JP2002514605A

JP2002514605A - 血管形成を検出および阻害する方法

Info

Publication number: JP2002514605A
Application number: JP2000547990A
Authority: JP
Inventors: ジュディスエイ．ヴァーナー、
Original assignee: ザレジェンツオブザユニヴァースティオブカリフォルニア
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2002-05-21
Also published as: JP2009051815A; CA2328414A1; EP1075277B2; CY1109062T1; PT1075277E; ATE423570T1; DK1075277T4; EP2327451B1; EP2327451A2; CA2328414C; WO1999058139A2; EP1075277B1; DK1075277T3; WO1999058139A3; JP4312822B2; EP2327451A3; DE69940465D1; ES2322723T5; EP2044955A3; ES2322723T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、組織における血管形成を低減させまたは阻害する方法であって、その組織中のα５β１インテグリンを、その組織中で発現されるリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する薬剤と接触させることによる方法、および組織における血管形成を確認する方法であって、その組織をα５β１インテグリンを特異的に結合する薬剤と接触させ、その組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前記薬剤の特異的結合を検出することによる方法を提供する。また、個体中の組織における血管形成を特徴とする病理学的状態の診断方法も提供される。さらに本発明は、個体中の組織における血管形成を低減させまたは阻害する方法であって、その組織中で発現されるリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する薬剤をその個体に投与することによる方法、および個体中の血管形成に関係する病理学的状態の重症度を軽減する方法であって、その病理学的状態に関係する組織におけるリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する薬剤をその個体に投与することによる方法も提供する。また本発明は、組織におけるα５β１インテグリン発現に関係する血管形成を低減させまたは阻害する薬剤を同定する方法であって、α５β１インテグリン発現に関係する血管形成を示す組織を薬剤と接触させ、その組織における血管形成の低減または阻害を検出することによる方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９８年５月８日に提出され、血管形成を検出および阻害する新
規な方法と題した、ＪｕｄｉｔｈＡ．Ｖａｒｎｅｒの米国仮特許出願番号第０
６／０８４，８５０号の優先権の特典を主張し、その全内容を参考として本明細
書に取込む。

【０００２】本発明は、国立癌研究所により与えられた付与番号Ｒ０１／ＣＡ７１６１９下
で一部政府の支援で実施された。政府は本発明にある権利を有する。

【０００３】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、一般に、望ましくない血管形成を含む状態を検出および処置する方
法、より特定するとリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する
ことにより血管形成を検出または阻害する方法に関する。

【０００４】（背景の情報）血管形成は、新血管が形成される過程である。血管形成は新血管形成とも呼ば
れ、通常、胚形成および発達中に起こり、完全に発達した生物では創傷治癒およ
び胎盤発達中に起こる。さらに、血管形成は、新血管形成による糖尿病性網膜症
および黄斑変性症などの眼疾病、関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの組織炎
症に関連した状態、および、成長している腫瘍の血管形成が酸素および栄養を腫
瘍細胞に与え、並びに、腫瘍細胞が全身に転移する経路を与えている癌を含む様
々な病理状態で起こる。世界中の多数の人々が、これらの疾病に苦しんでいるの
で、血管形成に関与する機序を解明するために、かかる解明によりかかる望まし
くない血管形成を検出および阻害する方法の開発が可能となることを願い、相当
の努力がなされている。

【０００５】血管形成は、１つ以上の既知の成長因子による刺激に応答して起こり、依然と
して同定されていないその他の因子も関与し得る。成熟血管を裏打ちする細胞で
ある内皮細胞は通常増殖しない。しかし、適切な刺激に応答して、内皮細胞は活
性化され、増殖して非血管形成化組織に移動し始め、新血管を形成する。前駆細
胞が活性化されて内皮細胞に分化し、新血管を形成し得る場合もある。

【０００６】血管は、細胞外基質により囲まれている。成長因子による刺激に加えて、血管
形成は、細胞外基質と内皮細胞の相互作用、並びに内皮細胞の互いの相互作用に
依存する。成長因子による内皮細胞の活性化および細胞外基質への移動および細
胞外基質との相互作用並びに内皮細胞の互いの相互作用は、内皮細胞により発現
される細胞表面受容体に依存する。成長因子受容体およびインテグリンを含むこ
れらの細胞表面受容体は、特定の分子と特異的に相互作用する。

【０００７】年齢に関連した黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの病理状態では、網膜の
酸素利用能の低下により低酸素状態となり、これは血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ
）などの血管形成成長因子の分泌を刺激し、これは眼の組織への内皮細胞の異常
移動および増殖を誘導する。眼組織でのかかる血管形成は、角膜瘢痕、網膜剥離
および脈絡膜での体液蓄積を誘導し得、その各々は、視覚に悪影響を与え、失明
につながり得る。

【０００８】血管形成は、乾癬、関節リウマチ、骨関節炎、並びに潰瘍性大腸炎およびクロ
ーン病などの炎症性腸疾患を含む、炎症性疾病の進行および悪化にも関連する。
例えば、炎症性関節炎疾病では、関節を囲む領域へのリンパ球の流入は、滑膜被
覆の血管形成を刺激する。脈管構造の増加は、より大量の白血球流入の手段を与
え、これにより関節での軟骨および骨の破壊は容易になる。炎症性腸疾患で起こ
る血管形成性血管形成は、腸に類似の効果をもたらす。

【０００９】冠状動脈における毛細血管のアテローム硬化型プラークへの増殖は、成長因子
誘導血管形成に関連した別の病理状態を示す。新血管形成プラークへの過剰な血
流により、血液充填プラークの破裂および出血が起こり得、血塊を遊離し、これ
は冠血栓症につながり得る。

【００１０】癌、眼の疾病および炎症疾病などの多様な疾病に血管形成が関与することによ
り、これらの疾病を処置する手段として血管形成を特異的に阻害する方法を同定
する努力がなされた。癌患者に、該処置法は、患者の標的腫瘍細胞だけでなく、
正常細胞、特に血液細胞、上皮細胞、および腸管内腔を裏打ちしている細胞など
の増殖正常細胞までも殺滅または障害する化学療法などの現在使用されている方
法に優る実質的な利点を与え得る。化学療法剤によるかかる非特異的殺滅により
、副作用が生じ、これはよくても不快であり、しばしば許容不可能な患者の罹患
率または死亡率をもたらし得る。事実、癌療法に関連した望ましくない副作用に
より、しばしば患者が受けることのできる処置は限定される。

【００１１】糖尿病性網膜症などの異常血管形成に関連した他の病理状態には、網膜移植以
外は効果的な処置がない。しかし、網膜移植を実施したとしても、新しい網膜は
、原発網膜症をもたらしたのと同じ条件に置かれる。従って、かかる病理を診断
および特異的に処置する方法を開発できるような、ある病理状態で起こる望まし
くない血管形成に関与する分子相互作用を同定する必要がある。本発明は、この
必要性を満たし、その上関連した利点も提供する。

【００１２】（発明の要約）本発明は、組織の血管に会合したα５β１インテグリンを、組織に発現された
リガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害する物質と接触させ、よ
って組織の血管形成を低減または阻害することによる、組織の血管形成を低減ま
たは阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、該物質は、α５β１拮
抗剤であり、これはα５β１インテグリン以外のインテグリンのそのリガンドへ
の特異的結合、例えば、αＶβ３インテグリンのビトロネクチンへの結合は実質
的に妨害しない。別の実施形態において、α５β１インテグリンリガンドはフィ
ブロネクチンである。

【００１３】本発明の方法は、例えば、網膜、網膜黄斑または角膜などの眼組織；皮膚；滑
膜組織；腸組織；または骨における血管形成の低減または阻害に有用である。さ
らに、本発明の方法は、良性または悪性であり得、悪性である場合、転移性新生
物であり得る、新生物の血管形成の低減または阻害に有用である。従って、本発
明は、α５β１拮抗剤を含み、個体の血管形成の低減または阻害に有用な医薬を
提供する。本発明の方法の実践に有用な物質は、ペプチド、例えば、アミノ酸配
列ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）を含むペプチド；抗体、例えば、抗α５β
１インテグリン抗体またはそのα５β１インテグリン結合断片；または非ペプチ
ド小有機分子、例えば、（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）ス
ルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニ
ルアミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２
−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸であり得る。α５β１拮抗
剤として有用な物質は、細胞毒素、例えば、癌化学療法薬に連結できる。

【００１４】本発明はまた、組織を、α５β１インテグリンと特異的に結合する物質と接触
させ、組織の血管に会合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出
することにより、組織の血管形成の存在を同定する方法を提供する。物質は、ペ
プチド、抗体、または非ペプチド小有機分子であり得、これは直接的に、または
その存在を特定の試薬との相互作用により検出できる、検出標識に連結できる。
かかる方法は、胚組織または胎盤組織などの正常組織、肉芽組織、または、新生
物、網膜症または関節炎状態などの病理状態または他の炎症状態に関与する組織
を含む、様々な組織の血管形成の存在の同定に有用である。

【００１５】本発明はさらに、個体の組織の血管形成を特徴とする病理状態を診断する方法
を提供する。診断法は、例えば、個体から組織のサンプルを得、ここで、病理状
態を有する個体の組織は血管形成を示す；サンプルを、α５β１インテグリンに
特異的に結合する物質と接触させ；組織の血管に会合したα５β１インテグリン
への物質の特異的結合を検出し、よって個体の血管形成を特徴とする病理状態を
診断することにより実施できる。病理状態は、眼、例えば、糖尿病性網膜症また
は黄斑変性症；皮膚、例えば、血管腫または乾癬；関節、例えば、関節リウマチ
または骨関節炎；または腸、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎を含み得るか
；または新生物であり得、これは良性または悪性であり得る。転移性であり得る
悪性新生物は、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌、または膵臓癌であり得る。

【００１６】個体の組織の血管形成を特徴とする病理状態を診断する方法はまた、病理状態
を有することが疑われる個体に、α５β１インテグリンに特異的に結合する物質
を投与し；組織の血管に会合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を
検出することにより実施できる。物質は、例えば、放射性核種、常時性材料また
はＸ線減弱材料などの部分に連結させることにより、検出可能に標識できる。検
出法は、放射性核種映像法、ポジトロン放出断層撮影法、コンピュータアクシャ
ル断層撮影法、または磁気共鳴映像法などのｉｎｖｉｖｏ撮影法であり得るか
、または、物質の投与後、組織のサンプルを個体から得、サンプル中の物質の特
異的結合を検出するｅｘｖｉｖｏ法であり得る。該サンプル中のα５β１イン
テグリンに特異的に結合する物質は、直接的に、例えば、該物質に連結した部分
に起因する放射活性の検出により、または間接的に、特異的に結合した物質を、
該物質または該部分と特異的に相互作用する試薬と接触させ、該物質または該部
分と試薬の相互作用を検出することにより検出できる。

【００１７】本発明はさらに、個体に、組織で発現されたリガンドへのα５β１インテグリ
ンの特異的結合を妨害する物質を投与し、よって個体の組織の血管形成を低減ま
たは阻害することにより、個体の組織の血管形成を低減または阻害する方法を提
供する。また、個体に、病理状態に関連した組織のリガンドへのα５β１インテ
グリンの特異的結合を妨害する物質を投与し、よって組織の血管形成を低減また
は阻害し、結果として、病理状態の重度を低減させることにより、個体の血管形
成に関連した病理状態の重度を低減させる方法も提供される。状態は、悪性新生
物、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌または膵臓癌などの癌、または肉腫、中皮腫
、奇形腫、星細胞腫、グリア芽腫であり得る新生物、または、転移性悪性新生物
を含む他の新生物を含む、血管形成に関連した任意の病理状態であり得る。該物
質は、様々な経路、例えば、静脈内、経口、または処置する領域に直接的に、例
えば、新生物腫瘍に直接的に；病理状態が眼を含む場合、点眼により；または状
態が関節を含む場合、滑液嚢内に投与できる。

【００１８】本発明はまた、組織のα５β１インテグリン発現に関連した血管形成を低減ま
たは阻害する物質を同定する方法を提供する。スクリーニングアッセイとして有
用な該方法は、α５β１インテグリン発現に関連した血管形成を示す組織を、物
質と接触させ、組織の血管形成の低減または阻害を検出することにより実施でき
る。組織と物質の接触は、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで実施できる。
該方法をｉｎｖｉｔｒｏ型式を使用して実施する場合、自動高処理スクリーニ
ング系に容易に適合できる。該組織は、α５β１インテグリン発現と関連した血
管形成を受ける任意の組織、例えば悪性新生物組織であり得、これは、例えば、
哺乳動物、鳥類、爬虫類または両生類を含む任意の個体由来であり得る。

【００１９】（発明の詳細な説明）本発明は、組織の血管のリガンドへのα５β１インテグリンの結合を同定する
ことによる、組織の血管形成を検出する方法を提供する。個体の血管形成の存在
を診断する方法も提供される。本発明はさらに、組織で発現されたリガンドへの
α５β１インテグリンの特異的結合を妨害することによる、組織の血管形成を低
減または阻害する方法を提供する。個体における病理状態に関連し得る血管形成
を低減または阻害させる方法も提供される。

【００２０】血管形成は、様々な成長因子と細胞接着事象の協力に依存する。αＶインテグ
リンが、血管形成に重要な役割を果たすことが示されたが、αＶインテグリンヌ
ルマウスを使用した研究により、他の接着受容体およびそのリガンドも血管形成
に関与し得ることが示唆された。本明細書に開示したように、インテグリンα５
β１およびそのリガンドのフィブロネクチンは、成長因子刺激血管形成中および
ヒト腫瘍生検に存在する血管上で協調的にアップレギュレートされ、これらの分
子の相互作用は、腫瘍増殖中に起こりｉｎｖｉｖｏで腫瘍増殖を支持する血管
形成に、並びに、様々な病理状態に関連した血管形成に必要である。

【００２１】胚形成または正常および病理血管形成中の血管網の発達は、成長因子により誘
導された刺激（ＢｒｅｉｅｒおよびＲｉｓａｕ、ＴｒｅｎｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ６：４５４−４５６（１９９６）；Ｂｒｅｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：６７８−６８３（１９９７）；Ｆｏｌｋｍａｎ
、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．１：２７−３１（１９９５）；Ｒｉｓａｕ、Ｎａｔｕｒｅ３８６：６７１−６７４（１９９７））および細胞外基質との細胞相互作
用（ＳｔｒｏｍｂｌａｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ３：８８１−８８５（１９９６）；Ｖａｒｎｅｒ；Ｅｘｓ．７
９：３６１−３９０（１９９７）；この開示に引用した各刊行物は参考として本
明細書に取込む）に依存する。遺伝的および機能的解析により、細胞外成分およ
び細胞表面受容体は、脈管形成および血管形成における内皮細胞増殖、生存およ
び分化を調節することが示される（Ｇｅｏｒｇｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１１９：１０７９−１０９１（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１９：１０９３−１１０５（１９９３）；ＳｔｒｏｍｂｌａｄおよびＣｈ
ｅｒｅｓｈ、上記、１９９６；Ｂｌｏｃｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９
：２６５−２７８（１９９７）；Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７；Ｒｉｓａｕ、
上記、１９９７；Ｂａｄｅｒら、Ｃｅｌｌ９５：５０７−５１９（１９９８）
）。

【００２２】血管は、胚形成中に、脈管形成および血管形成の２つの過程により生じ（Ｒｉ
ｓａｕ、上記、１９９７）、両方の過程における成長因子の役割は、十分に確立
されている。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ３８０：４３９−４４２（１９９６））およびその受容体（ｄｅＶｒ
ｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：９８９−９９１（１９９２）；Ｆｏｎｇら
、Ｎａｔｕｒｅ３７６：６６−７０（１９９５）；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、Ｃｅｌｌ７２：８３５−８４６（１９９３）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｃｅｌｌ８９
：９８１−９９０（１９９７））、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ
；ＢａｓｉｌｉｃｏおよびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ、Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５９：１１５−１６５（１９９２））は、初期の胚血管網の発達を促進し、
発達、創傷治癒および女性生殖周期中の既存の血管からの新血管の形成に関与す
る。ＶＥＧＦ（Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９
−１７９７（１９９５）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
７：１４０１５−４０２３（１９９７）；Ｋｏｎｇら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：８２３−８３３（１９９８））、ｂＦＧＦ（Ｓｔａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８２：１０４４−１０５２（１９９５）；Ｃｈｏｐｒａら、Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２３：１６７−１７２（１９
９７）；Ｃｚｕｂａｙｋｏら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．３：１１３７−１１４０
（１９９７）；Ｙｏｓｈｉｄａら、上記、１９９７）、インターロイキン−８（
ＩＬ−８；Ａｒｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２７９２
−２８０２（１９９６）；Ｌｕｃａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５１：１１０５
−１１１３（１９９７）；Ｋｅａｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１４３
７−４３（１９９７）；Ｙａｔｓｕｎａｍｉら、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．１２
０：１０１−１０８（１９９７）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９：１０９７−１１０６（１９９８））、およ
び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα；Ｙｏｓｈｉｄａら、上記、１９９７）は、例えば
、固体腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、および関節リウマチを含む、様々な病理状態
に関連した血管形成に役割を有する成長因子である。

【００２３】成長因子は新血管増殖を刺激するが、細胞外基質（ＥＣＭ）への接着は、新血
管増殖中の、内皮細胞生存、増殖および運動性を調節する（Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ
およびＣｈｅｒｅｓｈ、上記、１９９６；Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７）。特
異的インテグリンまたはそのリガンドも、血管発達および血管形成に影響を及ぼ
す。例えば、αＶインテグリンは、活性化内皮細胞に生存シグナルを与えること
により、血管形成に関与する（Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：３７７−
３８０（１９９７）；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：５６９−５７
１（１９９４ａ）；Ｃａｒｒｏｎら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：１９３０−
１９５５（１９９８）；Ｃｌａｒｋら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：
１４０７−１４２１（１９９７）；Ｄｒａｋｅら、Ｄｅｖｅｌ．Ｄｙｎ．１９３
：８３−９１（１９９２）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１
０８：２６５５−２６６１（１９９５）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：１５００−１５０２（１９９５））。しかし、血管形成のいく
つかの態様は、αＶインテグリンの非存在下でも進行し得（Ｂａｄｅｒら、上記
、１９９８）、これは、β１インテグリンファミリーを含む他の分子が、発達中
に不在のαＶインテグリンを補い得ることを示唆する（Ｄｒａｋｅら、上記、１
９９２；Ｂｌｏｃｈら、上記、１９９７；Ｓｅｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３６１２−１３６１７（１９９７）。

【００２４】血管形成の促進におけるインテグリンの活発な役割は同定されたが、ｉｎｖ
ｉｖｏで血管形成に関与するインテグリンの同族ＥＣＭリガンドはあまり十分に
記載されていない。１つのＥＣＭタンパク質であるフィブロネクチンが仮血管マ
トリックスに発現され、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症および高血圧中に、
増殖シグナルを血管細胞に与える（ＭａｇｎｕｓｓｏｎおよびＭｏｓｈｅｒ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１３６３
−１３７０（１９９８））。フィブロネクチン発現は、創傷治癒中の肉芽組織の
血管上でアップレギュレートされ（Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７９：２６９−２７６（１９８２））、フィブロネクチンのアイソフ
ォームであるＥＤ−Ｂスプライス変異体は、胎児および腫瘍組織の血管上には優
先的に発現されるが、正常静止成人血液細胞には発現されない（Ｃａｓｔｅｌｌ
ａｎｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５９：６１２−６１８（１９９４）；Ｋ
ａｃｚｍａｒｅｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：１１−１６（１９９４
）；Ｎｅｒｉら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：１２７１−１２７５（
１９９７））。これらの観察により、フィブロネクチンが、血管形成に役割を果
たし得ることが示唆される。さらに、フィブロネクチンを欠失した動物は、脊索
および体節の欠失並びに不適切に形成された脈管を含む多くの欠陥のために発達
の初期に死亡する（Ｇｅｏｒｇｅら、上記、１９９３）。しかし、本開示前には
、脈管形成または血管形成におけるフィブロネクチンの直接的な機能的役割は確
立されていなかった。

【００２５】数個のインテグリンがフィブロネクチンに結合し（Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ６
９：１１−２５（１９９２））、インテグリンα５β１が、一般に、フィブロネ
クチンに選択的である（Ｐｙｔｅｌａら、Ｃｅｌｌ４０：１９１−９８（１９
８５））。研究により、インテグリンα５サブユニットをコードしている遺伝子
の欠失は、マウスの胚に致死的であり、完全な後体節の不在およびいくつかの血
管および心臓の欠陥と関連のあることが実証された（Ｙａｎｇら、上記、１９９
３；Ｇｏｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：４３０９−４３１９（１９９
７））。しかし、インテグリンα５β１が血管発達または特に血管形成の調節に
直接的な役割を有するかどうかは不明であった。

【００２６】本明細書に開示したように、フィブロネクチンおよびその受容体のα５β１イ
ンテグリンの両方が、直接的に血管形成を調節する。さらに、フィブロネクチン
とα５β１の特異的相互作用は、血管形成に対するこれらの２つの分子の寄与の
中心である。インテグリンα５β１は、インテグリンαＶβ３の経路と同じであ
るが、αＶβ５に関与する経路とは異なる血管形成経路に関与する。α５β１と
フィブロネクチンの特異的結合を妨害する物質は、成長因子刺激血管形成および
腫瘍で起こる血管形成を低減または阻害でき、よって悪性新生物を含む様々な病
理状態の処置に有用であり得ることが本明細書にさらに開示される。

【００２７】フィブロネクチンの中心細胞結合ドメインおよびその受容体α５β１の血管形
成における関与を本明細書に開示する。インテグリンα５β１およびフィブロネ
クチンの発現は両方共、ヒト腫瘍の血管上および成長因子刺激組織で有意に増強
されたが、これらの分子は、正常ヒト血管および非刺激組織上では最小限に発現
された（実施例Ｉ）。さらに、フィブロネクチンの中心細胞結合ドメインに結合
する抗体拮抗剤および抗α５β１抗体、並びに２つの別のクラスのα５β１拮抗
剤（ペプチドおよび非ペプチド小有機分子拮抗剤）が、ヒヨコ絨毛尿膜（ＣＡＭ
；実施例ＩＩ）およびＳＣＩＤマウス上で増殖させたヒト皮膚（実施例ＩＩＩ）
の成長因子刺激血管形成を遮断した。インテグリンα５β１の拮抗剤は、ｂＦＧ
Ｆ、ＴＮＦαおよびＩＬ−８刺激血管形成を遮断したが、ＶＥＧＦ誘導血管形成
には最小限の効果しかなかった。これらの各α５β１拮抗剤は、腫瘍血管形成を
阻害し、動物モデル系で腫瘍は減退した（実施例ＩＶ）。フィブロネクチン機能
の拮抗剤も、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ血管形成の両方を遮断し、これは、他のフ
ィブロネクチン受容体がＶＥＧＦ媒介血管形成に関与していることを示唆する。

【００２８】本明細書に開示した結果は、血管形成におけるインテグリンα５β１およびフ
ィブロネクチンの発現は協調されていることを実証する。各分子の発現が、非刺
激静止血管上のように、最少である場合、各分子の拮抗剤およびフィブロネクチ
ンのニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）への添加は、血管形成にほとんど効果がなかっ
た。これに対し、成長因子で刺激後、α５β１およびフィブロネクチンの発現は
増強され、血管は、いずれかの分子の拮抗剤として作用する物質に、並びに外因
的に加えたフィブロネクチンの効果に感受性になる。ＶＥＧＦ刺激はα５β１発
現を増加させず、これは、ＶＥＧＦ血管形成はα５β１の拮抗剤に不応性である
という観察を支持する。この結果は、内皮細胞上でのインテグリンα５β１のｉ
ｎｖｉｔｒｏ発現は、ｂＦＧＦに応答してアップレギュレートされ（Ｃｏｌｌ
ｏおよびＰｅｐｐｅｒ、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１２：５６９−５７８（１９
９９））、ＶＥＧＦはα５β１発現をアップレギュレートできなかった（Ｓｅｎ
ｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１−７（１９９６）；Ｓｅｎｇ
ｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３６１２−
１３６１７（１９９７））という報告により実証される。従って、血管形成にお
けるインテグリンα５β１およびフィブロネクチンの機能的役割は、その成長因
子誘導発現の直接的な結果のようである。

【００２９】ＲＧＤインテグリン結合部位を含む、フィブロネクチンの中心細胞結合断片に
対して指向された抗体は、血管形成を阻害した（実施例ＩＩおよびＩＩＩ）。こ
れらの抗体は、フィブロネクチンへのα５β１インテグリンの特異的結合を妨害
し、結果として、潜在的な下流のシグナル伝達事象をｉｎｖｉｖｏで妨害する
ようである。α５β１依存的様式でのフィブロネクチンおよびその細胞結合ドメ
インによるｂＦＧＦ血管形成の刺激により、α５β１は血管形成中でのフィブロ
ネクチンのインテグリン受容体であることが示される。ＶＥＧＦ刺激血管形成に
おけるインテグリンα５β１発現の不在は、フィブロネクチンがＶＥＧＦ血管形
成を増強できないことを説明するようであるが、フィブロネクチンの細胞結合ペ
プチドに対して指向された抗体はＶＥＧＦ血管形成を遮断した。本明細書に開示
した結果は、血管形成におけるフィブロネクチンの直接的なｉｎｖｉｖｏの役
割の最初の実証である。

【００３０】本明細書に開示した結果は、血管形成の促進における細胞外基質タンパク質の
役割を明確に同定した最初のものである。コラーゲンは、血管発達に役割を果た
すことが示唆されたが、無傷コラーゲンは内皮細胞成長、生存または増殖を支持
しない（ＩＪａｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１１：３６２１−３６３１（１
９９８）；Ｉｓｉｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１７５：１４９−１５５（１
９９９））。事実、コラーゲン受容体インテグリンα２β１およびα１β１の阻
害は、大血管の形成を防ぎ、小血管の形成を促進した（Ｓｅｎｇｅｒら、上記、
１９９７）。それらの結果は、α２β１、α１β１、およびそのリガンドのコラ
ーゲンは、新血管の芽の促進よりも、血管成熟に関与することが示唆される。

【００３１】血管形成におけるインテグリンα５β１の機能的役割は、α５β１のそのリガ
ンドへの結合に拮抗する物質が、成長因子により誘導された血管形成および腫瘍
断片の血管形成を遮断することを実証することにより確立された（実施例ＩＩ、
ＩＩＩおよびＩＶ）。α５β１と同様、αＶβ３は、フィブロネクチン受容体と
して作用し得るが（Ｃｈａｒｏら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１１：２７９５
−８００（１９９０））、本明細書に開示されたように、内皮細胞は、両方のイ
ンテグリンが発現された場合、α５β１を主要なフィブロネクチン受容体として
使用する。

【００３２】 α５β１およびαＶβ３の発現は、類似の成長因子により調節され、両方のイ
ンテグリンが、ｂＦＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−８および腫瘍誘導血管形成に有意な
役割を有するが、ＶＥＧＦ誘導血管形成には有さない（実施例参照；また、Ｂｒ
ｏｏｋｓら、上記、１９９４ａ；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ７９：１１５７−
１１６４（１９９４ｂ）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、上記、１９９５参照）。
血管形成動物モデルでのその拮抗剤の組合せが相加的でも相乗的でもないので、
これらの２つのインテグリンは同じ血管形成経路に影響を及ぼすようである（実
施例ＩＩ参照）。

【００３３】インテグリンの細胞外基質タンパク質への結合は、細胞接着、移動、侵入、生
存および増殖を促進し（Ｖａｒｎｅｒ、上記、１９９７）、αＶβ３の拮抗剤は
、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで増殖内皮細胞のアポトーシスを誘導
する（Ｂｒｏｏｋｓら、上記、１９９４ｂ；Ｓｔｒｏｍｂｌａｄら、上記、１９
９６）。本明細書に開示したように、α５β１拮抗剤は、ｉｎｖｉｔｒｏおよ
びｉｎｖｉｖｏで成長因子刺激内皮細胞のアポトーシスも誘導する。

【００３４】 α５β１の拮抗剤は、腫瘍血管形成および増殖を遮断し（実施例ＩＶ）、これ
はインテグリンαＶβ３の拮抗剤と類似している（Ｂｒｏｏｋｓら、上記、１９
９４ｂ、１９９５）。ｉｎｖｉｖｏ腫瘍原性および血管形成研究（実施例ＩＶ
）に使用した腫瘍細胞系は、腫瘍細胞に対する拮抗剤の任意の直接的効果を無視
するためにインテグリンα５β１陰性であり；ＣＡＭ上でのその培養の経過を通
じてα５β１陰性を維持した。ＨＴ２９腫瘍は、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦα
、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦおよびＩＬ−８を含む様々な成長因子を発現するが；ＨＴ
２９細胞がｂＦＧＦも発現するかは不明である。ＶＥＧＦは最も一般的には腫瘍
の低酸素核に会合し、低酸素症により転写的に調節されるが、ｂＦＧＦおよび他
の因子は、腫瘍の増殖端と会合する（Ｓｈｗｅｉｋｉら、上記、１９９２；Ｋｕ
ｍａｒら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１０：３０１−３１１（１９９８））。成長因
子刺激ＣＡＭで観察されたように、α５β１拮抗剤は、移植腫瘍の根底にあるＣ
ＡＭ上の既存の大血管に影響を与えなかった。これらの結果は、α５β１の、そ
のリガンド、特にフィブロネクチンへの特異的結合を妨害する物質は、血管形成
を低減または阻害できることを実証する。それ故、該物質の使用は、癌患者を含
む様々な病理状態に罹患する個体に臨床的利点を与えることができる。

【００３５】本明細書で使用した「インテグリン」なる語は、多種多様な細胞で発現され、
細胞外基質の特異的リガンドに結合する、細胞外受容体を意味する。インテグリ
ンの結合する特異的リガンドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペ
プチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）またはロイシン−アスパラギン酸−
バリントリペプチドを含み得、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オ
ステオポンチン、テネイシン、およびフォンウィルブランド因子を含み得る。イ
ンテグリンは、αサブユニットとβサブユニットからなるヘテロダイマーのスー
パーファミリーを含む。例えば、αＶ、α５等と称される多くのαサブユニット
、並びに、例えばβ１、β２、β３、β５等と称される多くのβサブユニットが
同定されており、α５β１、αＶβ３およびαＢβ５を含む様々なこれらのサブ
ユニットの組合せが、インテグリンスーパーファミリーに提示される。インテグ
リンのスーパーファミリーは、例えば、αＶβ３およびαＶβ５を含むαＶ含有
インテグリンとして、またはα５β１およびαＶβ１を含むβ１含有インテグリ
ンとして、ファミリーに細分できる。インテグリンは、線虫、ショウジョウバエ
属、両生類、爬虫類、鳥類、並びにヒトを含む哺乳動物を含む、広範囲の生物で
発現される。

【００３６】本明細書で開示したように、α５β１の、抗体、ペプチドおよび非ペプチド小
有機分子拮抗剤は、血管組織における、α５β１インテグリンの、そのリガンド
、特にフィブロネクチンとの特異的結合を妨害でき、血管形成を低減または阻害
できる（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ参照）。α５β１とそのリガンドの特異
的結合を妨害する該分子は、本明細書で一般に、「物質」、「物質拮抗剤」また
は「α５β１拮抗剤」と呼ぶ。本明細書に使用した「特異的結合」または「特異
的に結合」は、２つ以上の分子の相互作用に関して使用する場合、分子は、ｉｎ
ｖｉｖｏ条件下およびｉｎｖｉｖｏ条件を擬似し得る適切な条件下でインキ
ュベートした場合のｉｎｖｉｔｒｏ下で互いに会合できることを意味する。「
特異的に相互作用」および「特異的会合」なる語も、特異的に結合する分子を意
味するために使用される。

【００３７】本発明の目的のために、互いに特異的に相互作用する分子は、一般に、例えば
、インテグリンとその特定のリガンドまたはリガンド群、または抗体とその特定
の抗原または抗原群を含む、受容体型分子とそのリガンドである。しかし、α５
β１拮抗剤とα５β１インテグリンが可能であるように、例えば、αインテグリ
ンサブユニットとβインテグリンサブユニットなどの他の分子も、特異的に相互
作用して、インテグリンヘテロダイマーを形成することが認識される。２つの分
子が特異的に相互作用するかどうかを決定する方法が本明細書に開示され、結合
親和性および特異性を決定する方法は当分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ、抗体：実験マニュアル（コールドスプリングハーバーラボラ
トリー出版、１９８８）；Ｆｒｉｅｆｅｌｄｅｒ、「物理生化学：生化学および
分子生物学への適用」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよび共同研究者１９７６）参
照）。

【００３８】 α５β１とフィブロネクチンの特異的結合を妨害する、抗体、ペプチドおよび
非ペプチド小有機分子拮抗剤を例示する（実施例ＩＩ参照）。本明細書で使用し
た「妨害」なる語は、受容体とそのリガンドの特異的相互作用に対する物質拮抗
剤の作用に関して使用する場合、相互作用の親和性が、物質の非存在下で起こる
結合レベル以下に減少したことを意味する。当業者は、受容体とそのリガンドの
会合は、該分子の個体群間で起こる動的関係であり、任意の特定の時間に、一定
比率の受容体とリガンドが会合していることを認識する。受容体とそのリガンド
の特異的相互作用を妨害する物質は、それ故、一定の時間に起こる該相互作用の
相対数を減少させ、全てのかかる会合を完全に阻害する場合もあり得る。

【００３９】「拮抗剤」なる語は、本明細書で、受容体とそのリガンドの特異的相互作用を
妨害し得る、抗体、ペプチドまたは非ペプチド小有機分子であり得る物質を意味
するために使用される。α５β１とフィブロネクチンの結合を妨害でき、よって
、α５β１インテグリンとフィブロネクチンの会合を低減または阻害する、抗α
５β１インテグリン抗体は、α５β１拮抗剤の一例である。拮抗剤は、α５β１
のそのリガンドへの結合の競合的阻害剤または非競合的阻害剤として作用できる
。

【００４０】拮抗剤が、受容体とそのリガンドの会合を完全に阻害したか、または特定のア
ッセイの検出限界以下に会合を減少させたかを識別することは困難であり得る。
従って、「妨害」なる語は、本明細書で広義に使用し、受容体とそのリガンドの
特異的結合の低減または阻害を包含する。さらに、物質は、受容体とそのリガン
ドの特異的結合を、例えば、リガンド結合部位に結合して、リガンド結合を妨害
することにより；受容体のリガンド結合以外の部位に結合するが、受容体へのリ
ガンドの結合を立体的に妨害することにより；受容体に結合し、コンフォメーシ
ョンまたはその他の変化を受容体に引き起こし、リガンドの結合を妨害すること
により；または他の機序を含む、様々な機序により受容体とそのリガンドの特異
的結合を妨害できる。同じように、物質は、リガンドと結合し、または別様にリ
ガンドと相互作用して、受容体とのその特異的相互作用を妨害できる。α５β１
インテグリンとそのリガンドの特異的相互作用を妨害する本明細書に開示した方
法には、妨害が起こる機序の解明は必要ではなく、作用機序は全く提唱していな
い。

【００４１】 α５β１インテグリンのそのリガンドへの結合の拮抗剤として作用する物質は
、抗体、特に抗α５β１抗体または抗フィブロネクチン抗体であり得る。本明細
書で使用した「抗体」なる語は、その広義の意味で使用し、ポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体、並びに該抗体の抗原結合断片を含む。抗インテグリン抗
体、特に抗α５β１抗体に関して、「抗原」なる語は、インテグリン、特にα５
β１インテグリンタンパク質、ポリペプチド、またはそのペプチド部分を意味し
、これはＲＧＤ結合ドメインのいくらかまたは全てを含んでも含んでいなくても
よい。抗α５β１抗体、またはその抗原結合断片は、α５β１インテグリンに少
なくとも１×１０^５Ｍ^−１、一般的には少なくとも１×１０^６Ｍ^−１、特に少な
くとも約１×１０^７Ｍ^−１の特異的結合活性を有することを特徴とする。α５β
１インテグリンに特異的結合活性を保持する、抗α５β１抗体のＦａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）_２、ＦｄまたはＦｂ断片は抗体の定義内に含まれる。

【００４２】本明細書に使用した「抗体」なる語は、例えば、単鎖抗体、キメラ、二機能性
およびヒト化抗体、並びに、その抗原結合断片を含む、天然抗体並びに非天然抗
体を包含する。かかる非天然抗体は、固相ペプチド合成を使用して作成できるか
、組換え産生できるか、または、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６
：１２７５−１２８１（１９８９）（これは参考として本明細書に取込む）に記
載のように、可変重鎖および可変軽鎖の組合せライブラリーをスクリーニングす
ることにより得ることができる。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖、
および二機能性抗体を製造するこれらおよび他の方法は、当業者には公知である
（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：２４
３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６
（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄ
ら、タンパク質工学：実践的なアプローチ（ＩＲＬ出版１９９２）；Ｂｏｒｒａ
ｂｅｃｋ、抗体工学、第２版（オックスフォード大学出版１９９５）；その各々
を参考として本明細書に取込む）。

【００４３】抗α５β１抗体を含む抗インテグリン抗体は、ケミコン社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ
ＣＡ）などの市販業者から購入できるか、または、天然源から調製するかまた
は組換え産生したヒトインテグリン、マウスインテグリンまたは他の哺乳動物ま
たは非哺乳動物インテグリンであり得る、実質的に精製された全長インテグリン
、または、ＲＧＤ結合ドメインの一部を含み得るインテグリンのペプチド部分、
例えば合成ペプチドを、免疫原として使用して産生できる。ヒトα５β１などの
インテグリンの非免疫原性ペプチド部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）また
はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリヤー分子にハプテ
ンを結合させることにより、または、融合タンパク質としてペプチド部分を発現
させることにより免疫原性にすることができる。様々な他のキャリヤー分子およ
びハプテンをキャリヤー分子に結合させる方法は、当分野で公知であり、例えば
、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上記、１９８８）により記載されている。

【００４４】本発明の方法の実施に特に有用な抗体は、α５β１インテグリンに特異的に結
合する抗体である。該抗体が、αＶβ３またはαＶβ５などの別のインテグリン
に結合する親和性よりも少なくとも一次数高い親和性でα５β１に結合する場合
、特に有用である。また、抗フィブロネクチン抗体、特に、α５β１インテグリ
ンへのフィブロネクチンの結合は妨害するが、αＶβ３または他のインテグリン
への結合は妨害しない、抗フィブロネクチン抗体も本発明の方法に有用であり得
る。

【００４５】本明細書で開示したように、抗α５β１抗体を使用して、病理状態で起こる、
成長因子刺激血管形成の領域を検出した（実施例Ｉ参照）。α５β１インテグリ
ン発現の存在または量は、例えば、少なくとも部分的に望ましくない血管形成を
特徴とする病理を有することが疑われる個体の組織または器官から得られた組織
学的薄片であり得る、組織サンプルで同定できる。α５β１インテグリン発現の
存在またはレベルの同定は、公知のイムノアッセイまたは免疫組織化学的方法を
使用して実施できる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８）。抗α５
β１抗体、特に、α５β１インテグリンへのリガンドの結合を防ぐ抗体も、スク
リーニングアッセイに使用して、リガンドのインテグリンへの結合に競合する物
質を同定できる。本明細書に開示したように、該物質は、α５β１媒介血管形成
の阻害に有用であり得る。

【００４６】 α５β１に特異的に結合するペプチドも、α５β１の、フィブロネクチンを含
むそのリガンドへの結合の拮抗剤として有用である。抗α５β１抗体について議
論したように、抗体がαＶβ３などの別のインテグリンに結合する特異性よりも
少なくとも２倍高い特異性でα５β１に結合する、α５β１に特異的に結合する
ペプチドが、本発明の方法に有用であり得、α５β１に少なくとも約５倍高い特
性を有する場合にはより有用であり、αＶβ３などのインテグリンよりもα５β
１に少なくとも約一次数高い特異性を有する場合には特に有用である。従って、
αＶβ３またはαＶβ５に対するその比較的高い結合親和性に基づいて同定され
た様々なＲＧＤおよびＲＬＤ含有ペプチド（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３５４２）は
、本明細書に定義したように、α５β１のそのリガンドへの結合のペプチド拮抗
剤とは考えない。

【００４７】「ペプチド」なる語は、本明細書で広義に使用し、ペプチド結合またはペプチ
ド結合の類似体により連結したアミノ酸またはアミノ酸類似体のオリゴマーおよ
びポリマーを含む。従って、「ペプチド」なる語は、一般に約２−約５０のアミ
ノ酸を含むペプチド、一般に約２０−約５０またはそれ以上のアミノ酸を含むポ
リペプチド、および、例えば翻訳後修飾されるペプチドまたはポリペプチドを含
み得るタンパク質と一般的に呼ばれる分子を含む。従って、ペプチド拮抗剤は、
２つ以上のアミノ酸を含み、これはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、化学修飾
アミノ酸であり得、これは天然または非天然アミノ酸、またはアミノ酸類似体で
あり得る。血管形成を低減または阻害するα５β１拮抗剤として有用なペプチド
は、公知の化学合成法（例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、上記１９９３、１９９４
）を使用して調製できるか、または市販業者から購入できる、ペプチドライブラ
リーをスクリーニングすることにより同定できる。

【００４８】 α５β１のそのリガンドへの結合を妨害する物質は、ペプチドの構造を擬似し
た有機分子であるペプチド擬似体を含む、非ペプチド小有機分子；またはビニル
性ペプトイドなどのペプトイドであり得る。α５β１インテグリンの、リガンド
のフィブロネクチンへの結合の特異的相互作用の拮抗剤として作用する非ペプチ
ド小有機分子は、例えば、一般構造（Ｓ）−２−フェニルスルホニルアミノ−３
−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピ
ロ−｛４，５｝−デック−２−エン−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸を
有するヘテロ環であり得、これは本明細書で構造：（Ｓ）−２−｛（２，４，６
−トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボ
ニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピ
ロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸
（実施例ＩＩおよびＩＶ；米国特許第５，７６０，０２９号参照）を有するＳＪ
７４９と称される分子により例示される。本明細書に開示したように、ＳＪ７４
９は、α５β１のフィブロネクチンへの結合を妨害し、用量依存的に血管形成を
低減または阻害した（図２参照）。本発明の方法に有用な追加の非ペプチド小有
機分子α５β１拮抗剤は、例えば、ＳＪ７４９の化学修飾誘導体を含む、上記に
開示した構造を有するヘテロ環の化学修飾誘導体、または非ペプチド小有機分子
の他のライブラリーのスクリーニングにより同定できる（下記参照）。

【００４９】本発明は、組織のα５β１インテグリンを、α５β１インテグリンの、組織で
発現されたリガンドへの特異的結合を妨害する物質と接触させ、よって組織の血
管形成を低減または阻害することによる、組織の血管形成を低減または阻害する
方法を提供する。特に有用な物質拮抗剤は、α５β１のフィブロネクチンへの結
合を妨害するが、α５β１インテグリン以外のインテグリンへのリガンドの特異
的結合は実質的に妨害しない。本明細書で開示したように、α５β１インテグリ
ンのそのリガンドへの結合を妨害する、抗α５β１抗体、ペプチドまたは非ペプ
チド小有機分子などの物質は、成長因子刺激血管形成および腫瘍増殖中に起こる
血管形成を低減または阻害できる（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ参照）。

【００５０】本明細書で使用した「低減または阻害」なる語句は、血管形成に関して使用す
る場合、物質拮抗剤の存在下で起こる新血管形成量が、外因的に加えた物質拮抗
剤の非存在下で起こる血管形成量以下に低減することを意味する。「低減」およ
び「阻害」なる語は、血管形成量は、特定のアッセイ法により検出できるレベル
以下に減少し得、それ故、血管形成が非常に低いレベルにまで減少したのか、ま
たは完全に阻害されたのかを決定することが不可能であり得るので、一緒に使用
する。それにも関わらず、α５β１インテグリンのそのリガンドへの結合を妨害
する物質に応答して、組織の血管形成が、対応する非処置組織の血管形成のレベ
ル以下に低減することは、使用した特定のアッセイから明らかである。本明細書
に開示した免疫組織化学的方法を含む（実施例Ｉ）、組織の血管形成量を決定す
る方法は、当分野で公知である。

【００５１】本発明の方法は、α５β１の、組織のフィブロネクチンなどのリガンドへの結
合を妨害することにより、例えば、網膜、網膜黄斑または角膜などの眼組織；例
えば乾癬が生じた皮膚；滑膜組織；骨；または腸組織の血管形成の低減または阻
害に有用である。さらに、本発明の方法は、良性または悪性であり得、悪性であ
る場合、転移性新生物であり得る、新生物の血管形成の低減または阻害に有用で
ある。本発明の方法の実践に有用な物質は、ペプチド、例えば、アミノ酸配列Ｃ
ＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）を含むペプチド；抗体、例えば、抗α５β１イ
ンテグリン抗体またはそのα５β１インテグリン結合断片；または非ペプチド小
有機分子、例えば、（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホ
ニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルア
ミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エ
ン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸（ＳＪ７４９）であり得る。所
望であれば、細胞毒素の連結が、物質のα５β１インテグリンへの特異的結合能
を実質的に減少させず、α５β１のそのリガンドへの結合を妨害しない場合、リ
シンまたは化学療法薬などの細胞毒素に連結できる。

【００５２】本発明はまた、組織を、α５β１インテグリンに特異的に結合する物質と接触
させ、組織の血管と会合したα５β１インテグリンへの物質の特異的結合を検出
し、よって組織の血管形成の存在を同定することにより、組織の血管形成の存在
を同定する方法も提供する。物質は、ペプチド、抗体、または非ペプチド小有機
分子であり得、これは直接的に、またはその存在を特定の試薬との相互作用によ
り検出できる、検出標識に連結できる。かかる方法は、例えば、胚組織または胎
盤組織などの正常組織、肉芽組織、および病理状態に関与する組織を含む、様々
な組織の血管形成の存在の同定に有用である。従って、本発明はさらに、個体の
組織のα５β１インテグリン発現に関連した血管形成を特徴とする病理状態を診
断する方法を提供する。

【００５３】本明細書で広く用いられる「病状」という用語は、少なくともある程度、組織
での新生血管形成におけるα５β１インテグリン発現に関連した血管形成を特徴
とする任意の病的な物理的症状または生理学的症状を意味する。かかる病状とし
ては、新生物（実施例Ｉを参照）、血管形成に関連する糖尿病網膜症および黄斑
変性などの眼科疾患、乾癬および血管腫などの皮膚疾患、歯肉炎、慢性関節リウ
マチおよび骨関節炎などの関節炎症状、および炎症性腸疾患などがあげられる。
本発明の診断方法または他の方法を施すことが可能な他の病状は、実施例Ｉに記
載されているような方法、あるいは当該技術分野で知られている方法を使用する
ことによって確認することができる。

【００５４】本明細書で広く用いられる「新生物」という用語は、新たに生じたいかなる病
的組織腫瘍をも意味する。本発明においては、新生物は腫瘍の形成を生じ、それ
は部分的に血管形成を特徴とする。新生物は、例えば、血管腫、神経膠腫、奇形
腫等の良性、あるいは、例えば、癌腫、肉腫、膠細胞腫、星状膠細胞腫、神経芽
細胞腫、網膜芽腫等の悪性でありうる。「腫瘍」という用語は、一般に、良性新
生物または悪性新生物を意味するために用いられる。また、「癌」という用語は
、一般に、悪性新生物を意味するために用いられ、それは、転移性または非転移
性であってよい。本発明の方法を使用により診断可能な悪性新生物には、例えば
、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌および卵巣癌などの癌腫、
並びに骨肉腫およびカポジ肉腫などの肉腫があるが、その場合、その新生物は、
少なくとも、新しく生ずる血管によるα５β１発現に関連した血管形成を特徴と
する（実施例ＩおよびＩＩＩを参照）。

【００５５】診断方法は、例えば、病状を有する個体から血管形成を示す組織の試料を入手
し、特異的にα５β１インテグリンに結合する薬剤とその試料とを接触させ、組
織の血管に関連しているα５β１インテグリンに対するその薬剤の特異的結合を
検出することによって実施することができる。本発明の方法を使用して診断され
る個体または処理される個体は、α５β１インテグリン発現に関連した血管形成
を示す任意の個体であり、したがって、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ
またはヤギをはじめとする哺乳類、鳥類、あるいは他の動物などの脊椎動物、特
に、購入上主要な動物または飼育された動物であってよい。

【００５６】また、個体の組織における血管形成を特徴とする病状を診断する方法は、病状
を有する可能性のある個体に特異的にα５β１インテグリンが結合する薬剤を投
与し、組織の血管に関連したα５β１インテグリンに対するその薬剤の特異的結
合を検出することことにより実施することができる。その薬剤は、例えば、成分
に薬剤を結合することによって検出可能に標識化することができ、それは、例え
ば、ｉｎｖｉｖｏで薬剤の特異的な結合を検出するかどうか、あるいは、薬剤
が結合している可能性がある組織が、例えば、生検によって取り出され、ｅｘ
ｖｉｖｏで試験されるかどうかに基づいて選択される。

【００５７】薬剤拮抗剤を標識化するのに有効な成分は、放射性核種、常磁性体、Ｘ線減衰
物質、蛍光性分子、化学発光性分子または発光性分子、ビオチンなどの分子、あ
るいは、例えば、酵素に対する基質または抗体に対するエピトープなど、特定の
試薬との反応で視覚化することが可能な分子であってよい。その成分は公知の方
法を使用して薬剤に結合させることができるが、それは、部分的に、その薬剤お
よびその成分の化学の性質に基づいて選択される。例えば、成分がヘキサヒスチ
ジン（Ｈｉｓ６）配列などのアミノ酸配列であり、かつ、薬剤がペプチドである
場合、Ｈｉｓ６配列はペプチドの一部として合成され、Ｈｉｓ６成分へのニッケ
ルイオン試薬の結合によってＨｉｓ６標識化薬剤を確認することができる。さら
に、成分を薬剤に化学的に結合する方法も利用可能である。（例えば、Ｈｅｒｍ
ａｎｓｏｎ、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ１９９６）を参照、なお、本文献は引用により本明細書に
援用する。）特異的結合薬剤は、放射性核種画像診断、陽電子射出断層撮影法、コンピュー
タ断層撮影法または磁気共鳴画像方法などのｉｎｖｉｖｏ画像診断方法の使用
により個体中で検出することができる。また、特異的結合薬剤は、ｅｘｖｉｖ
ｏ方法の使用によって検出することも可能である。この場合、投与後、個体から
組織の試料を得て、試料中の薬剤の特異的結合を検出する。試料中のα５β１イ
ンテグリンに特異的に結合している薬剤は、例えば、放射性核種成分によって放
出された放射能の検出などにより薬剤を検出することによって、あるいは、成分
の存在を検出することによって、直接検出することが可能である。また、特異的
結合薬剤は、さらにそれを薬剤と特異的に相互作用する試薬と接触させるか、薬
剤に結合する成分と接触させて、その薬剤と試薬との相互作用または標識を検出
することにより間接的に検出することができる。例えば、特に、成分が薬剤に結
合する場合、特異的に成分に結合する抗体との接触によってその成分を検出する
ことが可能である。その成分は、例えば基質であってよく、それは、その存在が
検出され得る成分と相互に作用し変化する酵素と接触させる。アルカリフォスフ
ァターゼ、ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ等などの酵素の使用
をはじめとするかかる間接的検出システムは、特定の種類の薬剤に対して特異的
成分を取り込む方法または結合する方法として、当該技術分野で公知であり、か
つ購入可能である。

【００５８】また、本発明は、組織で発現されるリガンドへのα５β１インテグリンの特異
的結合を阻害する薬剤を個体に投与し、それにより個体の組織における血管形成
を低減するか、あるいは阻害する、個体の組織における血管形成の低減方法、ま
たは阻害方法を提供する。同様に、本発明は、個体における血管形成に関連した
、病状に関連した組織のリガンドへのα５β１インテグリンの特異的結合を阻害
する薬剤を個体に投与し、それによって組織における血管形成を低減、または阻
害し、結果的に、病状の発病度を低減することによる、病状の発病度を低減する
方法を提供する。

【００５９】本明細書では、「病状の発病度の低減」という用語は、病状に関連した好まし
くない臨床上の徴候または症状を改善することを意味する。病状の発病度の減少
は、適当な酵素量またはサーキュレーティング抗原または抗体を測定するために
用いることができる血液検査、新生物の増殖速度または大きさの減少を測定する
ために用いることができる画像診断検査、または、糖尿病患者における網膜の血
管数の減少を確認するために用いることができる眼科的方法などのルーチンの臨
床試験を含む様々な方法によって検出可能である。かかる臨床試験は、治療され
ている特定の病状に基づいて選択される。さらには、治療を受けている患者が述
べたコメント、例えば、関節炎を患っている患者が疼痛をあまり感じないか、ま
たはより大きな関節可動性を有するというコメント、あるいは、糖尿病網膜症ま
たは血管形成による黄斑変性を患っている患者がよりはっきりと見ることができ
るというコメントなどに基づいて、病状の発病度の減少を確認することができる
。

【００６０】例えば、診断方法または治療方法において、α５β１インテグリンのそのリガ
ンドへの特異的結合を阻害する薬剤を生物個体に投与する場合、その薬剤は、一
般に、一種または複数の薬剤および薬学的に許容し得る担体である医薬組成物の
形態である。薬学的に許容し得る担体は当該技術分野で公知であり、生理的緩衝
食塩水または他の緩衝液または溶媒などの水溶液、あるいはグリコール、グリセ
リン、オリーブオイルなどのオイル、または注射用有機エステルのような媒介物
がある。薬学的に許容し得る担体は、ある程度、例えば、薬剤が、抗体、ペプチ
ドまたは非ペプチド、小有機分子であるか否かなどの薬剤の化学的性質により選
択される。

【００６１】薬学的に許容し得る担体は、例えば、薬剤を安定させるか、またはその吸収を
増加させるように作用する生理学的に許容し得る化合物、あるいは、所望の他の
補形薬である。生理学的に許容し得る化合物には、例えば、グルコース、スクロ
ースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンな
どの抗酸化剤、キレート化剤、低分子量タンパク質、あるいは他の安定剤または
賦形剤がある。生理学的に許容し得る化合物を含む薬学的に許容し得る担体は、
例えば、薬剤の投与経路によって、また、薬剤の特定の理学療法化学的特性によ
って選択することは当業者には公知である。

【００６２】 α５β１インテグリン発現に関連した血管形成は、例えば、糖尿病網膜症を患
っている個体の網膜に局所的に生じ、また、例えば、慢性関節リウマチまたは転
移性悪性新生物を患っている個体ではさらに全身的に生じ得る。かかる血管形成
の領域は限局性であるか、より全身的に分散し得るので、当業者は、ある程度こ
の因子に基づいて、α５β１インテグリンとそのリガンド、例えば、フィブロネ
クチン、との結合を阻害する薬剤の投与の特定経路および方法を選択する。例え
ば糖尿病網膜症を患っている個体においては、α５β１インテグリン発現に関連
した血管形成が網膜に限局されている場合、薬剤は点眼液としての使用に便利な
医薬組成物に製剤化することができ、それを直接目に投与することが可能である
。それに対し、転移性癌を患っている個体においては、医薬組成物中の薬剤を、
静脈内投与、経口的投与、または薬剤を全身的に循環する他の方法によって投与
することができる。したがって、薬剤拮抗剤は、様々な経路、例えば、治療され
るべき領域への静脈内投与、経口的投与、または直接投与、例えば、新生物の腫
瘍への直接投与、目に病状がある場合の点眼薬による投与、あるいは、関節に症
状がある場合の滑液内投与によって投与することができる。

【００６３】個体に投与されるα５β１薬剤拮抗剤の量は、その薬剤を診断目的で投与する
か、治療目的で投与するかによってある程度決まる。診断方法または治療方法に
おいて投与する薬剤の有効量を決定する方法は当該技術分野で公知であり、フェ
ーズＩ、フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ臨床試験が含まれる。薬剤は有効量
で投与するが、それは、個体でのα５β１インテグリンのその特異的リガンドに
対する特異的結合を阻害するのに十分な量である。一般に、薬剤拮抗剤は、０．
０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与する。

【００６４】本明細書に示されたように、ニワトリ胚の２ｍｌ血液容量当たり５μｇの抗α
５β１抗体を全身性投与した場合、成長因子刺激血管形成は５０％阻害された（
実施例ＩＩ）。同様に、２ｍｌの血液容量当たり１２０ピコモルのＣＲＲＥＴＡ
ＷＡＣ（配列番号１）を投与した場合、および、２ｍｌの血液容量当たり１５ピ
コモルのＳＪ７４９を投与した場合、血管形成は５０％まで阻害された。これら
の結果に基づいて、当業者は、ヒトなどの個体における組織の血管形成を効果的
に阻害するのに必要とされる、かかる薬剤の量を推定することができ、また、最
適の投薬量を決定するためにルーチン臨床試験を用いることができる。例えば、
ヒトが約６リットルの血液容量を有していると仮定した場合、ヒトに投与する薬
剤の量を決定するにあたり、臨床試験で約１５ミリグラム未満の、またはその数
値付近の一連の量の抗α５β１抗体を使用可能であることを当業者は知っている
。薬剤を局所的に投与することになっている場合、例えば、投与される推定量は
適宜調節することができる。

【００６５】比較的短期間にわたって、大きな丸薬として、または静脈内注入のいずれかに
より、被検者に薬剤拮抗剤の総量を一回投与として投与することができる。ある
いは、さらに長期間にわたって、複数回投与を行う分割した治療手順を使用して
投与することができる。当業者においては、個体でのα５β１インテグリン発現
に関連した血管形成の単一領域または複数領域に有効量を提供するのに必要とさ
れる特定の薬剤の濃度は、多くの因子に依存することが公知であり、それらの因
子には、被検者の年齢および全体的な健康状態、並びに、投与経路、投与される
処置数、および、薬剤が抗体、ペプチドまたは非ペプチド小有機分子を含んでい
るかどうかということをはじめとする薬剤の性質がある。これらの因子を考慮し
て、α５β１インテグリンとそのリガンドとの結合を効果的に阻害するのに有効
な量を得るために特定投与量を調節し、それによって、診断目的において、α５
β１インテグリン発現に関連した血管形成の領域での薬剤を検出することができ
る、あるいは、治療目的において、かかる血管形成を低減または阻害することが
できることは、当業者に公知である。

【００６６】 α５β１インテグリン発現に関連した血管形成を検出、低減または阻害するの
に有用な薬剤、あるいは、それらの薬剤を含有する医薬組成物は、少なくともあ
る程度、かかる血管形成を特徴とするすべての病状を治療するために用いること
ができる。様々な経路によって薬剤を投与することは当業者には公知であり、例
えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、関節内投与
、滑液内投与、腹腔内投与、あるいは、例えば、皮膚パッチ法または経皮的イオ
ン浸透療法を用いた皮膚を介する受動的吸収または促進性吸収をはじめとする非
経口投与がある。さらに、薬剤は、注射による投与、挿管法による投与、座剤を
用いた投与、経口的投与、局所的投与を行うことができ、後者は、例えば、薬剤
を含有する軟膏または粉薬を直接適用することによって受動的に吸収される。ま
た、例えば、鼻内噴霧あるいは吸入剤を使用により、促進的吸収を行うことがで
きる。さらに、所望の場合、局所的スプレーとして薬剤を投与することができ、
その場合には、組成物の構成が好適な噴射剤である。また、所望の場合、リポソ
ーム、微小球または他のポリマー基質にその医薬組成物を取り込むことができる
（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＬｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．１（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ１９８４）。なお、
この文献は引用により本明細書に援用する。）例えば、リン脂質または他の脂質
からなるリポソームは、調製し投与するのが比較的簡単な、無毒で、生理学的に
許容し得る、代謝可能な担体である。

【００６７】本明細書に記載したように、α５β１インテグリンとそのリガンドとの結合を
阻害する薬剤は、α５β１発現に関連した血管形成を低減、または阻害し得る。
例示した薬剤拮抗剤に加えて、他のかかる薬剤も、α５β１インテグリンとその
リガンドとの結合を阻害する薬剤の検出によりを確認することができる。したが
って、本発明はスクリーニングアッセイを提供するものであり、それは、組織に
おけるα５β１インテグリン発現に関連した血管形成を低減、または阻害する薬
剤を確認するのに有用である。

【００６８】本発明のスクリーニングアッセイは、薬剤とα５β１インテグリン発現に関連
した血管形成を示す組織とを接触させ、組織における血管形成の低減または阻害
を検出し、それによって、組織におけるα５β１インテグリン発現に関連した血
管形成を低減または阻害する薬剤を確認することによって実施することができる
。組織は、ｉｎｖｉｖｏで、またはｅｘｖｉｖｏで薬剤と接触させることが
できる（例えば、米国特許第５，６２２，６９９号を参照）。ｉｎｖｉｔｒｏ
フォーマットを使用して本発明のスクリーニング法を実施する場合、自動化方法
を適応することができ、したがって、α５β１発現に関連した血管形成を低減ま
たは阻害し得る潜在的α５β１拮抗剤を確認する分子のライブラリの試験におい
て高処理量スクリーニングアッセイが可能である。組織は、α５β１インテグリ
ン発現に関連した血管形成が生じるすべての組織であり、例えば、悪性新生物組
織がある。

【００６９】分子のライブラリを調製する方法は、α５β１発現に関連した血管形成を低減
または阻害するα５β１拮抗剤を確認する本発明の方法を使用してスクリーニン
グすることができ、例えば、オリゴヌクレオチドライブラリ（Ｇｏｌｄら、米国
特許第５，２７０，１６３号）；ペプチドライブラリ（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、上
掲、１９９３，１９９４）；擬似ペプチドライブラリ（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、
ＴｒｅｎｄｓＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１４：８３−９２（１９９５）；オリゴ
糖ライブラリ（Ｙｏｒｋら、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．，２８５：９９−１２８，（１
９９６）；Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２，（１
９９６）；および、Ｄｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３７
６：２６１−２６９，（１９９５）；リポタンパク質ライブラリ（ｄｅＫｒｕ
ｉｆら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，３９９：２３２−２３６，（１９９６））；糖
タンパク質または糖脂質ライブラリ（Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．，１３０：５６７−５７７（１９９５））；あるいは、例えば、一般的構
造（Ｓ）−２−フェニルスルフォニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニル
アミノオメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピロ−｛４，５｝−デカ−２−
エン−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸を有する複素環（米国特許第５，
７６０，０２９号）を含む、薬剤または他の医薬品薬剤（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｅｃｋｅｒａ
ｎｄＣｒｏｏｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：３５１−３６０（１
９９５））を含んでいる化学ライブラリがある。さらに、種々の分子のライブラ
リは、市販商品から得ることができる。

【００７０】以下の実施例は具体的に説明するものであるが、本発明を限定するものではな
い。

【００７１】（実施例Ｉ）血管形成時のα５β１インテグリン発現本実施例は、α５β１が、ヒトおよびハツカネズミの様々な腫瘍で新たに形成
された血管に関連して発現するという免疫組織化学的証明を提供するものである
。

【００７２】６週齢ＣＢ１７雌ＳＣＩＤマウスにおけるヒト正常胸部およびヒト正常結腸、
結腸癌腫、乳癌、ヒト腫瘍の異種移植片の５μｍ凍結切片（ＣｈａｒｌｅｓＲ
ｉｖｅｒ；ＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎＭＡ）、並びにＭｔａｇマウスからの乳房腫
瘍の凍結切片をアセトン中で１分間固定し、風乾し、リン燐緩衝食塩液（ＰＢＳ
）中で５分間再水和した。それらの切片は、ＰＢＳに溶解した８％正常ヤギ血清
中で２時間ブロッキングし、室温（ＲＴ）で２時間、ＰＢＳ溶解２％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）中で、１）５μｇ／ｍｌの抗α５β１細胞質テールポリクロ
ーナル抗体（ＡＢ１９２８Ｐ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．；ＳａｎＤｉ
ｅｇｏＣＡ）、および５μｇ／ｍｌのネズミ抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗
体（ＰＥＣＡＭ；ＭＡ−３１００；Ｅｎｄｏｇｅｎ）；２）５μｇ／ｍｌの抗α
５β１モノクローナル抗体、および５μｇ／ｍｌのウサギ抗ｖｏｎＷｉｌｌｅ
ｂｒａｎｄ因子抗体（０１６Ｐ；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ；ＳａｎＲａｍｏｎＣＡ
）；または、３）５μｇ／ｍｌの抗フィブロネクチン細胞結合ペプチドモノクロ
ーナル抗体（７８４Ａ２Ａ６；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．；Ｔｅｍｅｃｕｌａ
ＣＡ）、および５μｇ／ｍｌの抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体（０
１６Ｐ）とインキュベートした。

【００７３】６回新たに入れ替えた新しいＰＢＳ中に切片を浸漬することによって洗浄し、
１：４００〜１：６００希釈のヤギ抗ウサギＦＩＴＣ、および１：４００〜１：
６００のヤギ抗マウスローダミン中で一時間室温にてインキュベートした（交差
吸着第２抗体；ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｃａｍａｒ
ｉｌｌｏＣＡ）。スライドを洗浄し、過冷却ＣＣＤカメラ使用の蛍光性照度下
のディジタル画像分析に先立って、一滴のフルオロマウントＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｂｉｒｍｉｎｇｈ
ａｍＡＬ）にカバーガラスをマウントした。

【００７４】２色免疫組織化学による内皮細胞マーカーＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）およびイン
テグリンα５β１の発現に関するヒト結腸癌腫および乳癌の凍結切片の分析は、
ＣＤ３１陽性腫瘍血管（赤色染色）は、さらにインテグリンα５β１発現（緑色
染色）に対しても陽性であることを示し、両方分子に対して陽性の血管は顕微鏡
写真撮影によって黄色に見えた。内腔を有する大きな血管、並びに、明らかに内
腔を有さない小さな血管も、インテグリンα５β１およびＣＤ３１に対してはっ
きりと染色された。卵巣癌および膵臓癌の切片は、血管におけるインテグリンα
５β１発現の類似パターンを示した。対照的に、正常ヒト結腸および胸部切断中
に存在するＣＤ３１陽性血管は、皮膚を含む他の正常成体組織中の血管と同じく
、インテグリンα５β１に対して陰性であった。これらの結果は、インテグリン
α５β１発現が腫瘍血管において生じ、これら腫瘍切断中の大多数の血管はα５
β１発現に対して陽性であることを示している。さらに、それらの結果は、α５
β１は、正常成体組織の血管においては有意に発現しないことを示唆している。

【００７５】また、別の血管マーカーである、フィブロネクチン（赤色に染色）およびｖｏ
ｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（緑色に染色）に対して方向性を有する抗体で腫
瘍組織を染色した。乳癌および結腸癌腫、並びに正常ヒト胸部および結腸の凍結
切片の試験は、腫瘍血管を囲む細胞外基質は、フィブロネクチン発現に対して陽
性であることを示した。対照的に、正常組織中の血管は、もしあったとしても、
フィブロネクチンをほとんど発現しなかった。卵巣癌および膵臓癌の切片は、血
管におけるフィブロネクチン発現の類似パターンを示した。

【００７６】特に、インテグリンα５β１およびそのリガンドのフィブロネクチンの発現は
、ヒト腫瘍切片内の多数の同じ血管において同等に高まった。ヒト腫瘍組織中の
これら分子の同等の発現は、これらタンパク質間の機能的相互作用の可能性を示
している。また、インテグリンα５β１およびフィブロネクチンの発現を、ＳＣ
ＩＤマウスのヒトＭ２１Ｌ黒色腫腫瘍異種移植片およびＰｙＶマウスの自発性乳
癌を含む異常増殖動物モデルの腫瘍血管構造において確認した（ＰｙＶマウスモ
デルに関しては、Ｇｕｙら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：９５４−９６
１（１９９２）を参照、また、これを引用により本明細書に援用する）。したが
って、明らかなインテグリンα５β１およびフィブロネクチンの高発現は、自発
性腫瘍の血管構造に関係しており、実験誘発性ヒト腫瘍およびマウス腫瘍を正常
組織と比較した。

【００７７】（実施例ＩＩ） α５β１およびフィブロネクチンは血管形成に必須である本実施例は、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンレセプターインテグリ
ンα５β１が腫瘍の血管形成、および成長因子刺激血管形成に関係することを示
す。

【００７８】Ａ．方法１．細胞接着アッセイＨＴ２９インテグリンα５β１^＋細胞、インテグリンα５β１⁻結腸癌細胞（
Ｖａｒｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ６：７２５−７４０（１９９５
））、およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
およびゲンタマイシン補充ＤＭＥＭ高グルコース中に保持した。ヒト臍静脈内皮
細胞（ＨＵＶＥＣ）は、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ヘパリン、血管内皮細
胞増殖補充、２０％ＦＢＳおよびゲンタマイシン含有のＭ１９９培地に保持した
。培養基および試薬は、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，
ＣＡ）からのものである。

【００７９】４８ウェル培養容器（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のウェルは、１μｇ／ｍｌの
ビトロネクチン、２μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ニワトリ胚繊維芽細胞およ
びＨＷＥＣ）、または１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ＨＴ２９−α５^＋細
胞）で、３７℃において１時間コーティングし、次いで、１時間、ＰＢＳに溶解
した２％加熱変性ＢＳＡでブロッキングした。接着緩衝液（１％ＢＳＡ、２ｍＭ
のＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＣａＣｌ_２および０．２ｍＭのＭｎＣｌ_２を含有した、
ＨＥＰＥＳバッファー利用ハンクス平衡塩類溶液、ＨＢＳＳ）中に、５０μｇ／
ｍｌの抗α５β１機能遮断抗体（ＮＫＩ−ＳＡＭ−１，ＪＢＳ５またはＩＩＡ１
）溶液２５０μｌ、５０μｇ／ｍｌの抗α５β１非機能遮断抗体（ＨＡ５または
ＶＣ５；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．；ＳａｎＤｉｅｇｏＣＡ）、１０
μＭの環状ペプチド（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：
２０２０５−２０２１０（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌ．１２４：３７３３８０（１９９４））、０〜１０μＭのＳＪ７４９（（
Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルフォニル｝アミノ−３｛
７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オ
キサ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボ
ニルアミノ｝ピロリン酸））、５０μｇ／ｍｌのＬＭ６０９、抗αＶβ３機能遮
断抗体、５０μｇ／ｍｌのＰ４Ｃ１０、抗β１機能遮断抗体、５０μｇ／ｍｌの
抗フィブロネクチン細胞結合ドメインモノクローナル抗体、または、５０μｇ／
ｍｌの抗フィブロネクチンＮ末端モノクローナル抗体を含む３つ組のウェルに、
接着緩衝液２５０μｌ中の細胞５万個を加えた。

【００８０】３７℃、２０分間で、細胞を器に付着させた。未付着の細胞は、５００μｌの
暖めた接着緩衝液で各ウェルを４回洗浄することにより除去した。その後、３．
７％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で１５分間その接着細胞を固定し、２％ク
リスタルバイオレット溶液で染色した。おおがかりな水洗浄によって過剰のクリ
スタルバイオレットを除去した後、プレートを一晩乾燥させた。１０％酢酸中で
１５分間インキュベーションすることによってクリスタルバイオレットを抽出し
、多数の結合した細胞の指標として５６２ｎｍにおける吸光度を検出した。各実
験は、１つの条件当たり３つの試料を用い、３通りずつ実施した。データは、接
着のパーセントとして、正の対照（接着培養基単独）±測定の標準誤差、により
示した。

【００８１】２．細胞移動アッセイ８μｍ孔トランスウェルインサート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）の下部側を２
μｇ／ｍｌのフィブロネクチン、コラーゲン（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＢ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ；ＢｅｄｆｏｒｄＭＡ）または非タ
ンパク質で１時間コーティングし、次いで、ＰＢＳ溶解２％ＢＳＡ溶液で１時間
ブロッキングした。その後、下部チャンバー中の５００μｌ移動緩衝液を含有す
る２４ウェル容器へそのインサートを置いた。移動緩衝液（１％ＢＳＡ、２ｍＭ
のＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＣａＣｌ_２、および０．２ｍＭのＭｎＣｌ_２を含有する
ＨＥＰＥＳバッファー利用Ｍ１９９培養基）５０μｌ中の２万５０００のＨＵＶ
ＥＣは、移動緩衝液中に、５０μｇ／ｍｌの抗α５β１機能遮断抗体（ＮＫＩ−
ＳＡＭ−１、ＪＢＳ５またはＩＩＡ１）溶液５０μｌ、５０μｇ／ｍｌの抗α５
β１非機能遮断抗体（ＨＡ５またはＶＣ５）、または、５０μｇ／ｍｌのＬＭ６
０９（抗αＶβ３機能遮断抗体）を含む、あるいは移動緩衝液のみを含む上部チ
ャンバーの重複インサートに加えた。

【００８２】３７℃、４時間で、細胞を上部チャンバーから下部チャンバーへ移動させた。
非移動性細胞は、吸収チップで上部側を拭きとることによって上部表面から除去
した。また、トランスウェルインサートの下部側に移動した細胞をＰＢＳ溶解３
．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、２％クリスタルバイオ
レット溶液で染色した。おおがかりな水洗浄によって過剰のクリスタルバイオレ
ットを除去した後、移動した細胞数は、１つのインサート当たり３つの代表的ハ
イパワー（２００×）フィールドで計測した。データは、移動細胞の数±測定の
標準誤差として示した。

【００８３】３．卵におけるニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）血管形成アッセイ殻下の血管を照らすために１０日齢の有胚鶏卵（ＭｃＩｎｔｙｒｅＰｏｕｌ
ｔｒｙ；ＲａｍｏｎａＣＡ）を灯に透かして調べ、極小の小血管が存在する領
域を確認した。ミネラル化殻に小さな空孔をあけ、下部の内殻膜に圧力を加える
ことによって、ＣＡＭをこの領域の卵殻から下方に遠ざけた。この方法により、
エアポケットが卵の広端部から確認領域へシフトし、卵殻から離れた下部で直径
約２ｃｍのＣＡＭの環伏領域を発育促進した。卵殻に開口部を開け、１μｇ／ｍ
ｌのｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−８（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．；Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）または生理的食塩水で飽和させた直径５ｍｍのコルチ
ゾン酢酸塩事前処理フィルターディスクをＣＡＭ上に置いた。殻の開口部を接着
テープで封じ、その卵を４日間培養した。

【００８４】２５μｌ中０〜２５μｇの範囲の機能遮断抗α５β１または対照の非機能遮断
抗α５β１、２５μｌ中０〜２５μＭの環状ペプチド（ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ；配
列番号１）またはスクランブル対照ペプチド（ＣＡＴＡＥＲＷＲＣ；配列番号２
；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０２０５−２０２
１０（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２４：３
７３３８０（１９９４））、２５μｌ中０〜２５μＭのＳＪ７４９、不活性対照
小分子、または２５μｌの生理的食塩を２４時間後の成長因子飽和フィルタに供
した。さらに、抗フィブロネクチン抗体（２５μｌ中２５μｇ）を局所的にＣＡ
Ｍに供した。

【００８５】フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン断片（最終用量
２５μｌ中５９ピコモル）を誘導ＣＡＭまたは非誘導ＣＡＭに供した。また、循
環２４時間後に、α５β１のペプチドまたは小分子の拮抗剤を（最終血清濃度０
〜２５μＭで）そのニワトリに静注した。誘導４日目にＣＡＭを回収した。成長
因子に応じた血管新形成のサイズ無関係な定量指標として、５ｍｍフィルターデ
ィスク内の血管分岐点を盲検法で３０×の倍率で計測した。血管形成は、成長因
子に応じた新しい血管の新形成を特徴とする。したがって、血管分岐点の計測は
、血管形成指標を得る有用な定量手段である（Ｂｒｏｏｋｓら、「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ
１９９９）に記載）。一投与群当たり、少なくとも１０個の胚を使用した。各
実験は、最低３回実施した。

【００８６】データは、投与群当たりの血管分岐点の平均数±測定の標準誤差に関して評価
した。統計分析は、スチューデントｔ検定を使用して実施した。各投与群の代表
的ＣＡＭを１０×倍率で撮影した。いくつかの事例では、卵から切除したＣＡＭ
組織を液体窒素のＯＣＴ（Ｂａｘｔｅｒ；ＭｃＧｒａｗＰａｒｋＩＬ）で凍
結し、５μｍ切片にカットし、風乾し、固定を除く以外は実施例Ｉに記述したよ
うな免疫組織化学的アッセイ用に処理した。

【００８７】４．インテグリンレセプターリガンド結合アッセイヒト胎盤から精製したインテグリンαＶβ３およびα５β１レセプターは、Ｃ
ｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。血小板インテグリ
ンαＩＩｂβ３は、確立している方法に従って血小板から精製した。レセプター
は、Ｃｏｓｔａｒ（３５９０）高キャパシティー結合プレート上で４℃において
一晩コーティングした（１００μｌ／ウェル）。コーティング溶液は廃棄し、プ
レートは、遮断／結合（Ｂ／Ｂ）緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、
１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＭ
ｎＣｌ_２および１％のＢＳＡ）で一度洗浄した。

【００８８】１１０マイクロリットルのＢ／Ｂ緩衝液を室温にて６０分間加えた。３０μｌ
のビオチン化細胞外間充織タンパク質リガンド（インテグリンα５β１に対する
フィブロネクチン、インテグリンαＶβ３に対するビトロネクチン、およびイン
テグリンαＩＩｂβ３に対するフィブリノーゲン）にＢ／Ｂ緩衝液溶解ＳＪ７４
９またはＢ／Ｂ緩衝液のみのいずれか５０μｌを加えたものを各ウェルに添加し
、室温にて２５分間培養した。Ｂ／Ｂ緩衝液でプレートを２度洗浄し、Ｂ／Ｂ緩
衝液に溶解した抗ビオチンアルカリフォスファターゼ（１００μｌ／ウェル）を
加えて室温で１時間培養した。最後に、Ｂ／Ｂを用いてプレートをさらに２度洗
浄し、続いてフォスファターゼ基質（１．５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加した
。２ＮのＮａＯＨ（２５μｌ／ウェル）を添加して反応を中止し、４０５ｎｍで
の発色色調を記録した。

【００８９】Ｂ．結果１．フィブロネクチンの細胞結合ドメインに対する特定の抗体は、ｉｎｖｉ
ｔｒｏにおいてフィブロネクチンに対するα５β１インテグリンを発現する細胞
の付着および移動を阻害するとともに、ＣＡＭのｉｎｖｉｖｏにおける血管形
成を阻害する。

【００９０】腫瘍および成長因子処理組織の５β１−発現血管にフィブロネクチンが局在化
したので、血管形成におけるフィブロネクチンの作用、および機能遮断抗フィブ
ロネクチン抗体の作用を評価した。

【００９１】まず、ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞接着アッセイを用いて、中央細胞結合ドメイ
ンペプチドに対して方向性を有する抗体（抗−ＣＢＰ抗体）か、フィブロネクチ
ンへの細胞接着を阻害するヒトおよびニワトリのフィブロネクチンのフィブロネ
クチンＮ−末端ペプチドに対する抗体（抗−ＮＴ抗体）かを検出した。抗−ＣＢ
Ｐ抗体は、α５β１^＋ＨＴ２９結腸癌細胞、ＣＥＦおよびＨＵＶＥＣを含む、
インテグリンα５β１陽性細胞のフィブロネクチンへの接着を著しく阻害した。
ＨＵＶＥＣ接着は、抗−ＣＢＰ抗体によって７０±３％阻害された。対照的に、
抗−ＮＴ抗体はフィブロネクチンへの細胞接着の阻害について効果がなかった。
これらの結果は、α５β１インテグリンを発現する細胞の接着にはフィブロネク
チンのＣＢＰドメインが必要であることを示唆している。

【００９２】インテグリンα５β１の機能遮断モノクローナル抗体拮抗剤（しかし、対照（
非機能遮断）抗α５β１インテグリンモノクローナル抗体ではない）は、フィブ
ロネクチンへのＨＴ２９ α５^＋（１００±６％）、ＣＥＦ（８９．７±３．４
％）、およびＨＵＶＥＣ（７２±２．５％）接着を選択的に阻害したが、ビトロ
ネクチンへの結合は阻害しなかった。しかしながら、ＬＭ６０９、抗αＶβ３特
異的抗体は、ビトロネクチンへの細胞の付着を阻害した。これらの結果は、フィ
ブロネクチンへのα５β１発現細胞の接着には、フィブロネクチンに結合するα
５β１が必要であることを示唆している。

【００９３】血管形成が部分的に内皮細胞移動および侵入による場合、ＨＵＶＥＣ移動を遮
断する抗α５β１抗体の能力がさらに評価された。インテグリンα５β１に対し
て誘導された機能遮断抗体は、著しくフィブロネクチン上のＨＵＶＥＣの移動を
阻害したが（８７±２％）、この抗体はコラーゲンを含む他の基質タンパク質上
の内皮細胞移動には影響を与えなかった。これらの結果は、α５β１インテグリ
ンがフィブロネクチン仲介細胞移動にも関係していることを示唆している。

【００９４】血管形成に関するフィブロネクチンの機能およびα５β１の機能をＣＡＭアッ
セイの使用によりｉｎｖｉｖｏで試験した。ｉｎｖｉｖｏでの血管形成時の
フィブロネクチン機能を評価するために、１０日齢胚のＣＡＭをｂＦＧＦまたは
ＶＥＧＦで刺激した。２４時間後、抗フィブロネクチン抗体をＣＡＭに直接供し
、２日後、ＣＡＭを切除し、血管分岐点をカウントすることにより血管を定量し
た。

【００９５】抗−ＣＢＰ抗体は、７５±１０％（ｐ＝０．００２）までｂＦＧＦによって誘
導された新しい血管の成長を阻害したが、抗−ＮＴ抗体はわずかに最小限の効果
しかなかった（３４±１５％阻害、ｐ＝０．０２）。さらに、抗−ＣＢＰ抗体は
、７１±７％（ｐ＝０．０２）までＶＥＧＦ血管形成を阻害し、抗−ＮＴ抗体も
同様に阻害した（８９±１７％阻害、ｐ＝０．０３５）。抗フィブロネクチン抗
体とは対照的に、ビトロネクチンに対して誘導される機能遮断抗体は、血管形成
に有意な効果はなかった。これらの結果は、フィブロネクチンの細胞結合ドメイ
ンが血管形成で重要な機能を果たし、さらに、フィブロネクチンのＮ−末端ドメ
インが血管形成にある程度寄与している可能性があることを示唆している。

【００９６】また、フィブロネクチンと血管形成刺激の間の特異的な機能上の関連を示すた
めに、成長因子の存在下または非存在下において、１０日齢胚のＣＡＭにフィブ
ロネクチンおよびビトロネクチンを直接供した。成長因子添加がない場合では、
フィブロネクチンもビトロネクチンも血管形成を促進することはなかった。等モ
ル量の無損傷ヒトフィブロネクチン、細胞結合ドメインを含むＲＧＤを有するフ
ィブロネクチンの１２０ｋＤ断片、または、細胞結合ドメインを含むＲＧＤを欠
失している４０ｋＤのＣ末端キモトリプシンフィブロネクチン断片（Ｃｈｅｍｉ
ｃｏｎ；ＴｅｍｅｃｕｌａＣＡ）をｂＦＧＦ刺激ＣＡＭに加え、血管形成を試
験した。

【００９７】無損傷フィブロネクチンは、成長因子刺激血管形成を少なくとも４６±１１％
（ｐ＝０．０４）促進した。また、フィブロネクチンの１２０ｋＤ細胞結合断片
は、血管形成を著しく増強した（６５±２０％；ｐ＝０．０５）。対照的に、フ
ィブロネクチンの４０ｋＤ断片には有意な効果はなかった。さらに、本工程とは
逆の抗−α５β１インテグリン抗体は、フィブロネクチン増強血管形成がインテ
グリンα５β１活性に依存していたことを示している（以下を参照）。ｂＦＧＦ
刺激ＣＡＭへのビトロネクチンの添加は血管数に関して効果はなかった。ＶＥＧ
Ｆ刺激ＣＡＭに対するフィブロネクチンまたはビトロネクチンの添加もまたＶＥ
ＧＦの血管形成効果を高めるものではなかった。これらの結果は、フィブロネク
チンおよび内皮細胞インテグリンα５β１は、成長因子誘導血管形成において機
能的役割を担っていることを示唆している。

【００９８】また、ヒヨコＣＡＭにおける成長因子誘導血管形成に影響を与える抗α５β１
抗体の能力についても試験を行った。ｂＦＧＦによる血管形成刺激から２４時間
後、成長因子飽和フィルターディスクに直接抗α５β１抗体を添加するか、胚循
環に静脈内注射した。インテグリンα５β１の抗体拮抗剤は、少なくとも８８±
６％（ｐ＝０．０１）までＣＡＭ上のｂＦＧＦ誘導血管形成を遮断したが、対照
の非機能遮断抗α５β１抗体には有意な効果はなかった。刺激ＣＡＭへ機能遮断
または対照抗α５β１抗体を添加した場合、適用領域内に存在する血管の数また
は完全性において効果は得られなかった。同様に、抗αＶβ３抗体もまた、ｂＦ
ＧＦによって誘導された血管形成を６５±１０％（ｐ＝０．００８）まで阻害し
た。

【００９９】別の成長因子は、別のインテグリンを活性化するか利用する血管形成の選択的
経路を誘導し得る。例えば、インテグリンαＶβ３は血管形成のｂＦＧＦおよび
ＴＮＦαの経路に関係しているが、αＶβ５はＶＥＧＦおよびＴＧＦαの経路に
関係している。したがって、成長因子誘導血管形成における他のインテグリンの
機能をさらに試験した。

【０１００】ＴＮＦαまたはＩＬ−８で血管形成を刺激した場合、抗α５β１抗体は、各々
、平均値７０．４±１２％（ｐ＝０．０４）および８５±４．８％（ｐ〈０．０
００１）まで血管形成を阻害し、一部の実験では、抗α５β１抗体は、９９±５
％（ｐ＝０．００５）までＴＮＦαおよびＩＬ−８血管形成を阻害した。同様に
、インテグリンαＶβ３の抗体拮抗剤は、ＴＮＦαおよびＩＬ−８血管形成を各
々９３．６±６．２％（ｐ＝０．００４）および７７±５．２％（ｐ＝０．００
０１）まで阻害した。しかしながら、血管形成がＶＥＧＦで誘導される場合、イ
ンテグリンα５β１の抗体拮抗剤は血管形成を阻害しなかったが、抗αＶβ５抗
体は９９±０．１％（ｐ＝０．００４）までＶＥＧＦ誘導血管形成を阻害した。
抗α５β１インテグリンおよび抗αＶβ３インテグリン抗体を併用してｂＦＧＦ
刺激ＣＡＭに加えた場合、付加的阻害作用または相助的な阻害作用は確認されず
、これらのインテグリンが同じ血管形成の経路に関係していることがわかった。

【０１０１】これらの結果は、フィブロネクチンの細胞結合ドメインとα５β１インテグリ
ンとの相互作用は、ｉｎｖｉｖｏでの成長因子誘導血管形成に関係し、かつ、
抗α５β１抗体がかかる血管形成を阻害し得ることを示している。さらに、これ
らの結果は、インテグリンα５β１は、αＶβ３が調節するのと同様に血管形成
の同一経路を調節し、この経路はαＶβ５によって調節された経路とは異なるこ
とを示唆している。

【０１０２】２．ペプチドおよび非ペプチド小有機分子α５β１拮抗剤は、ｉｎｖｉｔｒ
ｏでα５β１インテグリン発現細胞のフィブロネクチンへの付着および遊走を阻
害し、ＣＡＭにおけるｉｎｖｉｖｏでの血管形成を阻害する α５β１インテグリンのペプチドおよび非ペプチド小有機分子拮抗剤の、フィ
ブロネクチンとの細胞相互作用を妨害する能力および成長因子誘発血管形成を妨
害する能力も調べた。

【０１０３】インテグリンα５β１の非抗体拮抗剤はフィブロネクチンへの細胞付着を強力
に阻害した。インテグリンα５β１の選択的環状ペプチド拮抗剤ＣＲＲＥＴＡＷ
ＡＣ（配列番号１）は、α５^＋ＨＴ２９結腸癌細胞、ＣＥＦおよびＨＵＶＥＣ
のフィブロネクチンへの接着を有意に阻害したが、ビトロネクチンへの接着は阻
害せず、一方、「スクランブルド（アミノ酸の順序を変えた）」対照ペプチド（
ＣＡＴＡＥＲＷＲＣ；配列番号２）はフィブロネクチンまたはビトロネクチンに
対する細胞接着にほとんど影響しなかった。ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）
はフィブロネクチンへの内皮細胞遊走を妨害した（対照ペプチドは妨害しなかっ
た）が、コラーゲンなどの他の基質タンパク質への内皮細胞遊走は妨害しなかっ
た。α５β１の上記環状ペプチド作用物質はｂＦＧＦ誘発血管形成も有意に遮断
したが（９０±６％；ｐ＜０．０００１）、対照ペプチドは血管形成を阻害しな
かった。インテグリンα５β１のペプチド拮抗剤はＶＥＧＦ血管形成を遮断でき
なかった。

【０１０４】 α５β１選択的非ペプチド小有機分子作用物質ＳＪ７４９は、これらの細胞の
フィブロネクチンへの接着を用量依存的に遮断したが（α５^＋ＨＴ２９細胞の
場合、半最大阻害濃度は０．８μＭ；図１）、ビトロネクチンまたは他の細胞外
基質への細胞付着を遮断する効果はなかった。ＳＪ７４９はα５β１へのリガン
ドの結合も選択的に阻害し、αｖβ３および他のインテグリンへのリガンド結合
を遮断する効力はかなり低かった。インテグリンα５β１の非ペプチド小有機分
子拮抗剤は、フィブロネクチンへの内皮細胞遊走も極めて効果的に遮断したが、
コラーゲンなどの他の基質へは遊走は効果的に遮断しなかった。またＳＪ７４９
は、局所的または全身的に適用すると、ヒヨコＣＡＭでのｂＦＧＦ誘発血管形成
を用量依存的に遮断したが（図２）、対照非ペプチド分子は試験した最高用量で
も血管形成を阻害しなかった。他のα５β１拮抗剤と同様にＳＪ７４９もＶＥＧ
Ｆ血管形成を遮断しなかった。

【０１０５】これらの結果は、α５β１のペプチドおよび非ペプチド小有機分子拮抗剤が、
抗α５β１抗体と同様に、ヒトおよびヒヨコα５β１の機能を有意にかつ選択的
に妨害することを実証している。より具体的に述べると、抗体、ペプチドおよび
非ペプチド小分子拮抗剤の全身投与により、成長因子誘発血管形成が、ニワトリ
胚の血液量２ｍｌにつきそ９れぞれ約５μｇ、１２０ピコモルおよび１５ピコモ
ルのＩＣ_５０で阻害された。これらの結果は、フィブロネクチンレセプターイン
テグリンα５β１がＣＡＭでの成長因子血管形成の一因になることも裏付けてい
る。

【０１０６】（実施例ＩＩＩ） α５β１拮抗剤はＳＣＩＤマウス中のヒト皮膚における成長
因子により誘発される血管形成を阻害するこの実施例ではα５β１拮抗剤がＳＣＩＤマウス中のヒト皮膚における血管形
成を阻害することを実証する。

【０１０７】ＳＣＩＤマウスへのヒト皮膚の移植は既に前述のように行なった（Ｂｒｏｏｋ
ｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１８１５−１８２２（１９９５）
）。ＳＣＩＤマウスに、ヒト新生児包皮の８ｍｍ×１３ｍｍ片を移植した。新鮮
なヒト新生児包皮は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のコオペラティブ・ヒューマ
ン・ティシュー・ネットワーク（ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＨｕｍａｎＴｉｓ
ｓｕｅＮｅｔｗｏｒｋ）から入手し、２％ウシ胎仔血清および１％ゲンタマイ
シンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中に保存した。

【０１０８】移植の４週間後、皮膚が完全に治癒した後に、１μｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞
成長因子（ｂＦＧＦ）、２５μｇ／ｍｌの抗α５β１機能遮断性モノクローナル
抗体を含有する１μｇ／ｍｌｂＦＧＦ、または２５μｇ／ｍｌの非機能遮断性
抗α５β１モノクローナル抗体を含有する１μｇ／ｍｌｂＦＧＦを使って再構
成した５０μｌの成長因子枯渇マトリゲル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ
社，マサチューセッツ州ベッドフォード）を、移植された各皮膚片の中心部に、
皮内注射した。ヒト皮膚は無毛のピンク色であり、マウスは白い柔毛に覆われて
いるので、境界は容易に確認できた。それらのヒト皮膚を凍結培地に包埋し、凍
結し、切片を作成した。血管密度の免疫組織化学的分析の項で説明したように、
抗ＣＤ３１を使ってヒト血管の存在がわかるように切片を染色した。データを倍
率１００倍の顕微鏡視野あたりの平均ＣＤ３１陽性血管数±測定の標準誤差とし
て表した。統計分析はスチューデントのｔ検定を使って行なった。

【０１０９】ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト新生児包皮に、機能遮断性抗α５β１抗体お
よび対照抗α５β１抗体の存在下または不在下で、ｂＦＧＦを含浸させた成長因
子枯渇基底膜を皮内注射した。３日後のヒト皮膚をヒトＣＤ３１陽性血管の存在
について分析した。機能遮断性α５β１抗体の添加により、上記成長因子によっ
て誘発される血管形成が選択的に遮断され、高倍率視野あたりのＣＤ３１陽性血
管数は９４±４．７％減少した（Ｐ＝０．００６）。

【０１１０】これらの結果は、成長因子に対するヒト血管の血管形成反応にインテグリンα
５β１が機能的な役割を果たすことと、α５β１結合の拮抗剤が、成長因子によ
って刺激されるヒト皮膚での血管形成を減少させうるまたは阻害できることを実
証している。

【０１１１】（実施例ＩＶ） α５β１拮抗剤は腫瘍成長を阻害するこの実施例ではα５β１拮抗剤がＣＡＭモデル系でヒト腫瘍における血管形成
を阻害することを実証する。

【０１１２】１０００万個の腫瘍細胞をＣＡＭの表面に載せ、その細胞を１週間培養するこ
とによって、ヒヨコＣＡＭ腫瘍アッセイを行なった。その結果生じた腫瘍を切除
し、各５０ｍｇの破片に切断した。これらの破片を新たなＣＡＭに載せ、翌日に
２５μｌ中２５μｇの抗α５β１または対照非機能遮断性抗α５β１で局所的に
処置するか、最終血清濃度が２５μＭの環状ペプチドまたは２５μＭのＳＪ７５
４９および２５μＭのスクランブルド対照ペプチドまたは２５μＭの不活性小分
子もしくは２５μｌの食塩水を静脈内注射することによって全身的に処置した（
ニワトリ胚の血液量は約２ｍｌである）。４８時間後に、ＣＡＭを卵から切除し
、腫瘍に入る血管の数を（血管分岐点として）数えた。

【０１１３】データを処置群ごとの平均血管数（±測定の標準誤差）として表した。各処置
群には１実験につき少なくとも１０個の腫瘍が含まれるようにした。代表的な腫
瘍を１０倍の倍率で写真撮影した。腫瘍を卵から切除し、各腫瘍について腫瘍重
量を測定した。データを処置群ごとの平均腫瘍重量（±測定の標準誤差）として
表した。統計分析はスチューデントのｔ検定を使って行なった。

【０１１４】 α５β１発現を欠くＨＴ２９結腸癌細胞を１０日齢胚のＣＡＭで生育した。こ
れらの腫瘍細胞はＶＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＮＦαおよびＩＬ−８を含
むいくつかの血管形成性成長因子を分泌する（Ａｎｚａｎｏら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４９：２８９８−２９０４（１９８９）；Ｖａｒｎｅｒら，前掲，１
９９５；Ｅｌｌｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０５２−１０５
７（１９９８））。潜在的な抗腫瘍効果をインテグリンα５β１拮抗剤の抗脈管
構造効果と区別するために、インテグリンα５β１陰性腫瘍細胞を使用した。機能遮断抗体による処置は腫瘍関連血管数を有意に減少させた（７０±１０％
、ｐ＝０．０２）が、対照抗体による処置では腫瘍血管数は有意に減少しなかっ
た。食塩水処置腫瘍と対照抗体処置腫瘍の間、またはそれらの関連血管の間に、
有意な形態学的または量的相違は観察されなかった。また、機能遮断性抗α５β
１抗体による処置は、腫瘍の後退をもたらした。抗α５β１処置腫瘍は、対照処
置腫瘍より３２％小さかった（ｐ＝０．０２）。

【０１１５】インテグリンα５β１の環状ペプチド阻害剤およびインテグリンα５β１の非
ペプチド小分子阻害剤の静脈内投与もＣＡＭ上の腫瘍の後退をもたらしたのに対
し、対照ペプチドまたは対照非ペプチドで処置した腫瘍のサイズは増加しつづけ
た。ペプチドおよび非ペプチド阻害剤で処置した腫瘍は、対照処置した腫瘍より
もそれぞれ３１％および５１％小さかった（ｐ＝０．００３）。腫瘍細胞は実験
中は常にインテグリンα５β１陰性のままであったことから、上記の抗腫瘍効果
が腫瘍関連血管のターゲッティングに基づくことが示された。

【０１１６】 α５β１^＋Ｈｅｐ３扁平上皮癌細胞での腫瘍血管形成に対するα５β１拮抗
剤の効果も調べた。機能遮断性抗α５β１による腫瘍の処置は腫瘍の後退をもた
らし、腫瘍は対照腫瘍より４５％小さくなった（ｐ＝０．０４６）。食塩水処置
腫瘍と対照抗体処置腫瘍の間に有意な形態学的または量的相違は観察されなかっ
た。

【０１１７】これらの結果は、血管細胞インテグリンα５β１のターゲッティングによって
腫瘍血管形成および腫瘍成長が阻害されることと、インテグリンα５β１の拮抗
剤が腫瘍成長および腫瘍誘発血管形成の強力な阻害剤であることを実証している
。

【０１１８】上記の実施例に関して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱することな
く様々な変更を加えることができると理解すべきである。したがって本発明は上
記請求項によってのみ限定される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、非ペプチド小有機分子ＳＪ７４９の、フィブロネクチンへのα５^＋Ｈ
Ｔ２９腫瘍細胞の接着に対する、阻害効果を示す。α５^＋ＨＴ２９腫瘍細胞は、
α５^＋ｃＤＮＡでＨＴ２９細胞を形質移入することにより産生した。

【図２】図２は、ＳＪ７４９の、絨毛尿膜（ＣＡＭ）の血管分枝点形成に対する用量依
存的阻害効果を示す。血管形成は、ＣＡＭを塩基性繊維芽細胞成長因子で処理す
ることにより刺激した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 27/02 51/00 29/00 １０１Ａ６１Ｐ 27/02 35/00 29/00 １０１ 43/00 １１１ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １１１ 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA01 BA08 BA17 BA23 CA62 MA01 MA52 MA55 MA58 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA331 ZA361 ZA891 ZA961 ZB261 4C085 AA13 AA14 AA26 HH03 HH07 HH09 4C086 AA01 AA02 CB22 GA08 MA01 MA04 MA52 MA55 MA58 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA89 ZA96 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組織における血管形成を低減させまたは阻害する方法であっ
て、前記組織中のα５β１インテグリンを、前記組織中で発現されるリガンドへ
の前記α５β１インテグリンの特異的結合を妨害する薬剤と接触させることによ
って、前記組織における血管形成を低減させまたは阻害することからなる方法。
【請求項２】前記薬剤が、α５β１インテグリンのそのリガンドへの特異
的結合以外には、インテグリンへのリガンドの特異的結合を実質的に妨害しない
請求項１の方法。
【請求項３】前記リガンドがフィブロネクチンである請求項１の方法。
【請求項４】前記組織が眼組織である請求項１の方法。
【請求項５】前記眼組織が網膜、網膜黄斑および角膜からなる群より選択
される請求項４の方法。
【請求項６】前記組織が皮膚である請求項１の方法。
【請求項７】前記組織が滑液膜組織である請求項１の方法。
【請求項８】前記組織が骨である請求項１の方法。
【請求項９】前記組織が新生物である請求項１の方法。
【請求項１０】前記新生物が悪性新生物である請求項９の方法。
【請求項１１】前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項１０の方
法。
【請求項１２】前記悪性新生物が癌腫である請求項１０の方法。
【請求項１３】前記薬剤がペプチドである請求項１の方法。
【請求項１４】前記ペプチドがＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）という
アミノ酸配列である請求項１３の方法。
【請求項１５】前記薬剤が抗α５β１インテグリン抗体または該抗体のα
５β１インテグリン結合性フラグメントである請求項１の方法。
【請求項１６】前記薬剤が非ペプチド有機分子である請求項１の方法。
【請求項１７】前記非ペプチド有機分子が一般構造（Ｓ）−２−フェニル
スルホニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）｝−１−オ
キサ−２−アザスピロ｛４，５｝デカ−２−エニル｝カルボニルアミノ｝プロピ
オン酸を有する複素環である請求項１６の方法。
【請求項１８】前記非ペプチド有機分子が（Ｓ）−２−｛（２，４，６−
トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニ
ル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ
｛４，４｝ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸を含ん
でなる請求項１６の方法。
【請求項１９】前記薬剤が細胞毒に連結される請求項１の方法。
【請求項２０】前記細胞毒が癌化学療法薬である請求項１９の方法。
【請求項２１】組織における血管形成の存在を確認する方法であって、ａ）前記組織を、α５β１インテグリンを特異的に結合する薬剤と接触させる
段階、およびｂ）前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前記薬剤の特異的
結合を検出することによって、前記組織における血管形成の存在を確認する段階
、である方法。
【請求項２２】前記薬剤がペプチドである請求項２１の方法。
【請求項２３】前記ペプチドがＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号１）という
アミノ酸配列である請求項２１の方法。
【請求項２４】前記薬剤が抗α５β１インテグリン抗体または該抗体のα
５β１インテグリン結合性フラグメントである請求項２１の方法。
【請求項２５】前記薬剤が非ペプチド有機分子である請求項２１の方法。
【請求項２６】前記非ペプチド有機分子が一般構造（Ｓ）−２−フェニル
スルホニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）｝−１−オ
キサ−２−アザスピロ｛４，５｝デカ−２−エニル｝カルボニルアミノ｝プロピ
オン酸を有する複素環である請求項２５の方法。
【請求項２７】前記非ペプチド有機分子が（Ｓ）−２−｛（２，４，６−
トリメチルフェニル）スルホニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニ
ル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキシ−２，７−ジアザスピロ
｛４，４｝ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸である
請求項２５の方法。
【請求項２８】前記薬剤が検出可能なラベルをさらに含んでなる請求項２
１の方法。
【請求項２９】前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前
記薬剤の特異的結合を検出する操作が、ａ）α５β１インテグリンに特異的に結合している前記薬剤を、前記薬剤と特
異的に相互作用する試薬と接触させる段階、およびｂ）前記試薬の相互作用を検出することによって、前記組織中の血管に関係す
るα５β１インテグリンへの前記薬剤の特異的結合を検出する段階、である請求項２１の方法。
【請求項３０】前記組織が胚組織および胎盤組織からなる群より選択され
る請求項２１の方法。
【請求項３１】前記組織が肉芽組織である請求項２１の方法。
【請求項３２】前記組織が病理学的状態に関与する請求項２１の方法。
【請求項３３】前記病理学的状態が新生物である請求項３２の方法。
【請求項３４】前記組織が眼組織である請求項３２の方法。
【請求項３５】個体中の組織における血管形成を特徴とする病理学的状態
の診断方法であって、ａ）前記個体から前記組織の試料を採取する段階（ここに前記病理学的状態を
持つ個体では、前記組織は血管形成を示す）、ｂ）前記試料を、α５β１インテグリンを特異的に結合する薬剤と接触させる
段階、および、ｃ）前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前記薬剤の特異的
結合を検出することによって、前記個体中の血管形成を特徴する病理学的状態を
診断する段階、である方法。
【請求項３６】前記病理学的状態が眼に関わる請求項３５の方法。
【請求項３７】前記病理学的状態が新生血管形成による糖尿病性網膜症お
よび黄斑変性症からなる群より選択される請求項３６の方法。
【請求項３８】前記病理学的状態が皮膚に関わる請求項３５の方法。
【請求項３９】前記病理学的状態が血管腫および乾癬からなる群より選択
される請求項３８の方法。
【請求項４０】前記病理学的状態が関節に関わる請求項３５の方法。
【請求項４１】前記病理学的状態が慢性関節リウマチおよび変形性関節症
からなる群より選択される請求項４０の方法。
【請求項４２】前記病理学的状態が新生物に関わる請求項３３の方法。
【請求項４３】前記新生物が悪性新生物である請求項４２の方法。
【請求項４４】前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項４３の方
法。
【請求項４５】前記悪性新生物が癌腫である請求項４３の方法。
【請求項４６】前記癌腫が乳癌、結腸癌、卵巣癌および膵臓癌からなる群
より７選択される請求項４５の方法。
【請求項４７】個体中の組織における血管形成を特徴とする病理学的状態
の診断方法であって、ａ）前記病理学的状態を持つと疑われる個体に、α５β１インテグリンを特異
的に結合する薬剤を投与する段階、およびｂ）前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前記薬剤の特異的
結合を検出することによって、前記個体における血管形成を特徴とする病理学的
状態を診断する段階、である方法。
【請求項４８】前記薬剤が検出可能に標識される請求項４７の方法。
【請求項４９】前記薬剤の特異的結合の検出がｉｎｖｉｖｏイメージン
グ法を用いて行なわれる請求項４８の方法。
【請求項５０】検出可能に標識された薬剤が、放射性核種、常磁性物質お
よびＸ線減衰物質からなる群より選択されるラベルに連結された薬剤である請求
項４８の方法。
【請求項５１】前記ｉｎｖｉｖｏイメージング法が放射性核種イメージ
ング、陽電子放出断層撮影法、コンピュータ体軸断層撮影法および磁気共鳴画像
法からなる群より選択される請求項４９の方法。
【請求項５２】前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前
記薬剤の特異的結合を検出する操作が、ａ）前記個体から前記組織の試料を採取する段階、およびｂ）前記試料における前記試薬の特異的結合を検出する段階、である請求項４８の方法。
【請求項５３】前記組織中の血管に関係するα５β１インテグリンへの前
記薬剤の特異的結合を検出する操作が、ａ）前記個体から前記組織の試料を採取する段階、ｂ）α５β１インテグリンに特異的に結合している前記薬剤を、前記薬剤と特
異的に相互作用する試薬と接触させる段階、およびｃ）前記試薬と前記薬剤の間の相互作用を検出することによって、前記個体中
の血管形成を特徴とする病理学的状態を診断する段階、である請求項４７の方法。
【請求項５４】前記個体がヒトである請求項４７の方法。
【請求項５５】個体中の組織における血管形成を低減させまたは阻害する
方法であって、前記組織中で発現されるリガンドへのα５β１インテグリンの特
異的結合を妨害する薬剤を前記個体に投与することにより、前記個体中の前記組
織における血管形成を低減させまたは阻害することからなる方法。
【請求項５６】前記個体がヒトである請求項５５の方法。
【請求項５７】個体における血管形成に関係する病理学的状態の重症度を
軽減する方法であって、前記病理学的状態に関係する組織中のリガンドへのα５
β１インテグリンの特異的結合を妨害する薬剤を前記個体に投与することによっ
て、前記組織中の血管形成を低減させまたは阻害し、前記病理学的状態の重症度
を軽減することからなる方法。
【請求項５８】前記病理学的状態が新生物である請求項５７の方法。
【請求項５９】前記新生物が悪性新生物である請求項５８の方法。
【請求項６０】前記悪性新生物が転移性悪性新生物である請求項５９の方
法。
【請求項６１】前記悪性新生物が癌腫である請求項５９の方法。
【請求項６２】前記癌腫が乳癌、結腸癌、卵巣癌および膵臓癌からなる群
より選択される請求項６１の方法。
【請求項６３】前記悪性新生物が肉腫、中皮腫、奇形癌、星状細胞腫およ
び膠芽細胞腫からなる群より選択される請求項５９の方法。
【請求項６４】前記個体がヒトである請求項５７の方法。
【請求項６５】前記薬剤が静脈内投与される請求項５７の方法。
【請求項６６】前記薬剤が経口投与される請求項５７の方法。
【請求項６７】前記薬剤が新生物中に投与される請求項５８の方法。
【請求項６８】前記病理学的状態が眼に関係する請求項５７の方法。
【請求項６９】前記病理学的状態が新生血管形成による糖尿病性網膜症お
よび黄斑変性症からなる群より選択される請求項６８の方法。
【請求項７０】前記薬剤が点眼剤の形で投与される請求項６８の方法。
【請求項７１】前記薬剤が静脈内投与される請求項６８の方法。
【請求項７２】前記薬剤が経口投与される請求項６８の方法。
【請求項７３】前記病理学的状態が関節に関係する請求項５７の方法。
【請求項７４】前記薬剤が滑液包内に投与される請求項７３の方法。
【請求項７５】前記薬剤が０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ−体重の用量
で投与される請求項５７の方法。
【請求項７６】組織中のα５β１インテグリン発現に関係する血管形成を
低減させまたは阻害する薬剤を同定する方法であって、ａ）α５β１インテグリン発現に関係する血管形成を示す組織を薬剤と接触さ
せる段階、およびｂ）前記組織における血管形成の低減または阻害を検出することによって、組
織中のα５β１インテグリン発現に関係する血管形成を低減させまたは阻害する
薬剤を同定する段階、である方法。
【請求項７７】前記組織を接触させる操作がｉｎｖｉｖｏで行なわれる
請求項７６の方法。
【請求項７８】前記組織を接触させる操作がｅｘｖｉｖｏで行なわれる
請求項７６の方法。
【請求項７９】前記組織が悪性新生物組織である請求項７６の方法。