JP2005530840A

JP2005530840A - コウジ酸誘導体及びその製造方法

Info

Publication number: JP2005530840A
Application number: JP2004515196A
Authority: JP
Inventors: ホウシクロ; スウナンキム; バエファンキム; ハエワンリ; ダクヒキム; リセオチャン; オクスブリ
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2002-06-22
Filing date: 2003-01-11
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2023-01-11
Also published as: EP1515966B1; KR20040000638A; EP1515966A4; CN1310910C; WO2004000836A1; EP1515966A1; US20030236299A1; CN1662526A; KR100482668B1; US6916844B2; JP4398367B2

Abstract

本発明は、コウジ酸誘導体とその製造方法に関するもので、本発明によるコウジ酸誘導体はコラーゲン生成を促進させるとともに、コラーゲンを分解する酵素であるコラゲナーゼの活性を抑制できるため、シワを改善する効果を有し且つ医薬品や皮膚外用剤として有用に活用できる。

Description

本発明は、下記の化学式１で表されるコウジ酸誘導体及びその製造方法に関するものである。

（式中の、Ｒ₁は-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は、-Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂-, -ＣＨ＝ＣＨＣ(Ｏ)ＯＣＨ₂-または-ＣＨ＝ＣＨ-である。）

全ての生物体は、歳とともに老化していくが、皮膚も同じである。こうした老化を遅延させるための努力が絶え間なく続けられてきたことで、老化の本質は何であり叉なぜ老化が起きるかに対する疑問が絶えず提起されてきた。皮膚の老化の要因は大きく２つに分けることができる。

まず、皮膚の構造と生理的な機能が歳をとるにつれて減退を起こす自然的な老化（Intrin sicaging）と、また、太陽光線などで累積された外部ストレスによる外的老化（Extrin sicaging）が挙げられる。特に、太陽光はよく知られている老化原因の一つで、長時間紫外線に露出された皮膚は、角質層が厚くなりコラーゲンが変性して皮膚の弾力性もなくなるという。このような皮膚の老化現状は様々な機能的、構造的変化を伴う。

まず、老化による皮膚の構造的変化を調べると、皮膚の構成成分である表皮、真皮及び皮下組織の厚みが薄くなる。また、皮膚の弾力と伸長を担当する真皮組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ; extracelluar matrix）成分が変化する。ＥＣＭは、大きく２つの成分から構成されている。一つは、ＥＣＭ全体の約２〜４％を占める弾力繊維である弾性繊維（elastic fiber）で、もう一つは、ＥＣＭ全体の約７０〜８０％を占めるコラーゲンである。このコラーゲンは、老化過程においてその生成が急激に低下する。このようなコラーゲンの生成低下は、生合成過程において様々な要因によって調節できるが、例えば、コラゲナーゼ（collagenase）のようなマトリックス金属プロテアーゼ（matrix metallo protease）の発現によって生成したコラーゲンが分解され皮膚内のコラーゲン含量が減っていく現状が起きる。真皮からコラーゲンが減少すると、皮膚の表皮が荒れてしまい老化現状であるシワができる。

このようなシワの原因になるコラーゲンの減少を抑制する目的として、様々な物質などが開発され使用されている。特に、レチノールとレチノイン酸などのレチノイドのシワ改善における効果はすでに知られた事実である（Dermatology therapy, １９９８, １６, ３５７〜３６４）。しかしながら、これらのレチノイドは、シワ改善という肯定的な効果がある反面、小量でも皮膚に適用した場合に刺激を与えたり、不安定で空気中に露出されると簡単に酸化してしまうため、使用上の制約が多い。これに、レチノイドを安定化させるための研究は続けられているが、依然として皮膚に対する刺激、すなわち、安全性の問題が解決されないままである。

レチノイドは、レチノ−ル、レチノイン酸またはこれの誘導体を指すものである。レチノイドは、様々な生物学的な作用を呈するが、皮膚には、過角質化やニキビに対する効果があると報告されており、皮膚のシワには、コラーゲン生成促進とコラーゲン分解の酵素であるコラゲナーゼ（Collagenase）の抑制能力があると一般的に知られている。（The Journal of Investigative Dermatology, １９９１, ９６, ９７５〜９７８）。

現在までのレチノイドの開発背景を見てみると、初期には単純なレチノ−ルとレチノイン酸の変形による誘導体を製造したが、このような変形の例としてはレチニル・パルミテート（Retinyl palmitate）が挙げられる。次に、安息香酸を用いた誘導体があるが、このような化合物をアロチノイド（Arotinoid）という（J. Med. Cheｍ，１９８８, ３１, ２１８２〜２１９２）。最近では、アロチノイド化合物のベンゼンリングにヘテロ原子を導入した化合物などが開発されており、これをヘテロアロチノイド（Heteroarotinoid）（J. Med. Chem., １９９９, ４２, ４４３４〜４４４５）といい、本発明によって提供されるレチノイドは、ヘテロ原子を有する安息香酸の代わりにコウジ酸を用いた誘導体である。

レチノイドが皮膚にもたらす生物学的な効果は、レチノイドのレチノイン酸受容体と言われる細胞（inter cellullar）受容体を介して作用することが明らかになった（British Journal of dermatology, １９９９, １４０, １２〜１７）。レチノイドの構造的特徴は、テトラメチルシクロヘキサン、不飽和炭素結合及びカルボン酸（carboxylic acid）からなる。特に、カルボン酸（carboxylic acid）は、レチノイド類が効果を呈する上で必須的な部分であり、受容体に作用するとき簡単にアニオンに変形され作用する（Chem. Pharm. Bull, ２００１, ４９, ５０１〜５０３）。

上記結果に基づいて、既存のレチノイドの効能を維持しながら毒性及び不安全性の減少させる方向への研究がなされてきた。

前述した通り、本発明者らは、従来のシワ改善原料であるレチノイドの皮膚刺激に対する問題を解消すると同時に、皮膚外用剤としての剤型の不安定性を解決できる方法の研究を重ねた結果、新規な形態のレチノイドを合成した。

一方、コウジ酸とその誘導体は美白剤として広く知られている物質である（UＳP, ５５２３４２１; Bioorganic & Medicinal chemistry letter, １９９６, ６, １３０３〜１３０８）。しかしながら、最近では、コウジ酸の美白剤としての効能以外にシワの抑制剤としての効能も研究され発表された（European Journal of Pharmacology, ２００１, ４１１, １６９〜１７４）。
UＳP, ５５２３４２１ Dermatology therapy, １９９８, １６, ３５７〜３６４ The Journal of Investigative Dermatology, １９９１, ９６, ９７５〜９７８ J. Med. Cheｍ，１９８８, ３１, ２１８２〜２１９２ J. Med. Chem., １９９９, ４２, ４４３４〜４４４５ British Journal of dermatology, １９９９, １４０, １２〜１７ Chem. Pharm. Bull, ２００１, ４９, ５０１〜５０３ Bioorganic & Medicinal chemistry letter, １９９６, ６, １３０３〜１３０８ European Journal of Pharmacology, ２００１, ４１１, １６９〜１７４

コウジ酸〔5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4H-pyrane-4-one〕の構造的特徴を見てみると、４位カルボニル基（carbonyl group）と隣り合わせた５位エノールヒドロキシ基（enolic hydroxy group）を有する。このエノールヒドロキシ基は簡単にアニオンを形成し、カルボン酸（carboxylic acid）と類似した形態として用いられるが、そこで、コウジ酸の特性を用いて新規なレチノイドを合成したところ、レチノイドの一類である本発明のコウジ酸誘導体の場合は、従来のレチノ−ル及びレチノイン酸による皮膚刺激、変色、変臭などがなく安定した化合物であることを見出して本発明に至ったものである。

従って、本発明の目的は、シワ改善効果が高く、レチノイドの安定性を向上させた新規な形態のレチノイドとしてのコウジ酸誘導体を提供することにある。
本発明の他の目的は、コウジ酸誘導体を製造する方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、上記コウジ酸誘導体の医薬品及び皮膚外用剤としての適合性を示すことにある。

上記した目的を達成するために、本発明は、レチノイドの一種である下記の化学式１で表されるコウジ酸誘導体を提供する。

（式中、Ｒ₁は-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は、-Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂-, -ＣＨ＝ＣＨＣ(Ｏ)ＯＣＨ₂-または-ＣＨ＝ＣＨ-である。）

また、本発明は、コウジ酸と３，４-メチレンジオキシ安息香酸、３，４-エチレンジオキシ安息香酸、３，４-メチレンジオキシ桂皮酸または３，４-エチレンジオキシ桂皮酸とのエステル結合する方法と、コウジ酸と３，４-メチレンジオキシベンツアルデヒドまたは３，４-エチレンジオキシベンツアルデヒドを二重結合で結合する方法とを提供する。

上記で説明したように、本発明による上記化学式１で表されるコウジ酸誘導体は、その構造及び効果からレチノイドとして分類され得る。

以下に、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明による新しい概念のレチノイドとしてのコウジ酸誘導体（hydroxy pyranone derivative）は、下記の具体的な例の次のような二つの製造方法から得ることができる。

方法（Ａ）で示す第１例として、コウジ酸２位ヒドロキシメチル基のヒドロキシ基をハロゲン元素に置換したハロゲン化コウジ酸〔5-hydroxy-2-(halogenmethyl)-4H-pyrane-4-one〕を製造する。そして、安息香酸または桂皮酸を極性溶媒で無機塩基と反応させて安息香酸塩または桂皮酸塩を製造した後、上記ハロゲン化コウジ酸と安息香酸塩または桂皮酸塩を反応させてコウジ酸誘導体を製造する方法がある。

方法（Ｂ）で示す第２例として、まず、コウジ酸２位ヒドロキシメチル基のヒドロキシ基をハロゲン元素で置換させハロゲン化コウジ酸を製造する。そして、ハロゲン化コウジ酸とトリフェニルホスフィンを反応させてホスホニム塩を形成した後、ホスホニム塩と３，４-メチレンジオキシベンツアルデヒドまたは３，４-エチレンジオキシベンツアルデヒドを反応させてコウジ酸誘導体を製造する方法がある。

上記の二つの製造方法において、ハロゲン元素は、ブロム、塩素またはヨウ素が可能である。

本発明による製造方法を下記の反応式に参照してさらに詳細に説明する。

まず、上記の方法（Ａ）による製造方法を一例として下記反応式１を用いて説明する。

（式中、Ｒ₁は、-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は-Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ₂-, ＣＨ＝ＣＨＣ(Ｏ)ＯＣＨ₂-または-ＣＨ＝ＣＨ-である。）

第１段階として、塩化チオニルを用いてコウジ酸の一次アルコールをクロリドに変形する。このとき、使用できる溶媒としてＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、メチレンクロリド、クロロホルムなどがある。また、安息香酸と桂皮酸を塩に変えるためには水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基を用いることができ、溶媒としてメタノール、エタノール、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの極性溶媒を用いることができる。

上記段階において、コウジ酸の１次アルコールがクロリド化され製造されたクロロコウジ酸〔5-hydroxy-2-(chloromethyl)-4H-pyrane-4-one〕と安息香酸塩あるいは桂皮酸塩を反応させるための溶媒としては、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、メチレンクロリド、クロロホルムのような溶媒がある。このうち、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドが最も適合している。反応温度は、７０℃〜１１０℃が最も理想的で、これより低い温度では反応物であるクロロコウジ酸が残ってしまい反応生成物からの除去が容易ではない。これに対し、１１０℃以上の温度では反応物であるクロロコウジ酸が分解されてしまい反応生成物の歩留まりが低下する。

続いて、上記方法（Ｂ）で表される製造方法の一例として下記の反応式２を参照して説明する。

（式中の、Ｒ₁は、-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂- であり、Ｒ₂は、-ＣＨ＝ＣＨ- である。）

まず、先の段階において合成したクロロコウジ酸をトリフェニルホスフィンと反応させてホスホニウム塩を合成する。このとき、使用可能な溶媒としてはメチレンクロリド、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエンなどがある。

上記生成されたホスホニウム塩に塩基を用いてイリドを作るが、このときに使用可能な塩基としてはｎ-ＢｕＬｉ、ソジウムメトキシド、ソジウムエトキシドなどがある。このような方法により生成されたイリドとアルデヒドを反応させスチルベン化合物を得る。

上記２つの例において、チオニルクロリド以外にチオニルブロマイドを用いてブロモコウジ酸〔5-hydroxy-2-(bromomethyl)-4H-pyrane-4-one〕が得られる。また、ヨウ化コウジ酸〔5-hydroxy-2-(iodomethyl)-4H-pyrane-4-one〕は、クロロコウジ酸〔5-hydroxy-2-(chloromethyl)-4H-pyrane-4-one〕をヨウ化ナトリウムあるいはヨウ化カリウムと反応させて得ることができる。このような方法から得たブロモコウジ酸、ヨウ化コウジ酸を用いて上記反応を進行させることもできる。

上記の製造方法から得た化学式１のコウジ酸エステル、スチルベン化合物の具体的な例としては、
（５-ヒドロキシ-４-オキソ-４Ｈ-ピラン-２-イル）メチル２Ｈ-ベンゾ [３，４-ｄ] １,３-ジオキソラン-５-カルボン酸塩〔（5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl）methyl 2H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-carboxylate〕;
（５-ヒドロキシ-４-オキソ-４水素 - ピラン-２-イル）２Ｈ,３Ｈ-ベンゾ [３，４-ｅ] １,４-ジオキサン-６-カルボン酸塩〔（5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl） 2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxane-6-carboxylate〕;
２-（３Ｅ）-４（２Ｈ,３Ｈ-ベンゾ[３，４-ｄ]１,３-ジオキソラン-５-イル）-２-oxobut-３-エニルオキシ（enyloxy）-５-ヒドロキシ-４Ｈ-４-ピラン-４-ワン〔2-((3E)-4-(2H,3H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-yl)-2-oxobut-3-enyloxy)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕;
２-（（３Ｅ）-４（２Ｈ, ３Ｈ-ベンゾ[３，４-ｅ] １,４-ジオキサン-６-イル）-２-oxobut- ３-エニルオキシ（enyloxy））-５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((3E)-4-(2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxan-6-yl)-2-oxobut-3-enyloxy)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕;
２-（（１Ｅ）-２-（２Ｈ, ３Ｈ-ベンゾ [３, ４-ｄ] １,３-ジオキソラン-５-イル）ビニール）-５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((1E)-2-(2H,3H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-yl)vinyl)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕;
２-（（１Ｅ）-２-（２Ｈ,３Ｈ-ベンゾ[３，４-ｅ] １,４-ジオキサン-６-イル）ビニール）-５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((1E)-2-(2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxan-6-yl)vinyl)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕;
などがある。

上記工程から製造された本発明のコウジ酸エステル及びスチルベン化合物は、シワ改善効果のある医薬品及び皮膚外用剤の有効成分として含有され得る。
本発明の組成物は、また、その剤型に応じて通常は他の成分を含むことができる。本発明の組成物は、シワ改善の効果のために、上記コウジ酸誘導体以外に既存の他のシワ改善成分等をさらに含有することができる。

以下、実施例を参照して本発明によるコウジ酸エステル、スチルベン化合物の製造方法をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例によって限定されるものではない。

[参考例１]
２-クロロメチル-５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン（クロロコウジ酸）〔5-hydroxy-2-(chloromethyl)-4H-pyran-4-one〕の製造
５０ｇのコウジ酸（０.３５ｍｏｌ）をＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド２５０ｍｌに溶かし、１０℃の氷水浴で冷却し、チオニルクロリド５０ｍｌ（０.４２ｍｏｌ）を３０分滴加した。常温で２時間攪拌した後、氷水２０００ｍｌに反応液を加えた。生成された固体を濾過して、酢酸エチル１０００ｍｌに固体（濾過物）を溶解した。そして、硫酸マグネシウム及び活性炭を加えて乾燥・脱色を行い濾過した後、濾液を濃縮してヘキサンを加えて結晶を得た。真空乾燥させて反応生成物であるクロロコウジ酸３９.５ｇ（７０％）を黄色固体として得た。

[参考例２]
クロロコジルトリフェニルホスホラン〔5-hydroxy-2-(chloromethyl)-4H-pyran-4-onyl triphenyl phosphorane〕の製造
クロロコウジ酸３０ｇ（０.１８ｍｏｌ）を５００ｍｌのメチレンクロリドに溶かした後、トリフェニルホスフィン４９ｇ（０.１８ｍｏｌ）を加えて６時間還流した。還流中に固体が生成し、その反応が完結された後、生成した固体を濾過してホスホニム塩６３ｇ（７５％収率）を得た。

（５-ヒドロキシ-４-オキソ-４Ｈ-ピラン-２-イル）メチル２Ｈ-ベンゾ[３, ４-ｄ]１,３-ジオキソラン-５-カルボン酸塩〔（5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl）methyl 2H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-carboxylate〕の製造
［方法Ａ］
３，４-メチレンジオキシ安息香酸５ｇ（０.０３ｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム１.８ｇ（０.４５ｍｏｌ）をメタノール４０ｍｌに溶解してメタノールを蒸留した後、残りの残渣をＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド７０ｍｌに溶解した。ここに、クロロコウジ酸４.８ｇ（０.０３ｍｏｌ）を加えて１１０℃ のオイル槽で２時間加熱攪拌した。溶媒を蒸留して残渣を酢酸エチル３００ｍｌに溶かした後、酢酸エチル溶液を５％の塩酸と蒸留水で洗浄して硫酸マグネシウムと活性炭を加えて乾燥・脱色した。不溶物を濾過して濾液を減圧下で蒸発させ反応生成物５.６ｇ（６５％水率）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン＝１:１）; Ｒｆ＝０.５４
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ, δ）; ９.４３（Ｓ, １Ｈ）, ８.１６（Ｓ, １Ｈ）, ７.６９（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４Ｈｚ）, ７.４８（Ｓ, １Ｈ）, ７.１２（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４Ｈｚ）, ６.６０（Ｓ, １Ｈ）, ６.２０（Ｓ, ２Ｈ）, ５.２２（Ｓ, ２Ｈ）.

（５-ヒドロキシ-４-オキソ-４Ｈ-ピラン-２-イル）２Ｈ，３Ｈ-ベンゾ[３, ４-ｅ]１,４-ジオキサン-６-カルボン酸塩〔（5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl） 2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxane-6-carboxylate〕の製造
３，４-メチレンジオキシ安息香酸の代わりに、３，４-エチレンジオキシ安息香酸を用いることを除く実施例１と同様な方法を用いて目的物（６.２ｇ, ６８％）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン＝１:２）; Ｒｆ＝０.５３
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ, δ）; ９.４２（Ｓ, １Ｈ）, ８.１５（Ｓ, １Ｈ）, ７.６５（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４Ｈｚ）, ７.４９（Ｓ, １Ｈ）, ７.１０（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４Ｈｚ）, ６.６３（Ｓ, １Ｈ）, ６.１８（Ｓ, ２Ｈ）, ４.２７（Ｓ, ２Ｈ）。

２-（３Ｅ）-４（２Ｈ, ３Ｈ-ベンゾ [３, ４-ｄ] １,３-ジオキソラン-５-イル）-2-oxobut-３-エニルオキシ）-５-ヒドロキシ-４Ｈ-４-ピラン-４-ワン〔2-((3E)-4-(2H,3H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-yl)-2-oxobut-3-enyloxy)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕の製造
３，４-メチレンジオキシ安息香酸の代わりに、３，４-メチレンジオキシ桂皮酸を用いることを除く実施例１と同様な方法を用いて目的物（５.８ｇ, ６２％）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン= １:４）Ｒｆ＝０.５０
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ, δ）: ９.４０（Ｓ, １Ｈ）, ８.０９（Ｓ, １Ｈ）, ７.６３（ｄ, ２Ｈ,Ｊ＝１５.９Ｈｚ）, ７.４４（Ｓ, １Ｈ）, ７.２１（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４７Ｈｚ）, ６.９５（ｄ, １Ｈ, ８.４Ｈｚ）, ６.６１（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝１５.９Ｈｚ）, ６.５０（Ｓ, １Ｈ）, ６.０７（Ｓ, ２Ｈ）, ５.０５（Ｓ, ２Ｈ）。

２-（（３Ｅ）-４（２Ｈ,３Ｈ-ベンゾ[３, ４-ｅ] １,４-ジオキサン-６-イル）-２-oxobut-３-エニルオキシ）-５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((3E)-4-(2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxan-6-yl)-2-oxobut-3-enyloxy)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕の製造
３，４-メチレンジオキシ安息香酸の代わりに、３，４-エチレンジオキシ桂皮酸を用いることを除く実施例１と同様な方法で目的物（５.９ｇ, ６０％）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン＝１:４）; Ｒｆ＝０.５１
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ, δ）; ９.３９（Ｓ, １Ｈ）, ８.０９（Ｓ, １Ｈ）, ７.６２（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝１５.９Ｈｚ）, ７.１６（Ｓ, １Ｈ）, ７.０２（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝８.４７Ｈｚ）, ６.８２（ｄ, １Ｈ, ８.４Ｈｚ）, ６.５９（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝１５.９Ｈｚ）, ６.５０（Ｓ, １Ｈ）, ５.０６（Ｓ, ２Ｈ）, ４.３０（ｍ，２Ｈ）。

２-（（１Ｅ）-２-（２Ｈ, ３Ｈ-ベンゾ [３, ４-ｄ] １,３-ジオキソラン-５-イル）ビニール）- ５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((1E)-2-(2H,3H-benzo[3,4-d] 1,3-dioxolan-5-yl)vinyl)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕の製造
［方法Ｂ］
ホスホニム塩２０ｇ（０.０４７ｍｏｌ）を無水テトラハイドロフラン２００ｍｌに溶解した後、反応溶液を０℃に冷却した。この溶液に２.５Ｍｎ-ブチルリチウム溶液１９ｍｌ（０.０４７ｍｏｌ）をゆっくりと滴加した。反応溶液をさらに３０分攪拌させた後、この溶液に３，４-メチレンジオキシベンズアルデヒド７ｇ（０.０４７ｍｏｌ）を、５０ｍｌの無水テトラハイドロフランに溶解してゆっくり滴加した。反応の完結後、反応溶液を濃縮して酢酸エチル１００ｍｌを加えて反応混合物を溶解した。蒸留水で２回洗い流して無水芒硝（anhydrous sodium sulfate）で乾燥後、濾過・濃縮して、カラムクロマトグラフィにより目的物（７.２ｇ, ６０％）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン＝１:４）; Ｒｆ＝０.５０
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３, δ）; ９.１２（Ｓ, １Ｈ）, ８.０２（Ｓ, １Ｈ）, ７.２.８ - ７.３２（ｍ，２Ｈ）, ７.１４（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝７.８Ｈｚ）, ６.９７（Ｓ, １Ｈ）, ６.９０（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝１４.５Ｈｚ）, ６.４１（Ｓ, １Ｈ）, ６.４１（Ｓ, ２Ｈ）。

２-（（１Ｅ）-２-（２Ｈ,３Ｈ-ベンゾ[３，４-ｅ] １,４-ジオキサン-６-イル）ビニール）- ５-ヒドロキシ-４Ｈ-ピラン-４-ワン〔2-((1E)-2-(2H,3H-benzo[3,4-e] 1,4-dioxan-6-yl)vinyl)-5-hydroxy-4H-pyran-4-one〕の製造
３，４-メチレンジオキシベンズアルデヒドの代わりに、３，４-エチレンジオキシベンズアルデヒドを用いることを除く実施例５と同様な方法で目的物（７.８ｇ, ６１％）を黄白色固体として得た。
ＴＬＣ（酢酸エチル:ヘキサン＝１:４）; Ｒｆ＝０.５１
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３, δ）; ９.１０（Ｓ, １Ｈ）, ８.０２（Ｓ, １Ｈ）, ７.２９（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝１６.２Ｈｚ）, ７.２０（Ｓ, １Ｈ）, ７.１３（ｍ，１Ｈ）, ６.９１（ｍ，２Ｈ）, ６.４３（Ｓ, １Ｈ）, ４.２６（ｍ，４Ｈ）。

[試験例１] コラーゲン生合成の促進
上記実施例１〜６から得られたコウジ酸誘導体のコラーゲン生合成の促進効果をレチノ−ル及びレチノイン酸と比較して測定した。
試験方法は、線維芽細胞（fibroblast）を２４ウェル（well）に１ウェル当たり１０５個ずつ播種して９０％になるまで培養する。これをＰＢＳ（phosphate buffered saline）で一回洗い流した後、上記物質を１０^-4モル濃度で処理して２４時間ＣＯ₂の培養器で培養する。これらの浮遊物を取ってプロコラーゲンタイプ（I）ＥＬＩＳＡキット（procollagen type(I) ELISA kit）を用いてプロコラーゲンの増減可否を観察した。試験結果を表１の通りである。生合成は、対照群を１００にして対比したものである。

[試験例２] コラゲナーゼの抑制効能の測定
上記実施例１〜６から得られたコウジ酸誘導体のコラゲナーゼ生成のインヒビション（collagenase-inhibiting effect）をレチノル及びレチノイン酸と比較して測定した。
試験は、２.５％のウシ胎仔血清とＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）の培地が含有された９６ウェルプレート培養器（９６-well microtiter plate）に人間の線維芽細胞を５,０００細胞/ウェル（well）になるように加えて、７０〜８０％に育つまで培養した。そして、上記の物質を１０^-4 モール濃度で２４時間処理した後、細胞培養液をかき集めた。かき集めた細胞培養液は、商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定キット（米国Amersham Pharmacia Biotech、Cataloｇ＃：ＲＰＮ２６１０）でコラゲナーゼの生成程度を測定した。まず、一次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６ウェルプレート（９６-well plate）に、かき集めた細胞培養液を加えて３時間かけて抗原・抗体反応を培養器で実施した。３時間後に発色団が結合され２次コラーゲン抗体を９６-ウェルプレート（９６-well plate）に加えて再び１５分間反応させた。さらに１５分後に発色誘発物質を加えて室温で１５分間発色を誘発させて、再び１Ｍ硫酸を加えて反応（発色）を止めると反応液色は黄色を帯び、反応程度によって黄色の色合いが変わってくる。黄色を帯びる９６-ウェルプレート（９６-well plate）の吸光度を吸光計の４０５ｎｍで測定し、下記の数学式１によりコラゲナーゼの合成程度を計算した。このとき、組成物を処理していない群の細胞培養液の反応吸光度を対照群にした。

細胞におけるコラゲナーゼ発現の阻害を測定した結果、ｉｎｖｉｔｒｏで上記物質は表２のようにコラゲナーゼ発現を阻害していることが確認された。発現阻害能は対照群の生合成を１００にして対比したものである。

[試験例３] 動物に対する皮膚の第１次刺激試験
１）試験方法
健康な雄のウサギ６匹の各々の背中部位の毛を除毛した後、約２.５ｃｍ×２.５ｃｍ程度の大きさに左側区画は対照区画として何も塗布せず、右側区画には実施例１〜６の化合物の１％溶液（溶媒は１,３-ブチレングリコール:エタノール=７:３使用）を０.５ｍｌずつ塗布した。塗布してから２４時間乃至７２時間経過後、紅班、痂皮成、及び浮腫などの刺激性有無を観察した。皮膚反応の評価は、「医薬品などの毒性試験基準」を用いて点数化したのを表３に示す。また、評価結果に対する刺激性の判定は一般的によく用いられるDraizeの P.I.I.（Primary Irritation Index）の算出方法で行なっており、その結果をレチノイン酸と比較して表４に示す。

上記表４から、上記実施例の１〜６の化合物は皮膚刺激のないことを確認することができる。
特に、本発明によるレチノイドとしてコウジ酸誘導体の優れた特徴で、既存のレチノ−ルあるいはレチノイン酸と比べてシワ改善効果は同等のレベルを維持しながらも安定性に優れ且つ刺激が少ない。

[試験例４] 光毒性の試験
白色のモルモット（guinea pig）１０匹の背中部位を除毛した後、固定器で固定して背中両側に２ｃｍ×２ｃｍの区画でそらぞれ３部位ずつ６部位を決めて、右側区画を光遮断の対照部位にし、左側区画を光走査部位にした。陰性対照群として賦形剤（vehicle; １,３-ブチレングリコール:エタノール=７:３使用）を、陽性対照群として０.１％８-MOP（methoxypsoralene）を用いて実施例１〜６の化合物の１％（ｗ／ｖ）溶液をそれぞれ５０μｌずつ均等に塗布した。３０分後に動物の左側部位をアルミニウムホイルで遮光し、紫外線装置（Waldmann）を用いてＵＶＡ（３２０〜３８０ｎｍ）で約１０ｃｍの距離から最終エネルギーが１５Ｊ/ｃｍ²となるよう走査した後、２４、４８及び７２時間が経過した後モルモットの皮膚反応を観察した。皮膚反応の評価は、下記の表５に示すように、紅班と浮腫をそれぞれ０〜４までに点数化して合計を出して評価した。評価は、２４時間後、４８時間後、７２時間後ごとにそれぞれ判定を行なった際、一番高い数値を選択し、下記数学式２のように動物皮膚刺激指数（Irritation index）を求めた後、数学式３によって光毒性指数（Phototoxic index）を計算した。その結果を下記の表５に示す。

上記表５からも分かるように、上記実施例１〜６の化合物の光毒性指数は０となっており、一般に光毒性がないと判定される基準の０.５より遥かに低い数値であることを確認した。

[試験例５] エームズテスト（Ames test）
試験菌株としては、ＴＡ９８、ＴＡ１００でサルモネラ菌を用いた復帰突然変異試験を行った結果、本試験の条件下で陰性を示し試験菌株の突然変異は誘発されなかった。つまり、サルモネラ菌においても突然変異が誘発されない程刺激性のないことを確認した。

[試験例６] 人体パッチテスト
過去に、皮膚刺激に敏感でない平均年齢２４.８才の健康な女性と男性３０名を対象に、ＣＴＦＡ Guideline（The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc. Washington, D.C. ２００３６, １９９１）に従って下記の通り実施した。まず、実施例１〜６の化合物のそれぞれを表６のように構成されるパッチベースに１％比率に溶解した試験物質２０μｌずつをフィンチェンバー（Finn Chamber）内に滴加した後、試験部位である前膊皮膚に貼り付けてマイクロテープ（micro tape）で固定した。貼布は２４時間塗布しておくが、それを取り外した後にはマーキングペン（marking pen）で試験部位を表示しておく。貼布してから１時間経過及び２４時間経過ごとに試験部位を観察した。皮膚反応を表７に従って評価し、その結果を表８に示す。

表８の平均反応度は、下記の数学式４によって求めた。

上記表８に示すように、本発明によるシワ改善組成物の平均反応度の評価結果はいずれも０〜０.８３で、一般的な非刺激判定の基準である１より低く人体に安全な組成物と言える。

以上のように、本発明のコウジ酸誘導体は、コラーゲン生合成の促進及びコラゲナーゼを抑制する効果を有する上皮膚刺激及び皮膚毒性がなく、シワ改善用の医薬品及び皮膚外用剤として有用に活用できる。

Claims

下記化学式１で表されるコウジ酸誘導体:

（式中、Ｒ₁は、-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は、 -Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ₂-, -ＣＨ＝ＣＨＣ(Ｏ)ＯＣＨ₂- または-ＣＨ＝ＣＨ-である。）
（１）コウジ酸２位ヒドロキシメチル基のヒドロキシをハロゲン元素に置換してハロゲン化コウジ酸を製造する段階；
（２）安息香酸または桂皮酸を極性溶媒で無機塩基と反応させて安息香酸塩または桂皮酸塩を製造する段階；
（３）前記ハロゲン化コウジ酸と安息香酸塩または桂皮酸塩を反応させる段階；
を含む下記化学式１で表されるコウジ酸誘導体の製造方法。

（式中、Ｒ₁は、-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は、-Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ₂-または-ＣＨ＝ＣＨＣ(Ｏ)ＯＣＨ₂-である。）
（１）コウジ酸２位ヒドロキシメチル基のヒドロキシをハロゲン元素に置換してハロゲン化コウジ酸を製造する段階；
（２）前記ハロゲン化コウジ酸とトリフェニルホスフィンを反応させてホスホニウム塩を形成する段階；
（３）前記ホスホニム塩と３，４-メチレンジオキシベンツアルデヒドまたは３，４-エチレンジオキシベンツアルデヒドを反応させる段階；
を含む下記化学式１で表されるコウジ酸誘導体の製造方法。

（式中、Ｒ₁は、-ＣＨ₂-または-ＣＨ₂ＣＨ₂-であり、Ｒ₂は、-ＣＨ＝ＣＨ-である。）
請求項２または３において、前記ハロゲン元素は、ブロム、塩素またはヨウ素であることを特徴とするコウジ酸誘導体の製造方法。
請求項１に記載のコウジ酸誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤の組成物。
請求項１乃至４に記載の方法で製造されるコウジ酸誘導体を含有することを特徴とする外用剤組成物。
請求項１に記載のコウジ酸誘導体または請求項２乃至４に記載の方法で製造されるコウジ酸誘導体を皮膚に塗布することを特徴とする皮膚のシワ改善方法。