JP2007084570A - 異常増殖性平滑筋細胞に関連した病因の予防及び治療 - Google Patents

Abstract

【課題】 TGF−ベータ活性化物質と TGF−ベータ生産刺激剤を、哺乳類の疾患又は損傷血管において血管管腔直径を維持し又は増加させるために使用する。症状、例えば血管形成、血管バイパス移植、移植臓器、アテローム性硬化症又は高血圧後の再狭窄が、減少された管腔直径を特徴とする。
【解決手段】本発明の好ましい態様においては、 TGF−ベータ活性化物質及び生産刺激剤が平滑筋細胞の異常な増殖を阻害する。予防投与量において不所望の全身毒性特性を特徴としない TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤は、増殖に関連する疾患症状及び／又は一定時間にわたる血管平滑筋の移動に関して、予防目的をもって慣性使用にも従う。さらに、インビトロにおいて TGF−ベータを測定し、それによりアテローム性硬化症についての危険にある患者を同定し、そして TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の１以上の投与を受容した受容者をモニタリングする方法をも提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、現在係属中の、1993年５月13日に出願された米国逐次番号第08／061,714 号の一部継続である。

発明の分野
本発明は、一般的には、異常平滑筋細胞増殖を特徴とする症状の予防及び治療に関する。より特に、インビボにおける血管平滑筋細胞増殖調節のための機構及びこれらの機構に衝撃を与える剤について討議する。

発明の背景
多くの病因学的症状が平滑筋細胞増殖に関連していることが判明している。このような症状は、再狭窄、アテローム性硬化症、冠状心疾患、血栓症、心筋梗塞、発作、平滑筋新形成、例えば腸及び子宮の平滑筋腫及び平滑筋肉腫、子宮類線維腫又は線維腫、及び血管移植及び移植臓器の閉塞（obliterative）疾患を含む。異常平滑筋細胞増殖の機構は、未だよく理解されていない。

例えば、経皮的経管腔的冠状血管形成（PTCA）は、冠状動脈の疾患をもつ多数の患者において主要な治療モダリティーとして広く使用されている。PTCAは、管腔閉塞を減少させ、そして冠状流れを改善することにより冠状動脈疾患を患う患者における心筋虚血を和らげることができる。この外科的処置は急速成長し、1983年に39,000の処置が実施され、1987年にほぼ 150,000の処置が実施され、1989年に、 250,000の処置が実施され、そして1994年までに500,000 PTCA／年を超えることが推定される。PTCA後の狭窄はかなりの問題を残し、患者の25％〜35％は１〜３月以内に再狭窄を顕出している。再狭窄はかなりの罹病率及び死亡率を生じ、そしてしばしばそれ以上の関与、例えば、反復した血管形成または冠状バイパス手術を必要とする。外科的関与または手術後の処置は（今日まで）再狭窄の予防において有効であることが証明された。

PTCA後の狭窄の原因となるプロセスは完全には理解されないが、いくつかの異なる生物学剤及び経路の間で複雑な相互作用から生ずることがある。組織学的断面で見ると、再狭窄病変は血管の内膜層の中に平滑筋細胞の過増殖を有することがある。PTCA後の平滑筋細胞の増殖についてのいくつかの可能な機構が示唆されている。

インビトロにおいて平滑筋の増殖を抑制すると報告されている化合物は、インビボにおいて使用するとき、望ましくない薬理学的副作用を有することがある。ヘパリンは１つのこのような化合物の例であり、インビトロにおいて平滑筋細胞の増殖を阻害すると報告されているが、インビボにおいて使用するとき、血液凝固を阻害するという潜在的に有害な副作用を有する。ヘパリンのペプチドは、抗血液凝固剤活性が減少しているが、短い薬理学的半減期を有するという望ましくない薬理学的特性を有する。二重バルーン・カテーテルを使用することによって、すなわち、血管形成部位における治療剤の領域デリバリーについて、そして薬物を含浸された生物分解性物質を使用することによって、すなわち、短い半減期の問題を補償するために、このような問題を解決する試みがなされた（例えば、米国特許第 4,929,602号）。

少なくとも５つの考察は、一見して、平滑筋細胞の過増殖から生ずる狭窄を予防するために阻害剤の使用を排除するように思われる。第１に、阻害剤は心臓血管疾患をもつ患者についての許容されえないレベルの危険をつくり出すことができるであろう全身的毒性を有することがある。第２に、阻害剤は手術後の血管外傷の治癒を妨害することがあり、そしてそれは治癒を遅延させるか又は新たに治癒した血管壁の構造または弾性を弱化することがある。第３に、平滑筋細胞を殺す阻害剤は取り囲む内皮及び／又は他の内側平滑筋細胞を損傷することがある。死亡した細胞及び死亡する細胞はまた、追加の平滑筋細胞の増殖を刺激しかつ狭窄を再燃させることがある有糸分裂誘発剤を放出する。第４に、阻害剤の治療的有効レベルのデリバリーはいくつかの点でやっかいであることがある：例えばａ）平滑筋細胞の間の細胞間空間の内への多数の分子のデリバリーは、すなわち、治療的有効投与量の分子がその細胞膜を横切りようにさせるために好適な状態を確立するために必要であることができる；ｂ）細胞内隔室の中への阻害薬物のデリバリーは、その作用が発揮される場合、コントロールすることが困難である；そしてｃ）阻害薬物とその細胞内標的、例えば、リボソームとの会合を最適化すると同時に、（例えば、付近の細胞への）その薬物の細胞間の再分配を最小化することは困難であることがある。第５に、平滑筋細胞の増殖は数週間にわたって起こるので、有益な効果を作り出すために、多分連続的に、阻害薬物をまた数週間にわたって投与すべきであるように演繹的に思われる。

以上から明らかなように、平滑筋細胞の増殖を有効に治療するための阻害薬物の使用において解決すべき多数の問題が残っている。例えば血管の手術の間に起こるような血管への外傷性障害後の血管平滑筋細胞の増殖を原因とする狭窄を抑制する新規の組成物又は方法を開発することは高く有利であろう。

発明の要約
TGF−ベータ活性物質及び TGF−ベータ生産刺激剤を、平滑筋細胞の不適当な増殖を特徴とする症状を予防し又は治療するために、例えば血管形成又は他の血管外傷後の再狭窄の防止又は減少のために本発明の実施において使用することができる。このような TGF−ベータ活性化物質及び生産刺激剤は、平滑筋細胞の異常な増殖を阻害する。このましい TGF−ベータ活性化物質／生産刺激剤は、トランス−２−〔４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エチルアミン並びにその機能的等価物、アナログ又は誘導体である。

投与される TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の量は、例えば移植後の血管拒絶の予防におけるより小さな血管外傷を治療するのに十分なより少ない量をもって、異なる重度の血管外傷を治療するために選択される。予防的投与量において不所望の全身的毒理学的特性を特徴としない TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤も、一定時間にわたり血管平滑筋細胞の増殖に関連する病的症状（例えば、アテローム性硬化症、冠状心疾患、血栓症、心筋梗塞、発作、平滑筋新形成、例えば腸及び子宮の平滑筋腫及び平滑筋肉腫、子宮類線維腫又は線維腫、等）に関して予防目的をもって慣性使用に従う。再狭窄の防止のためには、その外傷性手術（例えば、血管形成術）の前又は間により多くの量が好ましくは、投与される。外傷性手術が行われた後、一連のより少ない投与量が、再狭窄の危険を実質的に減少させ又は防止するために十分な時間にわたり抗−増殖的効果を維持するために一定時間にわたり投与される。この目的のために好ましい治療的プロトコール経過時間は約３〜約26週間である。

さらに、 TGF−ベータをコードする細胞mRNAをアップレギュレートする方法を提供する。このような代謝操作を受け易い細胞（例えば、平滑筋細胞）は、本明細書中に記載するやり方で同定され、そして有効量の TGF−ベータmRNA調節物質（すなわち、 TGF−ベータ生産刺激剤のサブセット）に晒される。このやり方で、 TGF−ベータ生産は刺激され、それにより平滑筋細胞の異常増殖が抑制される。

さらに、疾患又は損傷哺乳類血管内の血管管腔直径を維持し、そして増加させるための TGF−ベータの使用方法について記載する。さらに、哺乳動物におけるアナローム性硬化症を防止し又は減少させる方法を提供する。インビトロにおける TGF−ベータの測定方法をも提示する。

発明の詳細な説明
本明細書中に使用するとき、以下の用語は、以下に述べるような意味をもつ：
“増殖（Proliferation)”は、細胞数の増加、すなわち、細胞の有糸分裂を意味する。
“異常な又は病因学的な又は不適当な増殖”は、同一タイプの正常に機能する細胞内で典型的に生じるよりも有意に大きな程度まで又はそれよりも速く生じる細胞の分裂、成長又は転移を意味する。

“発現された（Expressed)”は、細胞によるポリペプチド、例えば血管平滑筋細胞又は血管周囲細胞により合成されたコンドロイチン・スルフェート・プロテログリカン（CSPG）の、mRNA転写及び結果として生じる合成による翻訳、糖添加、及び／又は分泌を意味する。

“タモキシフェン（Tamoxifen)”は、 TGF−ベータの生産又は活性化を強化することができるトンラス−２−〔４−（１，２−ジフェニル−１−グテニル）フェノキシ〕−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミンを含む。 TGF−ベータの活性化形態は、次に血管平滑筋細胞増殖を阻害する。上述の化学物質の機能的等価物及び誘導体も、本開示の目的のために用語“タモキシフェン”の範囲内に含まれる。例示的なタモキシフェンの機能的等価物は、プラスミン(plasmin) 、ヘパリン(heparin) 、アンギオテンシン(angiotensin) II、ヘキサメチレン・ビスアセトアミド（HMBA）、リポプロテイン(lipoprotein) LP(a) 又はグリコプロテイン・アポリポプロテイン（ａ）を失活させ又はそのレベルを減少させることができる化合物並びにそれらの誘導体又はアナログである。タモキシフェンを、本明細書中、原型 TGF−ベータ活性物質／生産刺激剤として使用する。

"TGF−ベータ (TGF-beta) ”は、 transforming growth factor-beta並びにその機能的等価物、誘導体及びアナログを含む。 TGF−ベータのイソ形態は、さまざまな細胞タイプの増殖及び分化に影響を与える多機能の、ジスルフィド結合２量体ポリペプチドのファミリーである。 TGFは、その時点においては、同定される生物学的活性を全くもたない潜在的プロペプチド形態で生産されるポリペプチドである。活性が付与され、そしてそれ故に血管平滑筋細胞増殖を阻害することができるようになるために、 TGF−ベータのプロペプチド形態は、解裂されて活性 TGF−ベータを生じなければならない。

"TGF−ベータ活性化物質（TGF-beta activator) ”は、 TGF−ベータの潜在形態をその活性形態に直接又は間接的に活性化することができる部分を含む。プラスミン、プラスミン活性化物質、タモキシフェン並びにそれらのアナログ、誘導体又は機能的等価物は、本発明の実施において有用な例示的な TGF活性化物質である。

"TGF−ベータ生産刺激剤（TGF-beta production stimulator) ”は、 TGF−ベータ（一般的にはその潜在形態）の生産を直接又は間接的に刺激することができる部分を含む。このような TGF−ベータ生産刺激剤は、 TGF−ベータmRNA調節物質（すなわち、 TGF−ベータのmRNAの生産を増加させる部分）、 TGF−ベータのmRNA発現のエンハンサー、等であることができる。

“直接的（Direct）”作用は、 TGF−ベータ活性化物質が TGF−ベータの潜在形態に対して作用することを含意する。このような直接的作用は、 TGF−ベータ生産刺激剤に適用されるとき、その生産刺激剤が作用する細胞が TGF−ベータのmRNA生産又は TGF−ベータの発現を増加させるということを示す。

“間接的（Indirect）”作用は、 TGF−ベータ活性化物質が一の部分それ自体に対して作用するか又は、１以上の他の部分を通して潜在的 TGF−ベータに対して作用するということを含意する。このような間接的作用は、 TGF−ベータ生産刺激剤に適用されるとき、その刺激剤が一の部分それ自体に対して作用するか又は、１以上の他の部分を通して細胞集団に対して作用して TGF−ベータmRNAの生産又は TGF−ベータの発現を刺激するということを示す。

本説明の目的のために、 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の効果が感じられる原型細胞（prototypical cells）は、損傷後の内膜過形成血管部位内で増殖する血管の層及び外膜（adventitia）血管から誘導される平滑筋細胞及び血管周囲細胞であり、例えばそれはPTCAの間に生じる。 TGF−ベータ活性化物質及び生産刺激剤は、血管形成後の治療のための使用に制限されず；むしろその有用性は、例えば血管壁内の平滑筋細胞及び血管周囲細辺の異常細胞増殖を阻害するそれらの能力により布告される（proscribed）であろう。従って、本発明の他の態様は、血管壁肥厚(hypertrophy) 及び／又は過形成の領域及びアテローム性硬化症の斑を減少させ、遅延させ、又は除去し（そしてさらに反転させる）ために初期の治療的関与において使用される TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤を含む。 TGF−ベータ活性化物質及び生産刺激剤は、アテローム性硬化症前症状における初期の関与のための用途もあり、例えばそれらは、血管壁の肥厚のための血管内のアテローム性硬化症の変化又は血管狭窄から生じる高血圧の徴候をもつ又は発達したアテローム性硬化症の高い危険にある患者において有用である。

本発明に係る TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤は、血管平滑筋細胞の病因学的増殖の阻害に、例えば血管形成後の狭窄の減少、遅延、又は除外に有用である。本明細書中に使用するとき、用語“減少する（reducing）”は、動物モデル又はヒトのいずれかにおいて、血管形成後の平滑筋細胞増殖の刺激から生じる内膜の厚さの減少を意味する。“遅延する（Delaying）”は、血管形成後の可視性の内膜過形成（例えば組織学的に又は血管造影図検査により観察されるもの）が開始するまでの時間を遅らせることを意味し、そしてまた“減少された”再狭窄により達成されることができる。血管形成後の再狭窄の“除去（Eliminating)”は、外科手術的な関与、すなわち繰り返しの、血管形成、アテローム切除術、又は冠状動脈バイパス手術により血管を通しての好適な血流を再確立することをもはや必要としない程度に、患者において内膜の厚みを完全に“減少させ”、そして／又は内膜の過形成を完全に“遅延させる”ことを意味する。狭窄を減少させ、遅延させ、又は除去する効果は、非限定的に、血管移植、超音波評価、Ｘ線透視画像形成、光学ファイバー内視鏡検査又は生検及び組織学を含む当業者に定常的な方法により測定されることができる。

高レベルのリポプロテイン Lp(a)は、アテローム性硬化症、冠状心臓疾患及び発作についての主な危険要因を構成することが知られている。このような症状及び他の問題に関連する一の徴候、例えばバルーン血管形成後の再狭窄及び他の病因学的症状は、平滑筋細胞の増殖又は転移である。 Lp(a)と血管平滑筋細胞との間の直接的なリンクは、従来技術において全く確立されていない。
血管平滑筋細胞増殖の調節のためのインビボにおける経路を図１中に示す。この機構は、健康な血管における非増殖性の状態において血管平滑筋細胞を維持する機構の一部を構成すると信じられている。

血管平滑筋細胞増殖は、 TGF−ベータの活性形態により阻害される。タモキシフェンは、 TGF−ベータの生産と活性化の両方を刺激することが、本明細書の実施例１中に詳説する実験により示された。ヘパリンは、血清中に存在する不活性複合体からの TGF−ベータの活性形態の放出に影響を及ぼすことにより TGF−ベータの活性化を刺激する。 TGF−ベータ中和抗体は、 TGF−ベータの活性を阻害し、それにより血管平滑筋細胞の増殖を容易にする。 TGF−ベータの活性化の明らかなインビボにおける生理学的調節物質は、プラスミンである。プラスミンは、例えばtPA(組織プラスミノーゲン賦活物質）による活性化を通してプラスミノーゲンから誘導される。プラスミノーゲン及び、それ故プラスミン活性は、リポプロテイン Lp(a)又はアポリポプロテイン（ａ)(apo(a)) により阻害され、それにより、 TGF−ベータの潜在形態の活性化を減少させ、そして血管平滑筋細胞の増殖を容易にする。

血管平滑筋細胞増殖の調節のためのさらなる経路を図２中に示す。休止平滑筋細胞は、それらの正常な、静止(quiescent) 非増殖状態における細胞を構成する。このような休止平滑筋細胞は、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子(FGF) 又は他の刺激性部分による活性化を通して増殖性平滑筋細胞に変換されることができる。この増殖性平滑筋細胞は、継続的な(continual) 増殖性平滑筋細胞（すなわち、その過増殖から生じる病的状態を作り出すことができる平滑筋細胞）に自己分泌的(autocrine) 成長因子により変換されることができる。この成長因子は、増殖性平滑筋細胞により生産されると信じられている。 TGF−ベータの活性形態又は適当に構築された（すなわちデザインされた）小分子阻害剤により阻害されることができるオートクライン成長因子の増加レベルが、継続的な増殖性平滑筋細胞の生産を仲介すると信じられている。

Lp(a)は低密度リポプロテイン(LDL) とapo(a)から成る。apo(a)は、プラスミノーゲンと約80％のアミノ酸同一性を共有している（MacLean et al., Nature, 330 : 132, 1987参照）。 Lp(a)は、細胞−会合プラスミノーゲン活性を阻害することが発見されている（例えば、 Harpel et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 86：3847,1989参照）。 Grainger et al., Biochem.J., 283 : 403, 1992中に記載されたようなDulbecco's修飾Eagles培地（DMEM）＋10％胎児ウシ血清(FCS) 中で培養された健康な移植ドナー組織から得られたヒト大動脈血管平滑筋細胞について行われた実験は、以下のことを示した：
１）集密下ヒト血管平滑筋細胞への Lp(a)の添加は、投与量依存のやり方でそれらの増殖を刺激した（ヒト血管平滑筋細胞への500nM Lp(a) の添加は、82±４時間から47±４時間までの倍化時間における減少を引き起こした；
２）apo(a)の添加は、同様の効果をもっていた。但し、より高い濃度のapo(a)がそのために必要とされる傾向にあった；
３）１マイクロモルまでの変化濃度における LDLの添加は、増殖に対する効果を全くもっていなかった。

Lp(a)とapo(a)についての１つの可能性のある作用モードは、表面・会合プラスミノーゲン活性化の競合的阻害であり、これは次に、プラスミンによる TGF−ベータのその後の活性化を阻害する。 TGF−ベータは、平滑筋細胞を含む多数の足場依存性細胞の有効な成長阻害剤である。 TGF−ベータは、その活性部分がそのプロペプチドのアミノ末端部分に非共有結合している共有結合したホモダイマー構造をもつ潜在的なプロペプチドとして生産される。潜在的 TGF−ベータは、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することができるようになるために（例えば、インビトロにおいては酸処理により、又はインビボにおいてはセリン・プロテアーゼ・プラスミンにより）解裂される必要がある。それ故、プラスミンは、 TGF−ベータの生理学的調節物質であるための主要な候補である。

Lp(a)とapo(a)が潜在 TGF−ベータの活性化による妨害により培養ヒト血管平滑筋細胞に対して作用するという仮定についてテストした。この仮定のサポートにおいて、血管平滑筋細胞に関連するプラスミン活性が Lp(a)により７倍、そしてapo(a)により５倍減少されたという観察が行われた。ならし培地中のプラスミン活性も Lp(a)とapo(a)により約２倍程減少されたが、血管平滑筋細胞カルチャー中の細胞会合プラスミン活性よりもかなり低かった。これらの観察は、 Lp(a)が、液相よりもむしろ表面会合の、プラスミノーゲン活性化のより有効な阻害剤であるという先の発見と矛盾しない。

Lp(a)が、プラスミノーゲン活性化よりもむしろプラスミノーゲン活性化物質の合成に影響を及ぼすという可能性を排除するために、ヒト血管平滑筋細胞カルチャー中のプラスミノーゲン活性化物質のレベルを、存在するリポプロテインが競合的阻害剤として有意に役立たないであろうように、大過剰のプラスミノーゲンの存在中並びにリポプロテインの存在及び非存在中、測定した。全プラスミノーゲン活性化物質の活性は、その血管平滑筋細胞カルチャー中のいずれかのリポプロテインの存在により影響を受けなかった。例えば、ならし培地中のプラスミノーゲン活性化物質の活性は、 500nMまでの Lp(a)の添加に伴い 0.7±0.6 mU／mlにおいて残存した。

Lp(a)とapo(a)は、共に、対照又は LDL−処理カルチャーに比較して 100倍を超える程、活性 TGF−ベータのレベルを減少させた。実施例１中に記載するように ELISAにより測定された全潜在プラス活性 TGF−ベータのレベルは、しかしながら、 Lp(a)又はapo(a)の存在により影響を受けなかった。これらの事実は、潜在 TGF−ベータから活性 TGF−ベータへのプラスミン活性化を阻害することによりヒト血管平滑筋細胞の増殖を Lp(a)が刺激するという結論を導いた。

この結論をさらにテストし、そして Lp(a)が活性 TGF−ベータに結合し、そしてプラスミン活性を減少させることにより働くという可能性を排除するために、ヒト血管平滑筋細胞を Lp(a)の存在中、培養した。これらの細胞は、47±３時間の集団倍化時間をもっていた。プラスミンの添加は、 Lp(a)の集団倍化時間減少効果を克服し、そして97±４時間に増加した集団倍化時間をもつ対照レベルまで細胞数を減少させることができた。

この経路におけるプラスミンの役割は、プラスミン活性の阻害剤がヒト血管平滑筋細胞に添加される試験により確認した。 Lp(a)と同様に、これらのプロテアーゼ阻害剤は細胞数を増加させた。例えばアプロチニンは、集団倍化時間（population doubling time）を対照カルチャーにおける82±４時間から48±５時間に減少させ、そしてアルファ２−アンチプラスミンは、倍化時間を45±２時間に減少させた。500nM Lp(a) 及びアプロチニンは僅かの追加の、増殖刺激だけをもたらし、この実験のカルチャーについての集団倍化時間は、45±６時間であった。

TGF−ベータに対する中和抗体は同様に、血管平滑筋細胞中の集団倍化時間を減少させた（例えば実施例１参照）。簡単に言えば、 Lp(a)、プラスミン阻害剤、及び TGF−ベータに対する中和抗体は、血管平滑筋細胞の増殖を刺激し、一方、プラスミンは、 Lp(a)の増殖刺激を無効にする。これらの結果は、 Lp(a)とapo(a)の作用モードがプラスミン活性化の競合的阻害であるという理論をサポートする。

TGF−ベータ及び血管平滑筋細胞増殖に対するタモキシフェンの衝撃を確認するために行った実験を実施例１中に詳細に記す。これらの実験の結果を以下に要約する。
１）タモキシフェンの添加は増殖の速度を減少させ、最大阻害が33マイクロモルを上廻る濃度において観察された。50マイクロモルのタモキシフェン濃度は、血清添加の96時間後に細胞数であって、タモキシフェンの非存在中同様に処理された細胞に比較したとき66％± 5.2％（ｎ＝３）程減少されたものを作り出した。
２）タモキシフェンは、細胞サイクル及び分裂を完了する細胞の割合を減少させる。それ故タモキシフェンにより引き起こされる血管平滑筋細胞の阻害は、増殖細胞のほとんど全て（＞90％）の細胞サイクル時間において増加の結果である傾向がある。
３）タモキシフェンは、細胞サイクルのＧ₂ 〜Ｍ期に移るのに要する時間を増加させることにより血清刺激血管平滑筋細胞の増殖速度を減少させる。
４）タモキシフェンは、 TGF−ベータ活性を誘導することにより血管平滑筋細胞の増殖速度を減少させた。
５）血管平滑筋細胞は、タモキシフェンに応答して TGF−ベータを生産した。タモキシフェンは、潜在 TGF−ベータの生産を刺激し、そして活性化された全 TGF−ベータの割合を増加させることによりラット血管平滑筋細胞のカルチャー中、 TGF−ベータ活性を増加させる傾向がある。
６）タモキシフェンは、ヘパリンと異なり、血清中に存在する不活性複合体から TGF−ベータを放出することによっては働かない。
７） TGF−ベータmRNAは、タモキシフェンの添加（10マイクロモル）後24時間までに約10倍程増加された。この結果は、平滑筋細胞による TGF−ベータmRNAの発現が増加され、それにより活性化された TGF−ベータによりその減少された増殖を容易にするであろうということを示唆する。この機構は、 TGF−ベータのmRNAをコードする核酸を取り込んだ細胞を使用することにより活用されることができ、これらの細胞は公知技術を使用して当業者により同定されることができる。
８）タモキシフェンは、外膜線維芽細胞についてよりも血管平滑筋細胞について少なくとも10倍低いED₅₀（50％阻害をもたらす濃度）をもつ血管平滑筋増殖の選択的阻害物質である。

追加の実験は、 Lp(a)又はapo(a)の添加が、タモキシフェンの、ラット血管平滑筋細胞増殖阻害活性を実質的に減少させ、タモキシフェン及び Lp(a)の存在中での集団倍化時間が（タモキシフェン単独についての55±２時間の集団倍化時間、及び対照についての35±２時間の時間に比較して）42±２時間であった。また、 Lp(a)の存在は、約50倍程タモキシフェンの添加に応答して生産された活性 TGF−ベータのレベルを減少させた。タモキシフェン及び Lp(a)により処理されたラット血管平滑筋細胞へのプラスミンの添加は、大部分の TGF−ベータが活性化されていることをもたらし、そして増殖は再び（57±３時間である集団倍化時間をもって）遅くされた。これらの観察は、 Lp(a)が TGF−ベータ活性化を阻害することにより働くとう理論と矛盾しない。

図１中に示す経路により血管平滑筋細胞増殖を阻害するように働く治療剤（直接的又は間接的 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤）の同定は、先にそして実施例１中に記載したタイプの実験を行うことにより本分離における従業者により同定されることができる。このような実験プロトコールは、本発明の、そして以下の活性の中の１であることができる実施において有用な治療剤の同定を容易にする：
１） TGF−ベータの生産又は活性化；
２） TGF−ベータ活性をもつこと；
３）プラスミンの活性化；
４）プラスミノーゲンの活性化；及び
５） Lp(a)又はapo(a)レベルの減少。

図２中に示す経路により血管平滑筋細胞増殖を阻害するように働く治療剤（直接又は間接 TGF−ベータ活性化剤又は生産刺激剤）の同定は、増殖平滑筋細胞により作られた成長因子であってこの成長因子はこれらの細胞にも作用するもの（すなわち、オートクライン成長因子）を同定するようにデザインされた公知の技術を使用した実験を行うことにより本分野における従事者により同定されることができる。合理的なドラッグ・デザインのための公知の技術を、次にこのようなオートクライン成長因子の生産又は活性を阻害するための能力について小分子をスクリーニングするために使用する。このような実験プロトコールは、本発明の、そして以下の活性の中の１であることができる実施において有用な治療剤の同定を容易にする：
１） TGF−ベータの生産又は活性化；
２） TGF−ベータ活性をもつこと；
３）増殖性平滑筋細胞により生産されるオートクライン成長因子の活性又は生産の阻害。

平滑筋細胞増殖は、心筋梗塞、アテローム性硬化症、血栓症、再狭窄、等の病因学的要因である。本発明に係る治療／予防剤であって、タモキシフェン等を含み、少なくとも１の上述の活性をもち、そしてそれ故、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することができるものが、これらの症状の防止又は治療において有用である。このような増殖を妨ぎ又は減少させるための血管平滑筋細胞についての増殖調節経路の操作は、例えば、アテローム性硬化症の動脈病変及び血管形成後の再狭窄動脈の主要成分を除去し又は減少させる。

より特に、活性化 TGF−ベータの上昇レベルを慣性的に維持することは、血管平滑筋細胞増殖の結果としてのアテローム性硬化症の病変の確率を減少させる。結果として、 TGF−ベータ活性化物質又は TGF−ベータ生産刺激剤の投与は、アテローム性硬化症及び冠状動脈遮断の結果であるその後の心筋梗塞に対して保護する。また、短時間にわたり活性化 TGF−ベータ・レベルを実質的に増加させることは、高い外傷性損傷又は手順、例えば血管形成により生じた血管平滑筋細胞増殖についての強力な刺激を、受容者をして少なくとも部分的に開始させることができる。外傷部位への継続した低投与量デリバリーは、その外傷領域内の血管平滑筋細胞増殖から生じた再狭窄に対してさらに保護する。

タモキシフェンは、例えばICI Pharmaceuticals (Macclesfield, England）から商業的に入手可能である。普通に商業的に入手可能な形態は10mg錠剤である。このような錠剤又はその部分は、本明細書中に記載された予防及び治療プロトコールにおいて使用されることができる。

外傷を受け又は疾患のある血管部位に関する予防又は治療、例えば TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤は、本発明に従って、注入カテーテル、例えば、 C.R.Bard Inc., マサチュセッツ州ビレリカにより製造されたもの、あるいはWolinsky（７；米国特許第 4,824,436号）またはSpears（米国特許第 4,512,762号）により開示されているものを使用して投与することもできる。この場合において、 TGF−ベータ活性化剤又は生産刺激剤の治療的／予防的有効投与量は、カテーテルのバルーンの間の流体空間中のその濃度が約10^-3〜10^-12 Ｍの範囲にあるとき、典型的には到達される。本発明者により認識されるように、 TGF−ベータ活性化剤又は生産刺激剤は、管腔をライニングする内膜又は外膜媒質細胞の基部の（６〜９）細胞層を暴露するのに十分な抗増殖性治療予防投与量でデリバリーされることも必要であることができる。またこのような投与量は、経験的に、例えば、ａ）好適な動物モデル系からの血管を注入しそして免疫組織化学的方法を使用して TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤及びその効果を検出し；そしてｂ）好適なインビトロにおける研究を実施する、ことによって決定されることができる。

当業者は認識するように、本発明に従ってカテーテルにより投与される TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の所望の治療的／予防的有効投与量は、いくつかの因子、例えば、ａ）注入の間に加えられる大気圧；ｂ）投与された TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤が血管部位に存在する経過時間；ｃ）使用する治療又は予防剤の性質；及び／又はｄ）血管外傷及び所望の治療の性質、を含むものに依存するであろう。（例えば患者内の薬物レベルをモニタリングし、そして臨床結果を観察することにより）治療的又は予防的有効投与量において薬物をデリバリーするように訓練された熟練者は、経験及び職業的判断に基づき個々の患者についての最適投与量を決定するであろう。好ましい態様においては、血管壁に15秒〜３分間直接的に加えられた約 0.3気圧（すなわち、300mmHg)〜約 気圧が、 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の、哺乳類動脈壁の平滑筋層への浸潤を達成するのに適当である。当業者は、 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の、疾患ヒト血管壁の内膜層への浸潤がおそらく変化するであろうし、そして個体に基づいて測定される必要があるであろうということを認識するであろう。

本発明の２つの代表的態様は、経口剤形又は注入カテーテル投与を使用する予防的又は治療的方法に関するものであるけれども、ドラッグ・デリバリー又は投与経路のための他の方法も、例えば、静脈内、リンパ内、くも膜下、動脈内への注射、移植された浸透圧ポンプ又は他の腔内経路による局所的デリバリーによるものも、有用であることができる。本発明に従う TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の投与は、連続的又は断続的であることができ、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるかどうか、そして、当業者に公知の他の要因に依存する。

本発明の特定の態様の実施においては、カテーテル及び他の投与経路は、好ましくは、液相にある医薬として許容される担体中に分散された TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤を使用して行われる。有用な医薬として許容される担体は、一般的に使用される担体、例えばホスフェート・バッファー生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば油／水及び水／油エマルジョン）及びさまざまなタイプの水和剤を含む。

TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤、例えばタモキシフェンのために、いくつかの例示的な投与法が、治療されるべき症状及びその症状が進行した段階に依存して、企図される。アテローム性硬化症に関しての予防的目的のために、例えばインビボにおける TGF−ベータ生産を上昇させるのに十分な低い慣性投与量が案出される。このタイプの例示的投与量は、（約 0.1〜約10mg／kg／日の間のレンジ内にあり）約 0.1mg／kg／日である。他の例示的投与量レンジは、約0.01〜約1000マイクログラム／mlである。このような低投与量は、比較的低い外傷損傷又は介在、例えば静脈移植又は臓器同種移植後の狭窄を改善することに関する使用をも企図される。有害な副作用（例えば、タモキシフェンが胸癌の治療において使用されたとき高投与量の投与の受容者により経験されるような悪心（nausea）は、これらの慣性又は低投与量養生法に関しては全く予期されない。

血管形成後の再狭窄、平滑筋細胞に対する強い急性増殖刺激をもたらすより高い外傷損傷又は介在の例を防止するために、より高い投与量が要求されるであろう。例えば、投与量養生法であって、上記介在時の前又は上記介在時に与えられる単一の“前−ローディング”投与量（又は多数のより少ない前−ローディング投与量）を含むのが企図され、慣性の少量（継続管理）投与量は、介在後２〜３週間以上にわたり毎日、デリバリーされる。例えば、単一の前−ローディング投与量が介在前約24時間前に投与されることができ、一方、多数の前−ローディング投与量は、介在前数日間にわたり毎日投与されることができる。あるいは、１以上の前−ローディング投与量は、介在前約１〜４週間投与されることができる。これらの投与量は、 TGF−ベータ活性化物質と生産刺激剤活性を最大化し、一方、細胞外マトリックス・タンパク質の合成及び分泌の誘導を最小化するように選択されるであろう。例示的な単一前−ローディング投与量は、約50mg／kgであり（約10〜約1000mg／kgの間のレンジにあり）、一方、例示的な多数の前−ローディングの個々の投与量は約10mg／kg／日であり（約0.01〜10mg／kg／日の間のレンジにある）。

認識されるように、 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤を注入カテーテルによりデリバリーすべき場合、所望の阻害活性を達成するために要求される治療投与量は、インビトロにおける研究の使用を通じて予測されることができる。好ましい態様においては、注入カテーテルは便利には透過性膜をもつ二重のバルーンまたは四重のバルーンのカテーテルであることができる。１つの代表的態様においては、 TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の治療的有効投与量は、疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤など）又は血管外科手術、例えば、血管形成、アテローム切除、ステントの配置（例えば、血管の中）、血栓切除、及び移植から生ずる血管の外傷の治療において有用である。アテローム切除は、例えば、外科的切除、超音波およびレーザーの処置によるか、あるいは高圧の流体流により行われることができる。移植は、例えば、天然又は合成材料を使用する血管の移植であるか、あるいは、例えば、器官の移植の間の、血管の外科的吻合であることができる。当業者は認識するように、所定の血管の外科手術（上の）のために適当な治療投与量はインビトロ及びインビボにおける動物モデルの研究において、そしてヒトの前臨床の実験において決定される。

本発明の代表的な態様は、経口剤形又は注入カテーテル投与を使用する治療方法に関するけれども、ドラッグ・デリバリーのための他の方法又は投与経路、例えば静脈内、リンパ内、くも膜下、動脈内、移植された浸透圧ポンプ又は他の腔内経路による局所的デリバリーも有用であることができることが認識されるであろう。本発明に従う TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤の投与は、例えば、受容者の生理学的症状、投与目的が治療又は予防的であるかどうか、及び熟練した従業者に公知の他の要因に依存して、連続的又は断続的であることができる。

本発明の特定の態様の実施においては、カテーテル及び他の投与経路は、好ましくは、液相にある医薬として許容される担体中に分散された TGF−ベータ活性化物質又は生産刺激剤を使用して行われることができる。有用な医薬として許容される担体は、一般的に使用される担体、例えばリン酸塩緩衝化生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば油／水及び水／油エマルジョン）及びさまざまなタイプの水和剤、を含む。

ヒト血管平滑筋細胞（VSMC）は、他の種、例えばラットから得られるVSMCよりも培養において増殖させるのが困難である（成人ヒトVSMCについての倍化時間＝70−85時間；大人ラットVSMCについてのもの＝35時間）。ヒトVSMCに対してならされた培地は、インビトロにおいてラットVSMCの増殖を減少させた。細胞サイクルのＳ期へのラットVSMCの侵入は、影響されなかった。しかしながら、Ｇ₂ 及び／又はＭ期の経過時間は、延長された。抗− TGF−ベータ抗体は、ヒトVSMCならし培地(HCM) への暴露により引き起こされたＭ期への遅延された侵入を反転させた。 HCMの検査は、上記培地中に存在する TGF−ベータの64±12％を既に活性化されたことを示した。これに反し、ラットVSMCならし培地は、潜在 TGF−ベータのひじょうに低いレベルを示し、そして検出可能な TGF−ベータ活性は全く示さなかった。ヒトVSMCは、培養においてt-PA活性を作り出すことが発見された。t-PAは、プラスミン活性における増加を導き、これは次に TGF−ベータを活性化する。これは、アプロチニン、すなわちプラスミン阻害剤の存在中、ヒトVSMCを培養することにより確認された。アプロチニンは、中和抗− TGF−ベータ抗体及びα₂ −抗プラスミンとほとんど同程度までヒトVSMCの増殖速度を増加させた。従って、培養におけるヒトVSMCの増殖は、プラスミンにより活性化された TGF−ベータの生産により測定され、このプラスミンは、細胞サイクルの経過時間を増加させるためにオートクライン・ループにおいてフィート・バックする。

継代培養されたヒト大動脈VSMCは、ラット大動脈VSMCよりもカルチャー中により分化されて残る（すなわち、それらは、より高いレベルの、ミオシン重鎖の平滑筋特異的イソ形態（SM-MHC）及びα−アクチンを含む）。 TGF−ベータは、同様に、SM-MHCとα−アクチン含量の維持において役割を演じ、そしてそれ故、より分化した表現型において細胞を維持することについて責任を負うことができる。これらのデータを見ると、血清中の不活性複合体から TGF−ベータを解放すると信じられているヘパリンは、内因的活性 TGF−ベータ生産により既に阻害されている、ヒトVSMCの増殖速度に対してほとんど効果をもたないと予想されるであろう。このような観察は、PTCA後に投与されたヘパリンのヒトの臨床試験がいずれかの有益な効果を立証するのになぜ失敗したかを説明することができる。

新たに分散されたラット大動脈VSMCは、それらが増殖し始めるときに、SM-MHCとα−SMアクチンを失う。培養７日後に、これらの細胞は集密に達する。血清が除去されるとき、約40％のVSMCが、新たに分散された細胞中に存在するものに匹敵するレベルにおいてSM-MHCとα−SMアクチンを再び発現する。これらの細胞が５継代以上培養され、そして集密に達するまで放置された場合、延長された血清除去後でさえ１％未満がSM-MHCが再発現される。これらの細胞は、増殖性の脱分化VSMCを提示する。

ラット大動脈VSMCの一次培養が TGF−ベータに暴露されるとき、204KD (SM-1)と 200KD (SM-2) SM-MHCイソ形態の喪失が実質的に阻害される。しかしながら、 TGF−ベータは、ひじょうに低いレベルの上記タンパク質をもつ継代培養された細胞においてSM-MHCの再発現を誘導することができなかった。それ故、 TGF−ベータは、（SM-MHC含量により定義されるような）細胞の分化状態を維持することができるが、脱分化された増殖性細胞において再分化を誘導することができない。 TGF−ベータは、一次と継代VSMCの両方の培養において細胞サイクルのＧ₂ 期を延長するので、このデータは、増殖と分化を仲介する経路が独立して調節されるということを示唆する。

分化と増殖 VSMCsの両方の特異的マーカーが単離されている。４つの細胞集団が生成された cDNAsを使用してプローブされた：（ａ）新たに分散されたラット大動脈細胞；（ｂ）培養７日後における新たに分散された大動脈VSMC（Ｄ７細胞）；（ｃ）12回継代された後の新たに分散されたラット大動脈VSMC（Ｓ12細胞）；及び（ｄ）ラット線維芽細胞。

５つのクラスの遺伝子マーカーが定義された。クラス１ cDNAsは、そのRNAsの全てにおいて同様のレベルまで発現された。クラス２ cDNAsは、新たに分散された大動脈細胞からの RNAにおいて高く発現されたが、Ｄ７又はＳ12細胞内では僅かに検出され、そしてラット線維芽細胞においては検出されなかった。クラス３ cDNAsは、新たに分散された大動脈、Ｄ７とＳ12細胞内で同様のレベルにおいて発現された。クラス４ cDNAsは、Ｓ12細胞と線維芽細胞内よりも新たに分散された大動脈及びＤ７細胞内でより高い発現を示した。クラス５ cDNAsは、新たに分散された大動脈細胞、Ｄ７細胞及び線維芽細胞内よりもＳ12細胞内でより強く発現された。クラス４遺伝子は、α−SMアクチン、γ−SMアクチン、SM22α、カルポニン（calponin）、トロポエラスチン（tropoelastin）、ホスホランバン(phospholamban) 及びCHIP28を含む。さらに、先に定義された分化された表現型のマーカーは、SM-MHC、インテグリン及びビンキュリンを含む。クラス５遺伝子は、マトリックスGla (MGP) 及びオステオポンチン(osteopontin) を含む。継代培養細胞が血清の除去により静止されたとき、 MGPとオステオポンチンのレベルは、有意に変更されず、これらの２つの遺伝子の高い発現が増殖を経験したVSMC内で生じるが、その細胞サイクル内にある細胞に依存しないということを示している。

遺伝子発現のこのような研究は、VSMCの増殖の間に生じる脱分化の過程に洞察を提供する。バルーン損傷ラット頸動脈のインサイチュー・サイブリダイゼーション分析は、損傷７日後に存在する分裂内膜細胞が高レベルのオステオポンチンと MGP RNAの両方を発現することを示唆した。これに対して、オステオポンチンは、無傷のラット大動脈と頸動脈の培地中に弱く発現されただけである。オステオポンチンと MGPは、血管病変において迅速に生じることができる石灰化の調節において役割を演じることができる。

ラット大動脈からの細胞の潜在的に異質の細胞を検査する経過において、３グループのVSMCクローンが単離された。１つのグループは、上皮様又は丸石の形態をもち、そして添加成長因子の必要性を伴わずに増殖する、自己分泌性成長因子の生産を示唆する小さな細胞から成る。第２のグループは、特徴的な“丘と谷”の模様において成長し、そして外因性成長因子に依存する中間サイズのスピンドル形状の細胞から成る。これらの細胞は、大人の大動脈VSMCの標準的な培養における優性な細胞形態に類似する。第３のグループは、限定された増殖能力をもつ、大きな、しばしば多核の細胞から成る。これらの大きな細胞は、多量の、平滑筋特異的タンパク質を発現する。

３タイプの細胞のすべてが、新生及び大人のラット大動脈から単離されることができた。しかしながら、若いラットからの大動脈は、高比率の上記小細胞クローンを作り出し、一方、大人のラットからのものは、高比率の、中間及び大きな細胞クローンを作り出した。小さなVSMCのクローンは、 TGF−ベータによる処理により中間サイズの細胞に変換するように誘導されることができる。これらの細胞の比率は、次に、低密度においてプレートされる場合、より大きな細胞に変更される。これらのより小さな細胞は、先祖細胞を提示することができ、そして大きな、非増殖性細胞は、成熟VSMCを提示することができる。

新生ラット大動脈から得られたVSMCは、いくつかの方法において正常な成人VSMCから区別される：（ａ）それらは、持続的な増殖のために外因性成長因子を必要としない；（ｂ）それらは、PDGF−様成長因子を分泌する；（ｃ）それらは、特徴的な上皮様形態をもって増殖する；そして（ｄ）それらは、高レベルのシトクローム P450IA1、エラスチン及びオステオポンチンを発現する（J.Biol.Chem. 266：3981-86, 1991 ; Biochem.Biophys.Res.Cowm. 177 ：867-73, 1991；Nature 311 ：669-71, 1984) 。内膜損傷後、新生内膜病変が上皮様形態をもって成長し、PDGF−様タンパク質を分泌し、そして血管壁中にオステオポンチンの増加された発現を示す（Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83：7311-15, 1986)。これらのデータは、齢と伴に全細胞集団の減少した割合を含んで成り、そして優先的に増殖するVSMCのサブ集団のインビボにおける存在と矛盾しない。

TGF−ベータは、血管損傷の部位において、血小板、マクロファージ及びVSMCにより放出される。血管損傷の部位におけるVSMC及び内皮細胞はt-PAを合成し、そして放出することができるので、分泌された TGF−ベータを活性化する局所的機構が存在する。
t-PA活性のレベルは、血管壁内で合成されるプラスミノーゲン活性化物質阻害剤−１(PAI-1) の発現に依存し、そして TGF−ベータによりアップレギュレートされることができる。さらに、 TGF−ベータは、高アフィニティーをもってα２−マクログロブリンに結合する。このような結合は、 TGF−ベータが、 TGF−ベータのための細胞表面レセプタへ結合できないようにする。多アニオン性グリコサミノグリカン、例えばヘパリンも正常には血管壁内に存在し、そしてこれらの部分は、α２−マクログロブリンとの TGF−ベータの会合を逆転させることができる。VSMCの表現型の状態は、それらの細胞外環境により影響されることができる。従って、 TGF−ベータの生物学的効果は、さまざまな調節機構の支配下にある。

TGF−ベータは、PDGF又は EGFのいずれかにより刺激されたラット大動脈VSMCにおける DNA合成を阻害する。しかしながら、血清により刺激された細胞においては、 TGF−ベータは、 DNA合成に対しほとんど効果をもっていない。その代わりに、 TGF−ベータは、細胞サイクルのＧ₂ 期を延長することによりその抗−増殖効果を発揮する。同様に、ヘパリンは、細胞サイクルのＧ₂ 期を延長することにより血清−刺激されたラットVSMCの増殖を阻害する。ヘパリンのこの効果は、抗− TGF−ベータ抗体により除去されることができる。これらの観察は、インビトロ、そしておそらくインビボにおけるVSMCに対するヘパリンの抗−増殖効果が TGF−ベータの放出を通して発揮されることができることを示唆する。

VSMCが細胞カルチャー中に分散されるとき、それらは、収縮性タンパク質を失い、そしてそれらが増殖するとき“合成”表現型に変調される。アテローム斑におけるVSMCの大部分は、この合成表現型をももつようである。平滑筋特異的タンパク質の損失が増殖が全く起こらない分裂促進剤の非存在中、細胞培養において自発的に生じるので、この表現型の変化は、分裂促進剤刺激に帰されることはできないが、むしろそれらの細胞外マトリックスからの細胞の除去に帰される。このマトリックスは、収縮状態においてVSMCを維持することができる多量のコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含む。しかしながら、 TGF−ベータは、表現型変調の阻害を通じてその抗−増殖効果を発揮しない。なぜなら、それが、もはや収縮タンパク質を発現することができない継代培養された細胞の増殖を遅くすることにおいて有効であるからである。従って、 TGF−ベータは、（１）その収縮表現型において分化した成人VSMCを維持し；（２）小さなVSMCから中間サイズのスピンドル−形状のVSMCへの成熟を引き起こし；そして（３）表現型に拘らずVSMC増殖を阻害する、独立した特性を示す。収縮から合成表現型への変更は、増殖のために必須ではない。

培養されたVSMCは、多量の細胞外マトリックス・タンパク質を合成し、そして分泌する。 TGF−ベータは、細胞外マトリックス・タンパク質の生産を強化し、これは、変調に供された細胞における合成表現型の維持を好む。さらに、 TGF−ベータは、多数のプロテアーゼ阻害剤の発現を増加させ、これは、細胞外マトリックス・タンパク質の蓄積をも増加させる。

高血圧においては、最大管腔直径におけるその後の増加を伴う、血管中膜の増加した厚さであって、増加した血管抵抗性を導くものが存在する。この血管中膜の増加した厚さは、その中膜内でのVSMCの成長に因る。大きな伝導性血管、例えば大動脈においては、VSMC成長は、VSMC過栄養（すなわち、増殖を伴わない細胞の拡大化）に主に帰されると信じられている。高血症動物においては、これらの血管は、その大動脈媒質内の多倍体細胞の増加した徴候を示す。しかしながら、低抗性血管、例えば腸間膜動脈においては、VSMC増殖は、血管中膜の増加した厚さに帰されることができる。従来、高血圧におけるVSMC増殖は、上昇した血圧から生じると信じられていた。最近のデータは、増加した血管の緊張状態（tone）及びVSMC過栄養及び／又は過形成が共通の刺激により独立して引き起こされることができるということを示唆している。例えば、ある環境下では、血管収縮ペプチド AIIは、VSMCのための分裂促進剤であることができる。さらにまた、 AIIにより刺激されたVSMCは、 TGF−ベータを合成する。従って、 AIIの分裂促進効果のいずれも TGF−ベータにより阻害されることができるであろうし、 AII刺激の正味の効果は、Ｇ₁ 内で休止し、そして増殖を伴わずに過栄養である。 AIIは、VSMCによりt-PAの発現を刺激することにより TGF−ベータの活性化を誘導することができる。

高血圧に関連するVSMCは、その血管の中膜内に残り、そしてヘパリン−含有の細胞外マトリックスにより取り囲まれる。それ故、生産された TGF−ベータのいずれも自由に利用可能であり、そして収縮状態においてVSMC維持するであろう。

閉塞性血管疾患、例えばアテローム性硬化症においては、VSMCは、その中膜から転移し、そしてその内膜内で増殖する。そこで、それらは、細胞外マトリックス・タンパク質を分泌し、そして血管管腔上に侵食する（encroaches）脂質に富む斑を形成する。この過程は、再狭窄を導く、PTCA後に生じる過程よりも遅いが、これに類似する。このような不適当な内膜VSMC増殖は、血管バイパス移植片及び移植された臓器の動脈内でも生じ、これらは、それぞれ、移植片閉塞及び臓器機能不全を導く。アテローム性硬化症においては、この病変に関係するVSMCは、高血圧に関連するVSMCとは異なり、一般的に合成表現型を有し、そしてその内膜内に局存在する。

アテローム性硬化症に関連する中間（medial）VSMCについては、VSMC転移は、マトリックス・タンパク質の合成及び分泌における増加及び増殖により行われる。 TGF−ベータは、分裂促進剤に対するVSMC増殖応答を減少させ又は防止することができ、そして／又は細胞外マトリックス・タンパク質の合成及び分泌を誘導することができる。この場合における TGF−ベータの効果は、細胞性の減少及びアテローム性硬化症の斑のマトリックス成分の増加であろう。

あるいは、内膜内のVSMCは、転移することができる新生−様VSMCの集団及び血管損傷後の優位な増殖から生じることができる。この内膜表現型は、血管損傷において誘導されるか又は選択されるかのいずれかであることができる。これらの細胞が、 TGF−ベータに暴露されるとき、新生−様の小細胞表現型は、もはや自己分泌的成長因子を生産しない中間サイズのスピンドル形状の細胞に変換されなければならない。従って、中間サイズの細胞は、減少された増殖傾向をもたなければならない。一定の時間にわたり、この中間サイズの細胞集団の一部が大きな非増殖性のVSMC表現型に変換されるであろう。

VSMCが自己分泌的 TGF−ベータを生産する場合、タモキシフェンは、VSMC増殖に対して最小の効果をもち又はさらなる阻害効果を全くもたない。その上、これらの TGF−ベータ−生産性VSMCは、 TGF−ベータを生産しないVSMCのものとは異なることができる分裂促進性の刺激に対する応答を示す。このようなデータは、アテローム性硬化症及び血管損傷又は外傷に関連する傾向をもつ要素間の複雑な相互作用のさらなる証拠を提供する。ヒトapo(a)遺伝子を発現するトランスジェニック・マウスは、 TGF−ベータ活性化、VSMC増殖及び、初期ヒト・アテローム性硬化症病変を真似る血管病変の研究に有用なツールである。これらのマウスにおいては、apo(a)は、血管壁の管腔表面内の病巣領域内に蓄積する。これらのapo(a)の病巣は、プラスミンの生産における減少を導くプラスミノーゲン活性化を阻害する。プラスミンの低い局所濃度は、 TGF−ベータの減少された活性化をもたらす。この TGF−ベータ活性化の阻害は、最高のapo(a)蓄積の部位において最大である。さらに、これらの効果は、このトランスジェニック・マウスが正常な食餌又は脂質に富んだ食餌により飼養されるか否かについて観察される。活性化された TGF−ベータの血清レベルは、組織切片上で行われる免疫蛍光測定と相関する。オステオポンチン、すなわち活性化されたVSMCのマーカーは、病巣のapo(a)蓄積及びひじょうに低い TGF−ベータ活性化の領域と共に局在化した。

一般的には、アテローム性硬化症は、血管の管腔を傷つける、血管壁が変形される心臓血管疾患である。このアテロール性硬化症の変形過程は、血管壁の内膜内での、細胞、すなわち、平滑筋細胞と単球／マクロファージ炎症細胞の蓄積を含む。これらの細胞は、たぶんその循環から脂質を取り込んで、成熟したアテローム性硬化症病変を形成する。これらの病変の形成は、慣性的過程であり、成人ヒト寿命の数十年にわたり生じるけれども、アテローム性硬化症に関連する罹患率の大部分は、病変が破裂するときに生じ、動脈を急速に閉塞させる血栓形成性の死骸を放出する。このような急性の事件が冠状動脈内で生じるとき、心筋梗塞があとに起り、最悪の場合、死に到ることができる。

アテローム性硬化症病変の形成は、５つの重複した段階において生じると考えられることができる。これらの過程のそれぞれは、アテローム性硬化症のヒト及び動物において生じることが示されることができるが、その病因に対するそれぞれの相対的な寄与及びその病変の臨床的意義は不明である。

１．転移(MIGRATION) 。健康な血管内では、平滑筋細胞(SMC) のほとんど又は全てが血管中膜内に含まれる。病変形成の間の拡大された内膜内への SMCの出現は、それ故、その中膜から血管の内膜への SMCの転移を必要としなければならない。この SMC転移の阻害は、その病変の性質をかなり変更するであろうし、そして病変形成と関連する病的症状を軽減することができる。

２．脂質蓄積（LIPID ACCUMULATION）。健康な血管壁内の中間 SMCは、脂質を有意に蓄積しない。しかしながら、内膜 SMCは、脂質取り込み及び保存についての増加された能力をもつ。循環性脂質（特に、低密度リポプロテイン；LDL)の上昇レベルに暴露されるとき、 SMCは、脂肪脂質により飽和されるようになることができ、そして死ぬことができる。脂質の蓄積は、その病変の、臨床的な意味までの進行に必要である。なぜなら、それは、その病変の血栓形成性の壊死性コアを形成するからである。 SMC内の脂質蓄積の阻害は、病変形成及び／又は進行を有意に減少又は防止し、これ故アテローム性硬化症及びその結果として生じる心筋梗塞を減少させ又は防止するはずである。

３．炎症細胞の増加(RECRUITMENT OF INFLAMMATORY CELLS) 。ヒト病変は、多くのマクロファージ−誘導細胞を含む。増加の過程、これらの細胞の機能、及び病的症状に対するそれらの寄与は不明である。過剰に単純化された機構は、マクロファージが、血管壁から脂質を除去するために、その病変内に蓄積する脂質にひきつけられるということを示唆する。マクロファージ−誘導細胞の増加の阻害は病変の病的症状を減少させることができるであろうけれども、それはまた、脂質が満たされた破裂し易い状態にまでの進行速度を上昇されることができる。

４．増殖(PROLIFERATION) 。内膜 SMC蓄積は、多くの場合、中間肥厚により達成される。それ故、全 SMC数は、その病変部位において有意には増加することができない。さらに、アテローム性硬化症の慣性特性は、これらの病変における増殖の刺激を検出することを困難にする。トランスジェニックapo(a)マウスから得られたデータは、apo(a)が SMC増殖を刺激することができるということを示唆する。しかしながら、 SMC過形成がアテローム性硬化症に対する主要な貢献者であるという証拠を欠く。従って、アテローム性硬化症に対してapo(a)の阻害がもつ最終的な効果は、 SMC増殖が、アテローム性硬化症斑の開始又は進行に貢献することに依存する。

５．細胞外マトリックス沈着(EXTRACELLULAR MATRIX DEPOSITION）。アテローム硬化症病変は、細胞外マトリックス(ECM) 、そして特に、コラーゲン線維内で富んでいる。増加された ECM合成は、斑の安定性を増加させることができる。心筋梗塞を導く初期の斑破裂は、低い ECM沈着及びその結果として生じる線維キャップであってその病変の壊死性の脂質に富むコアを重層するものの弱化に関連することができる。

従って、アテローム性硬化症は、その中のいくつかが未だ同定されることができないさまざまな過程の複雑な相互作用を包含する。アテローム性硬化症を減少させ又は防止するための努力における単一過程の標的化は、明示の病因学に対する各過程の相対的な貢献の知識に依存する。これらの理由のために、協調された治療的戦略が好ましい。例示的な戦略は、 ECM沈着の増加の可能性のある有益な効果による、 SMC転移、脂質の蓄積及び増殖の阻害を含む。

アテローム性硬化症について危険のある患者を同定し、そしてそれ故治療のための好適な候補を同定するための診断方法は、本発明の内に用途がある。さらに、この診断検定法は、アテローム性硬化症について治療されている患者をモニターするための手段を提供する。一の形式、すなわち、全 TGF−ベータを測定するためのサンドイッチ ELISAにおいては、 ELISAプレートを、潜在と活性 TGF−ベータの両方に結合するラット抗体によりコートする。患者血清を、これらの ELISAプレートによりインキュベートし、次にこれらのプレートを患者の血清の非結合成分を除去するために洗浄する。潜在と活性 TGF−ベータの両方に結合することができるウサギ抗− TGF−ベータ抗体を次にプレートに添加し、そしてインキュベートする。次にこれらのプレートを、洗浄して非結合抗体を除去し、そしてペルオキシダーゼ−標識された抗−ウサギ IgGを添加する。インキュベーション及び洗浄後、これらのプレートを発色団基質、オルトフェニレンジアミンに晒す。次に患者の血清中の全 TGF−ベータの存在を、標準曲線と比較することによりＡ₄₉₂ において比色計により測定する。 TGF−ベータを修飾する剤により治療された患者において、 TGF−ベータの前処理測定を、処理結果及び効果をモニターするために処理後の時点と比較することができる。

別の形式においては、 TGF−ベータの活性形態を認識する TGF−ベータ・タイプIIレセプタ細胞外ドメインを、 ELISAプレート上にコートする。患者血清をこれらのプレートに添加し、そして上述のように処理する。この検定法は、血清中に存在する活性 TGF−ベータを測定する。

さらに別の形式においては、蛍光−標識抗− TGF−ベータ抗体又は TGF−ベータ・タイプIIレセプタ細胞外ドメインを、患者血清中の TGF−ベータの存在を検出するために、ペルオキシダーゼ標識された第二抗体の代わりに使用する。さらに他の別の形式においては、抗− TGF−ベータ抗体又は TGF−ベータ・タイプIIレセプタ細胞外・ドメインを、標準的な手段により検出することができる放射性部分により標識付けする。これらの後者の２つの検定法は、上記の追加の抗− TGF−ベータ抗体の使用の有無に拘らず、 ELISA形式において行われることができる。さらに、これらの後者の２つの検定法は、他の自動化又は非自動化検定法及び検出方法に従う。
本発明は、以下の特定の実施例を参照することによりより良好に理解されるであろう。

実施例１
血管平滑筋細胞に対するタモキシフェンの衝撃及び TGF−ベータ生産及び活性化に対す
るその関係
細胞培養、 DNA合成検定及び細胞計数。 ラット血管平滑筋細胞を、 Grainger et al., Biochem.J., 277 ：145-151, 1991 中に記載したように、12−17週齢のWistarラットからの大動脈中膜の酵素的分散の後に培養した。（約６日後）細胞が集密に達したとき、これらの細胞を(Gibcoから入手可能な）トリプシン／EDTAにより解放し、そして 100Ｕ／mlのペニシリン及び10％胎児ウシ血清(FCS) を補ったDulbecco's修飾 Eagle's培地 (DMEM； ICN／Flowから入手可能）中で１：２希釈した。次にこれらの細胞を、約１×10⁴ 細胞／cm² において(ICN／Flowから入手可能な）組織培養プラスチック上に再プレートした。これらの細胞を、集密に達するときこの方法で繰り返し（約４日毎に）継代培養し、そしてこれらの細胞を６〜12の継代間で使用した。ラット血管外膜線維芽細胞を、 Grainger et al., Biochem.J., 283 ：403-408, 1992 中に記載したように培養した。簡単に言えば、大動脈をコラゲナーゼ（３mg／ml）により30分間37℃において処理した。血管外膜(tunica adventitia) を中膜(media) からはがした。この血管外膜を、(ICN／Flowから入手可能な) 培地M199中に溶解したエラスターゼ（１mg／ml）及びコラゲナーゼ（３mg／ml）中で２時間分散させた。次にこれらの細胞を遠心し(900×ｇ、３分間）、DMEM＋10％ FCS中に再懸濁し、そして組織培養プラスチック上に８×10⁴ 細胞／cm² においてプレートした。（約10日後）細胞が集密に達したとき、それらを血管平滑筋細胞について記載したように継代培養した。血管外膜線維芽細胞を、１：３希釈において３日毎に継代し、そして継代３〜９間を使用した。

DNA合成を、 Grainger et al., Biochem.J., 277 ：145-151, 1991 中に記載されたように〔 ³Ｈ〕−チミジン取り込みにより検定した。血管平滑筋細胞を継代培養し、DMEM＋10％ FCS中で24時間増殖させ、無血清DMEM中で48時間静止させ、そして“０”時間において10％ FCSにより再刺激した。〔 ³Ｈ〕−チミジン（５マイクロキューリー／ml；Amersham Internationalから入手可能である）を、再刺激の12時間後に添加し、そしてそれらの細胞を24時間後に収穫した。外膜線維芽細胞による DNA合成を同様に測定した。但し、細胞を、無血清培地中で24時間で静止にした。

細胞を、 Grainger et al., Biochem.J., 277 ：145-151, 1991中に記載したように３連培養皿から血球計による計数のために調製した。また細胞を、格子培養皿の直接顕微鏡観察によりカウントした。格子を、それらの細胞が実験の間にカウントされる領域内に又は外に転移することができないように、内部表面上プラスチック内に刻み目をつけた。２つの別個のウェル内の４つの正方形の中のそれぞれの中の細胞を各時間点においてカウントした。すべての細胞計測実験を、少なくとも３つの別個のカルチャーについて繰り返した。

タモキシフェンの保存溶液（５mM； ICI Pharmaceuticalsから入手可能）を10％エタノール (EtoH) 中で調製し、そしてDMEMと10％ FCS中で希釈して、最終濃度を得た。各タモキシフェン濃度の効果を、同一最終濃度のエタノール媒質を含む対照ウェル内で観察された効果と比較した。（Amersham Internationalから入手可能な）組換え TGF−ベータを 25mM Tris／Cl中に溶解して５マイクログラム／mlの保存溶液を得て、そしてSpinnex Tube (例えば、 Rainin Instrument Company, Inc., Woburn, MAから入手可能なCentrex Disposable Microfilter Unit)を通して滅菌濾過した。 TGF−ベータに対する中和抗血清(BDA19；R&D Systemから入手可能) を、Millipore Corporation, Bedford, MAから入手可能な）滅菌 Milli Q水で再構築した。10マイクログラム／mlにおいて、この抗体は、継代培養された（８継代）血管平滑筋細胞に対する10ng／mlの組換え TGF−ベータの活性を完全に失った。

TGF−ベータについての検定。 さまざまな細胞に対してならされた培地中に存在する TGF−ベータ活性を、ミンク肺内皮 (MvLu)細胞に対する DNA合成検定； Danielpour et al., J.Cell.Physiol. , 138 ：79-83, 1989 中に記載された検定の修飾により測定した。MvLu細胞を、DMEM＋10％ FCS中で１：５希釈において継代培養した。24時間後、その培地を、10マイクログラム／mlにおいて TGF−ベータに対する中和抗血清の非存在又は存在中テストされるべきならし培地により置換した。〔 ³Ｈ〕−チミジン（５マイクロキューリー／ml）の１時間のパルスの間の DNA合成を、上記テスト培地の添加23時間後に測定した。 TGF−ベータ活性を、阻害値を TGF−ベータの量に変換するための標準曲線を使用して、中和抗体の存在中逆転された DNA合成の阻害の割合として計算した。 TGF−ベータ１標準及びならし培地の両方がDMEM中10％ FCSを含んでいた。

存在する全潜在及び活性 TGF−ベータをサンドイッチ ELISAにより測定した。(Gibcoから入手可能な)Maxisorb 96−ウェル ELISAプレートを、室温において一夜、リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS) 中で２マイクログラム／cm² において TGF−ベータに対する中和抗体(BDA19； R&D Systemsから入手可能）によりコートした。これらのプレートを、 (Sigma Chemical Companyから入手可能な)0.1％ Triton X-100 を含むトリス−緩衝化生理食塩水により各段階の間で洗浄した。これらのプレートを、サンプルと２時間、 TGF−ベータに対する第二抗体 (BDA5；R&D Systemから入手可能）と 0.1マイクログラム／mlにおいて２時間、抗−ウサギ IgGペルオキシダーゼ結合抗体 (Sigma Chemical Co.から入手可能）と１時間、そして製造者の指示に従って調製した発色性基質ｏ−フェニレンジアミン(Sigma) と15分間、インキュベートした。 492nmにおける吸光度を、標準曲線を使用して TGF−ベータ・タンパク質の量に変換した。ならし培地と標準の両方をDMEM中の10％ FCSの存在中検定した。この検定は、DMEM中10％ FCSの存在中、 0.1ng／ml〜20ng／mlのレンジ内で TGF−ベータ濃度について線形であった。

RNA調製及びノーザン分析。 全細胞質 RNAを、 Kemp et al.,Biochem.J., 277 ：285-288, 1991 中に記載されたような培養された血管平滑筋細胞から単離した。ノーザン分析を、 2.2Ｍホルムアルデヒド、 20mM ３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸、１mM EDTA 、５mM酢酸ナトリウム及び 0.5マイクログラム／mlの臭化エチジウムを含むバッファー中、 1.5％のアガロース・ゲル中の全細胞質 RNAの電気泳動により行った。 RNAの完全性を、製造者により特定されるような(Pharmacia LKBから入手可能な）Hybond N上への転移の前にUV照明下でそのゲルを可視化することによりチェックした。フィルターを、 Millan et al., Development , 111 ；131-144 中に言及されたように TGF−ベータ１ポリペプチドの前駆体領域内のアミノ酸68−228 に対応する〔³²Ｐ〕−オリゴ標識マウス TGF−ベータ１プローブを使用して、Kemp et al.,Biochem.J., 285-288, 1991 中に記載されたようにハイブリダイズした。

結 果。 大人ラットの大動脈からの血管平滑筋細胞は、DMEM＋10％ FCS中約35時間の細胞サイクル時間をもって増殖する（例えば、 Grainger et al., Biochem.J., 277 ：145-151, 1991 参照）。タモキシフェンの添加は、33マイクロモルを上廻る濃度において最大阻害をもつ増殖速度を減少させた。50マイクロモルのタモキシフェン濃度は、66％± 5.2％（ｎ＝３）程減少された（血清添加96時間後の）細胞数における増加を作り出した。より低い速度の増殖が、血管平滑筋細胞の割合についての増殖の完全な遮断から、又は全ての細胞の細胞サイクル時間における増加から生ずると推定された。これらの可能性の間を区別するために、Ｍ期を通過する細胞の割合及び細胞分裂に入る時間経過を測定した。

静止血管平滑筋細胞を、33マイクロモルのタモキシフェンの非存在又は存在中DMEM＋10％ FCSにより刺激し、この細胞数を、低速度撮影の顕微鏡写真により８時間間隔で測定した。エタノール媒質単独の存在中、95％を上廻る血管平滑筋細胞が、40時間までに分裂し一方、48時間後までにはタモキシフェンの存在中細胞数における有意な増加は全く存在しなかった。しかしながら、64時間までに、90％を上廻る細胞がタモキシフェンの存在中で分裂した。血清による刺激後に50％の細胞が分裂するのにかかった時間は、33マイクロモルのタモキシフェンにより35±３時間（ｎ＝７）から54±２時間（ｎ＝３）まで増加した。タモキシフェンは、細胞サイクルを完結し、そして分裂する細胞の割合を有意に減少させなかったため、タモキシフェンにより引き起こされる血管平滑筋の阻害は、増殖細胞のほとんど全て（＞90％）の細胞サイクル時間における増加の結果をもつ傾向がある。

タモキシフェンが、Ｇ₀ 〜Ｓ期の経過時間を増加させることにより血管平滑筋細胞の細胞サイクルの経過時間を増加させるかどうかを決定するために、 DNA合成への侵入に対するタモキシフェンの効果を分析した。50マイクロモルまでの濃度におけるタモキシフェンは、静止血管平滑筋細胞の血清刺激後の DNA合成に侵入する細胞の割合又は時間経過に有意に影響を及ぼさなかった（刺激後12時間〜24時間の間の DNA合成が、〔 ³Ｈ〕−チミジン取込み： 17614±1714cpm における対照； 16898±3417cpm における10マイクロモルのタモキシフェン；及び 18002±4167cpm における50マイクロモルのタモキシフェン、により測定された。）Ｓ期の経過時間は約12時間（未公開データ）であるので、タモキシフェンは、 DNA合成へ入る時間経過に有意に衝撃を与える傾向をもたない。それ故、これらの結果は、タモキシフェンが、細胞サイクルのＧ₂ 〜Ｍ期の移動にかかる時間を増加させることにより血清刺激された血管平滑筋細胞の増殖速度を減少させるということを含意する。

これらの結果に基づき、タモキシフェンが、血清の存在中継代培養された血管平滑筋細胞の増殖に関して TGF−ベータについて先に記載されたもの（例えば、Assoian et al., J.Cell.Biol., 109 ；441-448, 1986 参照）と同様の効果を示すようである。タモキシフェンは、例えば、 Kanabbe, et al., Cell, 48：417-425, 1987 中に記載されているような胸癌腫細胞系の培養において TGF−ベータ活性を誘導することが知られている。従って、タモキシフェンが TGF−ベータ活性を誘導することにより血管平滑筋細胞の増殖速度を減少させるかどうかを決定するための実験を行った。静止血管平滑筋細胞が、50マイクロモルのタモキシフェン及び10マイクログラム／mlの、 TGF−ベータに対する中和抗血清の存在中、10％ FCSにより刺激されたとき、これらの細胞は、エタノール媒質単独の存在中、対照細胞と同一速度において増殖した。

血管平滑筋細胞がタモキシフェンに応答して TGF−ベータを生産することを確認するために、このような細胞を、10％ FCSの存在中、96時間、タモキシフェンにより処理した。次にならし培地を採取し、そして TGF−ベータ活性を、先に記載したような修飾ミンク肺上皮 (MvLu) 細胞検定により測定した。タモキシフェンは、＞50倍程上記培地中で TGF−ベータ活性を増加させた。このMvLu細胞への新鮮DMEM＋10％ FCS中の（50マイクロモルの）タモキシフェンの添加は DNA合成に対して全く効果をもたず、これは、タモキシフェンが、MvLu細胞によって活性化 TGF−ベータの生産を誘導しなかったということを立証している。

TGF−ベータは、プロテアーゼ、例えばプラスミンにより細胞外で活性化されることができる潜在プロペプチドとして生産される。タモキシフェンが、潜在 TGF−ベータの活性化を促進することにより、又は、その後に活性化された潜在プロペプチドの生産を刺激することにより TGF−ベータ活性を増加させるかどうかを決定するために、ならし培地中に存在する全潜在プラス活性 TGF−ベータを先に記載したようにサンドイッチ ELISAにより測定した。タモキシフェン（50マイクロモル）の存在中96時間後、存在する全 TGFタンパク質は、約４倍に増加した。さらに、活性形態において存在する TGF−ベータの割合は、エタノール媒質単独の存在中血管平滑筋細胞についてならし培地中＜５％から、タモキシフェンにより処理された細胞についてならし培地中約35％まで、増加された。従って、タモキシフェンは、潜在 TGF−ベータの生産を刺激することにより、そして活性化された全 TGF−ベータの割合を増加させることにより、ラット血管平滑筋細胞の培養において TGF−ベータ活性を増加させる傾向がある。

ヘパリンは、血管平滑筋細胞に対してならされた培地中で TGF−ベータ活性を増加させる（未公開データ）。これに関するヘパリンの作用機構は、血清中に存在する不活性複合体からの TGF−ベータの解放を含むようである。なぜならアガロース・ビーズ上に固定化されたヘパリンによる血清の前処理がそれらの細胞への遊離ヘパリンの直接添加と同様に有効であるからである。 ELISA検定において免疫反応性でない血清中での封鎖された錯体から TGF−ベータを解放するようにタモキシフェンが働くかどうかを決定するために、10％ FCS＋DMEMを、細胞の非存在中37℃において96時間50マイクロモルのタモキシフェンにより処理した。この方法により処理された培地は、同様のレベルの TGF−ベータ・タンパク質及び未処理培地に対する活性を含んでいた。それ故、ヘパリンと異り、タモキシフェンが血清中に存在する不活性複合体から TGF−ベータを解放することにより働かないようである。

TGF−ベータ１ mRNA の含量は、タモキシフェンの添加後さまざまな時間点においてノーザン分析により分析されることもできる。エタノール媒質単独の非存在又は存在中継代培養さたラット血管平滑筋細胞（対数増殖における第６継代）は、ひじょうに少量の TGF−ベータ１のためのmRNAを含む。タモキシフェン（10マイクロモル）の添加24時間後までに、 TGF−ベータ１のmRNAは約10−倍増加した。

TGF−ベータは血管平滑筋細胞の増殖速度を減少させるけれども、それは、線維芽細胞の増殖速度に影響を及ぼさない。50マイクロモルまでの濃度におけるタモキシフェンは、継代培養された外膜線維芽細胞の増殖速度を減少させなかった。それ故、タモキシフェンは、外膜線維芽細胞についてよりも血管平滑筋細胞について少なくとも10倍低いED₅₀をもつ血管平滑筋増殖の選択的阻害剤である。

実施例２
VSMC増殖と分化に対するヘパリン効果
ヘパリン。 未分化、高分子量、抗血液凝固ブタ粘膜ヘパリン、抗血液凝固活性を欠くヘパリン断片、及び抗血液凝固活性をもつヘパリン断片についてテストした。さらに、アガロース・ビーズ (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) に結合したヘパリンについて検査した (再び Grainger et al., Cardiovascular Res. 27：2238-47, 1993 を参照のこと）。

増殖に対する効果。 実施例１におけるように調製した新鮮分散ラットVSMCを、ヘパリンの存在又は非存在中（実施例１におけるものと同じ）血清を含む培地中で培養した。使用したヘパリンに依存して、（対照細胞が定常期に入ったとき)144時間目における細胞数における増加は、27±4.2 ％〜76±3.2 ％の間の程度減少した（テストした全ヘパリンについて対照ウェル内の細胞数と比較してｐ＜0.0005) 。 100μｇ／mlにおけるヘパリンの効果は同様であったけれども、分子サイズの増加に伴って効果がより大きくなる傾向があった。20kD以上の４つのヘパリンは、60−76％程増殖を阻害し、そして12.6−３kDの４つのヘパリンは27−45％程増殖を阻害した。

細胞サイクル期への侵入。 ヘパリンは、０−72時間10μＭブロモデオキシウリジンの存在中細胞の増殖により測定されるように、Ｓ期への細胞侵入に対する効果を全くもっていなかった。細胞を〔Ｈ³ 〕−チミジンによりパルス−ラベルしたとき同様の効果を得た。

ヘパリンの存在又は非存在中有糸分裂を完結した細胞の割合を測定した。細胞の所定の視野を、格子培養皿の低速度撮影の顕微鏡により８時間の間隔で写真撮影した。格子を、細胞がカウントされる領域内に又は外へ移動することができないように、内部表面上プラスチック内に刻み目を入れた。ヘパリンの非存在中、92±１％の一次細胞は60時間までに分裂したが、72時間目までにヘパリンの存在中検出可能な細胞分裂は全く存在しなかった。しかしながら、88時間目までに、96±２％の細胞がヘパリンの存在中分裂した。ヘパリンの存在又は非存在中、有糸分裂を完結するまでの時間は、３時間未満であった。ヘパリンの存在及び非存在中全細胞サイクル時間を測定した。このデータは、ヘパリンの主な効果が細胞サイクルのＧ₂ 〜Ｍ期の経過時間を選択的に延長することであるということを示した。

Ｓ期侵入を阻害するのに必要なヘパリンの濃度は、血清濃度が減少されるときに減少した。この観察は、Ｓ期への進行に必要な血清成分からのヘパリンの除去と矛盾しない。

ヘパリン及び TGF−ベータ。 TGF−ベータがヘパリンの効果を仲介するかどうかを決定するために、抗− TGF−ベータ抗体（10μｇ／ml；R&D Systems)を添加した。抗− TGF−ベータ抗体単独は、10％ FCSにより刺激されたVSMC増殖に対する効果を全くもっていなかった。この抗体は、細胞がヘパリンの存在中でインキュベートされたときに観察されたVSMC増殖の阻害を完全に逆転させた。 100μｇ／mlの細胞外濃度においてアガロース・ビーズに結合したヘパリンは、VSMC増殖の阻害において遊離のヘパリン(100μｇ／ml）と同様に有効であった。同一濃度におけるアガロース・ビーズ単独は全く効果をもっていなかった。これらの効果は、増殖を阻害するためのVSMCに対するヘパリンの細胞外作用と矛盾しない。さらに、細胞サイクルの研究は、ヘパリンがVSMC増殖を阻害するためにＧ₁ の最初の12時間以内に存在しなければならないということを示した。

ヘパリン及び平滑筋特異的ミオシン重鎖発現。 先の研究は、培養における一次VSMCが、そのVSMCが血清又はフィブロネクチン上無血清培地中で培養されるかに拘らず、SM-MHCの204kD (SM-1)と200kD (SM-2)の両方を失うことを立証した。血清により刺激された一次培養においては、 100μｇ／mlのヘパリンは、直接免疫ペルオキシダーゼ染色又はウェスタン・ブロッティングにより検定されるように（Cell Tissues Res. 257 ：1137-39, 1989 ；Biochem.J. 277：145-51, 1991) 、すべての細胞においてSM-1とSM-2タンパク質の両方の損失を実質的に阻害した。これらの細胞がフィブロネクチン上の無血清培地中にプレートされた場合、SM-1とSM-2タンパク質の正常な損失はヘパリンの存在により影響されなかった。血清中での一次VSMCの脱分化防止におけるヘパリンの効果は、抗− TGF−ベータ抗体（10μｇ／ml）の添加により完全に逆転され、これは、このヘパリンの効果も TGF−ベータ様活性により仲介されるということを示している。ヘパリンは、血清の存在中一次VSMCからの平滑筋特異的ミオシン重鎖の損失を妨げるけれども、それは、その再発現を促進しなかった。その上、ヘパリンは、ひじょうに低いレベルのこのタンパク質を示す継代培養された細胞内でのSM-MHCの再発現を促進しなかった。従って、一次VSMC内でのSM-MHCの発現に対するヘパリンと TGF−ベータの効果は近似している。

実施例３
酵素−分散と体外移植−誘導ヒトVSMCの比較
材 料。 コラゲナーゼ (C-0130) 、エラスターゼ (E-0258) 、抗−ウサギ IgGペルオキシダーゼ−結合抗体、発色性基質オルトフェニレンジアミン、及び硫酸ストレプトマイシンを Sigmaから得た。タモキシフェン (遊離塩基）を Aldrichから購入した。Dulbecco's修飾 Eagle's培地(D-MEM) 及び培地M199を Flow Laboratoriesから購入した。６−〔 ³Ｈ〕−チミジン及び細胞増殖キットをAmersham Internationalから得た。抗− TGF−ベータ抗体(BDA19及びBDA47)を R&D Systemsから購入した。EGF, PDGF-AA及び PDGF-BBをBachemから得て、そして１％脂肪酸不含ウシ血清アルブミン(BSA) を含む濾過滅菌25mM・Tris-HCl、pH 7.5中に溶解した。塩基性線維芽細胞成長因子及びインスリン−様成長因子１(N-mer) をBachemから得て、そして滅菌 Milli Q水中に溶解した。アンチオテンシンII (Antiotensin II) とエンドセリン１ (endothelin 1) を Sigmaから得て、そして滅菌 Milli Q水中に溶解した。 TGF−ベータ(0.5μｇ、凍結乾燥固体) を Peninsulaから購入し、５mM HCl中に溶解して５μｇ／mlストックを作り、そして PBS＋ 0.2％により希釈した。

ヒト大動脈VSMC培養。 成人ヒトVSMCを、酵素分散又は体外移植技術を使用して６人の移植ドナー（３〜54歳のレンジ内の年齢のいずれかの性）から得た。ある場合においては、同一ドナー（24歳男性）を、酵素−分散（ED) と体外移植−誘導 (EX) 細胞培養の両方を確立するために使用した。酵素分散又は体外移植処理に先立って、ヒト大動脈を死亡して18時間以内に得た。内皮細胞層をメスの刃により除去し、平滑筋細胞のストリップ（中膜）をピンセットで取り出し、そして小片（１mm²)に切断した。

ED培養。 大動脈片を、無血清Hanks Balanced Salt Solutionにより一回洗浄し、次に実施例１中に記載したように、コラゲナーゼ及びエラスターゼにより酵素分散させた。これらの細胞を 1.5×10⁵ 細胞／cm² の開始密度においてプレートし、そして空気中５％ CO₂中37℃において加湿雰囲気中でインキュベートした。これらの細胞を、トリプシン／EDTAによりそれらを解放し、そして D-MEM＋10％ FCS中１：1.5 にそれらを希釈することにより、（定常期において）それぞれ６−７日間継代培養した。継代培養されたED細胞を、プレーティング24時間後、そしてその後48時間の間隔で、 D-MEM＋20％ FCSと共に培養した。

EX培養。 大動脈片を D-MEM＋10％ FCSにより１回洗浄し、小容量の新鮮 D-MEM＋10％ FCS中に再懸濁し、そして培養フラスコ又はペトリに移した。これらの片を、プラスチック上に沈着せしめ、そして均一に分散させた（〜４片／cm²)。これらの細胞は、培養において３−７日後にその体外移植片から外成長し始めた。大動脈片は、培養において３週間で取り出され、そしてプラスチックに付着した細胞を、さらに１週間集密まで成長させた。次にこれらの細胞を、トリプシン／EDTAによりそれらを解放し、そして D-MEM＋10％ FCS中でそれらを希釈することにより４−５日毎に継代培養した。継代培養された細胞を、ED培養について記載したように新鮮 D-MEM＋20％ FCSと共にインキュベートした。

EDとEX継代培養物は、継代５−20の間で使用された。
細胞計数、 DNA合成検定及び全及び活性 TGF−ベータについての検定を、実施例１中に記載したように行った。

結 果。
単一個体の大動脈から調製されたEDとEXカルチャーは、明確な形態学及び増殖特性を示した。EXカルチャーは、EDカルチャーよりもかなり速く増殖した。EDとEXカルチャーを継代培養して６週間後であって集密が達成されるとき、細胞の全収量は、EDカルチャーよりもEXカルチャーにおいて、大動脈の湿重量１ｇ当り、４倍高かった。EDカルチャーは、EXカルチャー（35±２時間）よりも D-MEM＋20％ FCS中より長い集団倍化時間（71±５時間）をもっていた。

EXカルチャー中のVSMCは、紡錘状 (spindle-shaped) であり、そして集密において特徴的な“丘と谷”の模様もって集密まで増殖された。EXカルチャーVSMCは、高い飽和密度(2.0−4.0 ×10⁴ 細胞／cm²)において定常期に達した。これに反し、EDカルチャー中のVSMCは、多数の長い細胞質突起をもつ星形の形態をもっていた。それらは、その基質の単層被覆に達せずに、低い飽和密度(0.7−2.0 ×10⁴ 細胞／cm²)において定常期に達した。EDカルチャー中のVSMCは、高レベルのSM-MHCとα−アクチンの両方を含んでおり、一方、EXカルチャー中のVSMCは、より低いレベルの、これらのタンパク質マーカーの両方を含んでいた。

ラット大動脈からのED培養に比較したヒトEDカルチャーのより長い集団倍化時間は、活性 TGF−ベータの自己分泌的生産に因る。これらのヒトEDカルチャーは、15.2±1.6 ng／mlの全 TGF−ベータ・タンパク質を生産し、その64±12％が活性形態にあった。これに反し、ヒトEXカルチャーは、検出可能量の TGF−ベータを生産しなかった。対数増殖の間、EXカルチャー上で48時間ならされた培地は、＜１ng／mlの全 TGF−ベータを含んでいた。 TGF−ベータ生産を、同一ドナーから得られたEDとEXカルチャーを使用して比較したとき、EDカルチャーは、 8.5ng／mlの全 TGF−ベータを生産し、その中の57％が活性形態であった。対応のEXカルチャーは、＜１ng／mlの全 TGF−ベータ・タンパク質を生産した。

外因性 TGF−ベータ（10ng／ml）を継代培養24時間後にEXカルチャーに添加し、そして細胞数を24時間間隔で測定した。外因性 TGF−ベータの存在中96時間後、細胞数における増加は、34±２％程阻害された。EXカルチャーの集団倍化時間は、外因性 TGF−ベータの存在中32±１時間から42±３時間に増加した。

外因性 TGF−ベータの添加は、EXカルチャーの集団倍化時間を12時間未満程延長したので、 TGF−ベータ活性単独が、EDとEXカルチャーの間の集団倍化時間における差異の原因であることはできない。それ故、６日間の期間内で DNA合成に入る細胞の画分を、細胞増殖キットによるブロモデオキシウリジンの取込みを使用して比較した。６日間のパルス後にブロモデオキシウリジンの取込みを示すEXカルチャー核の割合は、86±４％であったが、EDカルチャー細胞については48±４％であった。それ故、EDカルチャーの集団倍化時間は、EXカルチャーのものを上廻ってさらに増加された。なぜなら、EX細胞よりも少ないED細胞が D-MEM＋20％ FCSの存在中で分裂しているからである。

タモキシフェン(TMX) は、２−５μＭ TMXにおける最大の半分の増殖阻害をもつ TGF−ベータの生産を誘導することによりラット ED VSMCの増殖を阻害した。ヒトEDカルチャーは既に自己分泌的 TGF−ベータを生産しているため、 TMXの添加は、さらに、VSMC増殖速度を減少させることが期待されないであろう。この予想を確めるために、さまざまな濃度のTMX(１nM〜 100μＭ）又はエタノール媒質単独(20ppm〜 0.2％) を96時間にわたりヒトVSMCに添加し、そして細胞数を細胞計数により測定した。＞33μＭの TMX濃度は、細胞死を引き起こしたが、10μＭを下廻る濃度は、増殖速度に影響を及ぼさなかった。

ヒトVSMCのEXカルチャーは、自己分泌的な TGF−ベータを生産せず、そのため TMXはVSMC増殖を阻害すると予測されるであろう。33μＭの濃度の TMXは、ヒトEDカルチャーにより観察されるように、ヒトEXカルチャーにおいて細胞死を引き起こした。EXカルチャーについての最大の半分の阻害投与量は、30−100nM TMX であった。５μＭ TMXにおいては、ヒトEXカルチャー中の細胞数における減少は、33±８％阻害された。

これらの観察を確認するために、静止EXカルチャーを再刺激し、そして抗− TGF−ベータ抗体（25μｇ／ml）の存在及び非存在中TMX (0.5μＭ）を含む D-MEM＋20％ FCS中で96時間培養した。 TMX単独の存在中での細胞数における増加は、エタノール媒質単独と共にインキュベートされた対照細胞と比較したとき、27±２％程阻害された。抗− TGF−ベータ抗体の存在は、 TMXによる増殖阻害を完全に逆転させた。 TGF−ベータについての ELISA検定は、５μＭ TMXの存在中でヒトEXカルチャー上でならされた培地が、 6.0±2.0 ng／mlの全 TGF−ベータ・タンパク質を含み、その中の55±５％が活性化されたことを確立した。

ヒトEDとEXカルチャーの増殖に対するヘパリンの効果を検査した。血清から TGF−ベータ−様活性を解放することによりラット EDVSMCの増殖を阻害することが知られているヘパリンIC 86-1771は、ヒトEXカルチャーの増殖を部分的に阻害したが、EDカルチャーは阻害しなかった。 100μｇ／ml及び添加後48時間目において、ヘパリンは、EXカルチャー中における細胞数の増加を51±10％程阻害し；添加後96時間目において、71±15％程阻害した。 100μｇ／mlヘパリンの添加後96時間目におけるEDカルチャーにおいては、細胞数における増加は、８±５％程阻害された。抗− TGF−ベータ抗体は、ヒトEX培養されたVSMCの増殖を阻害するヘパリンの能力を廃止しなかった。それ故、ヒト EX VSMCは、添加された抗体により中和されることができたであろうよりも、又はヘパリンにより影響を受けた TGF−ベータ DNA合成並びにテストされたヘパリン濃度における TGF−ベータ活性化よりも、20％ FCSからより多くの TGF−ベータを放出することができる。

EDとEX細胞の、 DNA合成への侵入に対する分裂促進剤の効果を検査した。静止EDと EX VSMCを、 D-MEM中の20％ FCS又は 100ng／ml PDGF-BBのいずれかにより再刺激し、そして DNA合成への侵入を、〔 ³Ｈ〕チミジンを使用して連続した８時間のパルスの間モニターした。EX細胞は、ED細胞よりも速く両方の分裂促進刺激に応答して DNA合成に侵入した。EX細胞は、刺激後16−24時間目に FCSに応答して DNA合成のピーク速度に到達した。ED細胞は、分裂促進刺激の24−32時間後に DNA合成のピーク速度に到達した。

次に、静止EX細胞をさまざまな分裂促進剤に晒し、そして DNA合成の刺激を刺激後16−32時間目の〔 ³Ｈ〕チミジンの取込みにより測定した。 DNA合成は、無血清 D-MEM中に一貫して残存する対照細胞と比較して、 8.0±1.5 倍程20％ FCSにより刺激された。 PDGF-BBと PDGF-AAは、 DNA合成の〜3.0 倍の刺激を引き起こした。インスリン様成長因子(IGF-1；25ng／ml) は、 1.2倍の刺激を提供した。しかしながら、上皮成長因子(EGF； 100ng／ml) 、塩基性線維芽細胞成長因子 (bEGF； 100ng／ml) 、 TGF−ベータ (10ng／ml) 、アンギオテンシンII (angiotensin II)(ＡII；100nM)及びエンドセリン−１（endothelin-1)(ET-1；100nM)は、 DNA合成を有意に刺激しなかった。

静止ED細胞をさまざまな分裂促進剤に晒し、そして DNA合成の刺激を、刺激後16−40時間目に〔 ³Ｈ〕チミジンの取込みにより測定した。 DNA合成は、一貫して無血清培地中に残存した対照細胞と比較して、25±６倍程、20％ FCSにより刺激された。 PDGF-BBは、〜3.0 倍刺激したが、 PDGF-AAはほんの 2.0倍だけ刺激した。後者の応答は、 EX VSMCの刺激と比較して、変化することもできた（３カルチャーの中の１が PDGF-AAに応答しなかった。）。 IGE-1と EGFは、 DNA合成を 1.3倍刺激し、そしてbFGF、 TGF−ベータ、ＡII及びET-1は、 DNA合成を刺激しなかった。

実施例４
TGF−ベータとトランスジェニックapo(a)マウス
Apo(a)マウス。 ヒトapo(a)は、トランスジェニック・マウス（Nature 360 ：670-72, 1992) 、すなわちapo(a)を正常には欠いている種、において発現された。これらのマウスは、強化されたVSMC増殖をもたらす TGF−ベータ活性化の阻害が、アテローム生成性における重要な段階を提示するかどうかを試験するために使用された。

Apo(a)トランスジェニック・マウスは、脂質に富む食餌により飼養されるとき、初期ヒト・アテローム性硬化症の脂肪線条病変 (fatty streak lesions) に近似した血管病変を顕出した。免疫ペルオキシダーゼ標識付けは、apo(a)が、血管の管腔表面内で強く染まる病巣領域においてその血管壁内に蓄積したことを示した。この現象は、より感度の高い、免疫標識付け技術を使用して研究された。

簡単に言えば、サザン・ブロッティングによりそのapo(a)遺伝子の存在について確認された、トランスジェニックapo(a)マウス、及び正常な同腹子を、Ｃ57／Ｂ16×SJL ハイブリッドとのトランスジェニックマウスの連続交配により得た。心臓及び付着動脈を解剖し、液体窒素中で直ちに冷凍し、埋め込み、そして６μｍの凍結切片を調製した、これらの切片を、90秒間氷冷アセトン中で固定し、そして使用するまで−20℃において保存した。蛍光標識付け手順のすべてを４℃において行った。apo(a)免疫標識付けのために、切片を、30分間、トリス緩衝化生理食塩水(TBS) 中で３％ BSAと、次に３％ BSAを含む TBS中で１：1000に希釈されたヒト・プラスミノーゲンに対して吸着されたヒツジ抗−ヒト Lp(a)抗体と、インキュベートした。抗−ヒト Lp(a)抗体は、マウス・プラスミノーゲンとの検出可能な交差−反応性を全くもっていなかった。結合した一次抗体を、３％ BSAを含む TBS中で１：80に希釈したフルオレセイン−結合ウサギ抗−ヒツジ IgGを使用して検出し、そして 400×倍率において蛍光顕微鏡により可視化し (λexc ＝440nm ; λem＝510nm)；顕微鏡写真を、５秒間の露出(ASA1600) をもって撮影した。組織切片を、マウスが正常食餌 (Techlad, Madison, Wisconsin ; ４％マウス／ラット食物 (chow))又は1.25％コレステロール、ココア・バターとしての 7.5％飽和脂肪、 7.5％カゼイン及び 0.5％コール酸ナトリウムのいずれかにより飼養されるかどうかについて区別されることができなかった。

apo(a)についての免疫蛍光標識付けは、大動脈壁の管腔表面内に強く標識されたapo(a)の病巣を示したが、apo(a)はまた、その血管の中膜じゅう実質的により低い強度において標識された。apo(a)標識付けは、正常な同腹子マウスからの大動脈切片内で全く検出されなかった。トランスジェニック・マウス内のapo(a)の血清濃度は、 3.8±1.2 mg／dlであった。ヒト動脈の、及び標識apo(a)により注射されたマウスの分析は、血漿−誘動apo(a)が血管壁を透過することを示した。インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、存在する場合、apo(a)マウスの血管壁内で、僅かなapo(a)が局所的合成から誘導されたことを示唆した。

全及び活性化されたプラスミノーゲン。 大動脈壁内のプラスミノーゲンの活性化を、特異的阻害剤、α２−抗プラスミン（α２−AP) であって活性プラスミンと安定性の共有結合体を形成するが血管壁内のプラスミノーゲン、apo(a)又は他のタンパク質と共有結合しないものを使用して検定した。簡単に言えば、α２−AP(Sigma)を、フルオレセイン・イソチオシアネート(Sigma) 又はトリメチルローダミン・イソチオシアネートのいずれかにより標識付けし (Experimentia 16 : 430, 1960)、そしてSephadex G25上２つのゲル濾過により取込まれなかった標識から分離した。

活性化されたプラスミノーゲンの測定のために、切片を、α２−AP-FITC(１μｇ／ml）と16時間インキュベートし、そして洗浄した。全プラスミノーゲンの測定のために、上記切片を、上述のように、α２−AP-FITC と共にインキュベートし、 0.2％ Nonidet-P40 (NP-40)と300mM NaClを含むTBS(洗浄バッファー）中で十分に洗浄し、そして次に、プラスミノーゲンを活性化するために３時間 TBS中で１mg／ml組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化物質(rt-PA) と共にインキュベートした。これらの切片を洗浄し、α２−AP-TRITC（１μｇ／ml）により16時間インキュベートし、次に洗浄バッパー中、その後 TBS中で十分に洗浄した。結合し標識されたα２−APを、 400×倍率において蛍光顕微鏡により可視化した (λexc ＝440nm ; FITC標識についてλem＝510nm ; λexc ＝490nm ； TRITC標識についてλem＝580nm)。アセトン−固定切片からの低レベルの背景自己蛍光を、各切片について、その標識の蛍光から差し引いた。同一マウス大動脈からの切片間又は正常な同腹子の大動脈切片とトランスジェニックapo(a)マウスからのものとの間のいずれにおいても自己蛍光強光における有意な差異は全く存在しなかった。活性プラスミンを検出するための、結合α２−AP-FITC の顕微鏡写真を、10秒間露出し、そしてプラスミノーゲンを検出するための、結合α２−AP-TRITCの顕微鏡写真を、１秒間露出した (1600ASA)。

蛍光の定量。 Nikon Diaphor倒立蛍光顕微鏡に接続された延長線形レンジのTVカメラ (Photonic Science) をもつMagiscan画像分析装置(Joyce-Loebl) を、蛍光を定量するために使用した。血管壁の面積を上廻る平均画素値がフル・スケールの２−５％の間にあるように光増幅装置上のゲイン対照を設定した。各切片について、大動脈壁の４つの視野を位相差(400×倍率) 下でランダムに選び、そして別個の蛍光画像を、フルオレセイン及びトリメチルローダミンについてのフィルターを使用して捕獲した。 TGF−ベータとプラスミノーゲン／プラスミンについて、血管中膜の全面積を上廻る蛍光強度についての平均画素値を、計算し、そして各マウスからの４つの切片についての平均（すなわち、16の視野）をコンピュータ処理した。オステオポンチンついては、血管中膜を部分的にのみ標識付けし、そしてフル・スケールの＞５％の強度値をもつ画素だけが、平均画素値の計算において包含された。閾値を上廻る画素数（×10^-2) を、オステオポンチンについて標識付けされた面積として示す。

α２−AP-FITC を、血管の弾性層に優先的に会合する、正常とapo(a)マウスの両方の大動脈切片内で検出した。蛍光標識の定量化は、表１中に示すように、マウスが脂質に富む又は正常な食餌により飼養されるかどうかに拘らず、正常マウスにおけるよりもapo(a)マウスの血管壁内で、約３倍少ない活性プラスミンを示した。

対照実験は、α２−AP-FITC が上記切片内の活性プラスミンだけに結合することを立証した。大過剰（１mU) の外因性活性プラスミンの存在中でα２−AP-FITC とインキュベートされた大動脈切片内には蛍光は全く検出されなかった。大動脈切片を、プラスミン阻害剤、すなわちアプロチニン(100μｇ／ml) による処理の後にα２−AP-FITC ともインキュベートし、そして蛍光は全く検出されず、このことは、活性プラスミンの非存在中での上記切片と標識との相互作用が全く存在しなかったということを示している。

プラスミノーゲンについて検定するために、活性プラスミンを先に記載したように、α２−AP-FITC により最初に標識付けし、次に同一の切片を、プラスミノーゲンを活性化するために rt-PAにより処理した。これらの切片を、α２−AP-TRITCを使用して活性プラスミノーゲンについて再標識した。 rt-PAが省かれたとき、α２−AP-TRITCによる活性プラスミンについてのさらなる染色は、観察されなかった。プラスミノーゲンの活性化の前後の活性プラスミンの２つの蛍光標識の定量は、それらの切片内で既に活性化されたプラスミノーゲンの割合の測定値及びプラスミノーゲンの全量の測定値を提供した（表１参照）。apo(a)マウスと正常マウスからの切片において、プラスミノーゲンの全量における有意な差異は全く存在しなかった。正常なマウスにおいては、〜６％のプラスミノーゲンが、apo(a)トランスジェニック・マウスにおけるほんの２％と比較して、プラスミンに活性化された。従って、apo(a)は、プラスミノーゲン活性化を阻害する。

TGF−ベータ。 apo(a)マウスの大動脈壁内の低プラスミン濃度が TGF−ベータの減少された活性化をもたらすかどうかを決定するために、免疫蛍光標識を活性 TGF−ベータ及び全 TGF−ベータ（活性＋潜在）を定量するために使用した。簡単に言えば、先に記載したように調製した切片を、25μｇ／mlのBDA47 (R&D Systems) 、すなわち、 TGF−ベータに対するウサギ・ポリクローナル抗血清であって等しい感度をもってイソ形態１と３を検出するが潜在と活性 TGF−ベータの間を区別しないものにより２時間にわたり全 TGF−ベータについて標識付けした。これらの切片を TBS中で３回洗浄し、そして TRITCにより結合されたヤギ抗−ウサギIgG (Sigma；１：50希釈）と共にインキュベートした。両抗体を３％ BSAを含む TBS中で希釈した。次に同一切片を TBS中で３回洗浄し、そして先に記載したように、FITCにより結合されたR2X(イソ形態１と３の活性形態だけを認識する TGF−ベータ・タイプIIレセプタ細胞外ドメイン）により活性 TGF−ベータについて標識した。切片を16時間インキュベートし、次に PBS中で３回洗浄した。結合した標識を、先に記載したように蛍光顕微鏡により可視化した。顕微鏡写真の露出は、５秒間(1600ASA) であった。２つの標識の蛍光強度を換算するために、さまざまな割合の活性 TGF−ベータを含む溶液（６ng／mlの全 TGF−ベータ）を、ゼラチン−ポリリシン−コートされたスライド上にスポットし、そして室温において乾燥に供した。タンパク質スポットを大動脈切片について記載したように、全及び活性−ベータについて標識付けし、そして蛍光強度比(TRITC／FITC) を測定した。活性形態における TGF−ベータの比率の偽色画像を上記換算を使用し大動脈切片の蛍光比からコンピュータ処理した。

TGF−ベータは、正常とapo(a)マウスの両方内の弾性層に優先的に会合して、大動脈中膜の全体にわたり存在した。一次抗− TGF−ベータ抗体が省かれたときは、蛍光標識はそれらの切片に全く結合されなかった。蛍光標識の定量は、正常とapo(a)マウスの大動脈壁内に存在する TGF−ベータの全量において有意な差異を示さなかった（表１参照）。

活性 TGF−ベータを、FITC標識付けされたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(R2X) に融合されたタイプII TGF−ベータ・レセプタの切り詰められた細胞外ドメインを使用して検定された。この標識は、弾性層(elastic laminae) と会合して正常とapo(a)マウスの両方からの切片内に検出された。 100mg／mlの組換え活性 TGF−ベータ−１の存在中、それらの切片へのR2X-FITCの結合は完全に遮断された。さらに、FITCにより標識付けされたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、正常又はapo(a)マウスのいずれかからの大動脈切片に検出可能な状態で結合しなかった。

apo(a)マウスからの大動脈壁内に存在する TGF−ベータは、そのマウスが脂質に富んだ食餌又は正常食餌により飼養されたかどうかに拘らず、正常マウスからの大動脈壁内の TGF−ベータよりも有意により低く活性であった（表１参照）。従って、大動脈壁内の TGF−ベータ活性は、apo(a)の存在により有意に阻害される。その上、 TGF−ベータの活性は、最高のapo(a)蓄積の部位において最も強く阻害される。それ故、減少された TGF−ベータ活性の結果である血管壁内の変化は、病巣apo(a)蓄積の部位において優先的に生じるであろうが、脂質の蓄積には依存しないであろう。

またマウス血清を、全及び活性 TGF−ベータについての ELISA_s を使用して、apo(a)による TGF−ベータ活性化の阻害について検定した（実施例１）。apo(a)マウスの血清中の全 TGF−ベータは、14.4±4.7 ng／mlであり；正常マウスにおいては、それは14.2±3.5ng／mlであった。しかしながら、apo(a)マウスの血清中で活性であった全 TGF−ベータの割合は、これに対し正常マウスの血清中での92±12％の活性 TGF−ベータに比較して、34±19％であった。

オステオポンチン。 大動脈切片を、オステオポンチン、すなわち活性化された平滑筋細胞のマーカー、について検定した。オステオポンチンを、16時間、３％ BSAを含む TBS中、10μｇ／mlにおいてモノクローナル抗体MPIIIB10₁ (National Institute of HealthDevelopmental Studies Hybridom Bank)と共に切片をインキュベートすることにより検出した。これらの切片を TBS中で３回洗浄し、そして結合抗体を、フルオレセインに結合したヤギ抗−マウスIgG(SigmaF-2012；１：50希釈；２時間）を使用して検出した。顕微鏡写真を 2.5秒間の露出時間(ASA1600) により得た。

オステオポンチンの蛍光標識付けを、脂質に富んだ又は正常な食餌のいずれかに基づくapo(a)マウスからの大動脈切片内で検出した。オステオポンチンについての標識付けにおける小さな増加がトランスジェニックapo(a)マウスからの大動脈の中膜全体にわたり検出されたけれども、ひじょうに高いレベルのオステオポンチン標識付けは、病巣apo(a)蓄積とひじょうに低い TGF−ベータ活性化の領域により同時に局在化された。殺生前24時間にわたるブロモデオキシウリジンによるapo(a)マウスの処理は、大動脈中膜内に有意な分裂促進活性を示さなかった。従って、物理的損傷の非存在中、アテローム性斑における複製速度は低く、これは、それらの病変の遅い成長を反映している。活性 TGF−ベータの高い割合を示した正常マウスからの大動脈切片の領域は、オステオポンチンについての検出可能な標識付けを示さなかった。正常なマウス切片内のオステオポンチン標識付けの全強度と面積も、apo(a)マウス切片と比較してひじょうに低かった。それ故、apo(a)の存在は、そのマウスが脂質に富んだ又は正常な食餌により飼養されるかどうかに拘らず、血管病変の発展の間に生じる変化に近似して、大動脈壁内でのVSMC内でのオステオポンチンの発現を誘導する。循環脂質が上昇した条件下での脂質の、血管壁への蓄積は、オステオポンチンの発現によりマークされたVSMC活性化における変化の、原因よりもむしろ結果であることができる。先の研究は、培養における活性化VSMCが収縮性VSMCよりも約20倍多くの脂質を蓄積するということを示している。

これらの実験の結果は、apo(a)を、プラスミノーゲンと潜在 TGF−ベータ活性化の阻害に、関連付ける。 TGF−ベータ活性化の阻害は、apo(a)含有被験体（マウス又はヒト）が脂質に富む食餌に供されるとき、脂肪病変のその後の発展に寄与するようである。

実施例５
タモキシフェンは、アテローム性硬化病における転移と脂質の取込みを阻害する
細胞培養。 12−20週齢のWistar雄ラットからのラット大動脈 SMC_s を、実施例１中に記載したように、酵素分散により調製した。培養細胞は、SM-MHCについての染色により＞99％ SMCとして確認され、そして36時間の細胞サイクル時間をもって増殖した。これらの細胞を実施例１中に記載したように継代培養し、そして６−12継代の間又は一次培養のいずれかにおいて使用した。
15−60歳の、いずれかの性のドナーからのヒト大動脈 SMCを、実施例３中に記載したように１mm³ の膜組織を移植することにより調製した。

移 植。 移植を、ガラス・カラースリップ上で集密まで増殖させた SMCを使用して検定した。所定の損傷を、 D-MEM＋10％ FCS中24時間回収に供される、細胞の集密層上で行った。ブロモデオキシウリジン（10μＭ）を増殖する細胞を標識するために、18−24時間の間に添加する。24時間目において外傷端の境界を超えて移動した細胞を、細胞核のプロピジウム・ヨージド（PI) 染色により検出する（室温において30分間 PBS＋ 0.5％ NP-40中の 500μＭ PI)。 DMAを合成した細胞を、フルオレセイン結合した抗−ブロモデオキシウリジン抗体を使用してブロモデオキシウリジンについての抗体染色により検出した。それぞれの視野内の転移及び増殖細胞を、PIからのローダミン・エミッション及びブロモデオキシウリジンからのフルオレセイン・エミッションの画像分析により同時にカウントした。

脂質の取り込み。 24ウェル・プラスチック皿内の細胞を37℃において24時間又は１時間無血清 D-MEMと共にインキュベートし、次に30分間氷上４℃において PBS＋１％ BSA中で洗浄した。細胞を、冷競合剤 LDLの存在又は非存在中３時間各種濃度における ¹²⁵Ｉ−標識 LDLと共にインキュベートした。これらの細胞を、氷冷 PBSにより６回洗浄し、 0.1Ｍ NaOH 又は 0.1％ SDS中で溶解し、そして LDLの細胞会合カウントをガンマ計数により測定した。

Apo(a)トランスジェニック・マウス。 Apo(a)〔ヒト 500kDイソ形態〕を、Ｃ57／Ｂ16×SJL F1交配マウス内でそのトランスフェリン・プロモーターから発現させた。マウスを、脂質に富む又は正常な食餌上12週間の後24週齢において殺した。心臓／肺／大動脈凍結ブロックを調製し、そして６μｍの凍結切片をゼラチン−コート・スライド上で調製した。切片を、（定量的免疫蛍光；QIF のために）90秒間アセトン中で固定するか、又は（組織学のために）18時間ホルムアルデヒド・ベーパー中で固定するかのいずれかとした。切片を、分析されるまで−20℃において保存した。

組織学。 切片を、脂質蓄積のために、三色染色又はヘマトキシリン／エオシン又はオイル・レッドＯ／ライト・グリーンにより染色した。パラホルムアルデヒド中で固定されたスライドを、再水和し、新鮮オイル・レッドＯ中で18分間インキュベートし、濯ぎ、そして次に新鮮ライト・グリーンSF帯黄色中で１−２分間インキュベートした。次にこれらのスライドを脱水し、載せ、そして脂質沈着の量と位置を画像分析により分析した。

定量的免疫蛍光(QIF) 。 アセトン中で固定した切片を30分間 TBS＋３％ BSA中で再水和した。これらの切片を、 TBS＋３％ BSA中、一次抗体（Imunexからの、プラスミノーゲン上に免疫吸収された抗−apo(a)、１：1000希釈； R&D Systemsからの、抗−全 TGF−ベータ BDA47、１：200 希釈； NIHDSHBからの、MBPIIIB10₁抗−オステオポンチン抗体、１：200 希釈）と共にインキュベートした。これらの切片を PBS中で３×３分間洗浄し、次に蛍光標識第二抗体と共に２時間インキュベートした。３×３分間洗浄し、そして載せた後、結合した蛍光を、画像分析により定量した。２つのマーカーを、異なる励起及び放出特性をもつ別個の蛍光標識としてフルオレセインとローダミンを使用して同一切片上で検査することができた。

活性 TGF−ベータを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として大腸菌（E.coli）内で発現された、 TGF−ベータ・タイプIIレセプタ(R2X) の蛍光標識された細胞外マトリックス・ドメインをもつスライドのインキュベーション後に、局在化し、そして定量した。

結 果。 集密細胞が血清の存在中損傷を受けたとき、多数の細胞が24時間以内にその外傷領域内に移動する。増殖も、これらの条件下で刺激された（損傷を受けない対照集密カルチャーにおける３％と比較して、７％の細胞が DNA合成に侵入した）。外傷時におけるラット細胞への TGF−ベータ−１（10ng／ml）又はタモキシフェン(TMX；10μＭ）の添加は、移動を実質的に阻害し（約90％少ない細胞が外傷の境界を横切り）、これは、 TGF−ベータがBoyden Chamber検定において SMCの移動を阻害したということを立証した先のデータと矛盾しない。 TMXによる移動の阻害が、 TGF−ベータ−１（25μｇ／ml）に対する中和抗体により（＞90％）逆転された。

これに反し、 TGF−ベータと TMXは、外傷の間に刺激された DNA合成への侵入を有意に阻害しなかった。この観察は、 DNA合成の阻害又はそれへの遅い侵入によるよりもむしろ、そのＧ₂ 期内のその細胞サイクルの延長により、 TGF−ベータと TMXが SMC増殖を遅くするということを示した先のデータと矛盾しない。

これらのデータは、apo(a)が培養において TGF−ベータ活性化を阻害し、それにより SMC移動を促進するということを示した先の研究に同意する。実施例４中に記載したように、apo(a)はVSMC増殖を刺激した。Apo(a)は、ヒト及びapo(a)トランスジェニック・マウスにおいてアテローム生成と関係する。活性 TGF−ベータの減少レベルと共にapo(a)が蓄積するとき、移動と増殖の両方が増加するであろう。活性 TGF−ベータの形成を刺激する TMXは、移動又は増殖（又は両方）が病因論において重要な役割を演じるかどうかに拘らず、アテローム生成を回避するはずである。

大人ラット大動脈 SMCにおいて、 LDL蓄積は、新たに分散された細胞調製物中並びに一次及び二次カルチャー中の両方において、ひじょうに低い。この現象は、細胞がリポプロテインに晒されたかどうかに拘らず、ひじょうに低レベルの LDLレセプタ(200−400 レセプタ／細胞) に因る。

これに反して、頸動脈へのバルーン損傷の14日後にラットから得られた内膜 SMCは、増加した LDLレセプタ数 (1500−2000レセプタ／細胞) のために、より大きな（〜５倍)LDLの取り込みをもつ。（ひじょうに近似した特性を示す）内膜細胞又は新生細胞を10ng／mlの TGF−ベータにより48時間処理するとき、これらの細胞は、明らかに不可逆的に、その大人の表現型を変調した。この表現型の変調は、＞80％の LDL取り込みの減少による、 LDLレセプタのダウン−レギュレーション（〜800 レセプタ／細胞) を伴っていた。 TGF−ベータの存在は、それ故、 SMCによる脂質の蓄積を減少させることができる。

apo(a)トランスジェニック・マウスにより得られたデータは、この予測と矛盾しない。これらのマウスにおいては、apo(a)は、大動脈の内膜表面において高いレベルで蓄積する。 TGF−ベータ活性は、対照大動脈における＞80％からapo(a)大動脈における＜20％まで強くダウン−レギュレートされる。脂質蓄積は、脂質に富む食餌により飼養され、そして上昇された循環 LDLレベルをもつトランスジェニック・マウスにおいてこれらの部位で発生した。従って、減少された TGF−ベータ活性は、循環からの LDLの増加された SMC蓄積と相関する。インビボにおいて TGF−ベータを上昇させることができる TMXは、インビボにおいて脂質蓄積を阻害することができる。

これらのデータは、以下の結論を示唆する：
ａ．アテローム性硬化症は、少なくとも５つの過程（移動；脂質蓄積； ECM形成；炎症；増殖）から生じる。これらの過程及びそれらの相互作用の相対的寄与は、不明である。
ｂ． TMXと TGF−ベータは、移動及び SMCによる脂質蓄積を減少す又は阻害するはずである。
ｃ． TMXと TGF−ベータは、 ECM生産を刺激するはずである。
ｄ． TMXと TGF−ベータは SMC増殖を減少させるはずである。
ｅ．これらの注記した効果のすべては、アテローム性硬化症及び臨床的意義をもつその進行並びに心筋梗塞に対する TMXの予測された有益な効果に、ある程度貢献するはずである。

以上本明細書中、本発明を、その特定の好ましい態様に関して記載し、そして多くの細目を説明の目的をもって言及してきたけれども、本発明が追加の態様を許容し、そして本明細書中に記載された詳細の特定のものが本発明の基本的原理から外れずにかなり変化することができるということが、当業者に明らかであろう。

インビボにおける血管平滑筋細胞増殖の調節のための経路を示す。 インビボにおける血管平滑筋細胞増殖の調節のための経路を示す。

Claims (29)

1. 罹患し又は損傷した哺乳動物の血管の血管管腔容量の減少を防止又は低下させるための、TGF-ベータの潜在形態を直接又は間接的に活性化させ又はTGF-ベータの産生を直接又は間接的に増加させ、かつ、以下の活性：平滑筋細胞移動の阻害、血管平滑筋細胞増殖の阻害、脂質蓄積の阻害、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の刺激の内の１以上を示す成分を含む医薬組成物。
2. 哺乳動物の血管に損傷を与える血管形成手術後の狭窄又は再狭窄を防止又は阻害するための、TGF-ベータの潜在形態を直接又は間接的に活性化させ又はTGF-ベータの産生を直接的又は間接的に増加させ、かつ、以下の活性：平滑筋細胞移動の阻害、血管平滑筋細胞増殖の阻害、脂質蓄積の阻害、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の刺激の内の１以上を示す成分を含む医薬組成物であって、当該組成物は、血管管腔容量の減少を防止し又は低下させるために又は拡大した血管管腔直径を維持するために十分な時間にわたり、損傷した血管に直接又は間接的に投与される、前記医薬組成物。
3. 血管管腔の直径の減少を防止し又は低下させることにより、アテローム性動脈硬化症を防止又は減少させるための、TGF-ベータの潜在形態を直接又は間接的に活性化させ又はTGF-ベータの産生を直接又は間接的に増加させ、かつ、以下の活性：平滑筋細胞移動の阻害、血管平滑筋細胞増殖の阻害、脂質蓄積の阻害、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の刺激の内の１以上を示す成分を含む医薬組成物であって、TGF-ベータのレベルにおける増加がアテローム性動脈硬化症の病変形成及び／又は進行の部位又は潜在的部位においてアテローム性動脈硬化症の病変形成を抑制する、前記組成物。
4. 前記成分がTGF-ベータ・アクチベータである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 前記成分がTGF-ベータ生産刺激剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記血管が外傷性外科手術に因り損傷を受けたものである、請求項１又は２及び４〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記血管がバルーン血管形成術、脈管移植、又は移植臓器に因る損傷された血管である、請求項１又は２及び４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記罹患血管がアテローム性動脈硬化症又は高血圧に関連したものである、請求項１及び３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記成分がその病理学的増殖を阻害するために血管平滑筋細胞上に直接又は間接的に作用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記成分が血管平滑筋細胞の細胞分裂サイクル時間を増加させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記成分がTGF-ベータのプロペプチド形態を解裂させる、請求項１〜10のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記成分が血管管腔直径の減少を防止する、請求項２〜11のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. TGF-ベータが、血管平滑筋細胞増殖の部位又はその付近で高められる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 前記成分がTGF-ベータmRNAの生産を増大させる、請求項１〜13のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記成分が局所投与される、請求項１〜14のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 前記成分が前記血管による脂質の蓄積を減少させ又は防止し、アテローム性動脈硬化症の病変のプラーク安定性を高め、又は病変形成及び／又は進行を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
17. 血管管腔直径の減少を防止し又は低下させるために、TGF-ベータの潜在形態を直接又は間接的に活性化させ、又はTGF-ベータの産生を直接又は間接に増加させ、かつ、以下の活性：平滑筋細胞移動の阻害、血管平滑筋細胞増殖の阻害、脂質蓄積の阻害、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の刺激の内の１以上を示す成分の一連の投与量が投与される、請求項１〜16のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 疾患の確立又は外傷の受容の前又は後に、TGF-ベータの潜在形態を直接又は間接的に活性化させ、又はTGF-ベータの産生を直接又は間接に増加させ、かつ、以下の活性：平滑筋細胞移動の阻害、血管平滑筋細胞増殖の阻害、脂質蓄積の阻害、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の刺激の内の１以上を示す成分のさらに一連の投与量が投与される、請求項１〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. 前記成分がトランス−２−〔４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エチルアミンである、請求項１〜18のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 投与が１日１回又は２回行われる、請求項１〜19のいずれか１項に記載の医薬組成物。
21. 血管平滑筋細胞の増殖の阻害又は低下のための、トランス−２−〔４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エチルアミンを含む医薬組成物。
22. 前記組成物が前記細胞を実質的に殺さない、請求項21に記載の医薬組成物。
23. 前記組成物が経口投与形態であり、かつ、経口投与される、請求項１〜22のいずれか１項に記載の医薬組成物。
24. 前記量が血管平滑筋細胞の転移を阻害し又は減少させる、請求項１〜23のいずれか１項に記載の医薬組成物。
25. 活性TGF-ベータが前記投与後に増加する、請求項１〜24のいずれか１項に記載の医薬組成物。
26. 潜状TGF-ベータが前記投与後に増加する、請求項１〜24のいずれか１項に記載の医薬組成物。
27. 前記投与が前記損傷前又はその間にある、請求項１，２、又は４〜25のいずれか１項に記載の医薬組成物。
28. 前記損傷後の投与をさらに含む、請求項27に記載の医薬組成物。
29. 前記投与がカテーテルを用いて行われる、請求項１〜28のいずれか１項に記載の医薬組成物。

Images