表１」に示す。表中の数値は、各酵素阻害活性を示す値（％）であり、各サンプルを用いた場合におけるグルコース量を、マレイン酸緩衝液を用いた場合（ネガティブコントロール）におけるグルコース量で除することにより算出した。

「表1」に示す通り、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を0.005%添加した場合、α−グルコシダーゼ活性は80%に抑制された。さらに、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を0.05％添加した場合にあっては、α−グルコシダーゼ活性は34%と、顕著に抑制された。このことから、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）が優れたα−グルコシダーゼ阻害活性を有することが明らかである。

＜血糖値上昇抑制効果の検討＞
６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）について、血糖値上昇抑制効果の検討を行った。

ラット（SD、雄、5週齢）を、オリエンタル酵母より購入し、1週間の馴化を行った。試験前日より17時間絶食させた後、体重測定を行った。また、尾静脈より採血し、血糖値をアントセンスII（バイエルメディカル社製）にて測定した。体重および血糖値が各群で均一になるように群分けを行い、1群あたり3匹とした。試験物質15mg/kg、ショ糖（和光純薬）2g/kgを、ゾンデを用いて強制経口投与した。６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）は低溶解性の為、投与溶媒は40%DMSO、60%蒸留水とした。投与30分、60分、120分後に尾静脈より採血し、血糖値をアントセンIIにて測定した。

コントロールには、前記投与溶液の代わりに40%DMSO、60%蒸留水のみの溶液と2g/kgを投与して同様に測定した。

投与後の血糖値の増加量（血糖上昇値(mg/dL)）を「表2」に示す。なお、血糖上昇値は、次の式により求めた。「血糖上昇値＝投与群血糖値−投与開始前の投与群血糖値」。

また、次の式により血糖値上昇抑制率(%)を求めた。「血糖値上昇抑制率＝ [1−{（投与群血糖値−投与開始前の投与群血糖値）/（対照群血糖値−投与開始前の対照群血糖値）}]×100」。血糖値上昇抑制率(%)を「表3」に示す。なお、表中、「AUC」は、曲線下面積（Area Under Curve）を表し、経時的な血糖値増加量を示す。

「表2」に示す通り、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を投与したラットでは、投与後30分、60分、120分の全ての時間において血糖値の増加が抑えられた。これにより、６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）が顕著な血糖上昇抑制作用を有することが示された（「表3」参照）。

本発明に係る抗糖尿病剤は、植物を起源とする天然物であることから、副作用等の心配が少なく、糖尿病の予防及び／又は治療剤として有効に利用することができる。また、抗糖尿病剤を配合した食品組成物は、容易に服用することができ、長期間に渡って、連続的に服用し続けることができる可能性が高い。

６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）のHPLCチャートを示す図である。６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）のUVチャートを示す図である。

Claims

下記「化１」で示される構造を有するフラボノイド配糖体である６−ヒドロキシケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド（１）を有効成分として含有する抗糖尿病剤。
α−グルコシダーゼ阻害活性及び／又は抑制活性を有することを特徴とする請求項１記載の抗糖尿病剤。
請求項１記載の抗糖尿病剤と薬理学的に許容され得る添加剤とを含有する糖尿病の予防剤及び／又は治療剤。
請求項１記載の抗糖尿病剤と食品原料とを含有する抗糖尿病食品組成物。