JP2005520545A - 抗細菌剤 - Google Patents
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Abstract
細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含むバクテリオファージのパネル。上記のバクテリオファージのパネルを含む薬学的組成物。細菌に感染された患者または部位から細菌の試料を得て、細菌の1つまたは複数のファージ感受性特徴を判定し、判定過程からの特徴を、細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージおよび細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含むバクテリオファージの各ライブラリーの既知の宿主域と比較して、そして細菌を死滅するのに適したパネルから1つまたは複数のバクテリオファージを判定することによる細菌を死滅するのに適したバクテリオファージの判定方法。
Description
本出願は、vir突然変異体を含むバクテリオファージのパネル(panel)、このような突然変異体を含有する組成物、バクテリオファージのこのようなパネルを判定し、生成する方法に、ならびに細菌感染を治療し、予防するための抗細菌薬としてのこのようなパネルの使用に関する。
化学的ベースの抗生物質(即ち非ウイルス薬)の形態の抗細菌薬、例えばペニシリンまたはテトラサイクリンがよく知られている。このような抗生物質に伴う問題は、それらに対する耐性が漸増的に一般的になることである。抗生物質耐性を付与する突然変異または抗生物質耐性酵素、例えばペニシリナーゼをコードする遺伝子は、病原性細菌において世界中で漸増的に一般的になりつつある。例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)細菌は、しばしば病院で他の原因のために手術中に獲得される感染の漸増的一般形態である。MRSA感染は、慣用的抗生物質を用いて治療するのが非常に難しい。
細菌感染を治療する代替的一アプローチは、バクテリオファージとして既知のウイルスに細菌を感染させることである。このような「バクテリオファージ療法」は、20世紀初頭に始めて開発されたが、しかし、1940年代における抗生物質の出現以来、西欧ではほとんど用いられてこなかった。より広範な研究は、東欧において実行されてきた。
バクテリオファージ(「ファージ」としても既知である)は、特定種類の細菌細胞に特異的である。重要な細胞内機構における、ならびに細胞表面構成成分における大きな差異のために、それらはより複雑な生物体の細胞に感染できない。ほとんどのバクテリオファージは、それらの標的細菌の表面の特定の分子にバクテリオファージを結合させる構造物、例えば尾部を有する。その場合、バクテリオファージ内のウイルスDNAは尾部を通して宿主細胞中に注入され、これが次に新規のバクテリオファージの産生を指図する。
異なる細菌に感染する異なる種類のバクテリオファージが見出される。慣用的には、それらは特定の細菌が増殖する環境から、例えば汚水または糞便から単離され得る。バクテリオファージの存在は、適切な増殖培地中で細菌を増殖させ、増殖培地を回転させて細菌からブロスの液体部分を分離して、フィルターを細菌が通り抜けるのを防止するのに十分小さい孔を有するフィルターに分離液を通すことにより確定される。濾過抽出物は通常は、増殖培地と混合され、細菌が付加されて、次に例えば寒天プレート上に広げられる。その結果生じる細菌のローン(lawn)上のプラークと呼ばれる明瞭なスポットの存在は、細菌を溶解させる1つまたは複数のバクテリオファージの存在を示す。
細菌を死滅し得るだけであるバクテリオファージは、「溶菌性」バクテリオファージとして既知である。溶菌性バクテリオファージは、タンパク質コートにより取り囲まれた核酸物質、しばしばDNAの形態で、細菌細胞の外側に存在する。タンパク質コートは通常はそれに結合される1つまたは複数の分子を有し、これが細菌の表面の特定分子にバクテリオファージを結合させる。細菌との結合時に、DNAは、それが転写され、新規のバクテリオファージの複製およびアセンブリーに必要な種々のタンパク質に翻訳される細菌宿主中へ入り込む。DNAはさらにまた複製され、細菌細胞の溶解時に放出される新規のバクテリオファージ中に包装される。
溶菌性バクテリオファージのほかに、テンペレートまたは溶原性バクテリオファージが存在する。これらのテンペレートバクテリオファージは2つのライフサイクルを有し、そ
の1つでは、それらは感染細胞を溶解させ、そして他の場合には、それらはプロファージ段階に入る。溶菌性バクテリオファージは常に、外側から感染し、宿主細胞を再プログラム化し、そして開口放出(breaking open)または溶解によりバクテリオファージのバー
ストを放出しなければならない。これらの「溶原性」バクテリオファージは、宿主細菌DNA中にそれらのDNAを組み込んで、特定細菌およびその子孫内のプロファージとして事実上恒久的な会合をもたらす。いくつかのプロファージは物理的に染色体中に組み込まれないが、しかし自律レプリコンとして存在する。プロファージは、それ自体の、そして任意の密接に関連した溶原性バクテリオファージの遺伝子の発現を遮断するリプレッサーの合成を指図する。時折、プロファージはそのリプレッサーによる調節を免れ得る。次にプロファージDNAは部位特異的組換えによりゲノムから切り取られ、複製されて、その子孫が、ほとんどの場合溶解により、宿主細胞から放出され得る。
の1つでは、それらは感染細胞を溶解させ、そして他の場合には、それらはプロファージ段階に入る。溶菌性バクテリオファージは常に、外側から感染し、宿主細胞を再プログラム化し、そして開口放出(breaking open)または溶解によりバクテリオファージのバー
ストを放出しなければならない。これらの「溶原性」バクテリオファージは、宿主細菌DNA中にそれらのDNAを組み込んで、特定細菌およびその子孫内のプロファージとして事実上恒久的な会合をもたらす。いくつかのプロファージは物理的に染色体中に組み込まれないが、しかし自律レプリコンとして存在する。プロファージは、それ自体の、そして任意の密接に関連した溶原性バクテリオファージの遺伝子の発現を遮断するリプレッサーの合成を指図する。時折、プロファージはそのリプレッサーによる調節を免れ得る。次にプロファージDNAは部位特異的組換えによりゲノムから切り取られ、複製されて、その子孫が、ほとんどの場合溶解により、宿主細胞から放出され得る。
溶菌性バクテリオファージは、細菌感染を治療するために用いられてきた。単離溶菌性バクテリオファージは、それらが細菌を死滅する場合、創傷に適用されるかまたは静注されてきた。バクテリオファージの利点は、それらが自己複製し、100個やそこらの少数のバクテリオファージが百万個という多数の細菌を死滅させ得るという点である。バクテリオファージは単に、個体または環境からそれらを排除するまで、細菌を死滅することによりそれら自体を複製する。例えばWO 01/51066は、1つまたは複数の溶菌性バクテリオファージによる患者の治療方法を開示する。同様に米国特許第4,957,686号は、バクテリオファージによる虫歯の治療方法を開示する。
バクテリオファージの使用に伴って考え得る問題の1つは、患者自身の身体はしばしばバクテリオファージに対する免疫応答を有し、血中からバクテリオファージを排除する、という点である。米国特許第5,660,812号、米国特許第5,688,501号および米国特許第5,766,892号は全て、治療される患者の血中のバクテリオファージ半減期を改善するためのバクテリオファージの選択方法を示す。米国特許第5,811,093号は、バクテリオファージがより長い間動物の循環系中で生き残るよう、キャプシド(コーティング)タンパク質(キャプシドE)のうちの1つをコードする遺伝子の増幅を考察する。後者特許の場合、修飾は遺伝子内の点突然変異として判定される。
慣用的には溶原性バクテリオファージは、バクテリオファージ療法のための悪候補であると考えられてきた。これは、それらが細菌病原性に関与する遺伝子の移入を潜在的にもたらし得るためである。バクテリオファージの中には毒素遺伝子を保有するものもあり、それゆえ溶原菌はビルレンス増強を示し得る。しかしながら全てのテンペレートバクテリオファージがビルレンス遺伝子を保有するわけではない。さらにまた細菌遺伝子はバクテリオファージ感染中にある宿主から別の宿主に移入され、そしてこれらの遺伝子はビルレンス遺伝子を含み得る。第一の過程はバクテリオファージ変換と呼ばれ、第二の過程は形質導入と呼ばれる。したがって溶原性バクテリオファージの使用は伝統的には、溶原性バクテリオファージが他の細菌に対する病原性に関与する遺伝子を撒き散らし得る、という点で問題があると考えられてきた。しかしながら溶菌性バクテリオファージも形質導入を引き起こし得る。
溶菌性バクテリオファージは細菌感染を治療するために用いられてきたことは既知であるが、しかしいくつかの病原性細菌に関する溶菌性バクテリオファージは相対的に稀で、単離するのが難しいため、溶菌性バクテリオファージを判定することはしばしば非常に多くの時間を要する。
溶原性バクテリオファージはいくつかの細菌中により一般的に存在するように見える、と本発明人等は了解した。細菌の異なる菌株に感染するそれらの能力により、例えば細菌病原性に関与する任意の毒素またはその他の物質をコードする遺伝子のそれらの欠如により多数の異なる溶原性バクテリオファージを選択することによって、それらはバクテリオファージのパネルを構成し得る、と彼等は了解した。パネルの成員は、例えば同一細菌の異なる菌株を処置するために選択され得る。
ほとんどの溶原性細菌に伴う問題は、細胞に感染時に、バクテリオファージDNAはしばしば細菌のゲノム中に組み込まれて、細菌を死滅しないことである、と本発明人等は認識した。この問題は、パネル中に用いるために1つまたは複数の「vir」突然変異体を判定することにより克服される。このようなバクテリオファージ突然変異体は通常は、テンペレートバクテリオファージDNAのオペレーター領域に突然変異を含み、これがリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを妨げる。リプレッサータンパク質は普通は、プロファージが転写、翻訳されないよう、そして溶菌性周期に入らないよう、オペレーターと結合する。しかしながらvir突然変異体では、突然変異は、感染バクテリオファージDNAが転写、翻訳され、そして細菌の溶解を生じる事を意味する。
したがって、本発明の第一の態様は、細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異体を含むバクテリオファージのパネルを提供する。
溶原性バクテリオファージは通常は、インテグラーゼ、リソルバーゼ、トランスポサーゼ、エクシジオナーゼ(excisionase)、attP、複製の起点に関する1つまたは複数
の遺伝子および宿主細胞のゲノム内のプロファージの保持に関連したその他の遺伝子をコードするDNAを含む。
の遺伝子および宿主細胞のゲノム内のプロファージの保持に関連したその他の遺伝子をコードするDNAを含む。
(テンペレートバクテリオファージの)vir突然変異体は、野生型プロファージを保有する溶原性宿主に溶菌性的に感染し得るものである。vir突然変異体は好ましくは、野生型プロファージと比較した場合にリプレッサータンパク質に対する結合特異性低減をそれらが示すよう、突然変異させたプロファージDNAの転写を制御するバクテリオファージのDNA中に1つまたは複数の突然変異したオペレーター領域を含有する。理論的には、vir突然変異体は、リプレッサータンパク質遺伝子におけるドミナントネガティブな突然変異のために生じ得る。リプレッサータンパク質はオペレーター領域を調節し、そしてそれ自体、該バクテリオファージからであるか、あるいは異なるがしかし関連のバクテリオファージからであり得る。
細菌の第一の菌株および細菌の第二の菌株は、同一種の細菌であるかまたは異なる種の細菌であり得る。細菌の2つの菌株は、それらの中に異なるプロファージを有することにより区別可能であり得る。すでに示したように、細菌内のプロファージの存在は、同一バクテリオファージによる感染に対する防御を付与し、そして異なるがしかし関連するバクテリオファージに対する防御を付与し得る。したがって異なるバクテリオファージのパネルを有することは、2つまたはそれ以上のバクテリオファージのパネルが一連の細菌に対して有効であり得るかまたは単一バクテリオファージが特定の細菌を処置するためにパネルから選択され得るよう、1つまたは複数の異なるバクテリオファージが選択されるのを可能にする。
好ましくは細菌の各菌株は、動物または植物病原体、特にヒト病原体である。好ましくは細菌は、ブドウ球菌属(Staphylococcus)(特に黄色ブドウ球菌(S.aureus))、ヘリコバクター属(Helicobacter)(ピロリ菌(H.pylori))、クレブシエラ属(Klebsiella)、リステリア属(Liste
ria)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、エシェリキア属(Escherichia)(好ましくは大腸菌(E.coli)、特に大腸菌0157(E.coli0157))、髄膜炎菌(meningococcus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、連鎖球菌属(Streptococcus)、腸球菌属(Enterococcus)、赤痢菌属(Shigella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バルクホルデリア属(Burkholderia)、クロストリジウム属(Clostridium)、レジオネラ属(Legionella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)またはサルモネラ属(Salmonella)である。好ましくはパネルは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35または少なくとも40の異なるバクテリオファージを含有する。好ましくはバクテリオファージのパネルの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%がvir突然変異体である。パネルは、1つまたは複数の溶菌性バクテリオファージも含み得る。
ria)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、エシェリキア属(Escherichia)(好ましくは大腸菌(E.coli)、特に大腸菌0157(E.coli0157))、髄膜炎菌(meningococcus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、連鎖球菌属(Streptococcus)、腸球菌属(Enterococcus)、赤痢菌属(Shigella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バルクホルデリア属(Burkholderia)、クロストリジウム属(Clostridium)、レジオネラ属(Legionella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)またはサルモネラ属(Salmonella)である。好ましくはパネルは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35または少なくとも40の異なるバクテリオファージを含有する。好ましくはバクテリオファージのパネルの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%がvir突然変異体である。パネルは、1つまたは複数の溶菌性バクテリオファージも含み得る。
パネルは、少なくとも1つの宿主域変異突然変異型バクテリオファージを含み得る。宿主域変異突然変異体は、原宿主細菌からの単離時に、細菌の第二の菌株に感染できないが、しかし突然変異因子による突然変異時に、細菌の第二の菌株に感染し得るようになるバクテリオファージである。
好ましくは細菌の少なくとも1つの菌株は、1つまたは複数の抗生物質に耐性である。抗生物質とは、1つまたは複数の化学的抗生物質をわれわれは意味する。それは、細胞に感染し得る機能性ウイルスではない。抗生物質としては、ペニシリン、テトラサイクリンおよびアミノグリコシドが挙げられる。あるいは細菌の菌株は、抗生物質耐性である必要はない。
本発明の第一の態様で明記したように、バクテリオファージのパネルを含む薬学的組成物は、任意に薬学的に許容可能な担体と組合せて提供される。このような担体は、バクテリオファージのパネルを治療される動物または患者の一部に適用させるか、または治療される患者または動物内に配置させる。
投与経路としては、経口、鼻、耳、静脈内、筋内、腹腔内、髄腔内、膣、直腸、局所的、腰椎穿刺により、あるいは脳またはその関連膜への直接適用が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、鼻噴霧剤として用いるためのエーロゾルのようなデバイスまたは吸入器により達成され得る。さらに薬学的組成物は、錠剤または座薬に製造され得る。
好ましくは薬学的組成物は、例えばパネルまたはバクテリオファージと、バクテリオファージを創傷にまたは鼻腔に局所的に適用させるための適切なクリームとを混合することにより、局所適用に適合される。このようなクリームとしては、当該技術分野で既知の型のパラフィンおよびラノリンベースのクリームが挙げられる。好ましくはバクテリオファージは、帯具または創傷用包帯中に組入れられ得る。
バクテリオファージは、消耗品、例えば石鹸、ハンドクリームまたは顔用クリーム、シェービングクリームおよびフォーム,デンタルフロス、歯磨き粉、練り歯磨き等に混入され得る。これは、例えば洗浄により皮膚疾患、例えばニキビの治療を、あるいは例えばバクテリオファージをしみ込ませた練り歯磨きで歯をブラッシングすることにより虫歯の治療を可能にする。
医薬品としてのまたは予防における本発明の薬学的組成物の使用も、本発明の範囲内に含まれる。本発明に従ってバクテリオファージのパネルを用いてヒト、動物または植物の
細菌感染を治療する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
細菌感染を治療する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
バクテリオファージのパネルは、それらが疾患を引き起こす前に、無症候的に保有されている細菌を死滅するために予防薬として用いられ得る。例えば細菌は、全身感染および膿瘍を生じ得るメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であり得る。これらの細菌は、いかなる見掛けの疾患症候も引き起こすことなく、鼻腔中に生息し得る。しかしながら細菌はヒトからヒトに伝播し得るし、免疫能力低下を示すヒトにおいて疾患を引き起こし得る。したがって細菌死滅は、疾患の防止に役立つ。バクテリオファージのパネルは、鼻への塗布により局所クリーム中で簡単に適用され得る。
バクテリオファージのパネルは、抗細菌薬または消毒薬として、適切な担体と組合せても用いられ得る。このような抗細菌組成物は、消毒される表面、例えば床に簡単に適用され得る。あるいは消毒される器具、例えば外科器具は、バクテリオファージのパネルを含有する適切な抗細菌溶液中に簡単に置かれ得る。このような器具を構成する物質も、このようなバクテリオファージを混入し得る。
さらにバクテリオファージのパネルは、結合、接着または共重合化といった技法により、プラスチックのような物質中に混入され得る。物質は次に、カテーテルまたはカニューレ等のような器具を構成するために用いられ得る。同様に、バクテリオファージのパネルは一旦生成されたこのような器具中に組入れられ得る。
好ましくはバクテリオファージのパネルは、細菌の多数の異なる菌株の処置または消毒を可能にするために、2つまたはそれ以上の異なるバクテリオファージを含有する。
あるいは処置または消毒される細菌の試料が得られ、細菌が判定され、そしてその細菌を死滅するのに適したバクテリオファージがバクテリオファージのパネルから選択される。
バクテリオファージは、ミルクおよび乳製品を処理するためにも用いられ得る。関連機能において、パネルバクテリオファージは、搾乳クラスター中にパネルを混入することにより、または乳首への局所適用のための塗布を用いることにより、乳腺炎を防止または治療するためにも用いられ得る。
本発明のさらなる態様は、細菌の死滅に適したバクテリオファージの判定方法であって、
(i)細菌に感染した患者、動物または場所から細菌の試料を得て、
(ii)細菌の1つまたは複数のファージ感受性特徴を判定し、
(iii)過程(ii)の特徴をバクテリオファージのライブラリーの各バクテリオファージの既知の宿主域と比較し、ここで、バクテリオファージのライブラリは、細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含み、そして
(iv)細菌の死滅に適したパネルから1つまたは複数のバクテリオファージを判定する、過程
を包含する方法を提供する。
(i)細菌に感染した患者、動物または場所から細菌の試料を得て、
(ii)細菌の1つまたは複数のファージ感受性特徴を判定し、
(iii)過程(ii)の特徴をバクテリオファージのライブラリーの各バクテリオファージの既知の宿主域と比較し、ここで、バクテリオファージのライブラリは、細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含み、そして
(iv)細菌の死滅に適したパネルから1つまたは複数のバクテリオファージを判定する、過程
を包含する方法を提供する。
バクテリオファージライブラリーは、本発明の第一の態様のパネルへの付加的成員を含有するバクテリオファージの収集物であり得る。
細菌の特徴の1つは、プロファージの存在または非存在であり得る。プロファージの存
在は、細菌からのプロファージDNAの一部を増幅するためのプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により確定され得る。
在は、細菌からのプロファージDNAの一部を増幅するためのプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により確定され得る。
本発明のさらなる態様は、高度にストリンジェントな条件下でプロファージヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る一対のプライマーを提供する細菌中のプロファージの存在を判定し、そしてPCRを実行して、プロファージの存在を判定する方法を提供する。
PCRはプロファージDNAの一部を増幅し、これは次に慣用的シーケンシング技法を用いてシーケンシングされ得る。
好ましくはプライマーは、インテグラーゼのようなプロファージ特異的配列に特異的である。
高度なストリンジェントには、例えば2mMのMgCl2および48℃アニーリング温度が含まれる。
本発明のさらなる態様は、機械読取り可能データでコードされたデータ保存物質を含む機械読取り可能データ保存媒体を提供し、この場合、データは、本発明に明記されたようなバクテリオファージのパネルまたはライブラリー中の各バクテリオファージの1つまたは複数の特徴を明示する。データ保存媒体は、フロッピー(登録商標)ディスク、CD−ROM、コンピューターメモリーまたはいくつかのその他の機械読取り可能媒体であり得る。データは好ましくは、1つまたは複数の適切なバクテリオファージの選択を可能にして、細菌感染の治療または細菌汚染の消毒を可能にする。
本発明は、本発明の第一の態様によるバクテリオファージのパネルの生成方法であって、第一のドナー細菌を単離し、1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、テンペレートバクテリオファージを突然変異化し、そしてバクテリオファージの1つまたは複数のvir突然変異体を単離することを包含する方法も、その範囲内に提供する。
好ましくは、パネルの生成方法は
(i)第一のドナー細菌を単離し、
(ii)第一の細菌をバクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)第一のドナー細菌から得られたテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定されたテンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)第一のドナー細菌を第二のドナー細菌にて、過程(iv)の突然変異させたバクテリオファージとともに培養し、それにより一次ドナー細菌を溶解し得るvir突然変異体を判定する、過程
を包含する。
(i)第一のドナー細菌を単離し、
(ii)第一の細菌をバクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)第一のドナー細菌から得られたテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定されたテンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)第一のドナー細菌を第二のドナー細菌にて、過程(iv)の突然変異させたバクテリオファージとともに培養し、それにより一次ドナー細菌を溶解し得るvir突然変異体を判定する、過程
を包含する。
あるいは過程(ii)の代わりに、バクテリオファージの誘導および単離が化学的または物理的因子によりもたらされ得る。
(i)所望の第一のドナー細菌を単離し、
(ii)前記第一の細菌をバクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)前記第一のドナー細菌から得られた1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)過程(iv)から得られた突然変異させたテンペレートバクテリオファージを、バクテリオファージに以前感染されていない細菌の第三の菌株とともに培養し、それにより1つまたは複数の宿主域変異バクテリオファージを判定すること
により、宿主域変異突然変異体が、バクテリオファージのパネルを生成し得る。
(ii)前記第一の細菌をバクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)前記第一のドナー細菌から得られた1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)過程(iv)から得られた突然変異させたテンペレートバクテリオファージを、バクテリオファージに以前感染されていない細菌の第三の菌株とともに培養し、それにより1つまたは複数の宿主域変異バクテリオファージを判定すること
により、宿主域変異突然変異体が、バクテリオファージのパネルを生成し得る。
用いられる突然変異原は、好ましくはヒドロキシルアミンである。その他の突然変異原、例えば紫外線およびその他の既知のDNA突然変異原が用いられ得る。
あるいは過程(ii)の代わりに、バクテリオファージの誘導および単離が化学的または物理的因子によりもたらされ得る。
しばしば見出されるさらなる問題は、植物または動物、例えばヒト患者が抗生物質耐性感染に罹患していることが判明する場合である。細菌病原体を単離し、その細菌内の任意の溶原性バクテリオファージを判定し、そして細菌病原体からの溶原性バクテリオファージを突然変異させて溶原性バクテリオファージのvir突然変異体を生成する、と本発明人等は了解した。このvir突然変異体は次に、1つまたは複数の適切な薬学的に許容可能な担体と混合され、そしてそられは細菌感染を治療するために用いられ得る。したがってその自身の細胞内からの細菌病原体自体のプロファージは、それを死滅するために用いられ得る。
このような方法により判定されたvir突然変異体は次に、本発明の第一の態様に明記されたようなパネルに付加される。
本発明を実施例のみによりここで説明する。
テンペレートスタフィロファージの同時培養および単離
2つの黄色ブドウ球菌単離物(SAI)を含有する一晩培養を37℃で一晩培養(o/n)し、次に5000rpmで1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA1
2遠心機で遠心分離後に、滅菌濾過(0.22μm)した。これらのSAIのうちの1つは、培養菌株と呼ばれ、そして第二のものは、ドナー菌株と呼ばれる。100μlの濾液を培養菌株のo/n培養100μlに付加し、次に室温(RT)で40分間インキュベートした。3mlの上層寒天を同時培養に付加した。次に混合物をルリアブロス(LB)(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Approach. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press)+10mMのMg2++8mMのCa2+プレート上に注ぎ、37℃o/nでインキュベートした。プラークを摘み取り、PBS+10mMのMg2+中で4℃でo/nインキュベートし、次にLB+Mg2++Ca2+プレート上にストリークした。培養菌株(100μlの培養菌株o/n+上層寒天)のローンをストリークプレート上に注いだ。プラークをストリークプレートから摘み取って、必要になるまで4℃でクロロホルム上に保存した。
2つの黄色ブドウ球菌単離物(SAI)を含有する一晩培養を37℃で一晩培養(o/n)し、次に5000rpmで1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA1
2遠心機で遠心分離後に、滅菌濾過(0.22μm)した。これらのSAIのうちの1つは、培養菌株と呼ばれ、そして第二のものは、ドナー菌株と呼ばれる。100μlの濾液を培養菌株のo/n培養100μlに付加し、次に室温(RT)で40分間インキュベートした。3mlの上層寒天を同時培養に付加した。次に混合物をルリアブロス(LB)(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Approach. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press)+10mMのMg2++8mMのCa2+プレート上に注ぎ、37℃o/nでインキュベートした。プラークを摘み取り、PBS+10mMのMg2+中で4℃でo/nインキュベートし、次にLB+Mg2++Ca2+プレート上にストリークした。培養菌株(100μlの培養菌株o/n+上層寒天)のローンをストリークプレート上に注いだ。プラークをストリークプレートから摘み取って、必要になるまで4℃でクロロホルム上に保存した。
突然変異誘発および突然変異体単離
ヒドロキシルアミン突然変異
細菌無含有濾過バクテリオファージストック0.2mlに、EDTA緩衝液(0.5MのKPO4(pH6.0)+5mMのEDTA)0.4ml+滅菌水(sH2O)0.2ml+滅菌0.2MのMgSO40.1ml+ヒドロキシルアミン溶液0.8mlを付加した。4MのNaOH0.56mlをNH2OH0.35gに付加してヒドロキシルアミン溶液(1MのNH2OH(pH6.0))を新たに作り、sH2O(滅菌水)で最終容
積を5mlとした。これを、37℃で31時間インキュベートした。バクテリオファージストックを0.2mlの滅菌sH2Oに置き換えた対照混合物を作製した。31時間インキュベーション後、混合物を透析管中のLB+10mMのMgSO4+8mMのCa(NO3)28mlに付加した。管を500ml円錐フラスコ中に入れ、これに300mlのLB+Mg2++Ca2+を付加した。これを4℃で7時間放置した。LB+Mg2++Ca2+を2回および3回取り替えた。3回目は、2回目の4℃で7時間インキュベーション後であった。バクテリオファージストックを滅菌万能瓶中に入れて、LB+Mg2++Ca2+中で4℃で3回目の7時間インキュベーション後、4℃で保存した。
ヒドロキシルアミン突然変異
細菌無含有濾過バクテリオファージストック0.2mlに、EDTA緩衝液(0.5MのKPO4(pH6.0)+5mMのEDTA)0.4ml+滅菌水(sH2O)0.2ml+滅菌0.2MのMgSO40.1ml+ヒドロキシルアミン溶液0.8mlを付加した。4MのNaOH0.56mlをNH2OH0.35gに付加してヒドロキシルアミン溶液(1MのNH2OH(pH6.0))を新たに作り、sH2O(滅菌水)で最終容
積を5mlとした。これを、37℃で31時間インキュベートした。バクテリオファージストックを0.2mlの滅菌sH2Oに置き換えた対照混合物を作製した。31時間インキュベーション後、混合物を透析管中のLB+10mMのMgSO4+8mMのCa(NO3)28mlに付加した。管を500ml円錐フラスコ中に入れ、これに300mlのLB+Mg2++Ca2+を付加した。これを4℃で7時間放置した。LB+Mg2++Ca2+を2回および3回取り替えた。3回目は、2回目の4℃で7時間インキュベーション後であった。バクテリオファージストックを滅菌万能瓶中に入れて、LB+Mg2++Ca2+中で4℃で3回目の7時間インキュベーション後、4℃で保存した。
死滅曲線
99.9%死滅(31時間)を時間経過を通して確定した。適切な時点で試料を採取した。試料をLB+Mg2++Ca2+中に希釈し、連続希釈した。希釈液を、室温で40分間、100μlの等容積の培養菌株とともにインキュベートした。この混合物に上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プレートを37℃でo/nインキュベートした後、プラークを計数した。プラーク形成単位(pfu)での103倍低下を99.9%死滅と確定した。
99.9%死滅(31時間)を時間経過を通して確定した。適切な時点で試料を採取した。試料をLB+Mg2++Ca2+中に希釈し、連続希釈した。希釈液を、室温で40分間、100μlの等容積の培養菌株とともにインキュベートした。この混合物に上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プレートを37℃でo/nインキュベートした後、プラークを計数した。プラーク形成単位(pfu)での103倍低下を99.9%死滅と確定した。
ビルレンス(vir)突然変異体の単離
発現および濃化過程後に、ビルレンス(vir)突然変異体を単離した。1mlのヒドロキシルアミン処理バクテリオファージおよび1mlのo/n培養菌株を15mlのLB+Mg2++Ca2+に付加し、37℃でインキュベートした。1時間後、1mlのo/n供給源菌株を付加した。一晩インキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分離し、滅菌濾
過(0.22μm)した。フィルターは、細菌が通過するには小さ過ぎるがしかしバクテリオファージに対するバリアではない0.22μm孔を含有し、それゆえ濾液は細菌を欠くがしかしバクテリオファージを含有する。100μlの濾液を100μlo/n供給源菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。o/nインキュベーション後、ガラスピペットを用いて単一プラークを摘み取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフ管に栓を付加し、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。滅菌ループを用いて、2つのLB+Mg2++Ca2+プレート上にストックをストリークした。一方の上には、供給源菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを注ぎ、二番目のものの上には、培養菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)の芝を付加した。これらを37℃でo/nインキュベートした。供給源菌株および培養菌株の両方に感染し得た場合には、そのバクテリオファージを推定vir突然変異体と確定した。純度を保証するために、ガラスピペットを用いて供給源SAIプレートから単一プラークを取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。これを前と同様にアンダーストリーク(under-streaked)し、インキュベートして、再採取し、撹拌して、4℃で保存した。
発現および濃化過程後に、ビルレンス(vir)突然変異体を単離した。1mlのヒドロキシルアミン処理バクテリオファージおよび1mlのo/n培養菌株を15mlのLB+Mg2++Ca2+に付加し、37℃でインキュベートした。1時間後、1mlのo/n供給源菌株を付加した。一晩インキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分離し、滅菌濾
過(0.22μm)した。フィルターは、細菌が通過するには小さ過ぎるがしかしバクテリオファージに対するバリアではない0.22μm孔を含有し、それゆえ濾液は細菌を欠くがしかしバクテリオファージを含有する。100μlの濾液を100μlo/n供給源菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。o/nインキュベーション後、ガラスピペットを用いて単一プラークを摘み取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフ管に栓を付加し、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。滅菌ループを用いて、2つのLB+Mg2++Ca2+プレート上にストックをストリークした。一方の上には、供給源菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを注ぎ、二番目のものの上には、培養菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)の芝を付加した。これらを37℃でo/nインキュベートした。供給源菌株および培養菌株の両方に感染し得た場合には、そのバクテリオファージを推定vir突然変異体と確定した。純度を保証するために、ガラスピペットを用いて供給源SAIプレートから単一プラークを取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。これを前と同様にアンダーストリーク(under-streaked)し、インキュベートして、再採取し、撹拌して、4℃で保存した。
vir対照
vir突然変異体として単離されたバクテリオファージが培養菌株から活性化されたプロファージでないことを保証するために、対照を実行した。15mlのLB+Mg2++Ca2+アリコートを供給源および培養菌株に植え付けた。37℃でo/nインキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分離し、滅菌濾過(0.22μm)した。100μlの濾液
を100μlo/n供給源菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プラークが37℃でo/nインキュベーション後に観察された場合には、vir突然変異誘発は実際に
行なわれなかった。
vir突然変異体として単離されたバクテリオファージが培養菌株から活性化されたプロファージでないことを保証するために、対照を実行した。15mlのLB+Mg2++Ca2+アリコートを供給源および培養菌株に植え付けた。37℃でo/nインキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分離し、滅菌濾過(0.22μm)した。100μlの濾液
を100μlo/n供給源菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プラークが37℃でo/nインキュベーション後に観察された場合には、vir突然変異誘発は実際に
行なわれなかった。
hrc(宿主域変異)突然変異体の単離
上記の発現および濃化過程後に、hrc突然変異体を単離した。いくつかの菌株はvir突然変異型バクテリオファージに感受性でなかった:vir耐性宿主(VRH)。1mlのヒドロキシルアミン処理バクテリオファージおよび1mlのo/n培養菌株を15mlのLB+Mg2++Ca2+に付加し、37℃でインキュベートした。1時間後、VRH菌株のo/n培養1mlを付加した。一晩インキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分
離し、滅菌濾過(0.22μm)した。100μlの濾液を100μlo/nVRH菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。ガラスピペットを用いて単一プラークを取った。100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。滅菌ループを用いて、3つのLB+Mg2++Ca2+プレート上にストックをストリークした。1つの上には、供給源菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを注ぎ、二番目のものの上には、培養菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを付加した。三番目には、VRH菌株(3mlの上層寒天+100μlのVRH菌株)のローンを付加した。これらを37℃でo/nインキュベートした。それがVRH菌株に感染し得た場合には、そのバクテリオファージを推定hrc突然変異体と確定した。供給源菌株または培養菌株に感染することは予期されなかった。純度を保証するために、ガラスピペットを用いて供給源菌株プレートから単一プラークを取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。これを前と同様にアンダーストリークし、インキュベートして、再採取し、撹拌して、4℃で保存した。
上記の発現および濃化過程後に、hrc突然変異体を単離した。いくつかの菌株はvir突然変異型バクテリオファージに感受性でなかった:vir耐性宿主(VRH)。1mlのヒドロキシルアミン処理バクテリオファージおよび1mlのo/n培養菌株を15mlのLB+Mg2++Ca2+に付加し、37℃でインキュベートした。1時間後、VRH菌株のo/n培養1mlを付加した。一晩インキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分
離し、滅菌濾過(0.22μm)した。100μlの濾液を100μlo/nVRH菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。ガラスピペットを用いて単一プラークを取った。100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。滅菌ループを用いて、3つのLB+Mg2++Ca2+プレート上にストックをストリークした。1つの上には、供給源菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを注ぎ、二番目のものの上には、培養菌株(3mlの上層寒天+100μlの供給源菌株)のローンを付加した。三番目には、VRH菌株(3mlの上層寒天+100μlのVRH菌株)のローンを付加した。これらを37℃でo/nインキュベートした。それがVRH菌株に感染し得た場合には、そのバクテリオファージを推定hrc突然変異体と確定した。供給源菌株または培養菌株に感染することは予期されなかった。純度を保証するために、ガラスピペットを用いて供給源菌株プレートから単一プラークを取った。次に100μlのPBS+Mg2++Ca2+を含有するエッペンドルフチューブに栓をし、撹拌して、4℃でo/nインキュベートした。これを前と同様にアンダーストリークし、インキュベートして、再採取し、撹拌して、4℃で保存した。
PBSは、Sambrook et al.に記載されている。
hrc対照
hrc突然変異体として単離されたバクテリオファージが培養または供給源菌株から活性化されたプロファージでないことを保証するために、対照を実行した。2つの接種物を15mlのLB+Mg2++Ca2+に以下のように付加した:
菌株「A」 菌株「B」
供給源 VRH
培養 VRH
hrc突然変異体として単離されたバクテリオファージが培養または供給源菌株から活性化されたプロファージでないことを保証するために、対照を実行した。2つの接種物を15mlのLB+Mg2++Ca2+に以下のように付加した:
菌株「A」 菌株「B」
供給源 VRH
培養 VRH
37℃でo/nインキュベーション後、培養を5000rpmで3分間、1116ローターを用いてHettich ZentrifugenEBA12遠心機で遠心分離し、滅菌濾過(0.22μ
m)した。100μlの濾液を100μlo/nVRH菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プラークが37℃でo/nインキュベーション後に観察された場合には、hrc突然変異誘発は実際に行なわれなかった。
m)した。100μlの濾液を100μlo/nVRH菌株に付加し、RTで40分間インキュベートした。この混合物に、上層寒天を付加し、LB+Mg2++Ca2+プレート上に注いだ。プラークが37℃でo/nインキュベーション後に観察された場合には、hrc突然変異誘発は実際に行なわれなかった。
塩化セシウム勾配によるバクテリオファージの精製
4mlのよどんだ一晩SAI培養を、やや角張った2リットル円錐フラスコ中のLB+Mg2++Ca2+の4つの400mlアリコートに付加し、37℃で撹拌(300rpm)した。1時間後、40μlのバクテリオファージ(2×107pfu)を撹拌培養に付加した。4時間後、培養を十分に溶解した。培養をプールし、固体NaClを付加して、最終濃度を1Mとした。氷上で1時間後、4℃で10分間、11000gで溶解培養を遠心分離した。
4mlのよどんだ一晩SAI培養を、やや角張った2リットル円錐フラスコ中のLB+Mg2++Ca2+の4つの400mlアリコートに付加し、37℃で撹拌(300rpm)した。1時間後、40μlのバクテリオファージ(2×107pfu)を撹拌培養に付加した。4時間後、培養を十分に溶解した。培養をプールし、固体NaClを付加して、最終濃度を1Mとした。氷上で1時間後、4℃で10分間、11000gで溶解培養を遠心分離した。
10%(w/v)PEG6000を混合物に溶解し、次にこれを4℃で氷上に一晩放置した。Sambrook et al.(1989)に明記されたようにローターを用いて4℃で10分間、1
1000gで遠心分離後に生成されたペレットを、4mlのPBS中に再懸濁した。等容積のクロロホルムを付加した。次に混合物を30秒間撹拌した。3000gで遠心分離後に、クロロホルムを除去した。塩化セシウム(CsCl)を付加して、最終濃度を0.5g/mlとした。懸濁液を、以下のCsCl密度:1.4、1.5および1.6g/PBS1mlを含有するポリプロピレン試験管中に作製したCsCl勾配の上部に置いた。試験管を4時間、22,000rpmで遠心分離した(ベックマン(Beckman)SW28)
。次にゲージ21針を注意深くポリプロピレン試験管の側面を通して挿入して、バクテリオファージ帯域を抽出した。7時間、PBS+Mg2++Ca2+中で3回反復透析して、CsClを除去した。精製バクテリオファージストックを、必要になるまで4℃で保存した。
1000gで遠心分離後に生成されたペレットを、4mlのPBS中に再懸濁した。等容積のクロロホルムを付加した。次に混合物を30秒間撹拌した。3000gで遠心分離後に、クロロホルムを除去した。塩化セシウム(CsCl)を付加して、最終濃度を0.5g/mlとした。懸濁液を、以下のCsCl密度:1.4、1.5および1.6g/PBS1mlを含有するポリプロピレン試験管中に作製したCsCl勾配の上部に置いた。試験管を4時間、22,000rpmで遠心分離した(ベックマン(Beckman)SW28)
。次にゲージ21針を注意深くポリプロピレン試験管の側面を通して挿入して、バクテリオファージ帯域を抽出した。7時間、PBS+Mg2++Ca2+中で3回反復透析して、CsClを除去した。精製バクテリオファージストックを、必要になるまで4℃で保存した。
インテグラーゼ特異的PCR
黄色ブドウ球菌単離物は、ほとんど常に、それらのDNA中に組み込まれた少なくとも1つのテンペレートバクテリオファージを含有することが示された。宿主DNA中に挿入可能なテンペレートバクテリオファージは、そうする手段を保有しなければならず、これは、最も頻繁には、宿主細菌DNA中へのバクテリオファージDNAの組込みを触媒する酵素インテグラーゼにより促される。
黄色ブドウ球菌単離物は、ほとんど常に、それらのDNA中に組み込まれた少なくとも1つのテンペレートバクテリオファージを含有することが示された。宿主DNA中に挿入可能なテンペレートバクテリオファージは、そうする手段を保有しなければならず、これは、最も頻繁には、宿主細菌DNA中へのバクテリオファージDNAの組込みを触媒する酵素インテグラーゼにより促される。
多数のPCRプライマーは、黄色ブドウ球菌に感染し得るバクテリオファージ内に特に見出されるインテグラーゼ遺伝子を増幅し、判定するよう設計された。このような技法は、他の細菌/バクテリオファージ系における同様に重要な遺伝子、例えばリソルバーゼ遺伝子(リステリア属バクテリオファージ取込みに重要)にも向けられ得る。細菌DNA内のインテグラーゼ遺伝子の存在は、病原性島のようなプロファージまたはファージ関連存在物の存在を示唆する。
PCRプライマーの設計時に、シーケンシングされた約27の黄色ブドウ球菌バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子が存在した。これらのインテグラーゼ遺伝子を一列に並べ、系統樹を作成することにより、それらの系統的関連性を確定した。この方法は、黄色ブドウ球菌内のバクテリオファージまたはバクテリオファージ関連存在物中に見出されるバクテリオファージインテグラーゼ遺伝子の8つの異なる「ファミリー」が存在すると思われる、ということを示した。したがって上記のプライマーを用いたPCR反応により、黄色ブドウ球菌DNA内に存在するバクテリオファージまたはバクテリオファージ関連素子のファミリーを、われわれは確定し得た。
PCRプライマー
特定ファミリーのインテグラーゼ遺伝子を増幅、判定するために用いたプライマーを、以下の示す:
ファミリー1 正方向:CGT CAA CTC GGA GAT ATG AA
ファミリー1 逆方向:GTA TCC GAA TCC TTC CTC GT
ファミリー2 正方向:ATT CGT TGC ACT CAT GAC AG
ファミリー2 逆方向:CTC GCA ACT TCT GCT ACT CA
ファミリー3 正方向:CTG TTG GCT ATG CAC GAT CT
ファミリー3 逆方向:CTG GGA ATA GGA GTT ACC GA
ファミリー4 正方向:GCA CCG TCC ACA TCT ACA TT
ファミリー4 逆方向:CTG CAC GCA TGC CTG TAT AT
ファミリー5 正方向:GCG TGA AGC TAA TTC TGC TG
ファミリー5 逆方向:ACT GAC ACG ACA ACC CGT AC
ファミリー6 正方向:GCG AAG CTA TGG CTC TTG TT
ファミリー6 逆方向:CAC GTT GAT GTC GTT CAG TT
ファミリー7 正方向:GCG AAT TGG TGA AGC TAC TG
ファミリー7 逆方向:AGC ATG AGA ATG CCG TAA CC
ファミリー8 正方向:GGC ACT ATC AAA GAG ACA AC
ファミリー8 逆方向:CTA CAT GCT CTT GCA TTG TC
特定ファミリーのインテグラーゼ遺伝子を増幅、判定するために用いたプライマーを、以下の示す:
ファミリー1 正方向:CGT CAA CTC GGA GAT ATG AA
ファミリー1 逆方向:GTA TCC GAA TCC TTC CTC GT
ファミリー2 正方向:ATT CGT TGC ACT CAT GAC AG
ファミリー2 逆方向:CTC GCA ACT TCT GCT ACT CA
ファミリー3 正方向:CTG TTG GCT ATG CAC GAT CT
ファミリー3 逆方向:CTG GGA ATA GGA GTT ACC GA
ファミリー4 正方向:GCA CCG TCC ACA TCT ACA TT
ファミリー4 逆方向:CTG CAC GCA TGC CTG TAT AT
ファミリー5 正方向:GCG TGA AGC TAA TTC TGC TG
ファミリー5 逆方向:ACT GAC ACG ACA ACC CGT AC
ファミリー6 正方向:GCG AAG CTA TGG CTC TTG TT
ファミリー6 逆方向:CAC GTT GAT GTC GTT CAG TT
ファミリー7 正方向:GCG AAT TGG TGA AGC TAC TG
ファミリー7 逆方向:AGC ATG AGA ATG CCG TAA CC
ファミリー8 正方向:GGC ACT ATC AAA GAG ACA AC
ファミリー8 逆方向:CTA CAT GCT CTT GCA TTG TC
PCR反応条件
この反応のために用いるアニーリング温度は48℃である。PCR反応は、30サイクルの一般的反応である。
この反応のために用いるアニーリング温度は48℃である。PCR反応は、30サイクルの一般的反応である。
8つの反応のためのPCRマスターミックスを、以下のように作製する:
1.5μlのTaqポリメラーゼ−Gibco Life Techから入手可能
4μlのdNTP(25μM)−Invitrogenから入手可能
40μlの10×緩衝液(200mMのトリスHCl、500mMのKCl、pH8.4)−Gibco Life Techから入手可能。16μlのMgCl2(50mM)
280μlの水(滅菌、脱イオン化)
3.2μlのプライマーマスターミックス(正および逆プライマー1:1比)(ストックは約10μMである)
1.5μlのTaqポリメラーゼ−Gibco Life Techから入手可能
4μlのdNTP(25μM)−Invitrogenから入手可能
40μlの10×緩衝液(200mMのトリスHCl、500mMのKCl、pH8.4)−Gibco Life Techから入手可能。16μlのMgCl2(50mM)
280μlの水(滅菌、脱イオン化)
3.2μlのプライマーマスターミックス(正および逆プライマー1:1比)(ストックは約10μMである)
次に45μlの上記のマスターミックスを試験される試料5μl(100μlの水中に懸濁された5μlの1コロニー)に加える。
PCRによりプロファージおよびファージ関連存在物が細菌中で検出され、判定される。
有志による鼻実験結果
MRSAの鼻における保因を制御するための局所適用vir突然変異させたバクテリオファージの効力を査定するために、以下の実験を意図した。
MRSAの鼻における保因を制御するための局所適用vir突然変異させたバクテリオファージの効力を査定するために、以下の実験を意図した。
方法
Ψ134/B1virを、2×108pfu/mlの濃度で、供給源菌株SAI134を鼻腔中に保有する健常有志の前鼻孔に適用した。MRSA陽性であるがしかしSAI134保因者でない第二の有志を、対照として用いた。対照有志に、バクテリオファージ以外の、非対照有志が摂取したもの全てを投与した。有志等はともに、同一体重および伸長の男性25歳であった。実験時には、両者は最終学年PhD学生で、同一分野で働き、同じ家で生活していた。両有志は、同一塗布および接種プロトコールを受けた。
Ψ134/B1virを、2×108pfu/mlの濃度で、供給源菌株SAI134を鼻腔中に保有する健常有志の前鼻孔に適用した。MRSA陽性であるがしかしSAI134保因者でない第二の有志を、対照として用いた。対照有志に、バクテリオファージ以外の、非対照有志が摂取したもの全てを投与した。有志等はともに、同一体重および伸長の男性25歳であった。実験時には、両者は最終学年PhD学生で、同一分野で働き、同じ家で生活していた。両有志は、同一塗布および接種プロトコールを受けた。
PBSベースのファージ溶液を、原綿芽(cotton-wool buds)により各鼻孔の前部分に適用した。原綿芽をPBSベースの溶液中に浸漬し、軽く水切りした。溶液を、継続期間中の各20分間の3回適用(0〜20、60〜80および120〜140分)で適用した。別個の原綿芽を各適用時に各鼻孔に導入し、円運動で溶液を適用して、鼻粘膜の最大被覆面積を保証した。
試料を三重反復実験で採取して、意図された時点(0、20、60、80、120、140分、8、18、24時間、2、3、4、5日)で、ベアードパーカープレート(Baird Parker plates)(黄色ブドウ球菌に関して選択的である)上にプレート化した。o/nインキュベーション後、プレートを観察し、存在するコロニー数を任意のスケールで等級分けした:0:コロニーなし;1:<10コロニー;2:10〜100コロニー;3:>100コロニー。
結果
細菌の平均数は、バクテリオファージを摂取した有志において急速に低減する、ということが分かる。細菌数は、この有志においては長期間低いままであった。5日目までに、黄色ブドウ球菌集団は、両有志において回復した。
結論
この予備実験は、記載された方法でのバクテリオファージの付加が有志の鼻腔中の黄色ブドウ球菌数を低減する、ということを示唆する。低減レベルは、アジュバント単独を用いる場合に観察されるよりも上である。細菌クリアランスを保証するためには、継続処置が必要である。
この予備実験は、記載された方法でのバクテリオファージの付加が有志の鼻腔中の黄色ブドウ球菌数を低減する、ということを示唆する。低減レベルは、アジュバント単独を用いる場合に観察されるよりも上である。細菌クリアランスを保証するためには、継続処置が必要である。
動物創傷モデル
Ψ134/B1virを、SAI134に感染したネズミ外科的創傷も出るに付加した場合、細菌の回復は有意に低減し、動物は感染の臨床的症状発現から防御された。動物実験は、2×108pfu/mlのバクテリオファージを用いた。
Ψ134/B1virを、SAI134に感染したネズミ外科的創傷も出るに付加した場合、細菌の回復は有意に低減し、動物は感染の臨床的症状発現から防御された。動物実験は、2×108pfu/mlのバクテリオファージを用いた。
バクテリオファージのパネルの生成
バクテリオファージパネルは、17の既知のEMRSA(流行性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)菌株を含むウォーリック大学SAIコレクションからの約100の細菌単離物、ならびに欧州全体からのそして最近の公的利用可能供給元、例えばNCIMBまたはATCCからのその他の黄色ブドウ球菌単離物に対して活性である。結局、細菌の菌株は国中の病院の患者から収集されて、細菌の菌株の大コレクションを得る、と予測される。
バクテリオファージパネルは、17の既知のEMRSA(流行性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)菌株を含むウォーリック大学SAIコレクションからの約100の細菌単離物、ならびに欧州全体からのそして最近の公的利用可能供給元、例えばNCIMBまたはATCCからのその他の黄色ブドウ球菌単離物に対して活性である。結局、細菌の菌株は国中の病院の患者から収集されて、細菌の菌株の大コレクションを得る、と予測される。
一旦テンペレートバクテリオファージが得られたら、ビルレント(vir)突然変異体を単離する。野生型およびvir突然変異体を、細菌の異なる菌株に対して試験する。少なくとも、例えば70%、80%、90%、95%、好ましくは100%の細菌株がvir突然変異体により制御され得る場合、パネル内のバクテリオファージを精製し、治療および/または予防用製品を生産するために組合せ得る。
生成物を標準薬局等級水性クリームと組合せて、製品の局所適用を可能にする。あるい
はその他の薬学的に許容可能な賦形剤を、バクテリオファージのパネルと混合し得る。
はその他の薬学的に許容可能な賦形剤を、バクテリオファージのパネルと混合し得る。
パネルまたはバクテリオファージは、出現し得る耐性細菌の新規の菌株に対処するために周期的に更新し得る。
バクテリオファージのパネルが無効である細菌の菌株が明らかになれば、その場合、細菌を単離し、そのプロファージを得ることができる。テンペレートバクテリオファージを単離し、vir突然変異体を細菌の新規の菌株に対して産生し、vir突然変異体をバクテリオファージのパネル中に組入れ得る。
バクテリオファージパネル中のバクテリオファージで、感染に関連した細菌に感染し得るものがいないというまれな状況では、細菌を単離し、個々のバクテリオファージをvir突然変異体を産生するよう突然変異させて、その感染を治療し得る。
Claims (28)
- 細菌の第一の菌株に感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株に感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含むバクテリオファージのパネル。
- 細菌の各前記菌株がヒトまたは動物または植物病原体である請求項1記載のパネル。
- 異なるバクテリオファージを含む請求項1記載のパネル。
- 少なくとも1つの宿主域変異突然変異型バクテリオファージを含む請求項1記載のパネル。
- 細菌の前記菌株のうちの少なくとも1つが1つまたは複数の抗生物質に耐性である請求項1記載のパネル。
- 請求項1記載のバクテリオファージのパネルを薬学的に許容可能な担体と組合せて含む薬学的組成物。
- 局所適用に適合される請求項6記載の薬学的組成物。
- 薬剤として使用するための請求項6記載の薬学的組成物。
- 予防のための請求項6記載の薬学的組成物の使用。
- 担体と組合せて請求項1記載のバクテリオファージのパネルを含む抗細菌組成物。
- 消毒剤としての請求項10記載の抗細菌組成物の使用。
- 防腐剤としての請求項10記載の抗細菌組成物の使用。
- 外科用または医療用デバイスの構成要素としての請求項10記載の抗細菌組成物の使用。
- 細菌の死滅に適したバクテリオファージの判定方法であって、
(i)前記細菌に感染した患者または場所から前記細菌の試料を得て、
(ii)前記細菌の1つまたは複数のファージ感受性特徴を判定し、
(iii)過程(ii)の前記特徴をバクテリオファージのライブラリーの各バクテリオファージの既知の宿主域と比較し、ここで、前記バクテリオファージのライブラリは、細菌の第一の菌株を感染し、溶解し得る第一のvir突然変異型バクテリオファージ、および細菌の第二の菌株を感染し、溶解し得る第二のvir突然変異型バクテリオファージを含み、そして、
(iv)前記細菌の死滅に適したパネルから1つまたは複数のバクテリオファージを判定する、過程
を包含する方法。 - 前記細菌中の1つまたは複数のプロファージの存在または非存在が、前記細菌からのプロファージDNAを増幅する一対のプライマーを用いてPCRにより決定される、請求項14記載の方法。
- 高度にストリンジェントな条件下でプロファージヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る一対のプライマーを含み、細菌中の1つまたは複数のプロファージの存在を判定するためにPCRを実行する、前記プロファージの存在を判定する方法。
- 機械読取り可能データでコードされたデータ保存物質を含む機械読取り可能データ保存媒体であって、前記データが請求項1に記載されたようなバクテリオファージのパネル中の各バクテリオファージの1つまたは複数の特徴を明示する媒体。
- 機械読取り可能データでコードされたデータ保存物質を含む機械読取り可能データ保存媒体であって、前記データが請求項14に記載されたようなバクテリオファージのライブラリー中の各バクテリオファージの1つまたは複数の特徴を明示する媒体。
- 請求項1記載のパネルの生成方法であって、ドナー細菌を培養し、前記ドナー細菌から1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、該テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして前記バクテリオファージの1つまたは複数のvir突然変異体を単離することを包含する方法。
- (i)第一の前記ドナー細菌を単離し、
(ii)第一の前記細菌を、バクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)第一の前記ドナー細菌から得られたテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、
(v)第一の前記ドナー細菌を過程(iv)で突然変異させたバクテリオファージとともに培養し、それにより第一の前記ドナー細菌を溶解し得るvir突然変異体を判定する、過程
を包含する請求項19記載のパネルの生成方法。 -
(i)第一の前記ドナー細菌を単離し、
(ii)化学的または物理的因子を用いて前記ドナー細菌を誘導し、それによりテンペレートバクテリオファージを生成し、
(iii)第一の前記ドナー細菌から得られたテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)第一の前記ドナー細菌を過程(iv)で突然変異させたバクテリオファージとともに培養し、それにより第一の前記ドナー細菌を溶解し得るvir突然変異体を判定する、過程
を包含する請求項19記載のパネルの生成方法。 - (i)所望の第一のドナー細菌を単離し、
(ii)第一の前記細菌を、バクテリオファージに感染され得る細菌の第二の培養菌株と同時培養し、
(iii)第一の前記ドナー細菌から得られた1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)過程(iv)で突然変異させたテンペレートバクテリオファージを、前記バクテ
リオファージに以前感染されていない細菌の第三の菌株とともに培養し、それにより1つまたは複数の宿主域変異バクテリオファージを判定すること
を包含する請求項1記載のバクテリオファージのパネルの生成方法。 - (i)所望の第一のドナー細菌を単離し、
(ii)化学的または物理的因子を用いて前記ドナー細菌を誘導し、それによりテンペレートバクテリオファージを生成し、
(iii)第一の前記ドナー細菌から得られた1つまたは複数のテンペレートバクテリオファージを判定し、
(iv)突然変異原を用いて過程(iii)で判定された前記テンペレートバクテリオファージを突然変異させ、そして
(v)過程(iv)で突然変異させたテンペレートバクテリオファージを、前記バクテリオファージに以前感染されていない細菌の第三の菌株とともに培養し、それにより1つまたは複数の宿主域変異バクテリオファージを判定すること
を包含する請求項1記載のバクテリオファージのパネルの生成方法。 - 細菌性病原体に感染した動物または植物を治療するためのバクテリオファージの判定方法であって、
(i)前記細菌性病原体を単離し、
(ii)前記細菌から溶原性バクテリオファージを単離し、そして
(iii)前記溶原性バクテリオファージを突然変異させ、それにより溶原性バクテリオファージのvir突然変異体を生成すること
を包含する方法。 - 前記vir突然変異体が1つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と混合される請求項24記載の方法。
- 前記細菌感染を治療するための方法により判定された前記vir突然変異体を用いる過程を包含する請求項24記載の方法。
- 請求項24記載の方法により判定されたvir突然変異体を含む請求項1記載のパネル。
- PCRによりバクテリオファージのインテグラーゼ遺伝子の存在を判定するためのプライマー対であって、以下のものから選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー対:
CGT CAA CTC GGA GAT ATG AA;GTA TCC GAA TCC TTC CTC GT
ATT CGT TGC ACT CAT GAC AG;CTC GCA ACT TCT GCT ACT CA
CTG TTG GCT ATG CAC GAT CT;CTG GGA ATA GGA GTT ACC GA
GCA CCG TCC ACA TCT ACA TT;CTG CAC GCA TGC CTG TAT AT
GCG TGA AGC TAA TTC TGC TG;ACT GAC ACG ACA ACC CGT AC
GCG AAG CTA TGG CTC TTG TT;CAC GTT GAT GTC GTT CAG TT
GCG AAT TGG TGA AGC TAC TG;AGC ATG AGA ATG CCG TAA CC
GGC ACT ATC AAA GAG ACA AC;CTA CAT GCT C
TT GCA TTG TC。
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