JP2007529221A - 産物分泌に基づいて細胞を精製するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、1つ以上の細胞を精製するための方法を提供する。1つの実施形態において、その方法は、(a)捕獲マトリックスの近位に固定化された複数の細胞と、産物に選択的に結合する因子とを接触させる工程であって、その捕獲マトリックスは、1つ以上の細胞により分泌された産物を局在化し得、その因子は、光の特性として検出可能なシグナルを発生し得る、工程;(b)その細胞の集団に照明する工程であって、その集団はフレームに含まれる、工程;(c)そのフレームから方向付けられる2つ以上の光の特性を検出する工程であって、第1の光の特性は、その集団の実質的に全ての細胞を同定し、そして第2の光の特性は、その捕獲マトリックスに局在化される産物を同定する、工程;(d)(i)その検出された第1の光の特性に関してその集団の実質的に全ての細胞、および(ii)その検出された第2の光の特性に関して1つ以上の選択された細胞を位置決定する工程、ならびに(e)非選択細胞に照射する工程であって、各非選択細胞は、実質的に致死的な線量の放射線を受容し、それによって、所望の産物分泌プロファイルを有している1つ以上の選択された細胞が精製される、工程を包含する。
本発明は、分泌された産物のインサイチュでの捕獲及び検出、並びに実質的に致死的な線量の放射線による処理を介した不要な細胞の排除に基づく、所望の産物分泌プロファイルを有している細胞を精製するための方法に関するものである。本発明の方法は、例えば、高レベル、中レベル、もしくは低レベルに産物を分泌する1つ以上の細胞を精製するため、又は検出可能な産物の分泌を欠く1つ以上の細胞を精製するために、使用され得る。
(2つの光の特性の検出に基づく個々の細胞産物分泌の検出)
この実施例は、実質的に全ての細胞の同定を含む、捕獲マトリックスの近位に固定化された個々のハイブリドーマ細胞により分泌された抗体の捕獲及び検出、それに続くゼロ(すなわち、検出レベル未満)から高レベルまでの範囲の所望の産物分泌プロファイルを有する細胞の選択を記載する。
(1つの光の特性の検出に基づく個々の細胞産物分泌の検出)
この実施例は、捕獲マトリックスの近位に固定化された個々のハイブリドーマ細胞により分泌された抗体の捕獲及び検出、それに続く、低〜高レベルの産物分泌を有する細胞の選択、及び選択された細胞により占められたドメイン領域の位置決定を記載する。
(産物分泌に基づく細胞の精製)
この実施例は、3つのクローンハイブリドーマ細胞株の作製を記載する。
Claims (84)
- 1つ以上の選択された細胞を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)捕獲マトリックスの近位に固定化された複数の細胞と、産物に選択的に結合する因子とを接触させる工程であって、該捕獲マトリックスは、1つ以上の該細胞により分泌された該産物を局在化し得、該因子は、光の特性として検出可能なシグナルを発生し得る、工程;
(b)該細胞の集団に照明する工程であって、該集団はフレームに含まれる、工程;
(c)該フレームから方向付けられる2つ以上の光の特性を検出する工程であって、第1の光の特性は、該集団の実質的に全ての細胞を同定し、そして第2の光の特性は、該捕獲マトリックスに局在化される産物を同定する、工程;
(d)(i)該検出された第1の光の特性に関して該集団の実質的に全ての細胞、および(ii)該検出された第2の光の特性に関して1つ以上の選択された細胞を位置決定する工程、ならびに
(e)非選択細胞に放射線を照射する工程であって、各々の非選択細胞は、実質的に致死的な線量の放射線を受容し、それによって、所望の産物分泌プロファイルを有する1つ以上の選択された細胞が精製される工程を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記産物が、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、増殖因子、酵素、ホルモン、神経伝達物質、シグナル伝達分子、および治療用タンパク質より選択される、方法。
- 前記捕獲マトリックスが、プロテインG、プロテインA、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、及び前記産物についてのリガンドより選択される物質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスがゲルを含む、請求項1に記載の方法。
- (f)前記細胞のさらなる集団に照明する工程であって、該さらなる集団は、さらなるフレームに含まれる工程、および工程(c)から工程(e)を繰り返すことをさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項1又は5に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項1又は5に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項1又は5に記載の方法。
- 前記複数の細胞における前記非選択細胞の実質的に全てが、実質的に致死的な線量の放射線を受容するまで、工程(f)の後に工程(c)から工程(e)を繰り返すことをさらに包含する、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記精製された1つ以上の選択された細胞を増殖させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(e)が自動化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記フレームが、5mm2超、10mm2超、20mm2超、40mm2超、80mm2超、及び160mm2超の群より選択される面積を有している視野の一部である、請求項1、5、又は9のいずれかに記載の方法。
- 前記産物と選択的に結合する因子が、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、基質、及びリガンドより選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記1つ以上の選択された細胞の近傍の前記捕獲マトリックスに局在化された産物の量に対応するシグナル値に関して同定される、請求項1に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、1つ以上の放射線パルスで、各非選択細胞に送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、0.1J/cm2超、0.3J/cm2超、1J/cm2超、3J/cm2超、10J/cm2超、30J/cm2超、及び100J/cm2超の群より選択されるエネルギー密度を有している、請求項1に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、107W/cm2超、108W/cm2超、109W/cm2超、1010W/cm2超、及び1011W/cm2超の群より選択される照射量を有している、請求項1に記載の方法。
- 前記放射線が、200〜400nm、400〜760nm、及び760〜3000nmの群より選択される波長を有している電磁放射線を含む、請求項1に記載の方法。
- 照明の前に、前記複数の細胞が、該細胞の実質的に全てと選択的に結合する試薬と接触させられ、該試薬が、第1の光の特性として検出可能なシグナルを発生し得る、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の選択された細胞を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)フレーム内の細胞の集団に照明する工程であって、該照明される細胞は、捕獲マトリックスの近位に固定化された複数の細胞に含まれ、該捕獲マトリックスは、該細胞の1つ以上により分泌された産物を局在化し得る、工程;
(b)該フレームから方向付けられた2つ以上の光の特性を検出する工程であって、第1の光の特性は、該集団の実質的に全ての細胞を同定し、第2の光の特性は、該捕獲マトリックスに局在化された産物を同定する、工程;
(c)(i)該検出された第1の光の特性に関連して該集団の実質的に全ての細胞、および(ii)該検出された第2の光の特性に関連して1つ以上の選択された細胞を位置決定する工程、ならびに
(d)非選択細胞を照射する工程であって、各々の非選択細胞は、実質的に致死的な線量の放射線を受容し、それによって、所望の産物分泌プロファイルを有する1つ以上の選択された細胞が精製される工程を包含する、方法。 - 前記産物が、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、増殖因子、酵素、ホルモン、神経伝達物質、シグナル伝達分子、及び治療用タンパク質より選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスが、プロテインG、プロテインA、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、及び前記産物についてのリガンドより選択される物質を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスがゲルを含む、請求項23に記載の方法。
- (e)前記細胞のさらなる集団に照明する工程であって、該さらなる集団はさらなるフレームに含まれる工程、および工程(b)から工程(d)を繰り返すことを包含する、請求項23に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項23又は27に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項23又は27に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項23又は27に記載の方法。
- 前記複数の細胞における前記非選択細胞の実質的に全てが、実質的に致死的な線量の放射線を受容するまで、工程(e)の後に工程(b)から工程(d)を繰り返すことをさらに包含する、請求項27に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記精製された1つ以上の選択された細胞を増殖させる工程をさらに包含する、請求項23に記載の方法。
- 工程(a)から(d)が自動化されている、請求項23に記載の方法。
- 前記フレームが視野の一部であり、該視野が、5mm2超、10mm2超、20mm2超、40mm2超、80mm2超、及び160mm2超の群より選択される面積を有している視野の一部である、請求項23、27、又は31のいずれかに記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記1つ以上の選択された細胞の近傍の前記捕獲マトリックスに局在化された産物の量に対応するシグナル値に関して同定される、請求項23に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、1つ以上の放射線パルスで、各非選択細胞に送達される、請求項23に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、0.1J/cm2超、0.3J/cm2超、1J/cm2超、3J/cm2超、10J/cm2超、30J/cm2超、及び100J/cm2超の群より選択されるエネルギー密度を有している、請求項23に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、107W/cm2超、108W/cm2超、109W/cm2超、1010W/cm2超、及び1011W/cm2超の群より選択される照射量を有している、請求項23に記載の方法。
- 前記放射線が、200〜400nm、400〜760nm、及び760〜3000nmの群より選択される波長を有している電磁放射線を含む、請求項23に記載の方法。
- 照明の前に、前記複数の細胞が、該細胞の実質的に全てと結合する試薬と接触させられ、該試薬が、第1の光の特性として検出可能なシグナルを発生し得る、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上の選択された細胞を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)フレーム内の細胞の集団に照明する工程であって、該照明される細胞は、捕獲マトリックスの近位に固定化された複数の細胞に含まれ、該捕獲マトリックスは、該細胞の1つ以上により分泌された産物を局在化し得る、工程;
(b)該フレームから方向付けられた少なくとも1つの光の特性を検出する工程であって、光の特性は、該捕獲マトリックスに局在化された産物を同定する、工程;
(c)(i)該検出された光の特性に関して1つ以上の選択された細胞、および(ii)該フレーム内の1つ以上のドメインであって、各ドメインは、少なくとも1つの選択された細胞により占められた領域に対応する、ドメインを位置決定する工程であって、該1つ以上のドメインは、該検出された光の特性に関して位置決定される工程、ならびに
(d)該フレーム内に含まれる非ドメイン領域に照射する工程であって、該非ドメイン領域内に存在する実質的に全ての細胞は、実質的に致死的な線量の放射線を受容し、それによって、所望の産物プロファイルを有している1つ以上の選択された細胞が精製される工程を包含する、方法。 - 前記産物が、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、増殖因子、酵素、ホルモン、神経伝達物質、シグナル伝達分子、及び治療用タンパク質より選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスが、プロテインG、プロテインA、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、及び産物についてのリガンドより選択される物質を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスがゲルを含む、請求項44に記載の方法。
- (e)前記細胞のさらなる集団に照明する工程であって、該さらなる集団はさらなるフレームに含まれる工程、および工程(b)から工程(d)を繰り返すことをさらに包含する、請求項44に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項44又は48に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項44又は48に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項44又は48に記載の方法。
- 前記複数の細胞における前記非選択細胞の実質的に全てが、実質的に致死的な線量の放射線を受容するまで、工程(e)の後に工程(b)から工程(d)を繰り返すことをさらに包含する、請求項48に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項52に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項52に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項52に記載の方法。
- 前記精製された1つ以上の選択された細胞を増殖させる工程をさらに包含する、請求項44に記載の方法。
- 工程(a)から(d)が自動化されている、請求項44に記載の方法。
- 前記フレームが視野の一部であり、該視野は、5mm2超、10mm2超、20mm2超、40mm2超、80mm2超、及び160mm2超の群より選択される面積を有している視野の一部である、請求項44、48、又は52のいずれかに記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、該1つ以上の選択された細胞の近傍の前記捕獲マトリックスに局在化された産物の量に対応するシグナル値に関して同定される、請求項44に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、1つ以上の放射線パルスで、非ドメイン領域内に存在する各細胞に送達される、請求項44に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、0.1J/cm2超、0.3J/cm2超、1J/cm2超、3J/cm2超、10J/cm2超、30J/cm2超、及び100J/cm2超の群より選択されるエネルギー密度を有している、請求項44に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、107W/cm2超、108W/cm2超、109W/cm2超、1010W/cm2超、及び1011W/cm2超の群より選択される照射量を有している、請求項44に記載の方法。
- 前記放射線が、200〜400nm、400〜760nm、及び760〜3000nmの群より選択される波長を有している電磁放射線を含む、請求項44に記載の方法。
- 1つ以上の選択された細胞を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)捕獲マトリックスの近位に固定化された複数の細胞と、産物に選択的に結合する因子とを接触させる工程であって、該捕獲マトリックスは、1つ以上の該細胞により分泌された該産物を局在化し得、該因子は、光の特性として検出可能なシグナルを発生し得る、工程;
(b)該細胞の集団に照明する工程であって、該集団はフレームに含まれる、工程;
(c)該フレームから方向付けられた少なくとも1つの光の特性を検出する工程であって、光の特性は、該捕獲マトリックスに局在化された産物を同定する、工程;
(d)(i)該検出された光の特性に関して1つ以上の選択された細胞、および(ii)該フレーム内の1つ以上のドメインであって、各ドメインは、少なくとも1つの選択された細胞により占められた領域に対応する、ドメインを位置決定する工程であって、該1つ以上のドメインは、該検出された光の特性に関して局在化される工程、ならびに
(e)該フレーム内に含まれる非ドメイン領域に照射する工程であって、該非ドメイン領域内に存在する各細胞は、実質的に致死的な線量の放射線を受容し、それによって、所望の産物分泌プロファイルを有している1つ以上の選択された細胞が精製される工程を包含する、方法。 - 前記産物が、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、増殖因子、酵素、ホルモン、神経伝達物質、シグナル伝達分子、及び治療用タンパク質より選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスが、プロテインG、プロテインA、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、及び産物についてのリガンドより選択される物質を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記捕獲マトリックスがゲルを含む、請求項64に記載の方法。
- (f)前記細胞のさらなる集団に照明する工程であって、該さらなる集団はさらなるフレームに含まれる工程、および工程(c)から工程(e)を繰り返すことをさらに包含する、請求項64に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項64又は68に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項64又は68に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記集団の他の細胞に比べて検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項64又は68に記載の方法。
- 前記複数の細胞における前記非選択細胞の実質的に全てが、実質的に致死的な線量の放射線を受容するまで、工程(f)の後に工程(c)から工程(e)を繰り返すことをさらに包含する、請求項68に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて高レベルの産物を産生する細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された産物分泌細胞が、前記複数の他の細胞に比べて低レベルの産物を産生する細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記複数の他の細胞に比べて検出不可能なレベルの産物を産生する細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記精製された1つ以上の選択された細胞を増殖させる工程をさらに包含する、請求項64に記載の方法。
- 工程(b)〜(e)が自動化されている、請求項64に記載の方法。
- 前記フレームが視野の一部であり、該視野は、5mm2超、10mm2超、20mm2超、40mm2超、80mm2超、及び160mm2超の群より選択される面積を有している、請求項64、68、又は72のいずれかに記載の方法。
- 前記産物と選択的に結合する因子が、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、基質、及びリガンドより選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択された細胞が、前記1つ以上の選択された細胞の近傍の前記捕獲マトリックスに局在化された産物の量に対応するシグナル値に関して同定される、請求項64に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、1つ以上の放射線パルスで、非ドメイン領域内に存在する各細胞に送達される、請求項64に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、0.1J/cm2超、0.3J/cm2超、1J/cm2超、3J/cm2超、10J/cm2超、30J/cm2超、及び100J/cm2超の群より選択されるエネルギー密度を有している、請求項64に記載の方法。
- 前記実質的に致死的な線量の放射線が、107W/cm2超、108W/cm2超、109W/cm2超、1010W/cm2超、及び1011W/cm2超の群より選択される照射量を有している、請求項64に記載の方法。
- 前記放射線が、200〜400nm、400〜760nm、及び760〜3000nmの群より選択される波長を有している電磁放射線を含む、請求項64に記載の方法。
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