JP2006025637A

JP2006025637A - Ｄｎａリガーゼによるライゲーション反応の促進方法およびｄｎａリガーゼ組成物

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Publication number: JP2006025637A
Application number: JP2004205924A
Authority: JP
Inventors: Masao Kitabayashi; 北林　　雅夫; Yoshikazu Ishida; 石田　　由和; Hidesuke Komatsubara; 小松原　　秀介; Hiroji Matsumoto; 博治松本; Masanori Oka; 岡　　正則
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2024-07-13
Also published as: JP4590957B2

Abstract

【課題】ＰＣＲ産物の直接クローニングにおいてクローニング効率の高いＤＮＡリガーゼ組成物を得ること。
【解決手段】（１）ＤＮＡリガーゼ、（２）ベタイン、（３）２価金属イオン、動物血清タンパク質の内いずれか１つ以上、から成るＤＮＡ組成物。および前記組成物を用いたＰＣＲ産物のクローニング方法。

Description

本発明は，分子生物学の分野に属する。さらに詳しくはＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を促進させる方法、および、そのようなＤＮＡリガーゼ組成物に関する。

分子生物学の分野では，ＤＮＡ組換え体の作製において２本鎖ＤＮＡ断片の連結にＤＮＡリガーゼを利用することは，周知の技術であり，従来よりＴ４ＤＮＡリガーゼ，大腸菌ＤＮＡリガーゼ等が用いられている。また，ＰＣＲ産物のクローニングも分子生物学の分野では一般的に実施されている方法である。ＰＣＲ産物とはＤＮＡポリメラーゼを用いて目的遺伝子断片を短時間に増幅する技術であるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法により得られた多量の目的ＤＮＡ分子のことである。このようにして得られた目的のＤＮＡ分子を適当なベクターに連結してクローニングすることは，分子生物学の分野においては，遺伝子の構造及び機能解析を行う上で極めて重要である。

従来よりＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結反応の効率向上のために種々の改良が検討されてきた。たとえば，ＤＮＡ連結反応時に，ポリエチレングリコール，およびポリアミン，１価カチオン，２価カチオンなどのいずれか１つを添加する方法が開示されている（たとえば，特許文献１を参照）。
特開昭６２−３６１８７

また，一般的にＰＣＲ産物をクローニングするには，増幅された２本鎖ＤＮＡの３’末端にヌクレオチドを１個（ｄＡ）付加する形で生成させ，一方、ベクターＤＮＡの３’末端にも同様にヌクレオチドを１個（ｄＡと相補的なｄＴ）付加させておき，各々の突出末端の相補性を利用して連結させるＴ−Ａクローニングという方法が知られている（たとえば、特許文献２およびそのファミリーとしてＵＳ５４８７９９３、ＵＳ５８２７６５７などを参照）。
ＷＯ９２／０６１８９

現在、プラスミドベクターＤＮＡの３’末端にｄＴを付加させたものは、一般的にＴ−ベクターと呼ばれている。Ｔ−ベクターは様々な遺伝子研究用試薬を取り扱う会社から販売されており、また、各研究者が自ら比較的簡単に作製することもできる。例えば、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）を制限酵素ＥｃｏＲＶの様な平滑末端を生じる制限酵素で切断し、これと同時にアルカリフォスファターゼにて３’末端を脱リン酸化した後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと高濃度のｄＴＴＰを加え、７２℃，３０分間反応してプラスミドベクターの３’末端にｄＴを付加してＴ−ベクターを調製することが
できる。

また，このＴ−Ａクローニングでは通常ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとして良く知られているＴａｑＤＮＡポリメラーゼが使用されるが，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは生成する２本鎖ＤＮＡの末端にｄＡを付加するのでＴ−Ａクローニングでは有利である反面，エキソヌクレアーゼ活性を持たないため，ＰＣＲで生成する増幅ＤＮＡ産物には取り込まれたヌクレオチドの誤りが多く，正確性を欠くのが欠点である。ここで，エキソヌクレアーゼ活性とは，１本鎖ＤＮＡの３’側あるいは５’側から順次ヌクレオチド単位で分解する活性のことである。

これに対して，本発明者らはエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いるＴ−Ａクローニング方法を開発し特許出願を行った（たとえば、特許文献３を参照）。この方法では，エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いるため，生成するＰＣＲ産物のＤＮＡ末端は平滑末端となる。このままではＴ−Ａクローニングに供することができないため，ＰＣＲ後にエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制しておき，ＤＮＡ末端にヌクレオチドを１個付加させる反応を行わせ，Ｔ−Ａクローニングに供する。こうすることにより，正確な塩基配列を持ったＰＣＲ産物のＴ−Ａクローニングが可能となる。
特願２００２−２９２６３５このようにＰＣＲ産物のクローニングにおいて，目的とする遺伝子断片を含んだクローンを効率良く入手することは極めて重要であるが，従来より知られているＤＮＡリガーゼの組成では，たとえば，特許文献１のような組成をもってしてもしばしば低い効率となることが知られていた。

本発明は従来技術のこのような課題を背景になされたものであり、ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結効率の高いライゲーション方法を提供すること、および、そのような効率の高いライゲーション反応を可能にするＤＮＡリガーゼ組成物を提供するものである。

本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＤＮＡ連結反応時にベタインを共存させることによりＤＮＡ連結効率を高めることができることを見出し，本発明を完成するに至った。
即ち本発明は，（１）ベタインを含むことを特徴とするＤＮＡリガーゼ組成物である。該組成においてさらに、２価金属イオン、動物血清タンパク質から選ばれる少なくとも１つ以上を含有する緩衝液を含有しても良いし、動物血清タンパク質が牛血清タンパク質であってもよい。あるいは、該組成物は、ライゲーション反応用の組成物、下記（３）に記載のクローニング方法用の組成物、あるいは、ＬＣＲ法用の組成物でありうる。
また本発明は、（２）ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とするＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を促進させる方法である。該方法においてさらに、２価金属イオン，動物血清タンパク質から選ばれる少なくとも１つ以上を含有する緩衝液を共存しても良いし、動物血清タンパク質が牛血清タンパク質であってもよい。あるいは、該方法は、下記（３）に記載のクローニング方法や、ＬＣＲ法の一部を構成する方法でありうる。
また本発明は、（３）ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングする方法において、ＤＮＡ連結反応時に、ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とする、ＰＣＲ産物をクローニングする方法である。
また本発明は、（４）下記組成を含む、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングするキットである。
（ａ）ＤＮＡリガーゼ
（ｂ）ベタインを含む緩衝液
（ｃ）プラスミドベクターまたはファージベクター

本発明により、ＤＮＡ連結効率の高いライゲーション方法、および、そのような効率の高いライゲーション反応を可能にするＤＮＡリガーゼ組成物を提供できる。それによって、遺伝子工学領域におけるＤＮＡ連結反応の効率を顕著に向上させ，ひいてはＰＣＲ産物のクローニングの効率をも著明に向上させることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
ＤＮＡリガーゼとは，２本鎖ＤＮＡの５’リン酸末端と他の２本鎖ＤＮＡの５’水酸基末端との間でホスホジエステル結合を形成させる酵素であり，ＣｏｆａｃｆｏｒとしてＡＴＰを要求し、相補的塩基を持つＤＮＡどうし、平滑末端（ＢｌａｎｔＥｎｄ）どうしのいずれをも連結することができるＴ４ＤＮＡリガーゼや，ＮＡＤを要求し、相補的塩基を持つＤＮＡどうしのみを連結する大腸菌ＤＮＡリガーゼなどが良く知られており、市販のものを容易に入手できる。そのほか耐熱性ＤＮＡリガーゼとしてストラタジーン社のＰｆｕＤＮＡＬｉｇａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社のＡｍｐｌｉｇａｓｅＤＮＡＬｉｇａｓｅ（商品名）などが市販され、また、近年になって超好熱始原菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ（アエロパイラム・ペルニックス）由来のものなどが報告されている。

本発明で用いられるＤＮＡリガーゼとしてはどのようなリガーゼでも良いが，クローニングなど通常の遺伝子組み換えにおけるライゲーションの用途で好ましいのはＴ４ＤＮＡリガーゼである。

ところで、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列を増幅、検出する方法として、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）法が報告されている（たとえば、非特許文献１または２、および特許文献４を参照）。あるいは、別の方法としてギャップ充填ＬＣＲ法が報告されている（たとえば、特許文献５を参照）。
本願発明はこのような用途にも適用できると思われるが、その場合は耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いることが好ましい。
ＬＣＲ法では、標的ＤＮＡの（＋）鎖（センス鎖）および（−）鎖（アンチセンス鎖）にそれぞれアニーリングする２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブ、計４種類のプローブを用いて反応を行う。具体的には、まず、４種類のプローブと鋳型ＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡリガーゼを含む反応液を（加熱）変性させ、それぞれを１本鎖に分離させる。続く冷却操作により、１本鎖に分離した鋳型ＤＮＡに２種類の隣りあったオリゴヌクレオチドプローブがアニーリングする。さらに、耐熱性ＤＮＡリガーゼによって隣り合うオリゴヌクレオチドプローブが連結する。この一連の反応を繰り返すことによってライゲーション産物（オリゴヌクレオチドプローブの連結産物）、すなわち標的ＤＮＡ配列が指数関数的に増幅される。
このとき、隣接するオリゴヌクレオチドプローブの３´末端が鋳型ＤＮＡと完全に相補的な場合にのみライゲーション反応が起こり、このライゲーション産物を鋳型にして標的ＤＮＡの特異的な増幅が起こるが、二つのオリゴヌクレオチドプローブの境界部位に鋳型とのミスマッチがあると、ライゲーションは起こらず、ＤＮＡの増幅は起こらない。
ＬＣＲで増幅した産物の確認は、ＤＮＡ色素（エチジウムブロマイドなど）で染色する方法や免疫複合体反応を利用する方法など、種々の公知の方法を利用できる。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８、（１９９１）、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．著、１８９頁〜１９３頁ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１、（１９９１）、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．著、５頁〜１６頁特開２００１−２６９１８７号公報特許第３３３０５９９号公報

ベタインというのは１つの分子中に陽イオンとしての第４級アンモニウムと、陰イオンとしてのカルボン酸を持った化合物の一般名であり、溶液中では双性イオンとして存在する。本発明においてはグリシンベタイン（トリメチルグリシン）が特に好ましく用いられる。ベタインをＤＮＡリガーゼ組成物に添加する濃度としては０．０１Ｍ以上が好ましく、特に好ましいのは０．５〜２Ｍの範囲である。

本発明を好適に実施するには、さらに２価金属イオンおよび動物血清タンパク質から選ばれる物質の内、いずれか１つもしくは両者を添加することが好ましい。２価値金属イオンには、例えばＣａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺などが挙げられるが、特にＭｇ⁺⁺が好ましい。ＤＮＡリガーゼ組成物としてはこれらをたとえばＭｇＣｌ₂などの金属塩の形で添加する。添加する濃度としては、０．１ｍＭ以上が好ましく、特に１．０〜２０ｍＭが好適である。

動物血清タンパク質とは、主にウサギ、ウシ、マウスなどの哺乳動物の血清タンパク質であり、アルブミン、グロブリンなどのタンパク質が挙げられる。本発明において特に好ましい動物血清タンパク質はウシ血清アルブミンである。これらの動物血清タンパク質をＤＮＡリガーゼ組成物に添加する濃度としては、０．０００１重量％以上であって、特に０．０１〜０．０５重量％が反応に好適な濃度である。

これらを適当な緩衝液、例えばｐＨ７．０から８．０のトリスー塩酸緩衝液などに添加してＤＮＡリガーゼ組成物を構成する。

本発明はまた、このようなＤＮＡリガーゼ組成物を用いたＰＣＲ産物のクローニング方法でもある。本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いてＰＣＲ産物をクローニングするには、まず、標的とするＤＮＡおよびその一部と相補的な塩基配列を有するプライマーとを準備し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどを用いてＰＣＲを行う。この際、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼも用いることができるが、その場合はＰＣＲ後に、例えば前記エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを特異的に阻害する抗体などを添加して前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制しておき、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどにより増幅で生成した２本鎖ＤＮＡの末端にｄＡを付加させる。このようにして最終的には末端にｄＡが１個付加されたＰＣＲ産物を得ることができる。次にベクターとしてはプラスミドベクター、ファージベクターなどいずれでも良いが、好適にクローニングを実施するためには、適当な制限酵素を用いて切断し、ｄＴの突出末端を持ったベクターを作製し、前記に取得したＰＣＲ産物と、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を混合してＤＮＡの連結反応を行わせる。所望の標的ＤＮＡがクローニングされた形質転換体を得るには、前記のＤＮＡ連結反応物を大腸菌に形質転換し、ベクターのマーカーを利用して生育してくる大腸菌コロニーを選別することにより達成することができる。本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いることにより、従来ＴＡクローニングで得られていた効率と比べて大幅に効率を増大することが可能となる。
例えば、挿入ＤＮＡとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりλＤＮＡ由来の０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂのＤＮＡ断片を用いた実施例７の実験の場合、従来のＴＡクローニング効率より約１１〜６７％の効率を増大することが可能となる。

本発明において「ライゲーション反応が促進される」ことは、「ＤＮＡ連結効率が高まる」ということで示される。リガーゼのＤＮＡ連結活性を確認するためには種々の公知の方法が用いられうるが、例えば特許文献１の明細書２ページ右下１６行−３ページ左下７行に例示されているように、各リガーゼの反応に適した条件において、適当な基質を一定時間内に連結させる酵素量を単位として評価することができる。あるいは、実際に連結したＤＮＡの分子数またはＤＮＡの重量を計測することにより、確かめることができる。例えば、ＡというＤＮＡ分子とＢというＤＮＡ分子を連結して生まれたＡ＋ＢというＤＮＡ分子を定量することにより「ライゲーション反応の促進効果」を確かめることができる。以上のような定量実験ではラジオアイソトープを用いたトレーサー実験が一般的に行われている。

本発明において「ライゲーション反応が促進される」ことは、ＤＮＡリガーゼ反応がその全工程の一部を構成する方法において該方法の効率が向上することによっても示される。例えば、ＰＣＲ産物をクローニングする方法における「クローニング効率の向上」、あるいは、ＬＣＲ法における「増幅効率の向上」（増幅産物の生成量の増大や増幅時間の短縮など）などによっても示されうる。

本発明において、クローニングの効率とは形質転換された宿主細胞に現れる表現型を識別した上で、全ての形質転換体における外来ＤＮＡが挿入されたことを示す表現型を有する形質転換体の割合として表される。好ましくは、外来ＤＮＡ挿入部位がβ―ガラクトシダーゼ遺伝子内に存在するベクターを用いてクローニングを行い、形質転換させた大腸菌をβ―ガラクトシダーゼの基質を含む培地上でコロニー形成させた後、コロニーの青白を判定し、全コロニーに対する白コロニーの割合として求める。なお、クローニングの効率向上は、同じクローニング効率を得るために要する時間を短縮することによっても示されうる。

次に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１
ＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加によるクローニング効率に及ぼす影響を検討
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）４単位を、６．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、０２ｍＭＡＴＰ、２０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液に溶解した組成物を調製した（ベタイン（−）組成物）。次に、この組成物にベタインを終濃度１．０Ｍとなるように添加した組成物を調製した（ベタイン（＋）組成物）。
一方、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにて、プライマーλ−ｆ（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’）とλ０．５−ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’）を用いてＰＣＲを行い、λＤＮＡの０．５ｋｂＤＮＡ断片を調製し、前記の２種類のＤＮＡリガーゼ組成物を用いて自製化したＴベクターと２４℃、１時間反応させた。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを添加しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合は、クローニング効率が約３０％向上していた（表１）。

実施例２
ハイフィディリィティーＰＣＲ産物のＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加によるクローニング効率に及ぼす影響を検討
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）にてプライマーλ−ｆとλ２−ｒ（５’−ＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＴＣ−３’）を用いてＰＣＲを行い、λＤＮＡの２ｋｂ断片を増幅した。増幅後の反応液にそのまま、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼを特異的に中和抑制する抗体（東洋紡績製）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加して、６０℃、３０分間反応させることにより、ＰＣＲ産物の３’末端にｄＡを付加させた。次に、この反応液を実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物にて、２４℃、１時間、Ｔベクターとのリガーゼ反応を行った後、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合は、クローニング効率が約２０％向上していた（表２）。

実施例３
ＤＮＡリガーゼ反応におけるベタイン添加による反応時間短縮の検討
実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、Ｔベクターを用いて、反応温度１６℃にて反応時間を変化して反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物ではベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と同レベルのクローニング効率を得るためには、２時間の反応時間が必要であった。これに対して、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、反応時間１５〜３０分で十分なリガーゼ反応が行われているようであり、既にクローニング効率が上限に達していた。（表３、図１）。

実施例４．
ベタイン添加によるリガーゼ反応時間の短縮の検討２
実施例１に記載のベタインを含有する緩衝液と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、Ｔベクターを用いて、反応温度１６℃にて反応時間を変化してリガーゼ反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、反応時間２分でも十分なリガーゼ反応が行われており、既にクローニング効率が上限に達していた（表４）。

実施例５．
ライゲーション反応におけるベタイン至適濃度検討
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにて増幅したＰＣＲ産物と自製化したＴベクターを用いて、実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物に一定量のベタインを添加して、１６℃、５分間ライゲーション反応を行った。なお、λ１ｋｂＤＮＡ断片の増幅では、プライマーλ−ｆとλ１−ｒ（５’−ＧＣＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＧＣＡＡ−３’）を使用した。次に、この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。その結果、λＤＮＡ由来の０．５ｋｂ、λ１ｋｂのいずれの増幅産物を挿入ＤＮＡにした場合でも、終濃度０．５〜３Ｍのベタイン濃度でクローニング効率を増大する効果が見られた。そして、いずれの挿入ＤＮＡを用いた場合でも、その至適濃度は１Ｍであった。（表５、表６）。

実施例６．
ポリエチレングリコール含有ライゲーションバッファーにおけるベタイン添加によるクローニング効率向上の検討
プロメガ社ｐＧＥＭ−ＴＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍ添付の２ｘバッファー（６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＡＴＰ、１０％ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）に１Ｍベタインを添加することにより、クローニング効率に変化が見られるか、実施例５と同様のＴａｑＤＮＡポリメラーゼにて増幅したλ１ｋｂのＰＣＲ産物と自製化したＴベクターを用いて検討した。ライゲーション反応は２４℃、５分あるいは２４℃、６０分行ない、その反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌ、１ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生成するコロニーを観察した。添付の２ｘバッファーだけを用いた場合でも、反応時間５分でライゲーション反応は最大に達しているようであり、反応時間を伸ばすことによるクローニング効率の増大は見られなかった。一方、添付の２ｘバッファーに１Ｍベタインを添加した場合には、クローニング効率が１．３倍〜１．５倍増大していた。以上の結果から、従来よりライゲーション効率を高める効果が明らかにされているアルコール類に加え、ベタインの様なアミノ酸類似体を添加することによりクローニング効率が更に増大できることが明らかとなった。（表７）。

実施例７．
市販Ｔベクターを用いたＴＡクローニングにおけるベタイン添加による効率への影響
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲを行い、先の実施例と同じプライマーを用いてλＤＮＡの０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、実施例１と同様のライゲーション反応液組成にて、市販Ｔベクター（プロメガ社、ｐＧＥＭ−Ｔ）と２４℃、１時間反応させた。この反応物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生育するコロニーを観察した。その結果、ベタインを添加しないＤＮＡリガーゼ組成物に対して、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、クローニング効率がそれぞれ４５％、６７％、１１％向上していた（表８）。

実施例８．
市販Ｔベクターを用いたＴＡクローニングにおけるベタイン添加による反応時間への影響
実施例１に記載のベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物とベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物と、同様のλ０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片、市販Ｔベクター（プロメガ社、ｐＧＥＭ−Ｔ）を用いて、反応温度２４℃にて反応時間を変化して反応を行った。次に、この反応物を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．０１％Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地にて培養して、生育するコロニーを観察した。その結果、ベタインを含有しないＤＮＡリガーゼ組成物では、反応時間を延長することにより、クローニング効率が増大する傾向が見られた。一方、本発明によるベタインを含有するＤＮＡリガーゼ組成物を用いた場合には、反応時間５分でも十分なリガーゼ反応が行われているようであり、既にクローニング効率が上限に達していた。（表９、図２）。

本発明のＤＮＡリガーゼ組成物はＤＮＡの連結反応の効率を著しく向上させるため、一般的にＤＮＡのクローニングにおいて形質転換体の取得効率を改善することができる。特にＰＣＲ産物の直接クローニングにおいてはこれまでしばしばＤＮＡリガーゼの効率が悪く低い形質転換率であったものが、本発明によるＤＮＡリガーゼ組成物を用いることにより、大幅に改善される。

ＤＮＡリガーゼ反応液中のベタインの存在により必要な反応時間を短縮できることを示すグラフである。市販Ｔベクターを用いたＴＡクローニングにおけるベタイン添加による反応時間への影響を示すグラフである。

Claims

ベタインを含むことを特徴とするＤＮＡリガーゼ含有組成物
ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とするＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応を促進させる方法
ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングする方法において、ＤＮＡ連結反応時に、ベタインの共存下でＤＮＡリガーゼ反応を行うことを特徴とする、ＰＣＲ産物をクローニングする方法
下記組成を含む，ＰＣＲ産物をプラスミドベクターあるいはファージベクターに直接クローニングするためのキット．
（ａ）ＤＮＡリガーゼ
（ｂ）ベタインを含む緩衝液
（ｃ）プラスミドベクターまたはファージベクター