JP2006071534A - 長尺体の試料観察に適したプローブ顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明が解決しようとする課題は、基板上に一方向に引きのばされた一本のＤＮＡの試料に対し、端から端までの塩基配列順次読み取りをはじめとして既知のＲＮＡがハイブリダイゼーションした位置を特定できる、高分解能の形状と物性情報を検出する多機能分析装置を提供することにある。
【解決手段】
本発明の顕微鏡システムは、検出系として蛍光顕微鏡と、走査型近接場顕微鏡と、走査型プローブ顕微鏡とを具備し、これらの顕微鏡は切り換え機構に固定され、該機構の切り換え操作によって各顕微鏡が試料の同一箇所を観察できる位置に移動できるようにした。本発明の顕微鏡システムは、多機能走査による走査型プローブ顕微鏡によって一本のＤＮＡの形状及び物性情報を直接検出できる機能を備えるようにした。
【選択図】 図１

Description

本発明は基板上に長く引き伸ばされた長尺体の試料観察に適した走査型プローブ顕微鏡に関し、特に１本のＤＮＡの情報をそのまま読み取ることを可能にする走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）技術に関する。

ＤＮＡ配列解析は、現代において生物学的研究に、医学的診断に極めて重要な技術となっている。ＤＮＡはＡ−Ｔ，Ｇ−Ｃの塩基対に基づいて螺旋状の２本鎖を形成しており、加熱すると２本鎖がほどけて１本鎖ＤＮＡとなる。この１本鎖ＤＮＡを急冷して１本鎖の状態を留め、その１本鎖ＤＮＡに刻まれている情報を順次読みとることがＤＮＡ配列解析の基本となっている。

また、加熱して１本鎖ＤＮＡとなったものを徐々に冷やすともとの対と組み合って２本鎖ＤＮＡに戻ることが知られている。この現象はハイブリダイゼーションと呼ばれ、遺伝子情報を有するリボ核酸（ＲＮＡ）が１本鎖ＤＮＡとの間で対となる配列位置に組み合わされる現象にもこの呼び名が使われる。既に標準配列が既知であるＤＮＡについて着目するＲＮＡが標準の位置と異なるか否かを検査して、医学的または生物学的診断を行うことがなされている。

さて、この様な解析においてＤＮＡ情報を端から順次読みとることが求められるのであるが、１本の長いＤＮＡを端から端まで引き延ばした状態の試料を作成して、そこに刻まれている情報を端から順次読みとる技術は今現在まだ開発されていない。従来のＤＮＡシーケンサでは、染色体を構成する二本鎖のＤＮＡを階層的に制限酵素を用いて特定の長さに切断し、その端部に蛍光体を修飾し、切断された個々のＤＮＡについてその情報を読み取り、端部情報からもとの１本鎖において連続していたＤＮＡを割り出し、階層的切断を再合成するという途方もなく厄介な作業によって１本鎖ＤＮＡの情報を得ていた。大型計算機によってこの作業が行われてきたのであるが、時間が膨大にかかる上、再合成を間違えてしまうことも少なくなかった。

この様な状況の中で、特許文献１が１本鎖のＲＮＤもしくはＤＮＡ、Ａ（アデニン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）、もしくはＵ（ウラシル）もしくはＴ（チミン）の四塩基それぞれのコード配列を直接読み取ることが可能となる遺伝子配列読み取り装置を提供することを目的として提示されている。この技術は、Ａ，Ｃ，ＧもしくはＵもしくはＴ中の特定一塩基を検出するため、走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の金属探針の先端部分にカーボンナノチューブのような有機官能基との結合親和力の強いナノメートルオーダーの接着バインダを介して、金属探針の先端部分に遺伝子情報を持つ塩基を接合させることによって塩基特有の相補性を利用した水素結合によって生じる引力を検出するというものである。

この特許文献１は階層的に切断したＤＮＡに対して塩基配列情報を上記のような構成によって読みとることが出来ると説明されているが、どのようにして試料となるリボ核酸を基板上に走査プローブ顕微鏡の探針（以下簡単のためにプローブと記す。）がトレース可能なように直線的に固定するのか、また、プローブが引きのばされた１本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡを確実にトラッキングしていくための手法については説明がない。

本発明者等は研究の結果、水溶液中において通常は２本鎖の状態にあるＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとし、既知のＲＮＡ、ＤＮＡもしくはポリペプチド核酸（ＰＮＡ）とハイブリダイゼーションし、蛍光や金コロイドなどのラベル付けをした後、そのＤＮＡ水溶液の気液界面をよぎって基板を一旦沈めてから引き上げるという手法によって、長いＤＮＡを一方向に引きのばした状態で固定する試料の前処理技術の目途が立ったことを受け、引きのばされた１本のＤＮＡについて多種類の情報を検出する総合装置を開発することに取り組んだ。
特開２００２−３５０４３５号公報 「遺伝子配列の読み取り装置」 平成１４年１２月４日公開

本発明が解決しようとする課題は、長尺体の試料を対象としその長手方向画像を連続情報として検出可能な走査型プローブ顕微鏡を提供すること、特に、基板上に一方向に引きのばされた１本のＤＮＡ試料に対し、端から端までの塩基配列順次読み取りをはじめとして既知のＲＮＡがハイブリダイゼーションした位置を特定できる、高分解能の形状と物性情報を検出する多機能分析装置を提供することにある。

本発明の他の課題は、異なる顕微鏡に切り換えたときそれぞれの画像上で位置対応が出来る位置合わせ手法を提示することにある。

本発明の他の課題は、高分解能の形状と物性情報を検出するプローブが１本のＤＮＡの情報をその非直線形状に拘わらず、確実に検出することが出来る手法を提示することにある。

本発明の他の課題は、プローブの走査範囲毎のＤＮＡ情報を繋ぎ合わせて１本のＤＮＡ情報を得るための簡単で確実な手法を提示することにある。

また、本発明の更なる課題は、液を溜めることができる試料台を採用した装置において、液中の試料に対しプローブが走査するに際し支障のない手法を提示することにある。

本発明の顕微鏡システムは、検出系として蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）と、走査型近接場顕微鏡（ＳＮＯＭ）と、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）とを具備し、これらの顕微鏡は切り換え機構に固定され、該機構の切り換え操作によって各顕微鏡が試料の同一箇所を観察できる位置に移動できるようにした。なお、蛍光顕微鏡は試料面に励起光を照射し試料表面での蛍光を検出する光学顕微鏡であり、走査型近接場顕微鏡は光学路となるファイバープローブを試料面にレーザ波長以下の距離まで近接させて走査し、マッピングによって光学像を合成する顕微鏡である。

本発明の顕微鏡システムは、多機能走査による走査型プローブ顕微鏡によって一本のＤＮＡの形状及び物性情報を直接検出できる機能を備えるようにした。

本発明の顕微鏡システムは、各顕微鏡を切り換えて標準パターン試料を用いた画像を得て、それぞれの顕微鏡画像における位置の対応関係を事前に検出して記憶しておき、切り替え時にＸＹステージで各プローブ間の誤差合わせをする機能を備えるようにした。

本発明の遺伝子読み取り装置は、長い曲がったＤＮＡを自動で測定するためにプローブ走査位置を順次変更する手法を採用した。具体的にはまずプローブをＤＮＡを横切る方向（Ｙライン）に走査し、Ｙライン上でのＤＮＡの位置を検出し記録すると共に、次にＸ方向に１単位移動して、前回測定のＤＮＡ位置がＹライン上の中心になるようにＹラインの始点終点位置を管理し、次の走査を行い、以下これを繰り返す手法。

また、Ｙラインに大きく走査し、ＤＮＡを横切る位置（始点）を検出記録した後、Ｘ方向に所定距離だけ飛び越え、再びＹラインに大きく走査し、Ｙライン上でのＤＮＡを横切る位置（終点）を検出記録する。この間のＤＮＡを疑似直線とみなし、始点と終点を直線で結びこの線に平行にＤＮＡの曲がり分を考慮してＸ方向の走査本数決めてＸ方向に走査を行う手法。

或いは常に周りに比較して高さが最高位置になるように探針位置を制御し、その最高位置を繋ぎながら自動追尾走査するトラッキング方式の手法。

本発明の顕微鏡システム、試料ステージをＸ方向にコマ送りしながらＳＰＭ画像を得るものとし、隣接画像間にＤＮＡの重なり合う部分が出るようにコマ送りし、当該部分を重なり合わせて長い１本のＤＮＡ情報を順次繋ぐ手法を採用した。

本発明の顕微鏡システムは、水中の試料を対象とする場合走査により水面の高さが変化してもカンチレバーの変位を検出する光学系の光軸が変わらないように光てこの光軸は、ガラスなどの固定された材質のなかを通過するようにした。またＳＰＭのスキャナーを高速で走査しても液面が波立たないないような波消しをプローブ部分に設けるようにした。

本発明の顕微鏡システムは、検出系としてＦＯＭとＳＮＯＭとＳＰＭとを具備し、これらの顕微鏡は切り換え機構に固定され、該機構の切り換え操作によって各顕微鏡が試料の同一箇所を観察できる位置に移動できるようにしたものであるから、ＦＯＭとＳＮＯＭとＳＰＭとを順次切り換えてまずＦＯＭによってＤＮＡの位置を確認し、次いでＳＮＯＭによってそのＤＮＡにおいてＳＰＭのプローブ位置を運ぶべき位置を割り出し、ＳＰＭによるＤＮＡの高精度形状検出や物性情報検出をスムーズに開始することが出来る。

また、本発明の顕微鏡システムは、多機能走査による走査型プローブ顕微鏡によって一本のＤＮＡの形状及び物性情報を直接検出できる機能を備えるようにしたものであるから、化学力顕微鏡としてのプローブで機能させれば一本の長いＤＮＡの塩基配列を端から順次読みとることが出来るし、Topo像による形状測定、位相像によるＤＮＡ形状測定、ＰＦＭ(Pulse Force Mode)によるＤＮＡの吸着力測定、ＫＦＭ(Kelvin prove Force Mode)によるＤＮＡの電位測定が可能となる。

更に、本発明の顕微鏡システムは、各顕微鏡を切り換えて標準パターン試料を用いた画像を得て、それぞれの顕微鏡画像における位置の対応関係を事前に検出して記憶しておき、切り替え時にＸＹステージで各プローブ間の誤差合わせをする機能を備えるようにしたので、切り換え機構に機械的な狂いがあってもＸＹステージの制御によって位置ズレを解消することが出来る。

本発明の顕微鏡システムは、長い曲がったＤＮＡを自動追尾方式で測定するためにプローブ走査位置を確認しつつ順次変更する手法を採用したり、常にＤＮＡ上を進むようにトラッキング機能を備えて走査するようにしたので、プローブが長い一本の非直線形状であるＤＮＡを確実に捉えて所望の検出をすることが出来る。

また、本発明の顕微鏡システムは、試料ステージをＸ方向にコマ送りしながらＳＰＭ画像を得るものとし、隣接画像間にＤＮＡの重なり合う部分が出るようにコマ送りし、当該部分を重なり合わせて長い１本のＤＮＡ情報を順次繋ぐ手法を採用したので、ＳＰＭの走査領域を遙かに越えた長さを持つＤＮＡを、従来のように切断してばらしてしまうことなく、端から順次画像取得し重なり部分を整合することにより、容易に且つ確実に長い１本のＤＮＡ情報を合成することが出来る。

また、本発明の顕微鏡システムは、水中の試料を対象とする場合走査により水面の高さが変化してもカンチレバーの変位を検出する光学系の光軸が変わらないように光てこの光軸は、ガラスなどの固定された材質のなかを通過するようにし、またＳＰＭのスキャナーを高速で走査しても液面が波立たないないような波消しをプローブ部分に設けるようにしたので、試料を液中に置いた状態でも液の存在による悪影響を除き、大気中と同様に試験検査を行うことが出来る。

本発明者等は前述したように、従来のＤＮＡシーケンサでは、染色体を構成する二本鎖のＤＮＡを小さな断片に切断し、切断された個々のＤＮＡについてその情報を読み取り、端部情報からもとの１本鎖において連続していたＤＮＡを割り出し、切断した小さな断片を再合成するという途方もなく厄介な作業によって１本鎖ＤＮＡの情報を得ていたことに鑑み、ＤＮＡを細切れにすることなく、基本的には端から端まで順次計測できる検査手法並びにそれを実行できる装置を提供する研究に取り組んできた。そのための前処理として基板上に一本の長いＤＮＡを出来るだけ直線状に固定することの研究を重ねてきた。

さて、基板上に一方向に引きのばされた１本のＤＮＡの試料の提供に目途が立ったことを受け、本発明はその試料であるＤＮＡ全体について試験検査を行う装置を提供するものである。本発明の基本思想は微細な幅の長い紐状体であるＤＮＡ上に直接プローブ先端部を接触又は接近させて、ＤＮＡの各種物性情報を検出し、プローブ顕微鏡機能を用いて画像化するものである。

まず、本発明に用いる試料基板について説明する。基板として求められる要件、平坦度が良くＤＮＡの密着性が良く真っ直ぐ伸びるような基板材質として、ガラス、シリコンウエハー、金（単結晶）、マイカ、ＨＯＰＧ（高配向性グラファイト）の劈開面を用いる。基板の表面処理としてシランカップリング剤、チオール（メルカブタン）、ジスルフィド（二硫化物）などを使用した化学修飾を行うが、これはＤＮＡを基板上に付着させるためである。ＤＮＡは負に帯電していることを利用し正電荷を表面に導入する試薬を使用するものである。

次にＤＮＡ試料の作製についてであるが、まず１本鎖ＤＮＡに着目する遺伝子情報のＲＮＡをハイブリダイゼーションした試料の作成について説明する。染色体からＤＮＡをほぐして１本（２本鎖ＤＮＡ）を取り出す。２本鎖ＤＮＡの温度を水溶液中で上昇すると２本鎖が融解され１本鎖ＤＮＡとなる。この状態にして、ハイブリダイゼーションを起こさせるＲＮＡプローブ（一般にはＤＮＡまたはＰＮＡ（ポリペプチド））を特定箇所に導入すると、この導入されたＲＮＡが１本鎖ＤＮＡの相対配列部分に付着する所謂ハイブリダイゼーションが起こる。このＲＮＡがハイブリダイゼーションした１本鎖ＤＮＡを試料としてピックアップするのであるが、その識別として蛍光体や金コロイドなどのＤＮＡのラベル付けを行う。この状態で基板上に固定を行うのであるが、長い１本のＤＮＡを出来る限り直線状にして固定することが後の検査を容易にするために望ましい。従来の固定方法は、液滴（水溶液滴）の蒸発時の基板表面での境界面の収縮時の表面張力の作用によりＤＮＡが放射状に伸ばされる現象を利用していたが、この引き伸ばし方法は、本発明が求める長いＤＮＡを引きのばし固定形態には合わない。本発明者等は様々な試みの中でさらに長くＤＮＡを伸ばすためには、ＤＮＡ水溶液の気液界面をよぎって、基板を沈めた後引き上げると水の表面張力によりＤＮＡが伸直されるという知見を得ることができた。この手法により１本の長く伸直されたＤＮＡが基板上に固定される。

本発明の基本構成を図１に示し、Ａは斜視図であり、Ｂは平面図として示してある。１は装置の基台となる定盤で四隅には脚２が取り付けられており、水平調整機構と除振機構を備えたものであることが望ましい。この定盤１には試料台３が載置されたＸＹ方向二次元の移動機能を備えた試料ステージ４と、試料台３を跨ぐようにコの字状のアーム５が取り付けられている。このアーム５にはヘッド切り換え機構６が摺動可能に取り付けられ、該ヘッド切り換え機構６には光学顕微鏡として例えば蛍光顕微鏡（ＦＯＭ）７、走査型近接場顕微鏡（ＳＮＯＭ）８、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）９が取り付けられ本装置の検出系を構成している。図示した例ではアーム５は試料ステージ４の長手方向と直交するように配置され、ＦＯＭ７、ＳＮＯＭ８、ＳＰＭ９がその方向に摺動して観察位置に切り換えられるようになっているが、要は切り換えられる顕微鏡が試料台３上の同一位置を中心に捉えられる配置構造となっていればよい。従って、アーム５は試料ステージ４の長手方向と直交するように配置されることは必須ではなく、交わる方向であればよいし、コの字形状ではなくリボルバー方式の回転摺動形態であっても良い。また、前記アーム５には顕微鏡取付側と反対側の位置に斜入射レーザー機構１０が取り付けられている。

ＦＯＭ７とＳＮＯＭ８は最終的なＤＮＡ検出手段であるＳＰＭ９の補助的観察手段として本装置に組み込まれている。これら３つの顕微鏡は、それぞれ切り換え機構６を摺動させることにより、試料の同一箇所を観察できる位置に移動できる。しかし、本装置の試料はＤＮＡというナノオーダーの微細構造物であるため、機械構造上完璧な位置整合を実現することは難しい。そこで、本発明では図２に示すような標準パターン試料１１（例えば格子模様のようなパターン）を用い、ＦＯＭ７とＳＮＯＭ８そしてＳＰＭ９による画像を取得し、画像における中心位置のズレを計測する。例えば中央に配置された光学顕微鏡７の光学軸に対して設計上ＳＰＭ９の配置位置をｘ１とし、ＳＮＯＭ８の配置位置をｘ２とた場合に、実際にヘッド切り換え機構６で切り換えたときには取付誤差等が伴いその中心位置についてΔｘ１とΔｘ２のズレが生じるが、このズレ分を標準パターン試料１１と顕微鏡測距機能によって読み取り把握するものである。このズレ分は図示していない制御部（コンピュータ）の記憶部にデータとして蓄積され、切り換え動作がなされる際に試料ステージ４のＸＹ二次元移動機構を制御してこのズレ分の位置補正を行う。この機構によって、本発明の装置は切り換えられる顕微鏡の画像の中心は常に一致するように機能させることができる。

次に試料台について説明する。試料は試験中は温度分布がなく、一定で安定した状態であることが求められるため、試料台全体を所定温度に制御することが重要となる。この試料台の型式としては、大気中用、液中用があり、それぞれ反射型、透過型がある。

まず、大気中用の試料台について説明する。試料台３は台本体とホルダーとから構成され、これらは例えばインバー、低膨張ガラスなど線膨張率の低い材質のものを使用する。透過型の台本体は図３のＡに示すように下からの観察が可能なように中央部分が空いた長方形枠体3aのもの、ホルダー3bも下からの観察が可能なように中央部分が空いたものを用い、試料基板は長方形枠体3aの穴空き部分に嵌め込む等の適宜の手段で固定される。この透過型は一般には下方から光を照射しその透過像を観察するために用いられる。試料は温度膨張が無いことが望ましく基板と試料台には低いだけでなく膨張率に差が無い材質のものが用いられる。また、反射型は図３のＢに示すように、台本体3a' には平板形状のものとホルダー3bとしては穴の空いたものである必要はないが透過型と同じであっても良い。台本体だけ透過用と反射用を準備すれば足りホルダーは兼用で問題はない。これらはたとえばインバー、低膨張ガラスなど線膨張率の低い材質のものを使用する。試料基板は裏面を貼着するなど適宜の方法で固定される。

台本体は透過型のもの3aも反射型のもの3a' も長手方向断面がコの字状のホルダー3bに保持される。図３のＣに部分拡大平面図として図示されるように、台本体3a(3a') の一端はホルダー3bの一方の端部に当接され、他端はホルダー3bの一方の端部に固定されたばね3cを介した保持板3dによって押圧保持される。保持板3dの材質は試料台３と同様線膨張率の低い材質のもので、かつ試料基板と膨張率に差のないものを使用する。この他端側の変位は温度変動に伴う線膨張であるから、この部分にキャパシタンスセンサーなどの変位センサー１２を配置して試料台３の温度安定性をモニタする。試料基板、台本体3a(3a') およびホルダー3bは熱膨張率の小さく差のないものを用いているが、温度分布が生じるとこの部分に変位差を生じる。このセンサーによって伸びが止まった状態あるいは、許容値以下になったら温度が均一かつ安定したものと判断して測定を開始する。さらに測定中の、時間に対する試料台の伸びをモニタすることができ、その検出値を試料台の伸びによる測定誤差の補正に使用する。なお、図に示した調整ネジ12a はセンサーの設置位置を調整するものであり、センサーとして最も感度の良い位置に調整する。

次に液中用の試料台について説明する。液中用の試料台３は試料槽3eとホルダー3bとから構成され、前記大気中用のものと同様に反射型、透過型がある。試料台３の素材としては先のものと同様にインバー、低膨張ガラスなど線膨張率の低い材質のものを使用する。透過型の試料槽3eは図４のＡに斜視図で示すように液をためることができる長方形の器形態で、下からの観察が可能なように底面が透明となっているのものを用い、前述した穴あきのホルダー3bに保持される。反射型も液をためることができる長方形の器形態で、底面が不透明となっている試料槽3e’を用い、これをホルダー3bに固定することは同様で、このホルダー3bは穴あきのものを兼用して差し支えない。液中に試料を入れる場合、図４のＢとＣに示すように液の蒸発防止のため薄いプラスチックフィルムＦで液面を覆い、観察領域となるＤＮＡ試料の上部のみに穴をあけてＳＰＭ９の検出器をいれて検査する。検出器１４にはプローブのカンチレバー１３の変位を検出する光テコ方式のものを用いる。プローブ走査により水面の高さが変化しても検出動作に影響がでないようにガラスなどの透明体からなる光伝導部材１５を液面下から大気中まで延在させ、入反射光の安定光路を確保する。またＳＰＭ９のスキャナーを高速で走査しても液面が波立たないないように船の舳先のような波消し１６を設ける。

検査中に試料の温度を所定温度に安定させるため、ホルダー3bにはヒーター等の加熱手段（図示していない）を設け、その加熱手段を用いて液の温度制御を行う。

次に、本発明装置の位置あわせ機能について説明する。前述したように本発明の装置にはＳＰＭを用いたＤＮＡの各種測定に先んじ、プローブをＤＮＡの所望箇所に位置合わせをするための低分解能観測機器が備えられている。すなわち、図１に示した例ではその観測位置合わせ機器として、蛍光顕微鏡７を中心に左右にＳＮＯＭ８とＳＰＭ９の検出部が切り換え機構６に取り付けられており、ＤＮＡ試料の同一の部位を観察できるようになっている。

まずステップ１として、ＦＯＭ７でＤＮＡの所望箇所を探す。今、試料を一本鎖のＤＮＡにハイビリダイゼーションによってＲＮＡプローブが結合されたものであるとする。ＲＮＡプローブには蛍光体のラベルが付けられているので、一本鎖のＤＮＡにこのＲＮＡプローブが結合された場所を選択的に蛍光観察して見つけだす。見つけたならばその位置がＦＯＭの観察領域の中心点に来るように試料ステージ４のＸＹ二次元移動機構を操作する。位置合わせが出来たならステップ２としてレンズ交換や高感度ＣＣＤカメラ等の取り付けを行い暗視野レーザー散乱モードの観察を行うこともできる。その場合図５に示すように斜入射レーザー機構１０からレーザービームを照射して暗視野レーザー散乱モードの観察を行い、蛍光染色しにくい一本鎖のＤＮＡの位置などを把握する。一本鎖のＤＮＡにハイブリダイゼーションしてＲＮＡプローブが結合された場所に金コロイドなどの微粒子をタグとして取り付ける。この微粒子に、レーザーを斜め照射し、微粒子からの散乱光を前記蛍光顕微鏡の対物レンズで集光し、高感度ＣＣＤカメラでスポット位置を確認する。確認位置を顕微鏡観察領域の中心位置から外れていたならば試料ステージ４のＸＹ二次元移動機構を操作して位置合わせをする。ここでヘッド切り換え機構６を操作してＳＮＯＭ８あるいはＳＰＭ９に切り換えるが、その際顕微鏡の取付誤差に伴う位置ズレは前述した機構によって自動補正される。

ステップ３：走査型近接場顕微鏡（ＳＮＯＭ）８は前記蛍光顕微鏡７あるいは暗視野レーザー散乱装置で同定した観察部位を、微細な開口面積の光学プローブ走査による合成光学像によってより高分解能で観察する装置で、光学像の分解能は、50ｎｍ程度のものである。また蛍光像などの測定も可能である。ＦＯＭ７よりも分解能の高いＳＮＯＭ８によってＳＰＭのプローブ先端を持っていくＤＮＡの特定箇所のより精度の良い位置合わせを行うことができる。その特定箇所をＳＮＯＭ８による観察画像の中心に位置するように試料ステージ４のＸＹ二次元移動機構を操作する。ここでヘッド切り換え機構６を操作してＳＰＭ９に切り換える。

ステップ４でいよいよＳＰＭ９によるＤＮＡの高分解能観察が行われる。前記位置あわせ用および低分解能観測機器で得られた光学情報をもとに、ＳＰＭ探針の位置合わせを行い、ＳＰＭにて高分解能の形状、物性情報を得る。ＳＰＭには各種の物理量を検出するものや塩基配列を読みとるものまであり、本発明ではこれらの検出量を得てＤＮＡの総合的な解析が可能となる。各種検査法によって得られる検出量についてその概要を説明する。

ＳＰＭにより検出される情報として、高分解能の形状情報を得るものとしてTopo像によるＤＮＡの形状測定が上げられる。この検出法によれば０．３４ｎｍのベースペアを見分けることができる。ただし、この検出法には基板の凹凸情報がベースペアの情報に重なるという欠点がある。

位相像によるＤＮＡの測定でも０．３４ｎｍのベースペアを見分けられる。この検出法は基板の凹凸の影響を受けにくいが、ハイブリダイゼーションによりサンプルの硬さが異なることによる影響が出る。

ＰＦＭ(Pulse Force Mode)像によるＤＮＡの付着力測定により、ＤＮＡの付着力分布を測定する。ＰＦＭは、プローブを試料面に接触させた後引き上げて、試料面と探針先端部間に出来る水膜が切れる位置を検出量とする検査法である。ＤＮＡはハイブリダイゼーションすると付着力が増すという現象があり、ハイブリダイゼーションした部分は吸着力が周辺と変わる。プローブの素材をＤＮＡ、ＰＮＡ（ポリペプチド）、ＲＮＡあるいは蛋白とすることにより、この検出法の検査が実施できる。

ＫＦＭ(Kelvin prove Force Mode) によるＤＮＡの電位測定によれば、ＤＮＡはハイブリダイゼーションするとマイナスの電荷が他の場所より増加するという現象がみられることから、電位像でハイブリダイゼーションしたところを見つけることができる。このＫＦＭによる測定は、測定対象となる試料と導電性カンチレバー探針間に交流電圧を印加すると、この交流印加電圧により、導電性カンチレバー探針と試料間には静電力が作用するが、この静電力を検出しマッピング画像化するものである。

化学力顕微鏡によるＤＮＡの測定によってＤＮＡのハイブリダイゼーション箇所の検出することができる。ＰＮＡ（ポリペプチド）は電気的に中性であるのでＰＮＡの着いた箇所は、ＤＮＡの−電荷が希釈される。この部分を、＋あるいは−の電荷を持つ探針でサーチすればその位置を見つけることが出来るし、ＲＮＡなどが付いたものとの判別もできる。たとえば金コートした探針の先にアミノ基を持ったチオールで化学修飾すれば＋末端にすることができるした、カルボキシル基またはスルホン基を持ったチオールで化学修飾すれば−末端にすることができる。また中性の水溶液中では、アルミナ探針は＋に帯電しており、シリカ探針は、−に帯電しているので化学修飾なしで上記箇所を選別することができる。

１本鎖ＤＮＡがハイブリダイデーションによって２本鎖となったところにＲＮＡが付着して３本鎖形態になったところは、負電荷がさらに増加するため、この様な部分の検出もこの検査法によって行うことが出来る。

走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）でＤＮＡを検査すれば、４種類の塩基配列を直接読みとることが可能である。金属基板（金）の時ＳＴＭは高分解能観察手段となる。ただし読み取り速度、情報量の処理が必要となる。

次に、ＳＰＭのプローブを走査させるスキャナーについて説明する。このスキャナーはＳＰＭの探針だけでなく前記ＳＮＯＭのプローブ（光ファイバ）にも適用できるピエゾタイプの微動アクチュエーターである。本発明の対象とする試料は一本の長いＤＮＡであるから、プローブの走査領域は幅方向には狭領域であるが長手方向には桁違いに広領域となる。すなわち、Ｘスキャナーの走査域を50×1000μｍとし、Ｙスキャナーの走査域を１×20μｍと長方形走査とする。Ｚスキャナーの領域は、１〜５μｍの傾き調整走査スキャナーと、高分解能走査域１μｍの高分解能スキャナの２段構成とする。スキャナー全体は、液中での駆動走査が必要となるため、防水コートして水中の測定に耐える構成とする。

測定に際してはＤＮＡをなるべくきずつけないようなソフトな走査方法を採ることが求められる。ソフトな走査方法として本発明はＳＩＳモードを使用する。ＳＩＳ(Sampling Intelligent Scan) モードとは、試料に与えるダメージが少なく、試料面に吸着層があっても安定に動作する測定モードです。具体的には、カンチレバーを共振点付近で微小振動（振幅２０ｎｍ以下）させ、カンチレバー全体は、ピクセル（サンプリング点）ごとに上下する。カンチレバーが試料面に近づくと前記微少振幅が減衰し、減衰量が所定の量に達したら、カンチレバーの試料への近接をやめ、このときのＺの値を試料の表面高さとして記録する。高さ計測後カンチレバーを引き上げ次のピクセル（サンプリング点）に移動し、同様の動作を繰り返す。

カンチレバーが常時試料を叩いておらず、振動振幅が小さいため試料に与えるダメージは小さくなり、また吸着層によりカンチレバーがトラップされても、カンチレバー全体が引き上げられるため測定が中断せず安定に動作する。

微細領域に刻まれたＤＮＡ配列情報やハイブリダイゼーションされた位置を測定する本発明の装置において、膨大な情報量を検出するために高速走査を実現することが望まれる。そこで本発明の高速走査方法について説明する。基板上に長く伸ばされたＤＮＡを効率的測定するための対象物へのアプローチと走査方法の工夫が必要であり、以下にいくつかの具体例を示す。

１．対象とするＤＮＡの標準マップが既知であって、着目するＲＮＡがどの位置にハイブリダイゼーションしたか、その位置が標準のマップと異なっているか否かを検出するケースを想定する。まず、光学的に標識確認、標識の周りを順次分解能を上げて測定する。ハイブリダイゼーションしたところは、ＤＮＡが太くなっているので、ＡＦＭなどの形状測定でその位置をサーチする。そして標識と標識の周りを各種ＳＰＭで精密測定する。また、その位置が先端からどれだけの所であるかを測長する。

２．対象とするＤＮＡの標準マップが未知であって、そのマップを作成するための検査を想定する。この場合は１本の長いＤＮＡを先端からの精密測定（１本読み取り）することが必要である。また、系が太くなっているハイブリダイゼーションしたところの検出は同様に高分解トポあるいは位相像からベースペアを読み取っていく。

まず、本発明ではＤＮＡの測定に際して従来のようにバラバラに分割することをせず１本の長いＤＮＡを基板上にほぼ直線状に固定して検査する点に大きな特徴がある。とはいえ、１本の長いＤＮＡを端から端まで一気に走査をすることはＳＰＭの画郭では不足である。従って１画面を高分解能で走査し、画像の一部をダブらせてステージで走査する手法を採る。この場合画像の切れ目は、標識となるマーカーを両方のＳＰＭ画面で測定し、画像を重ね合わせるようにする。試料ステージ４の走査でコマ送りする場合ステージ精度は重要であり、１軸（Ｘ軸）には、レーザー干渉、又はリニアスケールを取り付けるようにする。カンチレバーは、高速化のためアレー化したものを使うことも有効である。

試料台のＤＮＡは直線状に固定されているとはいえ、Ｘスキャンによって完全にＤＮＡ上をプローブ走査することは不可能である。非直線状のＤＮＡを自動追尾して検出漏れのない走査を実現しなければならない。そのようなプローブ走査を具体的実現する第１の方法を図６に示す。Ａに示すように長い曲がったＤＮＡを横切る方向に幅ｌ_０ の短いＹ走査を行い、ＤＮＡの位置を検出する。検出したＤＮＡの位置がＸ方向にワンステップｘ０進めた次のＹ走査では幅ｌ_０ のＹ走査の中心になるように始点と終点位置を変更して走査領域をシフトさせて行う。その際の検出位置をＸ方向にワンステップｘ０進めた次のＹ走査における中心となるように始点と終点位置を変更して走査領域をシフトさせる。以後順次同様に走査することにより、長い曲がったＤＮＡを確実に横切るように走査する方法である。Ａに図示した例は極端に曲がった試料について説明したので変化が大きく出ているが、本発明ではほぼ直線状に基板に固定されたＤＮＡを対象としているのでこの走査法では図のＢに示されるように画郭のほぼ中央にＤＮＡを捉えることができる。この走査法でＳＰＭを走査して形状画像をはじめ各種物性の情報画像を直接得ても良いが、この走査法によりＳＮＯＭ等を用いてまずＤＮＡの位置検出を行い（サーチモード）、その位置情報に基づいてＳＰＭプローブの走査制御を行いながらＤＮＡ情報の検出する（検出モード）２段階方式の走査をすることが出来る。ＤＮＡの形状検出には前者の方法が適しており、ＤＮＡの塩基配列検出や端部等特定位置からの長さ寸法を得る検出などには後者の走査法が適している。ＳＰＭによって各種物性の検出を行う場合はまず前者の走査法でＤＮＡ形状を検出し、その正確な形状情報に基づいてプローブのトラッキング制御を行い塩基配列等の検出を行うのが効率的である。

第２の走査法はＤＮＡを単位長さ毎に区分してその区分領域でのＤＮＡの方向をまず判定し、その方向に平行した複数ラインの走査を実行するものである。図７に示すようにＸ方向にｌ_１ 間隔でＤＮＡを横切るように第１回のＹ走査(１)を行いそのＸ位置におけるＤＮＡの位置であるＹ値を検出する。次にＸ方向にｌ_１ だけ離れた位置で第２のＹ走査（２）を行いそのＸ位置におけるＤＮＡの位置であるＹ値を検出する。検出した２つの位置情報ｙ１，ｙ２からこの区分領域でのＤＮＡの方向を判定する。間隔値ｌ_１ はその区分ではほぼ直線と見なせる値として設定する。ＤＮＡはほぼ直線形態で基板に固定されているのであるが、当然に曲がり成分を含んでおり、この検出方向に完全一致してはいないので、ＤＮＡの幅とこの曲がり分を考慮して検出方向に平行した複数ラインの走査(３)(４)…を実行する。この走査法により、ＤＮＡの存在をＳＰＭ画像領域内に完璧に捉えることが出来る。

次に示す３つの走査法はトラキング方式で、自動追尾走査させるものである。図８のＡに示す第３の走査法はＤＮＡを検出した後、所定長さ ｌ_０ 基板検出が続いたならばＵターンして次ラインの走査に入る走査手法である。すなわち、ＤＮＡを横切るようにＹ走査を行いＤＮＡを検出した後、基板検出が所定走査分続いたならばＤＮＡ部分を超えたものと判断しＹ走査を終了すると共に、Ｘ方向に１ステップ ｘ_０ 進ませて次にＹ走査を逆方向から実施する。同じくしＤＮＡを検出した後、基板検出が所定分 ｌ_０続いたならばＤＮＡ部分を超えたものと判断しＹ走査を終了すると共に、Ｘ方向に１ステップ ｘ_０ 進ませて今度はＹ走査を正方向から実施する。要するにＤＮＡの検出が出来たなら、走査を反転させ、ジグザグ方式によってＤＮＡ上を自動追尾させる手法である。この走査法はＤＮＡの形状測定を行うと共に、他のプローブで各種物性検出をその後に行う際のプローブ走査制御信号として利用すると効果的である。

次に示す第４の走査法は探針が常に周りに比較して高さが最高位置になるように探針位置を制御し、その最高位置を繋ぎながら自動走査する手法である。これにもサーチモードと走査モードの２段階がある。この走査方式は、図８のＢに示すように、ある点でＤＮＡを横切るようにＹ走査を行ない形状測定で最高点を見つける。この最高点というのは試料がＤＮＡであるから、横切った経路の最高点というのはＤＮＡの中心部とはいえなくともＤＮＡの存在する位置であることは確かである。この最高点から、所定数の方向例えば８方向にΔｄだけ微小移動させ、その内高さの変化の一番少ない方向（傾きが最少）へ所定量ｄだけ移動させる。この点を中心とするＹライン走査を行ないまたＤＮＡの最高点を見つける。再びこの点を中心として所定数の方向に微小移動し高さの変化の一番少ない方向へ所定量ｄだけ移動させる。以下繰り返し。常にＤＮＡの最高点付近を探針が走査できる。以上がサーチモードであり、このＤＮＡの位置情報を記憶蓄積して検出モードの際の走査を制御する。なお、所定数の方向は全方位均一分布とする必要はなく、前回の検出方向を中心に所定角度内に限定して数を減らしたり、角度幅を狭めるのが効率的である。

第５の走査法も探針が常に周りに比較して高さが最高位置になるように探針位置を制御する完全トラキング走査方式で、図９に模式的に示す。ある点でＤＮＡを横切るようにＹ走査を行ないその際の最高点を見つけ出す。次にこの最高点を中心にしてある半径ｒの円を描くようにプローブを走査させ、その円走査においてＤＮＡを横切る最高点の位置方向を検出する。試料の直線性に対応してＤＮＡを直線とみなせるｒ値を設定すれば中心点と円走査におけるその最高点とを結ぶ線上にＤＮＡが存在することになる。そこで、この方向にプローブを進める。この走査法によればＤＮＡの位置が基板上で寸法ｒの折れ線情報として把握されることになる。以上がサーチモードであるが、このＤＮＡの位置情報を記憶蓄積して検出モードの際の走査を制御する。

第６の走査法は一般制御技術において山登り制御と呼ばれている手法の応用である。ある点でＤＮＡを横切るようにＹ走査を行ないＺ値を検出する。この最初の動作は先の最高点を見つけ出すのと同様であるが、本走査法では最高点を検出した後減少傾向を検知したならばＹ走査を逆転させる。すると探針はまた最高位置に戻るがこの点を越えるとまた減少傾向を検出する。その時点で又Ｙ走査を逆転させると最初の動作に戻り、以後これを繰り返すことになる。すなわち、あるＸ位置に留めたままこのＹ走査を行えば、最高点を行ったり来たりの振動動作を行うことになるが、Ｘ方向への微小ステップを加えて行えば、探針はＤＮＡの最高高さ部分の上をＹ方向に振動子ながら自動追尾することになる。結果的にこの探針の追尾軌跡からＤＮＡの位置を検出し把握することが出来る。以上がサーチモードとなり、このＤＮＡの位置情報を記憶蓄積して検出モードの際の走査を制御すればよい。

ＤＮＡのような極めて細長いサンプルを測定する場合、顕微鏡画像において長手方向のピクセル数を多くし、短手方向のライン数を少なくした変形の画郭を作成することとなり、従来のＳＰＭの走査態様を大幅に変える必要がある。このような変形画郭においては長手方向の傾きが問題となってくる。ここで本発明の傾き補正走査について説明する。

ＤＮＡなどの高さが２ｎｍ程度と低くて数十ｃｍにおよぶ長さの試料を測定する場合、まず試料台の傾きを補正し、補正後、ダイナミックレンジの狭いすなわち、Ｚ分解能の高いＺスキャナーで測定する。しかしメカ的手法による補正には限界があるため、本発明ではこの目的に対応させるため試料台に傾き補正用のピエゾを備えるものとした。試料測定用のＺ方向ピエゾを用いてこの傾きに対応させることも可能であるが、試料測定用のピエゾのタイナミックレンジをあげ高分解能でＤＮＡの高さを測定するため、試料台に傾き補正用のピエゾを備えるようにしたのである。最初に測定画郭の４辺の輪郭に沿ってを高さを測定する。このとき試料測定用のＺ方向ピエゾのサーボ系は固定し、傾き補正用のピエゾのサーボ系のみアクティブとしておく。この状態で４辺の高さ測定を行い、この試料面の傾きが検出されれば傾き補正用のピエゾのサーボ系が作動し検出した測定位置の面傾きによる高さズレを、前記傾き補正用のピエゾで補正する。この操作により試料台の傾きは補正され、測定位置の基板高さは常に高さ測定ピエゾのタイナミックレンジの中央となるように設定でき、試料測定用のピエゾのタイナミックレンジをあげ高分解能でＤＮＡの高さを測定することができる。

本発明の装置は、ＤＮＡなど幅や高さ寸法が２ｎｍ程度と小さい反面、数十ｃｍにおよぶ長さの試料が対象となるため、長手方向のプローブ走査を一度に行うことは出来ない。そのため、本発明では前述したように長手方向を多数の区分に分割して画像を所得し、それらを合成するという方法を採用した。その際の画像合成についてここに説明する。１枚の顕微鏡画像の画郭は例えば１μｍ×２ｍｍ程度であるとし、１回の測定が終了したならば試料ステージによってＸ方向に１コマ分シフトさせるといった操作で順次測定する。

従来のＤＮＡ解析ではＤＮＡそのものを切れ切れに分割して検査を行っており、その合成には多大な労苦と時間がかかる上、その合成には間違いが起こりやすいものであった。本発明の試料はＤＮＡを分断してしまうのではなく、単に顕微鏡画像として分割取得するものであるから、全く事情は異なり、その画像合成は以下に説明するように簡単であり確実に実行されるものである。

本発明の区分画像の合成には画面つなぎ支援ソフトが用いられる。すなわち、試料ステージの駆動によってＸ方向のコマ送りをするのであるが、その際隣接するコマ間の画像は必ず端部画像が重なるようにコマ送りされる。したがって、隣接したＳＰＭ画像には重複部分が存在するので、その部分を単に重ね合わせるように処理するだけで画像が繋がれることになる。連続領域は必ず隣のコマ画像となっており、熟練した技術が無くとも間違えることなく画像合成が可能である。

ＤＮＡ自体の情報に特異点が見つけにくく重なり部分を見分けることが容易でない場合には、ＤＮＡのそばにたとえば、基板を探針で傷をつけたりレーザーマーカで穴を開けるなどして、特異点（マーカー）を生成するという手法が採用できる。この穴を特異点として特異点のをダブルように走査し、特異点を基に二つの画像を繋ぎ合わせればよい。

さらに精密な繋ぎ合わせ手法としては、上記のような特異点をＤＮＡ近傍に３点作成し、これら穴を特異点として特異点のをダブルように走査し、特異点を基に二つの画像を繋ぎ合わせる手法が採用できる。この場合２つの画像を測定する時の時間差によるＸＹ面とＺ面のドリフトの補正も可能となる。

本発明の装置では光学顕微鏡やＳＮＯＭと各種ＳＰＭを用いることによってＤＮＡに関する多種データを取得することが出来る。多種データを総合して解析をおこなうことができる処理ソフトについて説明する。図１０に示すように、異なる検出機能と分解能の顕微鏡で同一のステージ上で測定された同一ＤＮＡ試料の画像をそれぞれぞれ、ステージの座標を基準として並べて比較表示させるソフトウエア。比較表示に際しては中心位置が画面Ｘ方向に於いて一致するように位置合わせされると共に、画面間で位置対応がとれるように１画像に於いて特定された位置が他の顕微鏡画像に於いて表示されるようなソフトを備えるようにする。図１０に示した例はＤＮＡの所定の場所を測定するまでの位置合わせソフトで、ＦＯＭ → ＳＮＯＭ → ＳＰＭ（多機能）とアプローチが容易である。

図１１に示した表示例は各種ＳＰＭによって検出した同一箇所の情報を同一画面上に並べて比較表示させたものである。上段画面はＡＦＭによって得たＴｏｐｏ像であり、ＲＮＡがハイブリダイゼーションされた箇所が太くなっている。中段の画像はＫＦＭ(Kelvin prove Force Mode)による顕微鏡画像であって、ハイブリダイゼーションされた部分は引力が強くなっているため１本鎖ＤＮＡや基板部分とは異なる像として検出できる。下段の画像はＰＦＭ(Pulse Force Mode)によって検出した画像でハイブリダイゼーションされた部分は吸着力が強くなっているため１本鎖ＤＮＡや基板部分とは異なる像として検出できる。このように異なるプローブによって検出したＳＰＭ画像は比較したり情報を総合したりして解析を深めることが出来る。また、同一部分の像であることから並列表示でなく完全に重ね合わせた表示を行うようにしても良い。

本発明は、前述したとおり基板上に一方向に引きのばされた１本のＤＮＡ試料に対し、端から端までの塩基配列順次読み取りをはじめとして既知のＲＮＡがハイブリダイゼーションした位置を特定できる、高分解能の形状と物性情報を検出する多機能分析装置を提供することを課題として研究開発されたものであるが、本発明に係るＳＰＭ装置はＤＮＡに限定されることなく、基板上に引き伸ばされた微細断面の長尺構造を有する試料の観察、例えばサンプル例としてタンパク質の変性、１本鎖ポリマー、ペプチドなどの分子配列の測定等に広く適用することが出来る。

また、ＳＰＭのプローブの微細構造物の所望箇所へのアプローチ手法としては、蛍光顕微鏡と、走査型近接場顕微鏡と、走査型プローブ顕微鏡という組合せに限定される必要はなく、特定箇所検出機能を備えた顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡とを具備し、この特定箇所検出機能を備えた顕微鏡によって特定された位置にプローブ顕微鏡のプローブが容易にアプローチできるシステムであればよい。直接のアプローチが難しいときは、特定箇所検出機能を備えた蛍光顕微鏡で特定した位置をプローブ顕微鏡につなぐ中間倍率の顕微鏡を備えるようにするとよい。

本発明の顕微鏡システムの基本構成を示す図である。 本発明の顕微鏡システムにおける異種顕微鏡の切り換え機構と位置合わせを説明する図である。 本発明の顕微鏡システムに用いられる大気中用試料台を説明する図である。 本発明の顕微鏡システムに用いられる液中用試料台と、液中試料用ＳＰＭの特殊構造を説明する図である。 本発明の装置に光学顕微鏡として暗視野顕微鏡を用いた例を説明する図である。 本発明のプローブの第１走査法を説明する図である。 本発明のプローブの第２走査法を説明する図である。 Ａは本発明のプローブの第３走査法を説明する図で、Ｂは本発明のプローブの第４走査法を説明する図である。 本発明のプローブの第５走査法を説明する図である。 ＤＮＡの所定の場所をアプローチするため、異種の顕微鏡による画像を並べて表示した例を示す図である。 各種ＳＰＭによって検出した同一箇所の情報を同一画面上に並べて比較表示させた画像例を示したものである。

符号の説明

１ 定盤 ２ 脚
３ 試料台 3a，3a' 台本体
3b ホルダー 3c ばね
3d 保持板 3e 試料槽
４ 試料ステージ ５ アーム
６ ヘッド切り換え機構 ７ 光学顕微鏡（例、ＦＯＭ）
８ 走査型近接場顕微鏡（ＳＮＯＭ） ９ 走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）
１０ 斜入射レーザー機構 １１ 格子状標準サンプル
１２ 変位センサー 12a 調整ネジ
１３ カンチレバー １４ ＳＰＭ検出器
１５ 光伝導部材 １６ 波切り
Ｆ プラスチックフィルム

Claims (16)

1. 検出系として少なくとも特定箇所検出機能を備えた顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡とを具備し、これらの顕微鏡は切り換え機構に固定され、該機構の切り換え操作によって各顕微鏡が試料の同一箇所を観察できる位置に移動できるものであって、試料の特定箇所へ走査型プローブ顕微鏡のプローブのアプローチを容易にしたことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 特定箇所検出機能を備えたものとして蛍光顕微鏡を、該蛍光顕微鏡で特定した位置をプローブ顕微鏡につなぐ中間倍率の顕微鏡として走査型近接場顕微鏡とを具備し、ＤＮＡの特定箇所へプローブのアプローチを容易にしたことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 異なる機能の走査型プローブ顕微鏡を交換取付可能とし、長尺体試料の形状及び物性についての複数情報を直接検出できる機能を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡システム。
4. 各顕微鏡を切り換えて標準パターン試料を用いた画像を得て、それぞれの顕微鏡画像から切換時の位置ズレ情報を事前に検出して記憶手段に記憶しておき、切替時に試料ステージによるＸＹ駆動によって各プローブ間の上記位置ズレ分を補正する機能を備えるようにした請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
5. 走査型プローブ顕微鏡には試料槽内の液面の上下に延在する透明な光学部材を取り付けると共にプローブの前方部には波消しが設けられ、高速で走査しても液面変動の影響を受けないようにした請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
6. 試料基板を載置する台本体は長手方向断面がコの字状のホルダーの一端部に当接され、他端はホルダーの他端部に固定されたばねを介した保持板によって押圧保持され、前記台本体とホルダーは線膨張率の低い同じ材質のものであると共に前記ホルダーの他端部には変位センサーが配置された構造であって、このセンサーによって試料温度が均一かつ安定したものと判断する機能を備えた試料台を有する顕微鏡システム。
7. 試料台が台本体とホルダーには透過測定が可能なように試料基板とほぼ同じ大きさの穴が空いた構造である請求項６に記載の顕微鏡システム。
8. 試料台が台本体は液中検査が可能なように器形態の試料槽である請求項６または７に記載の顕微鏡システム。
9. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、Ｙライン上での長尺体試料の位置を検出し記録すると共に、次にＸ方向に１単位移動して、前回測定の長尺体試料位置がＹライン上の中心になるようにＹラインの始点・終点位置を管理した走査を行い、以下これを繰り返し、プローブが長尺体試料を確実に捉えるようにした顕微鏡システムにおける走査法。
10. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、長尺体試料を横切る位置を検出記録した後、プローブをＸ方向に所定距離だけ移動させて再びＹラインに大きく走査し、Ｙライン上での長尺体試料を横切る位置を検出記録し、この両検出位置間を直線で結び長尺体試料の曲がり分を考慮してこの線に平行な走査本数決めて走査を実行する顕微鏡システムにおける走査法。
11. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、長尺体試料を横切り検出した後所定長さの基板を検出したときＹライン走査を終了し、プローブをＸ方向に所定距離だけ移動させると共に逆方向からＹライン走査をし、Ｙライン上で長尺体試料を横切り検出した後所定長さの基板を検出したときＹライン走査を終了し、プローブを更にＸ方向に所定距離だけ移動させると共に正方向からＹライン走査を行い、以下同様の走査を繰り返す顕微鏡システムにおける走査法。
12. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、長尺体試料を横切る位置を検出記録した後、その位置を中心として多方向にプローブを所定距離だけ移動させ、探針が高い位置を最も長く維持した方向を割り出してその方向にプローブを所定量変位させ、その位置を中心として再び多方向にプローブを所定距離だけ移動させ、探針が高い位置を最も長く維持した方向を割り出してその方向にプローブを所定量変位させ、以下同様の走査を繰り返す顕微鏡システムにおける走査法。
13. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、長尺体試料を横切る位置を検出記録した後、その位置を中心として所定半径の円走査を行い、探針が最も高い位置を検出したらその位置にプローブを移動させ、その位置を中心として再び所定半径の円走査を行い、探針が最も高い位置を検出したらまたその位置にプローブを移動させ、以下同様の走査を繰り返す顕微鏡システムにおける走査法。
14. プローブが長尺体試料を横切る方向（Ｙライン）に走査し、長尺体試料を横切る位置を検出記録した後、その位置を中心として所定幅の振動を行いつつＸ走査を行い、探針が最も高い位置を検出するように探針位置を山登り制御し、長尺体試料上をトラッキング走査する顕微鏡システムにおける走査法。
15. 試料ステージをＸ方向にコマ送りしながら連続したＳＰＭ画像を得るものとし、隣接画像間に長尺体試料の重なり合う部分が出るようにコマ送りし、当該部分を重なり合わせて長い１本の長尺体試料情報を順次繋ぐことを特徴とする顕微鏡システムにおける画像合成法。
16. 試料にはマーカーを付けるようにし、隣接画像の端部間で位置合わせを行う請求項１５に記載の顕微鏡システムにおける画像合成法。

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