JP2004346083A - 熱ショックタンパク質とオリゴ糖または多糖とから形成されるコンジュゲート - Google Patents

Abstract

【課題】
従来使用されてきたキャリアで達成されたよりも良好な免疫原的特性をコンジュゲートに与える新規なタンパク質キャリアを同定し、オリゴ糖および多糖に対する免疫原性応答を高める、確実に高力価のワクチン接種を可能にすること。
【解決手段】
少なくとも１つの熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを合有する熱ショックタンパク質の一部と、病原菌の少なくとも１つの莢膜のオリゴ糖または多糖とを含有する、コンジュゲート化合物。
【選択図】
なし

Description

（発明の分野）
本発明は、熱ショックタンパク質と、多糖またはオリゴ糖（特に、病原性微生物の莢膜由来の多糖またはオリゴ糖）とからなるコンジュゲート化合物に関する。本化合物は、抗多糖抗体の形成を誘導し得る。そのため、本化合物は、ヒトおよび動物に使用するワクチンとして有用である。

（技術状況）
細菌は、広範囲の疾患状態に対する病原物質である。

このような疾患の例には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる髄膜炎、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（Ｈｉｂ）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓを含む）によって引き起こされる他の感染症、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの感染によって引き起こされる腸チフス、非腸チフス原性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ菌またはＳｈｉｇｅｌｌａ菌によって起こる腸疾患が含まれる。

莢膜を有する細菌に対する防御免疫は、莢膜中の多糖に対する抗体により介在されることが知られている。免疫系を充分に刺激するには、莢膜の多糖を、キャリアタンパク質に結合させる必要があることも知られている（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９０，１６１，８２１−８３２）。

特に、多糖（例えば、Ｃ群髄膜炎菌多糖（ＭｅｎＣ）、ＨｉｂおよびＡ群髄膜炎菌多糖（ＭｅｎＡ））およびＣＲＭ−１９７（Ｃｏｒｙｎｅｂｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のペプチド）のようなタンパク質、ＴＤ（ジフテリア毒素）またはＴＴ（破傷風毒素−Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，（１９９１年１０月）、３５０４−３５１０；Ｃｌａｅｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，１１２（５）、６９５−７０２、（１９８８年５月）を参照のこと）からなるコンジュゲート化合物が文献中に記載されている。

このようなワクチンのうち数種は、すでに臨床的に実用化されており、良好な結果が得られている。しかし、従来使用されてきたキャリアで達成されたよりも良好な免疫原的特性をコンジュゲートに与える新規なタンパク質キャリアを同定する必要がある。

本発明は、オリゴ糖および多糖の免疫原性応答を高めるタンパク質キャリアとしての熱ショックタンパク質の使用に関する。

熱ショックタンパク質は、非常に多数のＴエピトープを含有し、そのため細胞の免疫系を刺激することが知られている。

マラリア性エピトープのキャリアである、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓの熱ショックタンパク質のコンジュゲート化合物（６５ｋＤａ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）で予め免疫化した動物に、アジュバントを必要とすることなく、著しい免疫化を誘導することが記載されている（Ｌｕｓｓｏｗら Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，２１，２２９７−２３０２）。しかし、熱ショッ
クタンパク質に結合した（Ｔ−細胞依存性であることが周知の）ペプチドによって示されるＴ細胞依存効果に関するＬｕｓｓｏｗらに観察された効果は、注目に値する。

より詳細には、熱ショックタンパク質は、株および型が異なる細菌間でもよく保存されるので、継続的プロセスである細菌感染により、確実に、免疫系が熱ショックタンパク質に対して感作された状態なる。そのため、最初のワクチン接種または追加免疫ワクチン接種における投与で、本発明のコンジュゲート化合物に対する良好な応答が保証される。

本発明により、（アジュバントの使用も可能だが）アジュバントを用いずに、莢膜を有する細菌の多糖およびオリゴ糖の使用が可能となる。

大勢の子供たちが、結核予防のためにＢＣＧワクチン（細菌の熱ショックタンパク質を含む）を接種する。そのため、熱ショックタンパク質をキャリアとして含有する本発明のコンジュゲートは、このＢＣＧワクチン接種の実施の結果、すでにキャリアで予備免疫化された多くの被検体を見出す。

その上、熱ショックタンパク質は非常に保存されているので、ＢＣＧでワクチン接種を受けていない個体群でさえ（他の細菌との相互作用の結果として）容易に免疫を得られる。そのため、この個体群は、熱ショックタンパク質およびＴ細胞依存抗原（オリゴ糖または多糖）で構成されるコンジュゲートでのワクチン接種の後に良好な免疫応答を発現し得る状態にある。このように、本発明のキャリアは、確実に高力価のワクチン接種をするために、細菌間の熱ショックタンパク質の高い保存性およびＴ細胞記憶を、独自に利用するものである。

（発明の要旨）
本発明は、少なくとも１つの熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含有する熱ショックタンパク質の一部と、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖とを含有するコンジュゲート化合物を提供する。

熱ショックタンパク質は、動物、好ましくはヒトにおいて、免疫刺激効果を示し得る如何なる熱ショックタンパク質でもよい。

熱ショックタンパク質は、細菌、寄生生物および哺乳動物に高度に保存されている。重大な悪影響なしに意図する被免疫被検体にポジティブな免疫刺激効果を示す限り、あらゆる熱ショックタンパク質が本発明のコンジュゲート中に使用され得る。個々の例としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒａｅ由来の熱ショックタンパク質、特にｈｓｐ６０群の熱ショックタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

より詳細には、３種の熱ショックタンパク質、すなわち、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＧｒｏＥＬ型の６５ｋＤａのｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＤｎａＫ型の７０ｋＤａのｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の新規な熱ショックタンパク質の具体例を、本明細書中に示す。

Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は、図３に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するタンパク質であり、その分子量は５４〜６２ｋＤａの範囲にあり、好ましくは約５８〜６０ｋＤａである。このｈｓｐは、グラム陰性菌熱ショックタンパク質の群であるｈｄｐ６０に属する。一般的にｈｄｐは全ての生物、つまり原核または
真核の動物または植物に、最もよく保存されているタンパク質であり、そして、その保存は配列全体にわたっている。

コンジュゲートは、１種またはそれ以上の熱ショックタンパク質またはその免疫刺激ドメインを含み得る。熱ショックタンパク質は、同一でも異なっていてもよい。しかし、１つの熱ショックタンパク質、あるいは１つまたはそれ以上の免疫刺激ドメインを含有する部分が存在することが好ましい。

本明細書中で使用のように、用語「免疫刺激ドメイン」は、哺乳動物被検体のドメインを含有するコンジュゲート化合物の多糖またはオリゴ糖成分に対する、免疫を増強させ得る熱ショックタンパク質のアミノ酸配列の領域を指す。

完全な熱ショックタンパク質由来の特定のドメインのみを使用することの利点は、ヒト熱ショックタンパク質に共通のドメインを、選択的に含まないようにすることが可能な点である。ヒトヘのワクチン投与に対して、これは有利なことである。それは、このような領域が「自己」と認識されるので、熱ショックタンパク質の免疫刺激効果に影響を与えないからである。さらに、このような「自己」の領域に対して刺激を受ける全ての免疫は、自己免疫になり得るからである。

熱ショックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーの好適なドメインを同定し、ヒト熱ショックタンパク質と相同性が減少した配列に下線を引いて図２に載せてある。図２に示したドメインのうち、機能的なサブドメインもまた、ドメインおよびサブドメインの組合せとして同様に使用され得る。

当業者は、そのドメインまたはエピトープが免疫刺激反応を起こす所定の熱ショックタンパク質を容易に確認し得、そしてこれらのドメイン、またはそのサブセットのみを含む改変熱ショックタンパク質を、容易に調製し得る。

コンジュゲート化合物のオリゴ糖成分または多糖成分は、ワクチン投与しようとする全ての病原性微生物の完全な莢膜の多糖またはオリゴ糖、または防御免疫を誘導し得るその一部であり得る。オリゴ糖または多糖は、単一の細菌由来、あるいは２種またはそれ以上の細菌由来であり得る。

標的とされ得る細菌の個々の例には：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型（Ｈｉｂ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓを含む）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、非タイポイダル（ｔｙｐｏｉｄａｌ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌またはＳｈｉｇｅｌｌａ細菌によって引き起こされる腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の特定の実施態様によると、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ Ｃ（ＭｅｎＣ）群のオリゴ糖およびｈｓｐから成るコンジュゲートが調製された。

本発明のさらに特定の実施態様によると、本発明の目的に使用されたｈｓｐは、ｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０である。

本発明の第２の局面では、熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含むその一部を、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖に共有結合させることを包含する、本発明のコンジュゲート化合物を生産するプロセスが提供される。

オリゴ糖または多糖は、好ましくは標的とする細菌から単離されるが、合成によっても
生成され得る。

熱ショックタンパク質は、その自然発生源から単離され得、または合成的に生産される。好ましくは、熱ショックタンパク質は、本明細書の記載の一般的な中に記載された技法を用いる組換えＤＮＡ技術によって生産される。

好ましくは、オリゴ糖または多糖は、結合に対する反応部位を提供するように、熱ショックタンパク質またはその部分と結合する前に改変される。好ましくは、この改変はオリゴ糖または多糖の末端基へのアミノ基のような活性官能基の導入を包含する。次いで、このように改変されたオリゴ糖または多糖を、次いでスクシンイミドのような連結基を用いて活性化し、熱ショックタンパク質またはそれらのタンパク質に結合させる。

本発明の第３の局面では、製剤、好ましくはワクチンとして使用する、本発明の第１の局面に記載のコンジュゲート化合物が提供される。

本発明の第４の局面では、細菌感染に対するワクチン接種用の薬剤の製造における、本発明の第１の局面に記載のコンジュゲート化合物の使用が提供される。

本発明の第５の局面では、本発明の第１の局面に記載のコンジュゲート化合物の免疫学的に有効な量の投与する工程を包含するワクチン接種の方法が提供される。

発明の第６の局面では、本発明の第１の局面に記載の１つ以上のコンジュゲート化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含むワクチンまたは治療用組成物が提供される。

好ましくは組成物は、ワクチン組成物であり、そして必要であればアジュバントのような他の賦形剤を含み得る（以下に記載の「ワクチン」と表題された節を参照せよ）。

本発明の第７の局面では、１つ以上の本発明の第１の局面のコンジュゲート化合物を、薬学的に受容可能なキャリアおよび任意にアジュバントと組み合わせる工程を包含する、ワクチンの調製法が提供される。

従って、本発明は、以下を提供する：
（項目１） 少なくとも１つの熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含有する熱ショックタンパク質の一部と、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖とを含有する、コンジュゲート化合物。

（項目２） Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ Ｃ（ＭｅｎＣ）群のオリゴ糖、および熱ショックタンパク質を合有する、項目１に記載のコンジュゲート化合物。

（項目３） 前記熱ショックタンパク質が、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＧｒｏＥＬ型６５ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＤｎａＫ型７０ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の熱ショックタンパク質から選択される、項目１または２に記載のコンジュゲート化合物。

（項目４） 熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含むその一部を、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖に共有結合させる工程を包含する、項目１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物を生成する方法。

（項目５） 製剤として使用する、項目１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物。

（項目６） 細菌感染に対するワクチン接種用の薬剤の製造における、項目１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物の使用。

（項目７） 免疫学的に有効な量の項目１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物の投与する工程を包含する、ワクチン接種の方法。

（項目８） 項目１から項目３のいずれかに記載の１つ以上のコンジュゲート化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチンまたは治療用組成物。

（項目９） 項目１から項目３のいずれかに記載の１つ以上のコンジュゲート化合物を、薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程を包含する、ワクチンの調製方法。

（実施態様の詳細な説明）
（Ｉ．一般的な方法論）
本発明の実施には、他に示されていなければ、当該分野の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の方法を使用する。このような方法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第二版（１２８９）：ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，ＶＯＬＵＭＥＳ ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）：ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）：ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；ＡＮＩＭＡＬ
ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＨＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＨＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬｌＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編 １９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれに、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７），ＩＭＭＨＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７），ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，第二版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、および、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）を参照のこと。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な省略形が、本明細書中で使用されている。本明細書中に掲載されている、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考として援用されている。

（２．定義）
本発明に使用し得る熱ショックタンパク質には、上記のポリペプチド、および、上記タンパク質の天然のアミノ酸配列から少数のアミノ酸が変異したポリペプチドがあげられ；特に保存的なアミノ酸置換が予期される。

保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝子的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および、（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として、一緒に分類される。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンの、アスパラギン酸とグルタミン酸の、トレオニンとセリンとの単独の置換、あるいは、あるアミノ酸と、構造が関連するアミノ酸との同様の保存的置換が、生物学的活性に大きな影響を与えないことは当然予想し得る。タンパク質として実質的に同じアミノ酸配列を有するが、機能面に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を有するポリペプチド分子は、本タンパク質の定義の範囲に含まれる。

天然の供給源からタンパク質を単離精製するよりも、組換えＤＮＡ技術により熱ショックタンパク質を生産する大きな長所は、天然の供給源からタンパク質を単離するのに要求されるよりも少ない開始物質を用いて、同量のタンパク質が生産され得ることである。組換え技術によるタンパク質の生産は、細胞中に通常存在するいくつかの分子の非存在下でも、タンパク質を単離を可能にする。実際、ヒトタンパク質混入の痕跡が全くないタンパク質組成物を容易に生産し得る。なぜなら、組換え非ヒト宿主により生産されるヒトタンパク質は、問題の組換えタンパク質のみだからである。天然の供給源からの潜在的なウイルス性物質およびヒトに対して発病性のウイルス成分もまた、避けられる。

本明細書中に使用されているように、用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレチドを示し、その起源または操作により：（１）天然では結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合しない、（２）天然ではそれに結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合する、または（３）天然では存在しない。

本明細書中に使用されているように、用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態のことであり、本明細書中では、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」と相互変換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみを示す。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチドが包含される。これにはさらに、既知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識の存在、メチル化、末端「ｃａｐｓ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、ある型の非荷電性結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸エステルなど）、または、荷電性結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）との置換）、ペンダント部分の導入（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）、キレート剤（例えば、金属、放射性物質、ホウ素、酸化成分など）、アルキル化剤（例えば、αアノマー性核酸など））が、包含される。

用語「ゲノムの」により、ベクターにクローン化された制限フラグメント由来のＤＮＡ分子のコレクションまたはライブラリーを意味する。これには、微生物の遺伝子物質の全てまたは一部が包含され得る。

用語「ｃＤＮＡ」により、ｍＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズする相補ｍＲＮＡ配列を意味する。

本明細書中で使用されているように、用語「オリゴマー」は、プライマーおよびプローブの両方を意味し、本明細書では用語「ポリヌクレオチド」と相互変換的に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的にオリゴマーは、１０００ヌクレオチド未満、より典型的には５００ヌクレオチド未満、さらに典型的には２５０ヌクレオチド未満であり、それらは１００ヌクレオチド未満であり得、７５ヌクレオチド未満、そしてさらに５０ヌクレオチド未満の長さであり得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プライマー」とは、適切な条件下で使用されるときに、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として作用し得るオリゴマーのことである。プライマーは、コピーされるべきポリヌクレオチド鎖の領域に、完全にまたは実質的に相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件下で、プライマーは、分析物鎖の相補領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートなど）の添加により、プライマーは、重合剤により伸長されて分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは一本鎖であり得るか、または、部分的または全体に二本鎖であり得る。

用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」とは、標的領域を含有すると思われる、一本鎖または二本鎖核酸分子のことであり、生物学的試料中に存在し得る。

本明細書中で使用されているように、用語「プローブ」とは、標的領域中の配列とプローブ中の少なくとも１つの配列との相補性により、標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを含有する構造のことである。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。「捕獲プローブ」および「標識プローブ」は、プローブ内に包含される。

本明細書中で使用されているように、用語「標的領域」とは、増幅および／または検出されるべき核酸領域のことである。用語「標的配列」とは、プローブまたはプライマーが、所望の条件下で安定なハイブリッドを形成し得る配列のことである。

本明細書中で使用されているように、用語「捕獲プローブ」とは、結合パートナーに結合する一本鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドプローブのことである。この一本鎖ポリヌクレオチドは、標的するポリヌクレオチド配列に含有され、これは、分析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的領域内の標的配列に相補的である。この相補領域は、二本鎖に、分析物ポリヌクレオチドを固体表面に固定する（結合パートナーを介して）のに十分に安定性を与えるために、十分な長さからなり、標的配列に対して相補的である。結合パートナーは、第二の結合パートナーに特異的であり、第二の結合パートナーは、固体支持体の表面に結合され得るか、または、その他の構造物または結合パートナーを介して間接的に固体支持体に結合され得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標的するポリヌクレオチド配列」とは、標的ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドが含有されるポリヌクレチド配列のことであり、その配列は、意図される目的に十分な安定性を有する二本鎖を形成するのに、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。

本明細書中で使用されているように、用語「結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに特異的な抗体のような、高度な特異性を有するリガンド分子を結合し得る分子のことである。一般的に、特異的結合パートナーは、単離条件下で、分析物コピー／相補鎖の二本鎖（捕獲プローブの場合）を固定するのに十分な親和性で結合しなければならない。特異的結合パートナーは、当該分野で公知であり、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、多くの既知のレセプター−リガンド対、および
、相補的ポリヌクレオチド鎖を包含する。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場合には、パートナーは通常、少なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基であり得、さらに、少なくとも約４０％から約６０％のＧ＋Ｃ含有量を有する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。

本明細書中で使用されているように、用語「カップルした（ｃｏｕｐｌｅｄ）」とは、共有結合によるまたは非共有結合の強い相互作用（例えば、疎水相互作用、水素結合など）による付着のことである。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであり得る。

用語「支持体」とは、所望の結合パートナーが固定され得る、いずれもの固体または半固体の表面のことである。適切な支持体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどが含まれ、ビーズ、ウエル、ディップスティック、膜などの形態にされ得る。

本明細書中で使用されているように、用語「標識」とは、検出し得る（好ましくは定量し得る）シグナルを提供するために使用され得、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合され得る、いずれもの元素または部分のことである。

本明細書中で使用されているように、用語「標識プローブ」とは、分析物ポリヌクレオチド中の検出されるべき標的配列に相補的である、標的するポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドプローブのことである。この相補領域は、「標識プローブ」および「標識配列」を含有する二本鎖が、標識により検出されるように、十分な長さからなり、標的配列に相補的である。標識プローブは、直接に、または、マルチマーを含む、互いに高度な特異性を有する１組のリガンド分子を介して間接に、標識とカップルする。

本明細書中で使用されているように、用語「マルチマー」とは、同じ繰り返しの一本鎖ポリヌクレオチドユニットまたは異なる一本鎖ポリヌクレオチドユニットの、直鎖状または分枝状ポリマーのことである。ユニットの少なくとも１つは、目的の第一の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合したポリヌクレオチドプローブ（例えば、標識プローブ）に特異的にハイブリダイズし得る、配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を得るために、このユニットは、通常は少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、典型的には約５０ヌクレオチド以下の長さ、そして好ましくは約３０ヌクレオチドの長さであり；さらに、Ｇ＋Ｃ含有量は、通常は少なくとも約４０％、ほとんどは約６０％であるロこのようなユニットに加えて、マルチマーには、目的の第二の一本鎖ヌクレオチド、典型的には標識ポリヌクレオチドまたはその他のマルチマーに、特異的および安定にハイブリダイズし得る、多くのユニットが包含される。これらのユニットは、上記に考察されたマルチマーのように、一般にはほぼ同じ大きさおよび組成である。マルチマーがその他のマルチマーにハイブリダイズされるように設計されているときには、第一および第二のオリゴヌクレオチドユニットは異質（異なる）であり、選択されたアッセイの条件下では、互いにはハイブリダイズしない。従って、マルチマーは、標識プローブであり得るか、または標識をプローブにカップルするリガンドであり得る。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自己複製ユニットとして挙動する、すなわち、自己制御下に複製し得るいずれもの遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどである。これには選択マーカーが含まれ得る。

「ＰＣＲ」とは、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ５２４：１６３（１９８６）；およびＳｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−１０７８；および米国特許第４，６８３，１９５号；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号に記載されてい
るようなポリメラーゼ連鎖反応の技法である。

本明細書中で使用されているように、本来ｘが、同じ様式でｙに関連しない場合に、ｘはｙに関して「異種」である。すなわち、天然ではｘが全くｙに関連しないか、または、ｘが天然に実在して認められるような同じ様式でｙに関連しない。

「相同性」とは、ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。１つの形態の配列と別の配列との対応は、当該分野で公知の方法により決定され得る。例えば、それらはポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。または、相同性は、相同領域（例えば、Ｓ_１消化の前に使用される）間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブイブリダイズし、その後、一本鎖特異ヌクレアーゼにより消化し、その後に消化されたフラグメントの大きさを決定することにより決定され得る。

「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが接続されて、この接続されたセグメントの複製および／または発現をもたらすレプリコンである。

「制御配列」とは、それらが連結されるコーディング配列の発現をもたらすために必要であるポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み；真核生物では、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最少限、発現に必要とされる全成分を含み、さらに存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含み得ると意図される。

「作動可能に連結された」とは、記載されている成分が、それらの意図する様式で機能し得る関係にある並列のことである。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合した条件下で得られるように連結されている。

「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域のことである；この領域は、コーディング配列の一部またはコーディング配列全てを示し得る。

「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下におかれると、通常はｍＲＮＡを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよびポ末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列には、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれる得るが、これらに限定されない。

本明細書中で使用されているように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さの産物を指すわけではない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。この用語にはまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を意味せず、あるいは除外しない。定義に包含されるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、および当該分野で公知の天然に存在するおよび存在しない改変である。

示された核酸配列「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、配列にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの部分、ここで、この部分は、少なくとも３−５アミノ酸、さらに好ましくは少なくと
も８−１０アミノ酸、そしてよりさらに好ましくは少なくとも１１−１５アミノ酸からなる、または配列にコードされたポリペプチドにより免疫学的に同定され得るポリペプチドのことである。この用語にはまた、示された核酸配列から発現されるポリペプチドも包含される。

「免疫原性の」とは、アジュバントの存在または非存在下で、それのみで、またはキャリアに結合されて、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を引き起こすポリペプチドの能力のことである。「中和」とは、感染因子の感染力を、部分的または全体的に抑制する免疫応答のことである。「エピトープ」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原決定基のことである；１つのエピトープは、そのエピトープに対して唯一の高次構造（ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で、３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、さらに通常には少なくとも８−１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の高次構造の決定方法は当該分野では公知であり、例えば、これらには、ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原に対するその他の抗原の結合を阻む能力を示す、簡単な免疫アッセイにおいて同定され得る。

本明細書中で使用されているように、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、予防および／または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）（すなわち、あらゆる疾患症状の調整）のことである。「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、抗原性の莢膜多糖またはオリゴ糖構造を有する細菌の感染が疑われる動物を意味し、これにはヒトを含む霊長類が包含されるが、これらに限定されない。「ワクチン」は、免疫原性の、または、部分的または完全にこのような細菌に対する保護を誘起し得る、個体の処置に有用な組成物である。

本発明のコンジュゲート化合物は、このタンパク質に特異的な、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生に使用され得る。これらの抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、およびその他のこのような用語は、例えば、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体として使用され得るかまたは使用されてきた、微生物、昆虫細胞、および哺乳類細胞を示し、これには、形質転換されたもとの細胞の子孫も包含される。１つの母細胞の子孫は、自然突然変異、偶発突然変異または意図的突然変異（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）のために、形態学的に、または、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ補体が、必ずしも、もとの母細胞と完全に同一ではあり得ないことが理解される。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサル腎（ＣＯＳ）細胞が含まれる。

詳細には、本明細書中で使用されているように、「細胞系」とは、インビトロにおいて継続してまたは長期間に増殖および分裂し得る細胞群のことである。しばしば、細胞系は１つの幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）からのクローン群である。さらに、このようなクローン群の貯蔵または転移の間に、核型に自発変化または誘導変化が起こり得ることが、当該分野では公知である。従って、いわゆる細胞系由来の細胞は、祖先細胞または培養物に正確には同一ではあり得ず、この細胞系には、このような変異体が包含される。用語「細胞系」はまた、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系、または二細胞型のハイブリドーマを包含する。

本明細書中で使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のような、原核微生物種および真核微生物種が包合され、後者には、酵母および糸状菌が含まれる。

本明細書中で使用されているように、「形質転換」とは、挿入に用いられる方法（例え
ば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配またはエレクトロポーレーション）に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことである。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えばプラスミド）として維持され得るか、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するときには、「精製された」および「単離された」とは、示された分子が、同じ型のその他の生物学的高分子を実質的に含まずに存在することを意味する。本明細書中で使用されているように、用語「精製された」は、好ましくは、同じ型の生物学的高分子が、少なくとも７５重量％、さらに好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％で存在することを意味する（しかし、水、緩衝液、およびその他の小分子、特に、１０００未満の分子量を有する分子は存在し得る）。

（３．発現系）
一旦、適切な熱ショックタンパク質のコーディング配列が単離されると、それは種々の異なる発現系、例えば、哺乳類細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母により用いられる発現系、で発現され得る。

（３．１．哺乳類系）
哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコーディング配列の５’末端近傍に位置する転写開始領域、および、通常は転写開始部位の上流２５−３０塩基対（ｂｐ）に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＲＮＡ合成を適切な部位で開始させるのを導くと考えられている。哺乳類プロモーターはさらに、通常はＴＡＴＡボックスの上流１００から２００ｂｐ内に位置する上流プロモーターエレメントを有する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、いずれかの向きに作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９））。

哺乳類ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、広範囲の宿主を有する；従って、哺乳類ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。さらに、ネズミメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的または調節され得（誘導可能な）、プロモーターに依存して、ホルモン−応答細胞中でグルココルチコイドにより誘導され得る。

上記のプロモーターエレメントに組み合わされたエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常は発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同または異種プロモーターに連結されたときに、通常のＲＮＡ開始部位で合成を開始して、最高１０００倍まで転写を促進し得る調節ＤＮＡ配列である。さらに、エンハンサーは、通常の向きまたは裏返しの向きで転写開始部位から上流または下流に、または、プロモーターから１０００ヌクレオチドを超える位置に配置されるときに活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７（１９８９）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第二版（１９８２））。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、通常は広範囲の宿主を有するので、特に有用であり得る。例には、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：
７６１）、および、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来（Ｇｏｒｍａｎら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガロウイルス由来（Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２２１）のエンハンサー／プロモーターが含まれる。さらに、いくつかのエンハンサーは、調節可能であり、ホルモンまたは金属イオンのような誘導物質が存在するときのみに活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら、（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。

ＤＮＡ分子は、哺乳類細胞において細胞内に発現され得る。プロモータ配列はＤＮＡ分子に直接連結され得るが、この場合にはいつも、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸がメチオニンであり、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端は、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーションにより、タンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳類細胞で外来タンパク質の分泌をなすリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、細胞から増殖培地内に分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し、これは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３分節系リーダーは、哺乳類細胞内での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。

一般には、哺乳類細胞により認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに対し３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントとともに、コーディング配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的に翻訳後に切断され、ポリアデニル化されて形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「真核ＲＮＡの終結および３’末端プロセッシング」Ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導く。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０由来のものが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在するときに、より効率よく発現され得る。しかし、数個のｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライス供与部位および受容部位とも呼ばれる）が欠如しているベクターから効率よく発現された（例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、スプライス供与部位および受容部位を有するコーディング配列内の介在非コーディング配列である。それらは、一次転写物のポリアデニル化の後に、「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら、（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡスプライシング」，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編））。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終止配列を含有する上記の
成分は、発現構築物中に組み立てられる。エンハンサー、機能性スプライス供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所望であれば発現構築物中に含まれる。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞または細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。哺乳類複製系には、複製にトランス作用因子が必要とされる動物ウイルス由来のものが含まれる。例えば、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）またはポリオーマウイルスの複製系を含むプラスミドが、適切なウイルスＴ存在下で、非常に多数のコピーを複製する。哺乳類レプリコンのさらなる例には、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス由来のものが含まれる。さらに、レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のために哺乳類細胞中に、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中に維持される。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例には、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：９４６）、およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が含まれる。

使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーションポリヌクレオチドのリボソーム内へのカプセル化、および、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを包含する。

発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞系は、当該分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）および多くのその他の細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含するが、これらに限定されない。

（ｉｉ．バキュロウイルス系）
タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現ベクターに挿入され得、ベクター内の制御エレメントに作動可能に連結される。ベクター構築には、当該分野で公知の方法が用いられる。

一般的に、発現系の成分には転移ベクター、通常は細菌プラスミドが含まれ、これは、バキュロウイルスゲノムフラグメントと、発現されるべき異種の遺伝子または遺伝子群挿入のための便宜的な制限部位との両方；転移ベクター内のバキュロウイルス特異フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同的組換えを考慮する）；および、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を含む。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列を転移ベクター内に挿入した後に、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムが、昆虫宿主細胞内ヘトランスフェクトされ、そこでベクターとウイルスゲノムとの組換えが起こる。パッケージングされた組換えウイルスが発現され、組換えプラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料および方法は、キット形態で、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。これらの方法は当業者に公知であり、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ，１５５５（１９８７）（以後、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモ
ーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終止配列を含む上記の成分が、通常は中間置換構築物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（転移ベクター）に組み立てられる。この構築物は、１つの遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；各遺伝子がそれ自身の固有のセットの作動可能に連結された調節エレメントを有する複数の遺伝子；または、同じセットの調節エレメントに調節される複数の遺伝子を含み得る。中間置換構築物はしばしば、細菌のような宿主中で安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅のために適切な宿主中に維持される。

現在では、ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するための最も一般的に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知のその他の多くのベクターもまた設計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＡＴＴ下流３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照）。

プラスミドは通常さらに、ポリヘドロンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および、選択およびＥ．ｃｏｌｉ中での増殖のための原核アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含有する。

バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）翻訳を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５’末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含有する。バキュロウイルス転移ベクターもまた、エンハンサーと呼ばれる第二ドメインを有し得、これは存在する場合には、構造遺伝子の遠位に存在する。発現は調節され得るか、または構成的であり得る。

ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写された構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開Ｎｏ．１２７８３９およびＮｏ．１５５４７６）；および、ｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）が含まれる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のような、昆虫またはバキュロウイルス分泌タンパク質の遺伝子由来であり得る（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後の改変（シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化のような）のためのシグナルは、昆虫細胞により認識されると考えられており、そして分泌に必要なシグナルおよび核集積は、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているとも考えられているので、ヒトα−インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４０４）；マウスＩＬ−３，（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３；および、ヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９）
をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーもまた、昆虫での分泌を提供するために使用され得る。

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内に発現され得るか、または、適切な調節配列で発現されれば分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な細胞内発現は通常、ＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。

あるいは、組換えポリタンパク質または天然では分泌されないタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、小胞体へのタンパク質の輸送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を導く、疎水性アミノ酸を有するシグナルペプチドをコードする。

タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後に、昆虫細胞宿主を、転移ベクターの異種ＤＮＡと野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡとで共形質転換（通常は共トランスフェクション）する。構築物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２−５ｋｂ断片を含有する。バキュロウイルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ：Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、相同的二本鎖交差組換えによりなされ得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素部位になされ得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ
４：９１。

ＤＮＡ配列は、発現ベクターのポリヘドリン遺伝子の位置にクローニングされたときには、ポリヘドリン特異配列により、５’および３’両側に隣接され、ポリヘドリンプロモーターの下流に配置される。

新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、次に、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージングされる。相同的組換えは低頻度（約１％と約５％との間）で生じるため、共トランスフェクション後に産生された主要なウイルスは、まだ野生型である。従って、組換えウイルスを同定する方法が必要である。発現系の利点は、視覚スクリーニングにより、組換えウイルスの区別が可能であることである。天然ウイルスにより産生されるポリヘドリンタンパク質は、ウイルス感染後、後期に感染細胞の核に非常に高レベルで産生される。集積されたポリヘドリンタンパク質は、埋め込まれた粒子をも含む封入体を形成する。これらの封入体は、１５μｍまでの大きさであり、非常に屈折性であるために、光学顕微鏡下で容易に視覚化される光沢のある外観となる。組換えウイルスに感染した細胞には、封入体がない。野生型ウイルスから組換えウイルスを区別するには、トランスフェクション上清を、当業者に公知の方法により、単層の昆虫細胞上でプラーク形成させる。すなわち、プラークを光学顕微鏡下で、封入体の存在（野生型ウイルスの指標）または非存在（組換えウイルスの指標）についてスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．２（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（Ｓｕｐｐ．１０，１９９０）：ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ；Ｍｉｌｌｅｒら（１８９９）。

組換えバキュロウイルス発現ベクターは、数種の昆虫細胞への感染のために開発されて
いる。例えば、組換えバキュロウイノレは、とりわけ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ ｎｉのために開発されている（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６：および一般的にはＦｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。

細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系での異種ポリペプチドの直接発現および融合発現市販されている；細胞培養法は、一般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。

次に、改変昆虫細胞は、適切な栄養培地で増殖され得る。この栄養培地により、改変昆虫宿主内に存在するプラスミドは安定に維持され得る。発現産物遺伝子が誘導制御下にある場合には、宿主は高密度に増殖され得、発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合には、産物は培地に連続的に発現される。目的の産物を取り出し、枯渇した栄養分を補給しながら、栄養培地を連続的に取り替えねばならない。産物は、例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などの方法で精製され得る。適切には、培地に分泌されるかまたは昆虫細胞溶解から生じるいずれもの昆虫タンパク質を実質的に除去するために、宿主の破片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を提供するために、必要であれば産物はさらに精製され得る。

タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞は、配列をコードする組換えタンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、条件は、当該分野で公知のものに基づいて、当業者に容易に確認され得る。

（ｉｉｉ．細菌系）
細菌発現法は当該分野で公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得るいずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端近傍に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二ドメインを有し得、これは、ＲＮＡ合成を開始する位置である隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重複し得る。遺伝子リプレッサ一タンパク質はオペレターに結合し得、そのことにより特異遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターは、負の調節（誘導可能な）転写を行い得る。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列により達成され得、これは、存在する場合には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（５’）の近くに存在する。遺伝子活性化タンパク質の例は、力タボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉでのｌａｃオペロンの転写開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節的発現は正または負のいずれかであり得、そのことにより転写を促進または減退する。

代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列が含まれ
る。さらなる例には、トリプトファン（ｔｒｐ）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が含まれる（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６７７６およびＮｏ．１２１７７５）。ｇ−ラオタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「インターフェロンのクローニングおよびその他の誤り（ｍｉｓｔａｋｅｓ）」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、その他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列に接続され得て、合成雑種プロモーターをつくる（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサーにより調節される、ｔｒｐプロモーターおよびｌａｃオペロン両配列を含有する雑種ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合するＲＮＡポリメラーゼと結合して原核生物中である種の遺伝子を高レベルで発現し得る、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３：Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、雑種プロモーターもまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域を含有し得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ．２６７８５１）。

機能プロモーター配列に加えて、能率のよいリボソーム結合部位もまた、原核生物での外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、リボソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチドの長さの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端（３’ａｎｄ）との間で塩基対合してｍＲＮＡのリボソームヘの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱リボソーム結合部位を有する原核遺伝子および真核遺伝子を発現するためには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照のこと。

ＤＮＡ分子は細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、直接ＤＮＡ分子に連結され得、その場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸はメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。必要であれば、Ｎ末端のメチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーション、または細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションにより、タンパク質から切断され得る（ＥＰＯ公開Ｎｏ．２１９２３７）。

融合タンパク質は、直接発現の代替を提供する。通常は、内因性細菌タンパク質またはその他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コーディング配
列の５’末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子が外来遺伝子の５’末端で連結され得、細菌内で発現され得る。得られた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセッシング酵素（因子Ｘａ）に対する部位を保持している（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまたｌａｃＺ由来の配列を用いて生成され得る（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７，ｔｒｐＥ，Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３：Ｍａｋｏｆｆら（１８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１、およびＥＰＯ公開Ｎｏ．３２４６４７，ｇｅｎｅｓ）。２つのアミノ酸配列を接続したＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、またはコードし得ない。その他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からユビキチンを切断するためのプロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）に対する部位を保持しているユビキチン領域を用いて生成される。この方法によって、そのままの外来タンパク質が単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌で外来タンパク質分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子をつくることにより、細胞から分泌され得る（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質分泌を導く疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し、これはインビボまたはインビトロにおいて切断され得る。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌される細菌タンパク質の遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２：ＥＰＯ公開Ｎｏ．２４４０４２）。

通常、細菌により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導く。転写終止配列はしばしば、転写終止の助けとなるステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子およびその他の生合成遺伝子のような、強プロモーターを伴った遺伝子由来の転写終止配列が含まれる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発現構築物は、細菌のような宿主に安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは、１つの複製系を有し、このため、発現、またはクローニングおよび増幅のいずれかのために原核宿主中に維持される。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５から約２００、そして通常約１０から約１５０、の範囲のコピ
ー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含有する。高コピー数または低コピー数のいずれかのベクターが、宿主でのベクターの効果および外来タンパク質に依存して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする細菌染色体に相同な少なくとも１つの配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えによると考えられる。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡで構築された組込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込む（ＥＰＯ公開Ｎｏ．１２７３２８）。組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含有し得る。

通常、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含有し得る。（Ｄａｖｉｅｓら、（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路でのような、生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てられ得る。形質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに組み込まれる選択マーカーを含有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクターは、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の細菌のために開発されている：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｐａｌｖら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２：ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６２５９およびＮｏ．０６３９５３；ＰＣＴ公開Ｎｏ、Ｗｏ８４／０４５４１：Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８：Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６７７６，Ｎｏ，１３６８２９およびＮｏ．１３６９０７；Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ．Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ，Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；およびＳｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、米国特許第４，７４５，０５６号。

外因性ＤＮＡの細菌宿主への導入方法は当該分野で周知であり、ＣａＣｌ_２、または、二価カチオンおよびＤＭＳＯのようなその他の試薬で処理された細菌の形質転換を包含する。ＤＮＡはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞中に導入され得る。形質転換の方法は、通常形質転換されるべき細菌種により変化する。Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２：ＥＰＯ公開Ｎｏ．０３６２５９およびＮｏ．０６３９５３：ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓに関する；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒに関する；Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ６９：２１１０：Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：６１２７：Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「ｃｏｌＥ１由来プラスミ
ドによるＥ．ｃｏｌｉ形質転換のための改良法」，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａに関する；Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに関する；Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｓに関する；Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに関する；Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８：Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「エレクトロポーレーションによるＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換」，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５：Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓに関する、を参照のこと。

（ｉｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る、いずれものＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５’末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはさらに、上流活性化配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第二ドメインを有し得、これは、存在する場合には通常構造遺伝子の遠位に存在する。ＵＡＳにより、調節（誘導可能な）発現が行われる。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で起こる。調節的発現は正または負のいずれかであり得、そのことにより転写を促進または減退する。

酵母は、活性代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、代謝経路の酵素をコードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開Ｎｏ．２８４０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２９２０３）が包含される。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域に接続され得、合成雑種プロモーターがつくられ得る。このような雑種プロモーターの例には、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が含まれる（米国特許第４，８７６，１０７号および米国特許第４，８８０，７３４号）。雑種プロモーターのその他の例には、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に組み合わされた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが含まれる（ＥＰＯ公開Ｎｏ．１６４５５６）。さらに、酵母プロモーターには、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。このようなプロモーターの例には、特に
、Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５：Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９：Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７８）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの細菌抗生物質耐性遺伝子の発現」：Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９が、含まれる。

ＤＮＡ分子は酵母において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子に直接に連結され得、その場合には、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸はいつもメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望であれば、Ｎ末端メチオニンは、インビトロにおける臭化シアンとのインキュベーションにより、タンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、哺乳類、バキュロウイルス、および細菌発現系と同様に、酵母発現系の代替を提供する。通常、内因性酵母タンパク質またはその他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コーディング配列の５’に融合される。発現に際し、この構築物は、２つアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子が、外来遺伝子の５’末端で連結され得、酵母で発現され得る。２つのアミノ酸配列の接続部位ＤＮＡ配列は、切断部位をコードし得るか、またはコードし得ない。例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ．１９６０５６を参照のこと。その他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセッシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ）に対する部位を保持しているユビキチン領域でつくられる。従って、この方法によってそのままの外来タンパク質が単離され得る（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０２４０６６を参照のこと）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母での外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子をつくることにより、細胞から増殖培地に分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位が存在し、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ公開Ｎｏ．０１２８７３：ＪＰＯ公開Ｎｏ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）のような、分泌酵母タンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、非酵母起源のリーダーが存在し、これもまた酵母での分泌を提供する（ＥＰＯ公開Ｎｏ．０６００５７）。

分泌リーダーの好ましいクラスには、酵母α因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダーがあり、これは「ｐｒｅ」シグナル配列および「ｐｒｏ」領域の両方を含有する。用いられ得るα因子フラグメントの型には、全長ｐｒｅ−ｐｒｏ α因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および切断型α因子リーダー（通常約２５から約５０アミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４，５４６，０８３号および米国特許第４，８７０，００８号；ＥＰＯ公開Ｎｏ．３２４２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを用いる別のリーダーには、第一酵母のｐｒｅ配列でつくられたハイブリッドα因子リーダーが含まれるが、第二酵母のα因子のｐｒｏ領域は含まれない。（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９
／０２４６３を参照のこと）。

通常、酵母により認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコーディング領域に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を導く。転写終止配列およびその他の酵母認識終止配列の例は、解糖酵素をコードする配列などである。

通常、プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコーディング配列、および転写終止配列を含む上記の成分は、発現構築物中に組み立てられる。発現構築物はしばしば、酵母または細菌のような宿主中に安定して維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中に維持される。レプリコンは２つの複製系を有し得、このため、例えば、発現のために酵母中に、およびクローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持される。このような酵母−細菌シャトルベクターの例には、ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７−２４）；ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６）；およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）が含まれる。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を有し、通常約１０から約１５０のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０を有する。高コピー数または低コピー数のベクターは、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクターは通常、ベクターの組込みを可能にする、酵母染色体に相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含有する。組込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組換えによると考えられる（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８−２４５）。組込みベクターは、ベクター中への封入に適切な相同配列を選択することにより、酵母の特異的な座に導かれ得る。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質レベルに影響し得る（Ｒｉｎｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中の１つのセグメントとして存在して、完全ベクターの組込みになり得るか、または、染色体中の隣接セグメントに相同で、ベクター中で発現構築物に隣接する２つのセグメントとして存在して、発現構築物のみの安定な組込みになり得る。

通常は、染色体外および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７のような、酵母宿主で発現され得る生合成遺伝子、および、ツニカマイシンおよびＧ４１８のそれぞれに対する酵母細胞において耐性を与えるＧ４１８耐性遺伝子を含み得る。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒素化合物の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、銅イオンの存在下での酵母の増殖を可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）。

あるいは、上記成分のいくつかは、形質転換ベクター中に組み立てれられ得る。形質転換ベクターは通常、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクターに組み込まれる選択マーカーを合有する。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクターは、多くの酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に以下の酵母のために開発されている：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）；Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）：Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４９号および米国特許第４，９２９，５５５号）：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）；および、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１ Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。

外因性ＤＮＡの酵母宿主への導入方法は、当該分野では公知であり、通常は、スフェロプラストまたは完全酵母細胞をアルカリカチオンで処理する形質転換を包含する。形質転換方法は通常、形質転換される酵母種により変化する。例えば、Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１、Ｃａｎｄｉｄａに関する；Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｙ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２、Ｈａｎｓｅｎｕｌａに関する；Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５：Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓに関する；Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および米国特許第４，９２９，５５５号、Ｐｉｃｈｉａに関する；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５；１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関する；Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関する；Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９、Ｙａｒｒｏｗｉａに関する；参照のこと。

（４．ワクチン）
本明細書中で考察されている各コンジュゲート化合物は、単一ワクチン候補物として、または他の病原由来の１つ以上のその他の抗原との組み合わせで使用され得る。これらのワクチンは、予防剤（感染を予防するため）または治療剤（感染後に疾患を治療するため）のいずれかであり得る。

このようなワクチンは、コンジュゲート化合物を、通常は「薬学的に受容可能なキャリ
ア」との組合せで含有し、このキャリアは、この組成物が与えられる個体に対して有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しないいずれものキャリアを含む。適切なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリボソーム）、および不活性ウイルス粒子のような、大きくて徐々に代謝される高分子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風などのような細菌トキソイドにコンジュゲートされ得る。

組成物の効果を増強させる好ましいアジュバントには、以下が包含されるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型エマルジョン製剤〔ムラミルペプチド（下記を参照）のようなその他の特異的免疫刺激剤または細菌細胞壁成分を伴うまたは伴わない〕、例えば、（ａ）ＭＦ５９（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９０／１４８２７）：５％スクワレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５〔必須ではないが必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照）を含有する〕を含有して、１１０Ｙ型マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に処方される；（ｂ）ＳＡＦ：１０％スクワラン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照）を含有し、マイクロフルイダイザーにかけてサブミクロン粒子エマルジョンにされるか、ボルテックスにかけてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成する；および、（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）：２％スクワレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および、１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）よりなる群から、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））を含有する；（３）サポニンアジュバント（例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ））が使用され得るか、または、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のような、それらからつくられた粒子；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；および、（６）組成物の効果を増強するための免疫刺激剤として作用するその他の物質。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９が好ましい。

上記のように、ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれるが、これらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希釈剤を含有する。さらに、湿潤または乳化剤などのような補助物質、ｐＨ緩衝物質などが、このような賦形剤中に存在し得る。

典型的には、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射用に調製される；注射の前に液体賦形剤に溶解または懸濁するのに適切な固形もまた、調製され得る。薬学的に受容可能なキャリアについて上記で考察したように、調製物はまた、アジュバン
ト効果を増強するために、エマルジョンにされるか、またはリボソームにカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペプチド、および必要であれば、上記成分のいかなる他の成分をも含有する。「免疫学的に有効な量」とは、単回投与でまたは連続投与の一部として個体に投与される量が、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体条件、処置される個体の分類学上のグループ（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力、所望の予防程度、ワクチン処方、医療状況での治療医の評価、およびその他の関連因子に依存して変化する。その量は比較的広範囲にあり、日常の試行により決定され得ると思われる。

免疫原性組成物は従来より非経口的に、例えば、皮下または筋肉内注射により、投与される。その他の投与形態に適した処方には、経口および肺への処方、坐薬、および経皮投与が含まれる。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

（５． 実施例１）
Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ Ｃ群の多糖類ならびに熱ショックタンパク質ｈｓｐＲ７０およびｈｓｐ６５を含有するコンジュゲート化合物を構築し、ワクチンの効力について試験した。

（５．１． Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ Ｃ（ＭｅｎＣ）群の多糖の精製、およびＭｅｎＣのオリゴ糖の生成）
Ｃ群髄膜炎菌の多糖を、Ｆｒａｓｃ Ｃ．Ｅ３．の「バイオテクノロジープロセスの進歩：バクテリアワクチン」（Ａ．Ｍｉｚｒａｈｉ編），ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１２３−１４５，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）に記載されているように精製した。精製多糖類（１０ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ５の０．０１Ｍ酢酸緩衝液中で、１００℃で８時間加水分解して解重合した。得られた生産物を、分析用クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ６−５０）で分析し、０．２７のＫｄ（分布係数）を示した。

（５．２． 一級アミン基のオリゴ糖末端基への導入）
０．５Ｍの塩化アンモニウムおよび０．１５Ｍのシアノボロヒドリドナトリウムを加水分解から得られた溶液に加えた。ｐＨを７に上げて、得られた溶液を３５℃で１週間置いた。次に、オリゴ糖をクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ６−１５）により、収集したアミン基およびカルボハイドレート基に関して化学活性を含有するボイド容量画分を精製した。一方、単糖および過剰の試薬を含有する画分は廃棄した。得られたＭｅｎＣオリゴ糖は、アミン基、シアル酸基、およびＯ−アセチル基を測定することによって特徴付けられた。次のモル比が得られた：シアル酸／アミン基＝２０、Ｏ−アセチル／シアル酸＝０．８４。

（５．３． 熱ショックタンパク質の調製）
Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＧｒｏＥＬ−型 ６５ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）をプラスミドｐＲＩＢ１３００を宿した組換えＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株から発現し（Ｔｈｏｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８５，５０，８００：Ｖａｎ Ｅｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３１，１７１）、そして、Ｔｈｏｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．，１９８７，５５．１４６６に記述されたように精製した。

組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＤｎａＫ−型 ７０ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）を得て、ＡＴＰ−アガロースクロマトグラフィーで精製した（Ｍｅｈｌｅｒｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，３，１２５）。

（５．４． ＭｅｎＣ多糖とｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０との糖コンジュゲートの調製）
ＭｅｎＣアミノ−オリゴ糖を、Ｈ_２Ｏを１０％含むジメチルスルホキシドに溶解し、それから（アミン基について）１２倍過剰のアジピン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［Ｈｉｌｌら、「ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．」１０２：２８２（１９７９）に従って調製した］と反応させた。ジオキサン（１〜４倍量）で沈澱させて精製した後、活性化オリゴ糖を真空中で乾燥し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの含有量について分析した。次いで、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で５ｍｇ／ｍｌの量のｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０を、３００倍モル過剰の活性化オリゴ糖と反応させた。それぞれ得られた糖コンジュゲートは、クロマトグラフィーにより未反応オリゴ糖から遊離し、濾過し、そして４℃で保存した。開始物質のＭｅｎＣ多糖中のシアル酸の割合に対する糖コンジュゲートのシアル酸含有量の比は、カップリングしたオリゴ糖の量を表す。調製したタンパク質の含有量は、Ｌｏｗｒｙ「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９３：２６５（１９５１）の方法により確認した。特に、ｈｓｐＲ７０とのコンジュゲートは、３１０μｇ／ｍｌのタンパク質含有量および７６μｇ／ｍｌの糖含有量を有し、一方、ｈｓｐＲ６５とのコンジュゲートは、１８０μｇ／ｍｌのタンパク質含有量および９７μｇ／ｍｌの糖含有量を有する。

（５．５． マウスおよび免疫感作）
ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）、Ｃ５６７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）およびＣＢＡ／Ｊ（Ｈ−２^ｋ）の雌のマウス（８〜１２週齢）を本発明者らの飼育施設で飼育した。

最初のカップルはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから供給された。ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ 胸腺欠失マウスをＩｆｆａ Ｃｒｅｄｏ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから得た。

０日目、各々のマウスに１０^６ＣＦＵのＢＣＧ（またはコントロール群の場合はＰＢＳ）を腹腔内投与し、続いて１４日目と３５日目に２用量のコンジュゲート（ＰＢＳ中）を投与した。

コントロール群は、ＭｅｎＣオリゴ糖のみ、または水酸化アルミニウム（１ｍｇ／用量、０．５ｍｌ中）に吸着したＭｅｎＣオリゴ糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンを接種した。各々の免疫感作において、マウスに２μｇのＭｅｎＣオリゴ糖を接種し、それは８．７μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチン、８．４μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ｈｓｐＲ７０コンジュゲート、または３．７μｇのＭｅｎＣオリゴ糖−ｈｓｐＲ６５コンジュゲートに対応した。

（５．６． ＥＬＩＳＡ法による抗体の測定）
毎週、マウスの後眼窩叢から血液を採取し、抗体はＥＬＩＳＡで力価測定した。

ＩｇＧ抗ＭｅｎＣ抗体を測定するために、９６ウエル平底プレートをｐＨ７．４のＰＢＳ中のＭｅｎＣ多糖（５μｇ／ｍｌ）で３７℃で一晩のインキュベーションにより覆った（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｉ，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。０．０５４％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で繰り返し洗浄し、そして５％のＦＣＳを含有するＰＢＳ−Ｔの２００μｌで３７℃、１時間インキュベーションした後、ウエルを５％ ＦＣＳを含むＰＢＳ−Ｔで希釈したマウス血清１００μｌと
ともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄を繰り返した後、プレートを再び、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＩｇＧ抗マウス抗血清を適切に希釈したものの１００μｌとともに３７℃で３時間インキュベートした。

特異的抗体の存在を、２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を基質として加えることにより明らかにした。結果は、４１４ｎｍでの吸光度について測定した。試験した最初の希釈（１：５０）で０．２未満の吸光度を有する血清サンプルは、陰性と考えた。

（５．７． オリゴ糖ヘコンジュゲートしたｈｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０のキャリア効果）
ＨｓｐＲ６５およびｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣオリゴ糖コンジュゲートを、予めＢＣＧで感作したまたは感作していないＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫に使用した。

コントロールとして、数群のマウスにＭｅｎＣのみまたは水酸化アルミニウム上のＣＲＭ１９７−ＭｅｎＣコンジュゲートワクチンを感作させた。

図１は、抗ＭｅｎＣ多糖ＩｇＧ抗体が、水酸化アルミニウム上のＣＲＭ１９７−ＭｅｎＣコンジュゲートワクチンの場合に測定したのと同等またはそれ以上の量でｈｓｐ−ＭｅｎＣコンジュゲートの免疫の後産生されたことを示す（図１Ａ中のＣ５７ＢＬ／６）。この効果は、アジュバントが存在しない場合だけでなく、ＢＣＧで感作しなかったときのｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣコンジュゲートの場合にも観察された（図１Ｂ）。これらの結果より、アジュバント非存在下またはＢＣＧ感作していないとき、ミコバクテリウムのｈｓｐを用いる免疫が、オリゴ糖抗原を用いても本当に達成し得ると述べ得る。

従って、ｈｓｐ分子（特にｈｓｐＲ７０）は、ＢＣＧで感作していないマウスでも強力なキャリア効果を及ぼし、アジュバントの非存在下でさえ、移送した多糖に対して特異的なＩｇＧ抗体を誘導する能力のある分子の有効なキャリアとして作用することが確認された。

アジュバントおよび前感作の非存在下で及ぼされる、このミコバクテリウムのｈｓｐの有効なキャリア効果により、記載されたコンジュゲートが、細菌感染に対する新規ワクチンの開発に特に有用になる。

（６．実施例２）
新規のＨ．ｐｙｌｏｒｉ熱ショックタンパク質が同定され、組換えＤＮＡ法を用いて産生された。

（６．１． 材料および方法）
（６．１．１． Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株および増殖条件）
使用したＨ．ｐｙｌｏｒｉ株は：ＣＣＵＧ １７８７４、Ｇ３９およびＧ３３（Ｇｒｏｓｓｅｔｏ病院，Ｉｔａｌｙ，で胃生検より単離）、Ｐｙｌｏ ２Ｕ＋およびＰｙｌｏ ２Ｕ−（Ｆ．Ｍｅｇｒａｕｄ，Ｐｅｌｌｅｇｚｉｎ病院，Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅにより供与）、ＢＡ９６（Ｓｉｅｎａ大学，Ｉｔａｌｙ，で胃生検により単離）であった。Ｐｙｌｏ ２Ｕ＋株は非細胞毒性であり；Ｐｙｌｏ ２Ｕ−株は非細胞毒性およびウレアーゼ陰性である。全ての株は、０．２％のシクロデキストリン、５μｇ／ｍｌのセフスロジン、および５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含むコロンビアアガー上で、微好気性の条件下で、３７＾℃５〜６日間通常的に増殖した。細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した
。ペレットをＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液に再懸濁して、そして煮沸して細胞を溶解した。

胃炎および潰瘍に冒されている患者の血清（Ａ．Ｐｏｎｚｅｔｔｏ，「Ｌｅ Ｍｏｌｉｎｅｔｔｅ」病院，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｉｙにより供与）および胃癌患者の血清（Ｆ．Ｒｏｖｉｅｌｌｏ，Ｓｉｅｎａ大学，Ｉｔａｌｙにより供与）を使用した。

（６．１．２． ライブラリーの免疫スクリーニング）
λｇｔ１１ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡ発現ライブラリーの５０万個のプラークを、０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含むＬＢ中で一晩増殖したＥ．ｃｏｌｉ
Ｙ１０９０株の懸濁液５ｍｌと混和し、そして０．５ Ｏ．Ｄ．になるように１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４に両懸濁した。３７℃で１０分インキュベーションした後、溶かした７５ｍｌのＴｏｐＡｇａｒｏｓｅを、細菌／ファージ混合物に注ぎ、そして全部をＢＢＬプレート上で平板培養した（５０，０００プラーク／プレート）。４２℃で平板培養したライブラリーを３．５時間インキュベーションした後、１０ｍＭ ＩＰＴＧで予め湿らせたニトロセルロース濾紙（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をプレート上に載せ、そしてさらに３７℃３．５時間、次いで４℃で一晩インキュベーションした。λタンパク質を有する濾紙を持ち上げてＰＢＳで洗浄し、そしてＴＢＳＴ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５Ｍ ＭｇＣｌ_２）に溶解した５％脱脂乾燥乳で２０分間飽和させた。最初のハイブリダイゼーション工程は、患者血清で行った；陽性プラークを呈色および可視化するために、製造者の指示に従って、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中でアルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ヒトＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）およびＮＢＴ／ＢＣＩＰキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いた。

（６．１．３． 組換えＤＮＡ手順）
使用した試薬および制限酵素は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。分子クローニング、一本鎖ＤＮＡ精製、Ｅ、ｃｏｌｉでの形質転換、プローブの放射標識化、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリーのコロニースクリーニング、サザンブロット分析、ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析については、標準的技法を用いた。

（６．１．４． ＤＮＡ配列分析）
ＤＮＡフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でサブクローニングした。一本鎖ＤＮＡ配列決定を、製造者の指示に従って、［^３３Ｐ］αｄＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて行った。配列は両鎖について決定し、そして各鎖は平均２回配列決定した。コンピュータによる配列分析はＧＣＧパッケージを用いて行った。

（６．１．５． 組換えタンパク質）
ＭＳ２ポリメラーゼ融合タンパク質をｐＥＸ３４Ａ（ｐＥＸ３１の誘導体）ベクターを用いて生成した。挿入Ｈｐ６７（図３のヌクレオチド４４５からヌクレオチド１４０２）およびＥｃｏＲＩリンカーを、ベクターのＥｃｏＲＩ部位にフレーム内でクローニングした。停止コドンの位置を確認するために、ＨｐＧ３’ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＥＸ３４ＡのＨｉｎｄＩＩＩ部位にフレーム内でクローニングした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｈ１△ｔｒｐに形質転換した。誘導後の両方の場合で、予測した分子量の融合タンパク質を生成した。ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントの場合は、誘
導後に得られた融合タンパク質をウサギに免疫するために、標準プロトコルを用いて電気浴出した。

（６．２． 結果）
（６．２．１． 発現ライブラリーのスクリーニングおよびＨ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐのクローニング）
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングに適切な血清を見つけるために、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＣＣＵＧ １７８７４株の超音波処理抽出物を、異種の胃炎によって冒された患者の血清に対するウェスタンブロット分析で試験した。異なった血清による抗原認識パターンは多岐にわたり、おそらく、個体の免疫応答の差異、および感染物に含まれる株により発現する抗原の差異のためであった。

Ｎ°１９の血清を、細菌の増殖の間にインビボで発現される、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ特異的抗原を同定するためのλｇｔ１１ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために選択した。この血清でライブラリーをスクリーニングした後、多くの陽性クローンを単離し、特徴付けた。これらの１つのヌクレオチド配列（いわゆるＨｐ６７）は、熱ショックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに高い相同性を有するタンパク質をコードする９８５塩基対のオープンリーディングフレームであることがわかった（Ｅｌｌｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３５８：１９１−９２（１９９２））。全コーディング領域を得るために、本発明者らは、フラグメントＨｐ６７を、異なる制限酵素で切断したＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＤＮＡのサザンブロット分析のプローブとして用いた。プローブＨｐ６７は、それぞれ、約８００および１０００塩基対の２つのＨｉｎｄＩＩＩバンドを認識した。ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＤＮＡのゲノムＨ．ｐｙｌｏｒｉライブラリーをプローブＨｐ６７でスクリーニングし、そして予測した分子量の２つの陽性クローン（ＨｐＧ５’およびＨｐＧ３’）を得た。プラスミドｐＨｐ６０Ｇ２（約１から９２９のヌクレオチド）およびｐＨｐ６０Ｇ５（約８２４から１８３８のヌクレオチド）を合むＥ．ｃｏｌｉをアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。

（６．３． 配列分析）
ヌクレオチド配列分析で、開始ＡＴＧの６塩基対上流の推定リボゾーム結合部位を有する１６３８塩基対のオープンリーディングフレームが明らかになった。図３に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。推定リボゾーム結合部位および中間ＨｉｎｄＩＩＩ部位を下線で示す。フラグメントＨｐ６７の４４５位のシトシンおよび１４０２位のグアニンは、それぞれ最初および最後のヌクレオチドである。チミジン１７７２を、独立因子ターミネーター領域の局在化に関する演算法を用いて、転写された最後の推定のヌクレオチドとして同定した。オープンリーディングフレームは、５８．３ＫＤａの予測分子量、および５．３７の予測ｐＩを有する５４６アミノ酸のタンパク質をコードしていた。この遺伝子のコドンの選択は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉコドンの用法と一致する。

疎水性のプロフィル分析では、予測されるリーダーペプチドまたは他の貫膜ドメインを除いて、ほとんど疎水性タンパク質であることがわかった。アミノ末端配列は、精製タンパク質について、Ｄｕｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：１９４６−５１（１９９２）により決定された３０アミノ酸の配列に１００％の相同性を示し、Ｅｖａｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２１２５−２７（１９９２）によって公表された４４アミノ酸の配列から１残基のみ（Ｌｙｓに代わってＳｅｒ４２）異なっていた（Ｅｖａｎｓら、１９９２）。成熟ｈｓｐタンパク質のＮ−末端配列は、開始メチオニンを含まず、このことは、翻訳後に除かれたことを示している。

（６．４． ｈｓｐ６０ファミリーとの相同性）
アミノ酸配列分析で、全ての生物に存在するメンバーである熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０ファミリーと非常に高い相同性が示された。異種のｈｓｐ６０タンパク質問での相同の程度に基づいて、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐは、グラム陰性細菌のｈｓｐ６０タンパク質のサブグループに属する；しかし、ｈｓｐ６０ファミリーの他のタンパク質に対する相同の程度はかなり高い（少なくとも５４％の一致）。

他の熱ショックタンパク質とのＨ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐの相同性は図３に完全に例示した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｈｓｐまたはその１つ以上の機能的な免疫刺激ドメインは、本発明に従ってコンジュゲート化合物を生成するために上記実施例１の手法を用いてオリゴ糖または多糖にコンジュゲートし得る。

（６．５． 組換えタンパク質の発現およびポリクローナル抗血清の生成）
クローンＨｐ６７およびクローンＨｐＧ３’の挿入物を、ＭＳ２ポリメラーゼのアミノ末端に融合したこれらのオープンリーディングフレームを発現するために、発現ベクターｐＥＸ３４Ａにサブクローンした。クローンは予測したサイズの組換えタンパク質を生成し、そして最初のスクリーニングで用いたヒト血清により認識された。クローンＨｐ６７由来の融合タンパク質を電気浴出し、そして抗ｈｓｐ特異的ポリクローナル抗血清を得るためにウサギの免疫に用いた。得られた抗血清は、融合タンパク質と、ウレアーゼ陰性株および非細胞毒性株を含有する、試験したいくつかのＨ．ｐｙｌｏｒｉ株の全細胞抽出物の５８ＫＤａのタンパク質との両方を認識した。

Ｈｓｐは試験した全てのＨ．ｐｙｌｏｒｉ株で発現されることが示され、そしてその発現はウレアーゼの存在または細胞毒性に関係ない。抗ｈｓｐ抗血清により認識されるタンパク質は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの水溶性抽出物中に認められ、そしてウレアーゼサブユニットと同時に精製された。これは、このタンパク質が細菌外膜に弱い会合をしていることを示す。従って、ｈｓｐはウレアーゼに会合し、そして表面が露出していると記載し得る細胞表面の局在化により、ほとんどのｈｓｐに相同なタンパク質が細胞質中またはミトコンドリアおよび色素体中に局在していることは驚くことである。ｈｓｐにリーダーペプチドが欠けていることは、これが独特の輸送系により膜に輸送されるか、あるいはタンパク質が細胞質から放出され、細菌の死後に細菌の膜に受動的に吸着するかのいずれかであることを示唆する。

（７． 生物学的材料の寄託）
以下の材料は、１９９２年１２月１５日および１９９３年１月２２日に、本発明の譲渡人であるＢｉｏｃｉｎｅ Ｓｃｌａｖｏ，Ｓ．ｐ．Ａ．により、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約のもとに、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、メリーランド州，ロックビル，パークローンドライブ１２３０１，電話（３０１）２３１−５５１９に寄託された。
ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５５ プラスミドｐＨｐ６０Ｇ２を含むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１
ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９１５６ プラスミドｐＨｐ６０５を含むＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１。

これらの寄託物は、当業者の利便性のために提供され、寄託が、米国特許法１１２条、または本明細書の任意の指定国のいかなる相当規定のもとで要求されることを認めるものではない。これらの寄託物の核酸配列、およびそれにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、寄託物の配列と比較して、本明細書に記載の配列中に任意の誤りがある場合には、参考にされるべきである。寄託物質を製造し、使用し、または売るためには許諾が必要であり得るが、ここでは、そのような許諾は承認されていない。

このように、本発明のキャリアは、確実に高力価のワクチン接種をするために、細菌間の熱ショックタンパク質の高い保存性およびＴ細胞記憶を、独自に利用するものである。この化合物は、アジュバントを用いることなく、抗多糖抗体の形成を誘導し得る。そのため、本化合物は、ヒトおよび動物に使用するワクチン、特に細菌感染予防用ワクチンの調製に有用である。

図１は、ｈｓｐＲ６５／ＭｅｎＣコンジュゲートでマウスを免疫化した結果を示し、そして、血中の抗ＭｅｎＣに対するＥＬＩＳＡの結果を含む。図１Ａには、ＢＣＧで予め免疫化したマウスを記載し、図１ＢにはＢＣＧで予め免疫化しなかったマウスを記載している。図は、ＰＢＳ中のｈｓｐＲ６５−ＭｅｎＣ（白丸）コンジュゲートまたはｈｓｐＲ７０−ＭｅｎＣ（白菱形）コンジュゲートとでの結果を示す。コントロール群のマウスは、ＭｅｎＣ多糖のみ（白三角）または水酸化アルミニウム中のＣＥＭ１９７−ＭｅｎＣコンジュゲートワクチン（白四角）で免疫化した。 図２Ａは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの熱ショックタンパク質のアミノ酸配列を示し、そして、それとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来の関連する熱ショックタンパク質とを比較している。配列の下線は、配列１〜４とヒト熱ショックタンパク質との間で、相同性が減少したドメインを示す。 図２Ｂは、図２Ａの続きである。 図２Ｃは、図２Ｂの続きである。 図３Ａは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの熱ショックタンパク質の、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。 図３Ｂは、図２Ａの続きである。 図３Ｃは、図２Ｂの続きである。

Claims (9)

1. 少なくとも１つの熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含有する熱ショックタンパク質の一部と、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖とを含有する、コンジュゲート化合物であって、ただし、該オリゴ糖または多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポ多糖分子のＯ−多糖領域ではない、コンジュゲート化合物。
2. Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ Ｃ（Ｍｅｎ Ｃ）群のオリゴ糖、および熱ショックタンパク質を含有する、請求項１に記載のコンジュゲート化合物。
3. 前記熱ショックタンパク質が、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＧｒｏＥＬ型 ６５ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ６５）、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＤｎａＫ型 ７０ｋＤａ ｈｓｐ（ｈｓｐＲ７０）、およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の熱ショックタンパク質から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート化合物。
4. 熱ショックタンパク質または少なくとも１つの免疫刺激ドメインを含む熱ショックタンパク質の一部を、少なくとも１つのオリゴ糖または多糖に共有結合させる工程を包含する、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物を生成する方法。
5. 製剤として使用する、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物。
6. 細菌感染に対するワクチン接種用の薬剤の製造における、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物の使用。
7. 免疫学的に有効な量の請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート化合物を含む、ワクチンまたは治療用組成物。
8. 請求項１から請求項３のいずれかに記載の１つ以上のコンジュゲート化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチンまたは治療用組成物。
9. 請求項１から請求項３のいずれかに記載の１つ以上のコンジュゲート化合物を、薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程を包含する、ワクチンの調製方法。

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