KR101790101B1 - 바실러스 안트라시스 박테리오파지 Bac-ANP-1 및 이의 바실러스 안트라시스 증식 억제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 안트라시스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 안트라시스 박테리오파지 Bac-ANP-1 및 이의 바실러스 안트라시스 증식 억제 용도{Bacillus anthracis bacteriophage Bac-ANP-1 and its use for preventing proliferation of Bacillus anthracis}

본 발명은 바실러스 안트라시스 균에 감염하여 바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지, 이를 유효성분으로 포함한 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 안트라시스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP), 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.

바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 균은 호기성 그람 양성 간균으로 운동성이 없으며 협막을 가지고 있다. 바실러스 안트라시스 균은 살아있는 숙주에서는 포자를 형성하지 않지만 열악한 환경에서는 저항력이 강한 포자를 형성한다. 바실러스 안트라시스 균은 ‘탄저’ 또는 ‘탄저병’으로 알려져 있는 감염성 질환의 원인균이다. 탄저병은 주로 초식동물 및 잡식동물에서 발생하는 급성, 열성전염병으로서 발열, 호흡곤란 등으로 갑자기 폐사를 유발하며 가축에서는 제2종 법정전염병으로 지정되어 있다. 바실러스 안트라시스 균은 사람에게도 감염하여 질병을 초래할 수 있는 인수공통 감염균으로 생물무기로도 악용되어질 수 있다. 바실러스 안트라시스 균 감염 질환은 감염경로에 따라 피부탄저, 호흡기탄저, 위장관탄저로 구분된다.

우리나라 탄저병 발생은 1907년에 최초 공식보고가 있은 이후에 1930년대까지 동물에서 흔히 발생하였으나 백신 개발 등으로 동물에서의 발병은 급격히 감소하여 최근은 거의 발생 사례가 없고 다만 산발적으로만 발생하고 있다. 그러나, 탄저균은 생물무기로 악용될 가능성이 높다. 생물테러 등에 있어서는 에어로졸 상태의 포자가 주로 이용되는데, 기도를 통해 들어온 바실러스 안트라시스 균이 상부 기도에 잠복해 있다가 폐 주위의 림프계에 침투하고 바실러스 안트라시스 균 독소는 폐 조직에 출혈, 괴사, 부종 등을 일으켜 초기에는 감기와 비슷한 증상을 일으키지만 결국에는 호흡 곤란에 의한 사망을 초래한다. 미국 Centers for Disease Control and Prevention(CDC)은 바실러스 안트라시스 균을 Category A에 포함시켜 위험성이 가장 높은 세균으로 취급하고 있다.

이러한 이유로 바실러스 안트라시스 균에 의한 생물테러나 생물학전을 대비해야 할 필요성이 있다. 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지나 처치 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 항생제 내성 바실러스 안트라시스 균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 효과적 방안의 확보가 시급한 실정이다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(Infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성은 목적으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경 오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 항생제 사용과는 달리 박테리오파지 사용에 의한 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 따른 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다. 특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 전 세계적으로 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있으며 산업적 활용 사례도 점차 증가하고 있다.

앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 개별 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 개별 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 바실러스 안트라시스 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법(감염 예방법 또는 감염 치료법)을 개발하기 위해서도 당연히 바실러스 안트라시스 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.

이에, 본 발명자들은 바실러스 안트라시스 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 바실러스 안트라시스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 안트라시스 균에 감염하여 바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 Bac-ANP-1을 유효성분으로 포함하는 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 안트라시스 균에 감염하여 바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 Bac-ANP-1을 유효성분으로 포함하는 바실러스 안트라시스 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 소독제(제독제)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 바실러스 안트라시스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.

박테리오파지 Bac-ANP-1은 본 발명자들에 의해 분리된 후 2015년 11월 3일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12942BP).

또한, 본 발명은 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Bac-ANP-1을 유효성분으로 포함하는 소독제(제독제) 및 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물에 포함되는 박테리오파지 Bac-ANP-1은 바실러스 안트라시스 균을 효과적으로 사멸시키므로 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물은 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (ⅰ) 바실러스 안트라시스 균 감염의 방지; 및 (ⅱ) 바실러스 안트라시스 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징들을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물에는 박테리오파지 Bac-ANP-1이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Bac-ANP-1은 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵ pfu/㎖ 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 소독제(제독제) 및 약학적 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 소독제, 제독제, 및 감염 치료제로 구현될 수 있다.

이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 바실러스 안트라시스 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 바실러스 안트라시스 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Bac-ANP-1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 바실러스 안트라시스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 인간 및 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 또한, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[바실러스 안트라시스 균에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 바실러스 안트라시스 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.

도 1은 박테리오파지 Bac-ANP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Bac-ANP-1의 바실러스 안트라시스 균에 대한 사멸능을 보여주는 대표적인 실험 결과이다. 투명환은 시험대상 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 것이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 이하 실시예들의 실험들에 있어 바실러스 안트라시스 균을 사용하는 실험들은 생물안전 3등급연구실(BSL3, Biosafety Level 3) 시설에서 실시되었다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 바실러스 안트라시스 균을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 바실러스 안트라시스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot-on-lawn assay)을 통하여 바실러스 안트라시스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시하였다. TSB 배지에 바실러스 안트라시스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 바실러스 안트라시스 균의 배양액 3 ㎖(OD₆₀₀이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 바실러스 안트라시스 균이 도말된 평판배지 위에 점적한 다음 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 바실러스 안트라시스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 바실러스 안트라시스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

바실러스 안트라시스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 바실러스 안트라시스 균 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 바실러스 안트라시스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다.

실시예 2: 분리 박테리오파지의 증식용 균주 선정

바실러스 안트라시스 균의 취급에는 제한이 많이 따르기 때문에, 보다 용이하게 취급할 수 있는 분리 박테리오파지의 증식용 균주를 선별하는 일을 수행하였다. 통상적으로 박테리오파지는 세균 특이성이 높기 때문에 박테리오파지 분리에 사용한 균주 외의 다른 균주를 증식용 균주로 선정하는데는 많은 어려움이 예상되었다. 그렇기 때문에 본 발명자들은 증식용 균주의 선별 성공 가능성을 높이기 위하여 바실러스 안트라시스 균과 유연관계가 매우 높다고 알려진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 국한하여 분리 박테리오파지의 증식용 균주 선별을 수행하였다.

증식용 균주 선별을 위하여 실시예 1에서 준비한 분리 박테리오파지를 포함한 용액과 여러 바실러스 세레우스 균주들을 사용하여 실시예 1에 제시한 점적 실험을 수행하였으며, 상기 점적 실험에서 분리 박테리오파지에 의해서 투명환이 생성되는 균주를 증식용 균주로 선별하는 방식으로 수행하였다. 본 실험도 비록 바실러스 안트라시스 균을 사용하지 않는 실험이지만 생물안전 3등급연구실 시설에서 실시되었다.

그 결과, American Type Culture Collection(ATCC)에서 확보한 바실러스 세레우스 ATCC 4342를 분리 박테리오파지의 증식용 균주로 선정할 수 있었다.

후속 실험으로, 생물안전 3등급연구실 시설 외에서의 분리 박테리오파지의 증식에 사용할 박테리오파지 액을 다음과 같이 준비하였다. 상기 점적 실험에서 확인된 투명환의 일부를 취해 TSB 배지에 첨가하고, 여기에 50분의 1의 부피로 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액은 0.45 μm의 필터를 이용하여 3 회 여과해 주었다. 최종 확보된 여과액을 사용하여 한 번 더 박테리오파지 액 준비를 반복하였다. 50 ml TSB에 50 μl의 상기 확보한 여과액 (박테리오파지 액)을 첨가하고 여기에 50분의 1의 부피로 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액은 0.45 μm의 필터를 이용하여 3 회 여과해 주었다. 이렇게 하여 최종 박테리오파지 액을 준비하였다.

실시예 3: 분리 박테리오파지 순수분리

실시예 1에서 분리 박테리오파지에 대한 순수분리를 일부 수행하였지만 통상적으로 실시하던 전자현미경 분석을 통한 순수분리 최종확인을 수행하지 않았고, 또한 증식용 균주도 변경하였기 때문에 분리 박테리오파지의 순수분리를 다음과 같이 추가 수행하였다.

바실러스 세레우스 ATCC 4342 균을 사용한 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하여 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 상기 과정을 반복 수행하였다.

그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 박테리오파지 순수 분리는 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 모든 과정을 반복하여 수행하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 최종적으로 순수 분리된 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 신규 확보된 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복 수행하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

상기한 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Bac-ANP-1로 명명한 뒤, 2015년 11월 3일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(수탁번호 KCTC 12942BP)에 기탁하였다.

실시예 4: 박테리오파지 Bac - ANP -1의 유전체 분리 및 서열 분석

박테리오파지 Bac-ANP-1의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 3에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 바실러스 세레우스 ATCC 4342 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Bac-ANP-1의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행하여 박테리오파지 Bac-ANP-1의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Bac-ANP-1 유전체는 36,740 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

실시예 5: 박테리오파지 Bac - ANP -1의 바실러스 안트라시스 균에 대한 사멸능 조사

분리된 박테리오파지 Bac-ANP-1의 바실러스 안트라시스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였고 이때 박테리오파지 시료로는 실시예 3에서 준비한 박테리오파지 부유액을 사용하였다. 사멸능 조사에는 5종의 바실러스 안트라시스 균들이 사용되었다. 박테리오파지 Bac-ANP-1은 실험에 대상이 된 바실러스 안트라시스 균 모두에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Bac-ANP-1의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 별도 실험으로 실시하였는데, 그 결과로 박테리오파지 Bac-ANP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 Bac-ANP-1은 바실러스 안트라시스 균에 대하여 특이적인 사멸능을 가지며, 다수의 바실러스 안트라시스 균에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Bac-ANP-1이 바실러스 안트라시스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.

실시예 6: 박테리오파지 Bac - ANP -1의 바실러스 안트라시스 균의 감염 예방에 대한 실험예

본 실험은 실험 결과의 용이한 확인을 위해 감염 모방 조건에서 실시하였다. 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10⁹ pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Bac-ANP-1 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 바실러스 안트라시스 균의 배양액을 넣어 주었다. 바실러스 안트라시스 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 바실러스 안트라시스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Bac-ANP-1 액을 첨가해 준 튜브에서는 바실러스 안트라시스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 바실러스 안트라시스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

바실러스 안트라시스 균의 성장 억제

구분	OD600 흡광도 값
	배양 0분	배양후 60분	배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가	0.503	0.876	1.101
박테리오파지 액 첨가	0.503	0.328	0.126

실시예 5에서 사용했던 나머지 바실러스 안트라시스 균들을 대상으로 하여서도 상기와 동일한 방법으로 박테리오파지 Bac-ANP-1의 바실러스 안트라시스 균에 대한 성장 억제 효과를 조사해 보았으며, 그 결과 상기와 유사한 결과들을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들로부터 본 발명의 박테리오파지 Bac-ANP-1이 바실러스 안트라시스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Bac-ANP-1이 바실러스 안트라시스 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 7: 박테리오파지 Bac - ANP -1의 바실러스 안트라시스 균의 감염 제독에 대한 실험예

실시예 3에서 제조한 박테리오파지 부유액을 투석을 이용하여 생리식염수로 매질을 변경하여 본 실험에 사용하였다.

상추 10 g을 잘게 잘라 5 g씩 2개의 배양용 접시(Petri-dish)에 나누어 담았다. 미리 준비한 바실러스 안트라시스 균 포자(Spore) 부유액을 이용하여 각 배양용 접시에 포자가 10⁵개씩 첨가되게끔 분무 살포하였다(10⁵ cfu/plate). 그리고는 하나의 배양용 접시에는 생리식염수만을, 다른 하나의 배양용 접시에는 생리식염수로 매질을 교환한 박테리오파지 액(박테리오파지 함량: 10⁸ pfu/ml)을 매일 2회씩 6일간 분무 살포하였다. 6일간의 분무 살포 후에 각 배양용 접시로부터 상추 0.2 g씩을 취하여 5 ml의 TSB 배지가 들어 있는 2개의 튜브에 각각 첨가하였다. 10분 방치 후에 각 튜브로부터 배지 200 μl씩을 취하여 TSB 배지를 사용하여 십진희석을 실시하였다. 십진희석하여 준비한 희석액 100 μl씩을 TSA 평판배지에 도말하였다. 도말한 평판배지들은 37℃ 배양기에서 한밤배양 하였다. 다음날 각 평판배지들에 생성된 바실러스 안트라시스 균 콜로니(colony)의 수를 조사하였다. 생리식염수만을 분무 살포한 실험으로부터 준비된 평판배지들에서는 바실러스 안트라시스 균 콜로니들이 확인된 반면에, 생리식염수로 매질을 교체한 박테리오파지 액을 분무 살포한 실험으로부터 준비된 평판배지들에서는 바실러스 안트라시스 균콜로니가 전혀 관찰되지 않았다.

참고로, 바실러스 안트라시스 균 포자 대신에 바실러스 안트라시스 균으로 오염을 실시한 경우에서도 포자를 사용하였을 경우와 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

이상의 결과로 박테리오파지 Bac-ANP-1이 자연이나 환경에 고의 또는 실수로 유출 또는 누출된 바실러스 안트라시스 균의 제독에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 박테리오파지 Bac - ANP -1의 바실러스 안트라시스 균 감염에 대한 치료효과 조사

실시예 7에서 제조한 생리식염수로 매질을 교체한 박테리오파지 액(박테리오파지 함량: 10⁸ pfu/ml)을 사용하여 박테리오파지 Bac-ANP-1의 바실러스 안트라시스 균 감염에 대한 치료효과를 감염 동물 모델을 사용하여 조사하였다.

20 g 내외의 체중을 갖는 6주령의 암컷 A/J 마우스를 실험동물로 사용했다. 총 20마리를 2 개의 군으로 분리(군당 10마리씩)한 다음에 비강흡입 방식으로 마우스 당 바실러스 안트라시스 균 포자를 각각 1× 10⁵ 개 (즉, 1× 10⁵ cfu/mouse)씩 투여하여 감염을 유도하였다. 하나의 군 (처치군)에 대해서는 균 강제 감염 후에 30 분 경과 시점, 12 시간 경과 시점, 24 시간 경과 시점, 36 시간 경과 시점, 48 시간 경과 시점, 60 시간 경과 시점, 및 72 시간 경과 시점에 생리식염수로 매질을 교체한 박테리오파지 액(박테리오파지 함량: 10⁸ pfu/ml) 0.02 ml씩을 비강흡입 투여하였다. 또 다른 군 (대조군)에 대해서는 생리식염수를 동일 시점에 동일 양을 동일 방식으로 투여하였다. 균 강제 감염후로부터 5일 동안 매일 사망 개체 수를 조사하였다.

결과로 확연한 치료 효과가 확인되었다. 사망 개체 수는 다음의 표 2와 같았다.

군	사망 개체 수					사망 개체 수 /시험 개체 수	폐사율 (%)
	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5
대조군	0	1	3	3	1	8/10	80
처치군	0	0	0	0	0	0/10	0

이상의 결과로 본 발명의 박테리오파지 Bac-ANP-1이 바실러스 안트라시스 균 감염 처치(치료)에 효과적임을 확인할 수 있다. 이러한 특성은 박테리오파지 Bac-ANP-1이 포함된 약학적 조성물이 바실러스 안트라시스 균 감염 치료 목적으로 활용될 수 있음을 보여주고, 또한 바실러스 안트라시스 균 감염 처치 목적으로 통상의 항생제와 같은 방식으로 활용될 수 있음을 보여 준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

KCTC KCTC12942BP 20151103

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Bacillus anthracis bacteriophage Bac-ANP-1 and its use for preventing proliferation of Bacillus anthraci <130> KP090467 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36740 <212> DNA <213> Bacteriophage Bac-ANP-1 <400> 1 atgtgacact gaaagctaaa aacttctatg aaatgggacg cgtttcattg ttcttactag 60 atgaacaagg cgaacttgtc gccgacatta acatgaacga tctttattgg actgtagaga 120 gaacacacgg ttatgctgtt attggaaaca aaagtcaacc gaataacact aggaaaatgt 180 ttgattctgg cggtaacggc aatactgctt tcaacaactt ttacggtcgt atatcaatcg 240 ctagacgagg tagaacgtgg tctgtatact ttgctagatt cagaagcgga acagaaatag 300 acgatgctag cgcggtgcaa tactttactg atgatgaaaa gaatcctatg acagtaacgg 360 gaagaagagt ggcccaggta gctataggta ttcaacgttg gcaagataat gcgccagtcg 420 atctcatgag aatagacgat cttaaaattt ggaaggtcaa caaagttcca aacggcggga 480 agcctttttt gctggacact ggcgacaaag ttataataga tacagaacgt tcacttgtta 540 caatcaacgg aacggacgtt atttccgcca aagatatttt tagttcattc cctaagatca 600 taagagggga aaatagactt tcaattatgc caccagacat aaagggaaaa gtaacatata 660 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Claims (7)

1. 바실러스 안트라시스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 시포비리대 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP).
2. 제1항의 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP)을 유효성분으로 포함하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환 방지용 또는 처치용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 소독제, 제독제, 및 치료제 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환 방지용 또는 처치용 조성물.
4. 제2항에 의한 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 환경에 분사하는 단계를 포함하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환을 방지 또는 처치하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 소독제 또는 제독제 형태인 것을 특징으로 하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환을 방지 또는 처치하는 방법.
6. 제2항에 의한 박테리오파지 Bac-ANP-1(수탁번호 KCTC 12942BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환을 방지 또는 처치하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 치료제 형태인 것을 특징으로 하는, 바실러스 안트라시스 균에 의해 유발되는 질환을 방지 또는 처치하는 방법.

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