JP2003515334A

JP2003515334A - 醗酵ブロスからスタチン化合物を回収するための方法

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Publication number: JP2003515334A
Application number: JP2001541501A
Authority: JP
Inventors: ケリ，ビルモシュ; デアク，ラヨシュ; フォルガチ，イロナ; サボ，チャバ; アルバイナジェネ，エディト
Original assignee: ビオガルジョジセルジャールアールテー．
Priority date: 1999-11-30
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2003-05-07
Anticipated expiration: 2020-11-28
Also published as: DK1265604T3; US20020187531A1; CY1105925T1; EP1265604A1; JP2006055174A; KR20030026920A; ATE382344T1; CN1754872A; JP2008109948A; ES2239937T1; WO2001039768A1; AU1804601A; JP2004350687A; EP1265604B1; DE60031447D1; ES2273737T3; YU39102A; ZA200203912B; JP2006273861A; RU2002114072A

Abstract

(57)【要約】抽出による化合物の濃縮溶液形成する段階を含んで醗酵ブロスから化合物を回収するため、濃縮溶液から上記化合物の塩を得るため、上記化合物の塩を精製するため、化合物の金属塩に塩性転換(trans-salifying)するための方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の領域本発明は、水溶性醗酵ブロス中で行われる反応の所望する化学生成物を単離す
るための方法に関する。本発明は、さらに醗酵ブロスからのプラバスタチン、コ
ンパクチン、およびロバスタチンの単離に関し、より詳細にはコンパクチンの醗
酵によって作り出されるプラバスタチンの単離に関する。

【０００２】発明の背景心筋閉塞、発作および抹消血管症など心臓血管の合併症が米国内の死者の半数
を占めている。高レベルな血流中の低密度リポタンパク質(LDL)は、血流を阻害
し、破裂する場合もあり、血栓症を促進する冠状動脈疾患の形成に結びついてき
た。Goodman and Gilman,The PHarmacological Basis of Therapeutics 879(9th
ed.1996)を参照。血漿のLDLレベルの減少は、心臓血管症を有する患者、および
心臓血管症を有しないが高コレストロール症を有する患者の臨床状態となる危険
性を減少することを示してきた。Scandinavian Simvastain Survial Study Grou
p,1994;Lipid Reserch Clinics Program,1984a,1984bを参照。

【０００３】スタチン薬品は、心臓血管症の危険性のある患者における血流LDLレベルの減
少に利用できる現段階で最も治療に有効な薬品である。とりわけ、この種の薬品
には、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、および
フラバスタチンを含んでいる。スタチンの作用機構は、ある程度詳細に明示され
てきた。これらは、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−補酵素Ａ還元酵
素(「HMG-CoA還元酵素」)を競合的に抑止することによって、肝臓内のコレステ
ロールや他のステロールの合成を阻害する。HMG-CoA還元酵素は、それは、コレ
ステロールの生物的な合成速度の決定ステップであるHMG-CoAのメバロン酸への
転化することを触媒としている。

【０００４】したがって、その抑制化は、肝臓内のコレステロール形成速度の低減に導く。

【０００５】プラバスタチンは、化学化合物［１Ｓ−［１α（β’、δ’）２α、６α、８
β（Ｒ’）、８ａα］］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−β、δ、
６−トリヒドロキシ−２−メチル−８−（２−メチル−１−オキソブトキシ）−
１−ナフタレン−ヘプタン酸（CAS Registry No.81093-370.）の一般的な医薬名
である。遊離酸形状におけるプラバスタチンの分子構造は、Ｒ＝ＯＨである化学
式（Ｉａ）で表される。ラクトンの形状は、化学式（Ｉｂ）で表わされ、各原子
を符号化して番号付けを明示している。

【０００６】

【化１】

【０００７】プラバスタチン、コンパクチン（化学式Ｉｂ，Ｒ＝Ｈ），ロバスタチン（化学
式Ｉｂ，Ｒ＝ＣＨ_３），シンバスタチン、およびフルバスタチンそれぞれは、ラ
クトンで閉鎖されたカルボン酸を末端に有し、そしてカルボン酸基に対してβ位
、とδ位に２つの水酸基を有するアルキル鎖を有する。このアルキル鎖は、HMG-
CoA還元酵素に結合する上記部分の分子である。δ位置のカルボン酸基や水酸基
は、化学式（Ｉｂ）に示すようにラクトン化する傾向がある。

【０００８】ラクトン化可能なスタチン様化合物は、遊離酸形状、またはラクトン形状、ま
たは両形状の混合する平衡体として存在する。ラクトン化は、化合物の遊離酸や
ラクトンの形状の違う極性を有することから、スタチン薬品を製造する際にむず
かしい処理を生ずる。従って、ラクトン可能化合物を取り扱う場合、これらを高
収率で単離するために、通常は取り扱いに非常に慎重に行う必要がある。

【０００９】プラバスタチンは、他のスタチンよりも治療的に顕著な利点を示している。

【００１０】プラバスタチンは、肝臓および小腸内のコレステロールの合成を選択的に抑制
するが、抹消細胞中のコレステロールの合成に対して実質的に影響しない。Koga
,T.et al.Biochim.BiopHys.Acta,1990,1045,115-120を参照。

【００１１】この選択性は、ヘキサヒドロナフタレン核のＣ−６の位置で水酸基のあること
が、ある程度要因とされると見受けられる。Ｃ−６の位置は、コンパクチンの水
素原子、ロバスタチンのメチル基で占められている。プラバスタチンは、他のよ
り脂肪親和性の高い類似体（congeners）より末梢細胞の脂肪親和性膜を浸透す
る可能性が少なく、Serajuddin et al.,J.PHarm.Sci.,1991,80,830-34を参照、
そして、肝臓や腸内で有為的に局在化した作用として説明するために、限定され
るがプラバスタチンの移動性が考えられる。

【００１２】本明細に引用として組み入れられた米国特許第4,346,227によれば、プラバス
タチンは、コンパクチン代謝の研究中にM.Tanaka らによってコンパクチンの代
謝として最初に単離されたと記載されている。‘227特許によれば、プラバスタ
チンを、種々の微生物、すなわちアブシデア・コエルレア(Absidia coerulea)IF
O4423 spores 、カニングハメラ・エキヌラタ(Cunninghamella echinulata IFO4
445,ストレプトミセス・ロソクロモゲヌス(Streptomyces rosochromogenus)NRRL
1233,シンセファラストラム・ラセモスム(SyncepHalastrum racemosum)IFO4814
およびシンセファラストラム・ラセモスム(SyncepHalastrum racemosum)IFO4828
を用いてコンパクチンの醗酵で得ることができる。醗酵後、プラバスタチンは、
上記ブロスをpH３に酸性化することによって醗酵ブロスから分離され、プラバス
タチンおよび他の非親水性有機物を酢酸エチルで抽出して、その後塩水で洗浄し
た。

【００１３】プラバスタチンの遊離酸を、トリフルオロ酢酸の触媒量を付加することにより
ラクトン化し、次いで希釈された炭酸水素ナトリウムで中和し、硫酸ナトリウム
で乾燥し、そして蒸発乾固した。残留物を逆相液化クロマトグラフィ(“HPLC”)
によって精製した。当業者は、逆相HPLCが、化学化合物の大規模な調製の経済的
な精製方法でないことを理解できるはずである。

【００１４】米国特許第5,942,423は、アクチノマドラ(actinomadura)菌株を用いて微生物
によるコンパクチンのプラバスタチンへの水酸化に関する。上記例に提示された
単離のみの方法は、醗酵ブロスHPLC分析の分析規模に付随した最少量の単離であ
る。ブロスからプラバスタチンの単離に関するより一般的な記載によれば、単離
の好ましい方法はHPLCである。

【００１５】 PCT出願番号PCT/US00/19384(commonly-assigned,co-pending PCT Application
Serial No.PCT/US00/19384)は、コンパクチンの抗菌性効果に通常抵抗性のない
ミクロモノスポラ・マクラタ(Micromonospora maculata)の菌株を用いて、コン
パクチンのプラバスタチンへの微生物による水酸化に関する。

【００１６】米国特許第5,202,029は、HPLCを用いたHMG-CoA還元酵素抑制剤を精製する方法
に関するものである。HPLCカラム上の不純物の分離に従い、HMG-CoA還元酵素抑
制剤が、溶離液に溶解される溶質としてHPLCカラムから溶離する。溶離液は、１
部蒸発され、それでHMG-CoA還元酵素抑制剤の結晶化を誘発するために水が加え
られる。

【００１７】米国特許第5,616,595は、接線方向のろ過による醗酵ブロスから水に不溶な化
合物を回収するための連続処理方法に関するものである。醗酵ブロスが、ろ過器
を通して循環される。上記ブロスが、ろ過器を介して水を失うことから、各循環
で徐々に濃度を増してくる。いったん所望の濃度に達すると、次に濃縮ブロスを
、所望の化合物が可溶な溶媒でスラリー状にする。そのスラリーは、ろ過器を通
して循環される。所望の化合物の溶液を、ロ液として集め、次いで所望の化合物
をロ液から単離し、所望によりさらに精製処理にかける。上記方法は、ロバスタ
チン、プラバスタチン、およびシンバスタチンを含んでいる広範囲な化合物に適
用できると言われている。

【００１８】ラクトンの形状におけるロバスタチンを単離するための方法は、米国特許番号
5,712,130に記載されている。この方法において、ロバスタチンは、酢酸ブチル
により醗酵ブロスから抽出される。次に得られた溶液が遠心分離にかけられ、外
側に分離された水溶液相は廃棄される。有機相は、40℃を超える温度で真空蒸留
され、溶液を濃縮することに加えて、水を除去することによってラクトン化を促
進する。ロバスタチンラクトンの結晶は、冷却により結晶化され、90％以上の純
度で再結晶される。この方法は、遊離カルボン酸またはスタチンのカルボン酸塩
の形状を単離することにあまり適切でないことが当業者には理解されよう。

【００１９】現段階で、プラバスタチンを作成する最も経済的で可能性のある方法は、Ｃ−
６の位置でコンパクチンの酵素的な水酸化によることである。しかしながら、醗
酵ブロスからスタチンを単離する周知の方法は、そのナトリウム塩としてプラバ
スタチンの単離に適切でなく、薬理的に受入れ可能なレベルの純度に達成されな
いか、または高純度を実現するために、クロマトグラフで分離する必要がある。
本発明は、調製規模で、高純度、高収率、且つクロマトグラフの精製を必要とせ
ず醗酵ブロスからプラバスタチンを単離する有効な方法を技術的に満たしている
。

【００２０】発明の要約本発明の目的は、水溶性醗酵ブロスからスタチン化合物を単離する有効な方法
を提供することである。具体的において本発明は、クロマトグラフによる分離を
必要とせずプラバスタチン、コンパクチンおよびロバスタチンを精製するための
工業的製造規模の方法を提供する。

【００２１】さらに本発明の目的は、微生物の形質転換の顕著な立体選択性および位置選択
性が有為的な収率とより優れた経済性と同様に、達成できるような高純度の形状
と高い収率でプラバスタチンを得ることである。上記プラバスタチンを、溶媒の
消費量を最小にしてブロスから分離し、高収率で精製し、薬理的に受け入れ可能
なナトリウム塩に形質転換させる。

【００２２】上記方法は、水溶性醗酵ブロスからプラバスタチンの抽出、塩基性水溶液にプ
ラバスタチンの逆抽出、そして所望による有機溶媒中で再抽出、または水溶液を
濃縮に関与しており、その結果、醗酵ブロス中のプラバスタチンの初期濃度に対
してプラバスタチンの濃縮された水溶液か有機溶液のいずれかとなる。プラバス
タチンは、濃縮溶液から、その金属塩、またはアンモニウム塩の析出によって得
られ、次いでプラバスタチンの再結晶で精製される。次に再結晶された塩は、塩
転換処理され、プラバスタチンのナトリウム塩を形成し、そして、過剰ないずれ
のかナトリウムイオンも、イオン交換樹脂で除去される。上記プラバスタチンの
ナトリウム塩を、再結晶化、凍結乾燥、または他の手段によって溶液から単離す
ることができる。

【００２３】発明の詳細な説明本発明は、水溶性醗酵ブロスからプラバスタチン、コンパクチン、およびロバ
スタチンを単離するための方法である。本発明は、醗酵ブロスからプラバスタチ
ンナトリウムの単離することで示される。しかしながら、上記方法を、微生物ま
たは酵素による方法で作成される他の化合物を精製するために使用できることが
理解されよう。

【００２４】コンパクチンの酵素による水酸化プラバスタチンナトリウムは、米国特許第5,942,423および4,346,227で記載の
ようにコンパクチンの酵素による水酸化で合成される。プラバスタチンを単離で
きる水酸化されたブロスは、コンパクチンの工業的規模の醗酵として知られる任
意水溶性ブロスでよい。上記ブロスは、醗酵の競合による中性または塩基性であ
る場合、ブロスを約１と６の間のpH、好ましくは１と5.5の間、より好ましくは
２と４の間のpHとなるように、酸が加えられる。使用できる酸は、塩酸、硫酸、
トリフロロ酢酸、または他の任意のプロトン性酸、好ましくは水中１Ｍ溶液とし
て１以下のpHを有するものを含んでいる。醗酵ブロスの酸性化は、ブロス中のプ
ラバスタチンのカルボキシル塩を遊離酸におよび／またはラクトンに転換させる
。

【００２５】プラバスタチンナトリウムの単離本発明の方法は、プラバスタチンの濃縮溶液を形成するステップ、上記濃縮溶
液からプラバスタチンの塩を得るステップ、上記プラバスタチンの塩を精製する
ステップ、プラバスタチン塩をプラバスタチンナトリウム塩に塩転換させるステ
ップ、およびプラバスタチンナトリウム塩を単離するステップを含んでいる。

【００２６】第１のステップにおいて、プラバスタチンは、一連の抽出、逆抽出の操作によ
って、水溶性醗酵ブロスから比較的濃く濃縮された溶液で得られる。醗酵は、通
常非常に高い希釈状態で行われる。希釈にかかわらず上記ブロスは、有為的な最
大酵素性能(maxium enzyme potential)を達成する。高い希釈性による欠点は、
所望の生成物が有為的に濃縮された形状で得られるまで、大容量の醗酵媒体を維
持しなければならないことである。上記大容量が、単離方法のストリジェントな
要件に置いている。クロマトグラフィ法は、こうした大容量の分離、特に溶媒が
水の場合に一般的に実用的でない。上記単離処理が抽出で行われると、有機抽出
溶媒は、実質的に水中に溶けるほどの極性をまだない生成物の適した分画のため
水と競争的に十分な極性を有しなければならない。抽出が不十分な場合、醗酵施
設の内部、または周辺でヒトの健康と安全の危険性に伴い、大容量の有機溶媒が
、所望の生成物を高収率で単離するために必要とされる。Ｃ_２−Ｃ_４アルキル・
フォルメイトおよびＣ_２−Ｃ_４カルボン酸のＣ_１からＣ_４のアルキルエステルは
、高効率で水溶性醗酵ブロスからプラバスタチンの抽出で可能であることを、本
発明当事者が見出した。プラバスタチン、ラクトンの分画係数は、通常1000:1ま
たはそれより高く、そして遊離酸の分画係数は、通常10:1またはそれより高い。
アルキル基は、直鎖、分岐、または環状でもよい。好ましいエステルは、エチル
フォルメイト、ｎ−プロピルフォルメイト、ｉ−プロピルフォルメイト、ｎ−ブ
チルフォルメイト、ｓ−ブチルフォルメイト、ｉ−ブチルフォルメイト、ｔ−ブ
チルフォルメイト、酢酸メチル、酢酸エチル、ｎ−プロピルアセテート、ｉ−プ
ロピルアセテート、ｎ−ブチルアセテート、ｓ−ブチルアセテート、ｉ−ブチル
アセテート、ｔ−ブチルアセテート、メチルプロピオネート、エチルプロピオネ
ート、ｎ−プロピルプロピオネート、ｉ−プロピルプロピオネート、ブチルプロ
ピオネート、メチルブチレート、エチルブチレート、ｎ−プロピルブチレート、
ｉ−プロピルブチレート、ブチルブチレート、メチルイソブチレート、エチルイ
ソブチレート、プロピルイソブチレート、およびブチルイソブチレートを含んで
いる。これら好ましい有機溶媒のうち、酢酸エチル、ｉ−ブチルアセテートおよ
びギ酸エチルが有為的に十分に適したものであることを見出した。最も好ましい
抽出溶媒は、ｉ−ブチルアセテートである。他の有機溶媒を、エステルと置き換
えることができる。ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジク
ロロエタン、ベンゼン、ブチルメチルケトン、ジエチルエーテルおよびメチルｔ
−ブチルエーテルなど、ハロゲン化されたハロゲン化炭化水素、アロマテック化
合物、ケトンおよびエーテルが使用される。

【００２７】本発明の濃縮ステップにおいて、有機抽出物は、好ましくは上記一覧から選択
された有機抽出溶媒に、醗酵ブロスを接触することで形成される。上記醗酵ブロ
スのpHは、pH約1からpH約6の間のpHであり、好ましくは、上記pHは、pH約２から
pH約4の間である。

【００２８】大容量の液体をバッチ処理か連続処理のいずれかで混合するため使用される任
意の装置を使用することができる。醗酵が通常バッチ処理として行われるから、
バッチによる単離処理は自然の選択である。したがって、従来の高容量の混合機
、および混合や相分離の両方に適合した設定タンクまたは装置を使用することが
できる。本発明の本観点の好ましい形態において、最小部、好ましくは50％(v/v
)より低い抽出溶媒を、好ましくはゆっくりと機械的に振動させて醗酵ブロスに
接触させる。接触処理および相分離した後、プラバスタチンを含んでいる抽出溶
媒は、プラバスタチンの減少した醗酵ブロスから分離される。次に上記ブロスは
、１回または複数回有機抽出溶媒に接触させて、そして得られたそれぞれの有機
抽出物を組み合わせできる。

【００２９】プラバスタチンの得られた有機抽出物の容量は、醗酵ブロスの容量より有為的
に多い場合、または有為的に少ない場合いずれも可能である。

【００３０】プラバスタチンの濃縮溶液の形成に向けた第二の操作は、プラバスタチンの塩
基性水溶液への逆抽出である。逆抽出は、一部非極性または、全体の非極性有機
不純物を除去し、そしてプラバスタチンラクトンが存在する場合、プラバスタチ
ンラクトン環の再開環を促進する。特に化学的理論または機構によるいずれかの
方法にも限定を意図するものでないが、十分に確立された化学的理論によれば、
プラバスタチンは、塩基性水溶性抽出液内のカルボン酸アニオンの形状である。
逆抽出は、有機抽出物の容量より少ない特定容量の水溶性塩基物を使用すること
により、プラバスタチンを濃縮するために使用することができる。上記塩基は、
好ましくはNaOH,NH₄OHまたはKOH、最も好ましくはNH₄OHまたはNaOHであり、そし
て塩基性水溶液は、好ましくは約7.0と約13.7の間のpH，より好ましくは約7と約
13の間、最も好ましくは約7.5と約11の間のpHを有する。抽出を完了するために
十分な接触が起っていたとする主観的な判断を含くめて、薄相クロマトグラフや
他の任意の方法により決定されるように有機相のプラバスタチンの量が、実質的
に消失されるまで抽出溶媒を、塩基性水溶液に接触させる。複数の逆抽出を最適
な回収のために行うことができる。しかしながら、１回の逆抽出は、有機相が酢
酸ブチルである場合効率が高い。

【００３１】好ましくは、逆抽出は、有機抽出量の1/3未満、より好ましくは1/4未満、最も
好ましくは有機抽出量の約1/5である特定量の塩基性水溶液で行なわれる。プラ
バスタチンがこの処理の後で得られる濃縮水溶液の好ましい濃度範囲は、約２か
ら約50g/L、より好ましくは約５から約15g/Lである。

【００３２】水溶性抽出液は、溶液の濃度を増大するために。蒸留により、好ましくは真空
蒸留により、さらに濃縮することができる。蒸留による水溶性抽出液をさらに濃
縮する前に、pHを、pH約７とpH約13.7の間、好ましくはpH約7.5とpH約11の間、
およびより好ましくは、pH約8とpH約10の間で調整すべきである。真空蒸留を、
絶対圧5-120mmHg下で水溶性抽出液を約30℃から約80℃に加熱することによって
行うことができる。他の真空蒸留条件の選択は、本方法に関する当業者の能力の
十分範囲内である。

【００３３】本処理の後濃縮水溶液からプラバスタチンを得ることに対する他の選択肢とし
て、プラバスタチンを、濃縮有機溶液から得ることができる。水溶性抽出液を、
酸で、好ましくはトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸、酢酸またはリン酸、より好ま
しくは硫酸またはリン酸で、pH約１からpH約6.5、より好ましくはpH約2.0からpH
約4.0のpHにして再酸性化した後、プラバスタチンを有機溶媒で再抽出すること
によってプラバスタチンの濃縮有機溶液が形成される。条件により、プラバスタ
チンのカルボキシレートアニオンがプラバスタチン遊離酸にプロトン化される場
合があり、それがカルボキシレートより低い極性か、またはまだ低い極性の形態
にラクトン化されているかである。

【００３４】プラバスタチンは、醗酵ブロスからプラバスタチンを抽出するために適切であ
るとして前に前記載されている有機溶媒から選択される再抽出溶媒に再抽出され
る。有機溶媒は、醗酵ブロスからプラバスタチンの抽出に使用される溶媒と同一
でもよいが、同一にする必要もない。この再抽出する際、さらにプラバスタチン
の濃縮処理は、水溶性抽出液の約50％(v/v)より少なく、水溶性抽出液の容量に
対してより好ましくは約33％(v/v)から約29％(v/v)，さらにより好ましくは約25
％(v/v)である有機溶媒量で再抽出することによって達成される。したがって、
さらに実施例１の実験により、プラバスタチンを、醗酵ブロス100Lから濃縮有機
溶液8Lに、開始有機抽出液から89％の収率で濃縮することができる。有為的に収
率の高い精製プラバスタチンを、単一の抽出だけが、本発明を実施するため、本
好ましい形態として記載されている抽出を複数行うことによって実現できること
が、当業者によって理解されよう。この好ましい形態は、溶媒の経済性と生成物
の高収率の均衡を実現している。単一抽出だけが上に記載されている抽出を繰り
返すことにより、さらに収率を促進するという本好ましい形態を離れることは、
本発明の精神から必ずしも逸脱するものではない。「塩析」により濃縮有機溶液
からプラバスタチンを得るための処理をする前に、濃縮有機溶液を乾燥すること
が好ましく、それは、MgSO₄,Na₂SO₄,CaSO₄,シリカ、パーライトなどの従来の乾
燥剤を用いて行うことができ、所望により活性炭を用いて脱色することもできる
。次に乾燥、および／または脱色された濃縮有機溶液は、たとえばろ過または傾
斜分離処理により都合よく分離される。

【００３５】本方法の次の段階でプラバスタチンの塩は、可能な例として、濃縮水溶液また
は有機溶液から得られる。上記塩は、濃縮溶液から析出によって得られる。上記
析出は、濃縮溶液に金属塩、アンモニア、アミン、アンモニアの塩またはアミン
の塩を加えることによって誘発される。

【００３６】使用可能な金属塩は、ヒドロオキサイド、アルコオキサイド、ハライド、カー
ボネート、ボレイト、ホスフェート、チオシアネート、アセテート、ニトレート
、サルフェート、チオサルフェート、および水中で高い溶解性のある他の任意の
塩を含んでいる。金属塩の金属は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、銅、鉄、ニッケル、マンガン、スズ、およびアルミニウムを
含んでいる。好ましい塩は、以下の金属カチオン：Li⁺,Na⁺,K⁺,Ca^２+,Mg^２+,Cu
^２+,Fe²⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Mn²⁺,Sn²⁺,Zn²⁺およびAl³⁺イオンの塩である。プラバスタ
チンの金属塩の析出を誘発するための塩の最も好ましい金属カチオンは、Na⁺お
よび K⁺である。

【００３７】アンモニアまたはアミンを加えることによりアンモニウムまたはアミン塩とし
て、プラバスタチンを析出することができる。アミンは、一級、２級、３級アミ
ンでよい。プラバスタチンのアミン、ニトロゲンおよびカルボキシル基の間のイ
オン相互作用を防止するために立体障害にならない任意のアルキルアミンやアリ
ルアミンを使用することができる。上記アミンは、メチル、ジメチル、トリメチ
ル、エチル、ジエチル、トリエチルおよび他のＣ_１−Ｃ_６の１級、２級および３
級アミンを含んでいるが限定されず、さらにモルホリン、Ｎ−メチルモルホリン
、イソプロピル・シクロヘキシル・アミン、ピペリジンなどを含んでいる。窒素
上で置換のない場合、ある場合または多重にある場合に関係なく、アンモニアま
たはアミンの反応で形成される塩は、以後アンモニウム塩として明示される。そ
の意味は、アミンの塩およびアンモニアの塩を包含することを意図されたもので
ある。

【００３８】プラバスタチンのアンモニウム塩の析出を、単独、またはアンモニア、アミン
、または金属塩と組み合わせのいずれかのアンモニア塩の付加によっても誘発さ
せることができる。好ましいアンモニウム塩は、以下のようなアンモニアの塩、
すなわちNH₄Cl,NH₄Br,NH₄I,(NH₄)₂SO₄,NH₄NO₃,(NH₄)₃PO₄,(NH₄)₂S₂O₄,NH₄OAcお
よびNH₄SCNであり、最も好ましくはNH₄Clである。

【００３９】金属塩、アンモニウム塩、および高沸点の液体および固体アミンを、水溶性溶
媒または有機溶媒中に固体、混合のない液体か水溶性のいずれかで、従来の手段
により、好ましくは換気性の良い場所で加えることができる。気体アンモニアを
加えるには、腐食性気体を取り扱うための特別な装置を必要とする。圧力容器、
調節器、弁、および配管を含むこうした装置は、広く入手可能である。上記アン
モニアを、常圧で、あるいは圧力容器を用いる場合、昇圧された圧力で、濃縮溶
液上にある空隙部分に導入できる。選択肢として上記アンモニアを、溶液に通し
て泡立たせ、好ましくは攪拌することで、管導入口において析出されたプラバス
タチンアンモニウム塩によって閉塞になることを減少させる。

【００４０】本発明の方法の好ましい例において、プラバスタチンは、アンモニアまたはア
ミンの付加によるアンモニウム塩として濃縮溶液から得られる。より好ましい例
において、プラバスタチンは、濃縮アンモニアに気体アンモニアを加えることで
アンモニアのプラバスタチンの塩として濃縮溶液から得られる。アンモニアは、
プラバスタチンの極性高いアンモニウム塩を生成し、それが、抗溶媒から高い収
率で容易に析出される。最も好ましい例において、プラバスタチンは、気体状ア
ンモニアおよびアンモニウム塩を加えることで、アンモニウムのプラバスタチン
塩として得られる。最も好ましいアンモニウム塩は、NH₄₄CLで、それは、濃縮さ
れた有機溶液の乾燥が完全でない場合、濃縮された塩化アンモニウム水溶液を形
成するという利点を有する。

【００４１】金属塩、アンモニア、アミンおよび／またはアンモニウム塩を付加する必要の
ある温度は、小規模な反応を行い、そしてその反応の発熱を監視することによっ
て、定式化した実験で決定される。好ましくは、溶液の温度は、40℃を越えては
ならない。80℃程度の高温度は、プラバスタチンを有為的に分解することなく実
験できたとしても、本発明の多くの有機溶媒は、低温度で煮沸されることになる
。好ましい温度範囲は、約-10℃から約40℃である。

【００４２】いったん析出が停止したと見られ、またはいったんプラバスタチンの消費が、
他の手段で実質質的に完了されたと決定されると、付加処理を停止しなければな
らない。アンモニアまたは揮発性アミンが用いられると、容器内に過剰な発煙を
分散するために換気する必要がある。次に結晶は、溶媒のろ過、傾斜分離、溶媒
の蒸発乾固または他のこうした方法、好ましくはろ過により単離される。

【００４３】所望による析出された結晶を洗浄した後、プラバスタチン塩は、１回かまたは
複数回の再結晶により精製される。プラバスタチン塩を精製するために、上記塩
を最初水に溶かす。好ましくは水の量を最小限にして使用する。一般的に溶解す
るには、金属塩やアンモニア塩の代わりにアミン塩が得られる場合、水をより多
く必要とする。

【００４４】いったんプラバスタチン塩が完全に溶解すると、上記溶液の極性は、抗溶媒を
加えることで減少せれる。抗溶媒は、水溶性有機溶媒かプラバスタチン塩があま
り溶解しない溶媒の混合液である。適当な水溶性有機溶媒は、アセトン、アセト
ニトリル、アルキルアセテート、イソブタノール、およびエタノールを含んでい
る。

【００４５】プラバスタチン塩を、自然発生的に再結晶させてやるか、または共通イオンの
付加、冷却または種結晶を加えるなどさらなるステップを取ることによって再結
晶化を誘発させる。共通イオンを加えることでさらに再結晶誘発するために、プ
ラバスタチン塩と同じ金属イオンまたはアンモニウムイオンを有する塩が上記混
合物に加えられる。プラバスタチン塩の再結晶化を誘発するための適切な塩は、
濃縮溶液からプラバスタチン塩を析出するために使用できる塩と同じ金属塩また
はアンモニウム塩である。好ましい方法によれば、プラバスタチンは、アンモニ
ウム塩、アンモニアの塩素化塩として得られ、またプラバスタチン塩を得るため
に前に使用されるアミンは、プラバスタチン塩の再結晶を誘発させるために加え
られる。アンモニアのプラバスタチン塩が得られる最も好ましい例において、付
加塩は、最も好ましくはNH₄Clである。

【００４６】再結晶化は、約-10℃と約60℃の間で、好ましくは約0℃と約50℃の間で、そし
て最も好ましくは約0℃と約40℃の間で行なわれる。プラバスタチン塩が上記溶
液から実質的に再結晶された後、上記結晶を単離して、そしてたとえばイソブチ
ルアセテートとアセトンを1:1の混合液で洗浄し、その後乾燥することができる
。乾燥処理を、周囲温度で行うことができるが、好ましくは45℃未満の温度か好
ましくは約40℃に穏やかに上げた温度で行なわれる。所望により再結晶は、実施
例７および８に示すように良好な結果を得るために繰り返される。それぞれの繰
り返しでは、収率が約92-96％である。

【００４７】再結晶後でさえ、プラバスタチンは、HPLC上で相対保持時間(RRT)0.9である有
機不純物を含んでいる。有機不純物は、UV検出で得られたHPLCクロマトグラムに
基づいて、全組成物の内で約0.2％であると推定される。有機不純物を、以下の
ように除去することができる。

【００４８】プラバスタチン塩を水中に溶かして、その後、好ましくは最小限の、または約
6mlg^-1および約0.2％(v/v)のイソブタノールを加える。PHを、約pH８から約pH14
，好ましくは約pH10から約pH13.7に、水酸化ナトリウムを加えることにより高く
し、そしてその混合液は、約10℃から約50℃の温度で、10-200分、好ましくは約
20℃から約30℃の温度で、60-100分保持される。次に上記溶液は、鉱酸または有
機酸、好ましくは塩酸または硫酸、約pH4から約pH9，より好ましくは約pH5から
約pH9、最も好ましくは約pH6から約pH7.5で再酸性化される。pHを調節した後、
次に塩化アンモニウムが、上記プラバスタチンを塩析するために上記溶液に加え
られる。使用される水量が、約6mlg^-1の場合、プラバスタチン塩のグラム当り塩
化アンモニウム2.0-2.3gの使用が推奨される。好ましくは塩化アンモニウムは、
4時間から6時間にわたって部分的位置(portionwise)に加えられる。

【００４９】塩化アンモニウムを加た後、プラバスタチンアンモニウム塩は、自然的発生的
に結晶化される。その他の点において、再結晶を、冷却、種付け、またはその他
従来の手段によって誘発っせることができる。再結晶を、共通イオンの付加を介
して、たとえば、塩化アンモニウムを加えることによって誘発させることが好ま
しいが、前に記載された再結晶ステップにおいて適宜行われた同様の抗溶媒で希
釈することによる誘発も可能である。しかしながら、この操作において、プラバ
スタチン塩の不注意による析出のないよう、慎重に行う必要がある。実施例１に
より詳細に示されているように、RRT=0.9である有機不純物の量を、検出できる
限界を越えて減少して、プラバスタチンアンモニウムは、約99.3％の純度で得ら
れ、薬理的使用を受けることのできるレベルの純度に近づいている。本発明のこ
の段階で、プラバスタチンアンモニウム塩を、0.7％未満である有機不純物で得
ることができる。

【００５０】再結晶により有機不純物を除去した後、プラバスタチン塩を、プラバスタチン
ナトリウムで塩転換(trans-salifing)する。本明細書に用いられている塩転換(t
rans-salifing)は、有機塩分子のカチオンが別のカチオンに交換されるどのよう
な過程に対しても言及される。

【００５１】塩転換(trans-salifing)において、最初プラバスタチンを、水溶性溶媒に上記
塩を溶解することによってその金属塩、またはアンモニウム塩から遊離して、水
溶性溶液に対して塩酸、硫酸、りん酸トリフロロ酢酸、または酢酸などのプロト
ン性の酸を加えて、そして水溶性溶液から有機溶媒でプラバスタチンを抽出する
。プロトン性酸(protic acid)が、それを中性または酸性に、好ましくは約１か
ら６、より好ましくは約２から約４のpHに酸性化する量で水溶性溶液に加えられ
る。上記水溶性溶液にプロトン性酸(protic acid)を加える前か後のいずれかで
、水溶性溶液を、イソブチルアセテート(i-butyl acetate)や他の水に混和しな
い有機溶媒などの水に混和しない有機溶媒に接触させる。水溶性溶液に水に混和
しない有機溶媒の接触、およびプロトン性酸(protic acid)で処理した後、得ら
れたプラバスタチンを含む有機相が、水溶性相から分離され、そして所望により
アンモニウム残基を除去するために水で洗浄された後、上記プラバスタチンが、
水溶性水酸化ナトリウムで逆抽出される。プラバスタチン量よりわずか控えめな
モル過剰である、好ましくはその1.1未満に等しく、より好ましくはその1.02等
量に未たないNaOHの量を用いることが好ましい。

【００５２】水溶性水酸化ナトリウムに抽出した後、過剰なナトリウムカチオンを、破棄し
てナトリウムカチオンとプラバスタチンの比をほぼ1:1に等しくなるようにする
。破棄処理は、水に不溶なイオン交換樹脂を用いて行なわれる。適当なイオン交
換樹脂は、カチオン、およびキレート型樹脂であり、好ましくは、強酸、および
弱酸の交換樹脂である。

【００５３】強酸の中で使用可能なカチオン交換樹脂は、スルホン酸(SO_３ ^-H⁺)を有するも
のである。これらには、Amberlite（商標）IR-118,IR-120,252H;Amberlyst（商
標）15,36;Amberjet（商標）1200(H)(Rohm and Haas),Dowex（商標）50WXシリー
ズ、Dowex（商標）HCR-W2,Dowex（商標）650C,Dowex（商標）Marathon C,Dowex
（商標）DR-2030,および Dowex（商標）HCR-S,イオン交換樹脂(DowChemical Co.
);Diaion（商標）SK 102 to 116に一連に樹脂（Mitsubishi Chemical Corp.）,L
ewatit SP 120(Bayer)を含んでいる。好ましい強酸カチオン交換樹脂は、Amberl
ite（商標）120, Dowex（商標）50WX、および一連のDiaion（商標）SKである。

【００５４】弱酸カチオン交換樹脂は、ペンダントカルボン酸基(pendant carboxylic acid
)を有するものを含んでいる。弱酸カチオン交換樹脂は、市販製品、Amberlite（
商標）CG-50,IRP-64,IRC50およびC67,Dowex（商標）CCRシリーズ、Lewatit（商
標）CNPシリーズおよび、Diaion（商標）シリーズを含んでおりそのうち最も好
ましいものはAmberlite（商標）IRC50,Lewatit（商標）CNP80およびDiaion（商
標）WK10である。キレート型交換樹脂はあまり好ましくない。利用可能な市販品
種の幾つかは、Duolite（商標）C-718、およびC-467(Rohm & Haas)を含んでいる
。

【００５５】プラバスタチンナトリウム塩および過剰なナトリウムカチオンの含む溶液を、
上記樹脂のカラム又はベッドを通る溶液の通路を含む技術的に周知の方法により
、または溶液でフラスコ内に十分な量の樹脂を攪拌することによりイオン交換樹
脂で接触することができる。接触の形態は重要ではない。過剰なナトリウムイオ
ンを除去処理した後、pHが希釈で変化するが、プラバスタチンナトリウム溶液の
pHは、約pH6.5から約pH10，好ましくは約pH7.4から約pH7.8の範囲とすべきであ
る。より高いpHからより低いpHに平坦化することは、過剰なNa⁺イオンの破棄が
実質的に完了したことを示している。破棄が完了した後、プラバスタチンナトリ
ウム溶液を、従来の方法で樹脂から分離する。カラムか、ベッドからの溶出液と
していずれかで収集可能であり、またろ過、傾斜分離などによって分離すること
ができる。

【００５６】プラバスタチンナトリウムを、結晶化によって、プラバスタチンナトリウムは
溶液から単離することができる。有効な結晶化は、真空蒸留またはナノろ過で行
なわれる。好ましくは、水溶性プラバスタチンナトリウム塩溶液が、結晶化する
前に約20から約50w/v％に濃縮される。もし必要であれば濃縮の後、プラバスタ
チンナトリウム水溶液を、Ｈ^＋形状のイオン交換樹脂で約7と約10の間のpHに調
整することができる。

【００５７】プラバスタチンナトリウム溶液に水溶性有機溶媒または有機溶媒の混合液を付
加する処理は、再結晶を支援する。特に、アセトン、アセトン／アセトニトリル
、エタノール／アセトニトリル、およびエタノール／酢酸エチルの混合物を言及
することができる。プラバスタチンナトリウムを再結晶するための最も好ましい
溶媒系の1つは、プラバスタチンナトリウム水溶液を約３０w/v％に濃縮すること
によって形成される1/3/12の水／アセトン／アセトニトリルの混合比である。他
の最も好ましい結晶化溶媒の混合液は、水−アセトン(1:15)である。

【００５８】プラバスタチンナトリウムを、水溶性プラバスタチンナトリウム溶液の凍結乾
燥によって単離することもできる。

【００５９】上記生成物の純度を改良する結晶化によって単離されるか、または他の手段で
単離されるかは、本発明を実施する際単離されたプラバスタチンナトリウムが、
プラバスタチンラクトンを実質的に伴わないことである。以下の実験で実証され
ているように、プラバスタチンナトリウムが、全不純物の含量を0.5％(w/w)未満
で単離される。さらにプラバスタチンナトリウムを、本発明の好ましい実施例に
おいて、付着によって全不純物含量を0.2％(w/w)以下で単離することができ、そ
の２つを、実施例1と15で例示的に示している。全不純物含量の一部である主な
不純物は、エピプラバスタチンナトリウム、３′−ＯＨコンパクチンナトリウム
、６−ヒドロキシイソコンパクチンナトリウムおよびプラバスタチンラクトンを
含んでいる。

【００６０】けれど、以下の例は、その実例の幾つかにおいて本発明の実施の形態を示して
いる。上記実施例は、本発明の範囲を限定するものとして構成されるべきでない
。他の実例が、本明細書および実施例を考慮して当業者に対して明らかになるで
あろう。実施例を含んでいる本明細書は、以下の請求項によって指示される本発
明の範囲および精神で例示的にのみ考慮されることが意図されている。

【００６１】実施例実施例１プラバスタチンの精製醗酵ブロス(100L)が、硫酸を付加することで約2.5から約5.0のpHに酸性化され
た。酸性化された醗酵ブロスをイソブチルアセテート(i-butyl acetate)(3x50L)
で抽出した。イソブチルアセテート(i-butyl acetate)による抽出の収率は、上
記ブロス中の内部基準に校正されたHPLC分析で95%にあることがわかった。HPLC
条件（逆相）：カラム：C₁₈,粒子サイズ5μm、長さ150mm、直径4.6mm；移動相:4
5%メタノール／水、0.1%Et₃N,0.1%氷酢酸；流量1.3mlmin^-1;カラム温度25℃,注
入容量10μl;内部基準エチルパラヒドロキシルベンゾエイト；検出：UVλ=238nm
である。

【００６２】次に組み合わされたイソブチルアセテート(i-butyl acetate)相を、濃縮水酸
化アンモニウムを加えてpH約7.5からpH約11.0にした水(35L)で抽出した。その後
、得られたプラバスタチン水溶液を、5Mの硫酸を加えてpH約2.0から約4.0に再酸
性化して、そしてイソブチルアセテート(i-butyl acetate)(8L)で再抽出した。
イソブチルアセテート(i-butyl acetate)中に得られたプラバスタチン溶液を、
パーライトおよび硫酸ナトリウム(Perlite and Na₂SO₄)で部分乾燥した。プラバ
スタチンを傾斜分離し、乾燥剤をろ過して、活性炭(1.7g)で脱色した。次にその
溶液をろ過により活性炭を除去し、そして気体吸入口を備えたフラスコに移し換
えた。

【００６３】それで、アンモニアガスを、15-25℃で、高速攪拌しながら、溶液の上の上部
空隙に導入した。さらに析出が停止したと見受けられた後、上記アンモニアを止
めて、塩化アンモニウムが、ろ過処理を容易にするために上記混合物に加えられ
た。析出されたアンモニウムプラバスタチン・カルボキシル塩の結晶を、ろ過に
より収集し、イソブチルアセテート(i-butyl acetate)で洗浄し、その後アセト
ンで洗浄して、HPLCにより、UV検出、λ＝238nmで判定された、純度約94％のプ
ラバスタチンアンモニウム塩を生成した。

【００６４】さらに、プラバスタチンアンモニウム塩を、以下のように飽和化アンモニウム
溶液から再結晶により精製した。活性物質のプラバスタチン塩含有物162gを水(9
60ml)に溶解し、アセトン(96ml)とイソブチルアセテート(i-butyl acetate)(96m
l)、約35-40℃で希釈した。上記溶液を約30-32℃に冷却して、プラバスタチンア
ンモニウムは、固体塩化アンモニウムを付加し、さらに見かけ上結晶形成の増大
のなくなるまで付加することによって、結晶化のために誘発されした。固体塩化
アンモニウムを加えた後、その溶液を約0-26℃に冷却した。プラバスタチンアン
モニウムの結晶がろ過により収集され、イソブチルアセテート(i-butyl acetate
)とアセトンで洗浄し、その前後同様に約40℃で乾燥した。得られたプラバスタ
チンアンモニウム塩の結晶(155.5g)は、上記条件を用いてHPLCの判定として約98
％の純度で得られた。

【００６５】上記プラバスタチンアンモニウム塩を、以下のように他の結晶化によりさらに
精製した。プラバスタチンアンモニウム塩（活性物質155.5g）を、水(900ml)中
に溶解した。イソブタノール(2ml)を加えて、その後pHを、水酸化ナトリウムの
濃縮溶液を加えることで約pH10から約pH13.7にあげ、その溶液を周囲温度で75分
間攪拌した。上記溶液は、硫酸を付加してpH約７のpHに中和化され、プラバスタ
チンアンモニウムの結晶化が、固体NH₄Clの付加しることで誘発された。結晶(15
0g)をろ過で収集し、アセトンで洗浄した。プラバスタチンアンモニウムは、上
記条件を用いて、HPLC検出で約99.3％の純度であることがわかった。

【００６６】次いでプラバスタチンアンモニウムを、以下のようにナトリウム塩に塩転化(t
rans-salified)した。プラバスタチンアンモニウム塩の結晶を水(1800ml)に溶解
した。イソブチルアセテート(i-butyl acetate)(10.5L)を加えた。次にその溶液
を、硫酸を加えて約pH２からpH４の間のpHに酸化し、プラバスタチンをその遊離
酸に転化させた。プラバスタチンを含んでいるイソブチルアセテート(i-butyl a
cetate)相を水(5x300ml)で洗浄した。次にプラバスタチンをそのナトリウム塩に
転化させ、別の水溶液相に、約pH7.4から約pH13のpHに達するまで、NaOH，8mを
間歇的に加えて水(900-2700ml)上のイソブチルアセテート(i-butyl acetate)を
旋廻することによって逆抽出(back-rxtracted)した。

【００６７】次にプラバスタチンナトリウム塩を、過剰なナトリウム・カチオンを廃棄する
ためにイオン交換樹脂で処理した。分離後、水溶液相を、Amberlite（商標）IRC
50交換樹脂,H⁺の形状で、周囲温度、30分間攪拌した。攪拌は、約pH7.4から約pH
7.8のpHに達するまで続けられた。

【００６８】次に上記溶液をろ過して樹脂を除去し、重量で508gまで、真空下で部分的に濃
縮した。次にその溶液をアセトニトリル(480ml)で希釈して、アセトニトリル：
水の混合溶媒比を、1.4:1の比の溶媒を与えた。その溶液を脱色するために活性
炭(5g)を介して攪拌した。活性炭のろ過後、プラバスタチンナトリウムを、アセ
トンおよびアセトニトリルをさらに加えて水／アセトン／アセトニトリルの混合
(5.9L)を1/3/12にして、約-10から約0℃にした後で、結晶化による結晶として90
％の収率で得られた。プラバスタチンナトリウムは、上に記載の条件を用いて、
HPLCで測定されたように、醗酵開始活性化物質から、約99.3％の純度で、全収率
65％で得られた。

【００６９】実施例２実施例１の方法に従うが水／アセトン／アセトニトリルの混合液からの再結晶
化を除いて、プラバスタチンナトリウムが、水中におけるプラバスタチンナトリ
ウム濃縮溶液の凍結乾燥によって、純度約99％、収率約72％で得られた。実施例
１と本試料の最終純度の比較では、プラバスタチンナトリウムの凍結乾燥よりむ
しろ再結晶化が、ある程度高い純度の生成物を生成することを実証した。

【００７０】実施例３−６実施例１の方法に従って、プラバスタチンナトリウムが、該当する有機溶媒が
塩転換処理(trans-salification process)に使用される時、表１に示される収率
および純度で醗酵ブロスから単離された。

【００７１】

【表１】

【００７２】実施例７実施例1の方法に従うが、プラバスタチンアンモニウム塩の結晶化を一度繰り
返すことにより、プラバスタチンアンモニウム塩をさらに精製すると、プラバス
タチンナトリウムが、約99.6％の純度と、58.4％の収率で得られた。

【００７３】実施例８実施例１の方法に従うが、プラバスタチンアンモニウム塩の結晶化を２度繰り
返すことにより、プラバスタチンアンモニウム塩をさらに精製すると、プラバス
タチンナトリウムが、約99.8％の純度と、53％の収率で得られた。

【００７４】実施例９実施例１の方法に従い、醗酵ブロス(100L)を、硫酸を付加することでpHを約2.
5から約5.0に酸性化した。酸性化された醗酵ブロスをイソブチルアセテート(i-b
utyl acetate)(3x50L)で抽出した。次に組み合わされたイソブチルアセテート(i
-butyl acetate)相を、濃縮された水酸化アンモニウムを加えることで、pH約7.5
からpH約11.0のpHに塩基化された水(35L)で抽出した。

【００７５】実施例１で行ったと同様にさらに濃縮された有機溶液を得るために水溶性抽出
液を再酸性化し、そしてイソブチルアセテート(i-butyl acetate)で抽出処理す
るかわりに、水性抽出液が真空下で140g/Lに濃縮された。得られた濃縮溶液は、
pH約4.0からpH約8のpHを有した。過剰なアンモニアを蒸発乾固より除去した。

【００７６】次に塩化アンモニウムの結晶(405g)が、4時間にわたって、ある部分に沿って(
portionwise) 濃縮溶液にゆっくりと加えられ、そしてプラバスタチンアンモニ
ウム塩を周囲温度で結晶化させた。次に、その結晶をろ過により単離して、塩化
アンモニウムの飽和水溶液で洗浄した。次にその結晶が水(1L)中、40℃で加えら
れた。溶解した後、その温度を30℃に下げ、そして塩化アンモニウム(330g)を、
ある部分に沿って(portionwise)2時間にわたり、上記溶液に加えられた。次にそ
の溶液を周囲温度で１５時間攪拌混合して、プラバスタチンアンモニウム塩の結
晶を、ろ過により回収し、イソブチルアセテート(i-butyl acetate)で洗浄、次
にアセトンで洗浄した後で乾燥した。次に得られた結晶は、ナトリウム塩に換え
られる再結晶化によって、さらに精製され、そして実施例１に記載のように単離
された。

【００７７】プラバスタチンナトリウムは、約99.6％の純度、および64.7％の収率で得られ
た。

【００７８】実施例１０実施例１の方法に従うが、プラバスタチンナトリウム塩は、水／アセトン、1/
15の混合液から結晶化され、HPLCで測定されたように醗酵開始活性物質の全収率
64％、および純度99.6％である。

【００７９】実施例１１実施例９の方法に従うが、第２節の最初で、濃縮された水溶性抽出物(140g.L
^−１)が得られた。これらの濃縮された水溶性抽出物を、3等分に分割した。次に
得られた濃縮溶液を、1MのHCl付加によってpH約4.0からpH約8.0のpHに酸性化し
た。次に実施例９の第3文節の方法し従い、塩化アンモニウムを表２の塩と代え
て、プラバスタチン塩を上記部分のそれぞれから析出し、ナトリウム塩に転移し
た。

【００８０】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｄ 309/30 Ｃ０７Ｄ 309/30 Ｄ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フォルガチ，イロナハンガリー国，ハー−4033 デブレツェン，クルツストリート 71 (72)発明者サボ，チャバハンガリー国，ハー−4027 デブレツェン，ファイストリート 21 (72)発明者ナジェネ，エディトアルバイハンガリー国，ハー−4029 デブレツェン，チラグストリート 66 Ｆターム(参考） 4B064 AE46 CA04 CA05 CE08 CE11 CE15 CE16 DA06 4C062 BB68 4H006 AA02 AD15 AD16 AD32 BB12 BB16 BB17 BB21 BC50 BC53 BJ30 BN10 BS10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プラバスタチン、コンパクチン、およびロバスタチンから選
択される化合物のナトリウム塩を醗酵ブロスから単離するための方法において、
ａ）化合物の濃縮溶液を形成するステップ; ｂ）上記濃縮溶液から上記化合物の塩を得るステップ; ｃ）上記化合物の塩を精製するステップ; ｄ）ｉ）上記塩から上記化合物を遊離するステップ、ｉｉ）上記化合物に水酸化ナトリウムを接触することで、これにより上記
化合物のナトリウム塩の水溶液を形成するステップ、およびｉｉｉ）上記化合物のナトリウム塩の水溶液に水に不溶なイオン交換樹脂
を接触することで過剰なナトリウムイオンを除去するステップ、により上記化合
物の塩を上記化合物のナトリウム塩に塩転化する(trans-salifying)するステッ
プ；およびｅ）上記化合物のナトリウム塩の水溶液から上記化合物のナトリウム塩を単離
するステップ；を含んでいる方法。
【請求項２】上記濃縮水溶液が、ａ）酸性醗酵ブロスに有機抽出溶媒を接触することにより、上記化合物の有
機抽出物を形成するステップ；ｂ）塩基性の水溶性溶液を接触することにより上記有機抽出物を逆抽出し、
これにより水溶性抽出物を形成するステップ；およびｃ）水溶性抽出物を濃縮して、これにより上記化合物の濃縮された水性溶液
を形成るステップ；によって形成される濃縮水溶液である請求項１記載の方法。
【請求項３】上記濃縮水溶液が、ａ）酸性醗酵ブロスに有機抽出溶媒を接触することにより、上記化合物の有
機抽出物を形成するステップ；ｂ）塩基性水溶液を接触することにより上記有機抽出物を逆抽出して、これ
によって上記化合物の水溶性抽出物の形成するステップ；およびｃ）上記有機再抽出溶媒を接触することで、水溶性抽出物から上記化合物を
再抽出して、これにより上記化合物の濃縮された有機溶液を形成するステップ；
によって形成される濃縮有機溶液である請求項１記載の方法。
【請求項４】水溶性抽出物の濃縮処理が、真空蒸留によって行われる請求
項２記載の方法。
【請求項５】有機抽出溶媒を酸性醗酵ブロスに接触させる処理が、pH約1
とpH約6の間のpHで行われる請求項２記載の方法。
【請求項６】塩基性水溶液の逆抽出が、pH約7.0とpH約13.7の間のpHで行
われる請求項２記載の方法。
【請求項７】有機抽出溶媒が、Ｃ_２−Ｃ_４アルキルフォルメイト、Ｃ_２−
Ｃ_４のアルキルカルボン酸のＣ_１からＣ_４のアルキルエステル、ジクロロメタン
、ジクロロエタン、クロロフォルム、四塩化炭素、およびブチル・メチルケトン
から成る群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項８】有機抽出溶媒が酢酸である請求項７記載の方法。
【請求項９】酸性醗酵ブロスに有機抽出溶媒を接触する処理が、pH約1とp
H約6の間のpHで行われる請求項３記載の方法。
【請求項１０】塩基性水溶液での逆抽出処理が、pH約7.0とpH約13.7の間
のpHで行われる請求項３記載の方法。
【請求項１１】上記化合物に有機溶媒での逆抽出処理は、pH約1とpH約6の
間のpHで行われる請求項３記載の方法。
【請求項１２】有機抽出溶媒および有機再抽出溶媒が、Ｃ_２−Ｃ_４アルキ
ル・フォルメイト、Ｃ_２−Ｃ_４のアルキルカルボン酸のＣ_１からＣ_４のアルキル
エステル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロフォルム、四塩化炭素、お
よびブチル・メチルケトンから成る群からそれぞれ独立的に選択される請求項３
記載の方法。
【請求項１３】有機抽出溶媒および有機再抽出溶媒が、酢酸である請求項
１２記載の方法。
【請求項１４】有機抽出溶媒および有機再抽出溶媒が、イソブチルアセテ
ート (i-butyl acetate)である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】上記化合物の塩を得る処理が、約-10℃と約+60℃の間の温
度で行われる請求項１記載の方法。
【請求項１６】上記化合物の塩を得る処理が、濃縮溶液に金属塩、アンモ
ニア、アミンまたはアンモニウム塩を加えることにより上記化合物の塩を析出す
ることを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項１７】上記化合物の塩が、アンモニウム塩を加えることによって
析出される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】上記アンモニウム塩がNH₄Cl,NH₄Br,NH₄I,(NH₄)₂SO₄,NH₄NO ₃ ,(NH₄)₃PO₄,(NH₄)₂S₂O₄,NH₄OAcおよびNH₄SCNからなる群から選択される請求項
１７記載の方法。
【請求項１９】上記アンモニウム塩がNH₄Clである請求項１８記載の方法
。
【請求項２０】上記化合物の塩に気体アンモニアを加えることで析出され
る請求項１６記載の方法。
【請求項２１】上記化合物の塩に、気体アンモニアとアンモニウム塩を加
えることにより析出される請求項１６記載の方法。
【請求項２２】上記化合物の塩に、金属塩を加えることにより析出される
請求項１６記載の方法。
【請求項２３】上記金属塩が、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩、銅塩、鉄塩、ニッケル塩、マンガン塩、スズ塩
、亜鉛塩、およびアルミニウム塩から成る群から選択される請求項２２記載の方
法。
【請求項２４】金属塩が、金属イオンLi⁺,Na⁺,K⁺,Ca^２+,Mg^２+,Cu^２+,Fe² ⁺ ,Fe³⁺,Ni²⁺,Mn²⁺,Sn²⁺,Zn²⁺,Al³⁺イオンを含んでいる塩から選択される請求項
２３記載の方法。
【請求項２５】上記化合物の塩にアミン塩を加えることで析出される請求
項１６記載の方法。
【請求項２６】上記アミン塩が、Ｃ_１−Ｃ_３の１級、２級、および３級ア
ルキル・アミンからなる群から選択されるアミン成分を有する請求項２５記載の
方法。
【請求項２７】上記化合物の塩を精製するステップが、上記化合物の塩を
再結晶するステップを含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項２８】上記化合物の塩を再結晶する処理が、ａ）水中に上記化合物の塩を溶かして、これによって上記化合物の塩の水溶
液を形成するステップ；ｂ）上記化合物の水溶液に抗溶媒(ant-solvent)を希釈するステップ；およ
びｃ）上記化合物の塩と同じ金属、アンモニウム、またはアミニウムのイオン
の有する塩を加えるステップ；を含んでいる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】上記抗溶媒(ant-solvent)は、酢酸エチル、イソブチルア
セテート、イソブタノール、アセトン、アセトニトリルおよびエタノールから成
る群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】上記化合物の塩と同じ金属、アンモニウムイオン、または
アミニウムイオンを有する塩が、アンモニウム塩である請求項２８記載の方法。
【請求項３１】上記アンモニウム塩が、NH₄Cl,NH₄Br,NH₄I,(NH₄)₂SO₄,NH₄ NO₃,(NH₄)₃PO₄,(NH₄)₂S₂O₄,NH₄OAcおよびNH₄SCNからなる群から選択される請求
項３０記載の方法。
【請求項３２】上記アンモニウム塩がNH₄Clである請求項３１記載の方法
。
【請求項３３】上記化合物の塩から上記化合物を遊離させる処理が、ａ）水溶性溶媒中に上記化合物の塩を溶かすステップ；ｂ）水溶性溶媒中にプロチン酸を加えるステップ；およびｃ）水溶性溶媒から有機溶媒に上記化合物を抽出し、上記化合物の有機溶液
を形成するステップ；を含んでおり、さらに上記化合物を、水酸化ナトリウム水溶液に接触して、上記化合物の有
機溶液を水酸化ナトリウム水溶液で逆抽出するステップ；を含んでいる請求項１
記載の方法。
【請求項３４】上記化合物の抽出処理が、pH約1とpH約6の間のpHで行われ
る請求項３３記載の方法。
【請求項３５】上記有機溶媒が、Ｃ_２−Ｃ_４アルキル・フォルメイト、Ｃ _１からＣ_４のアルキルＣ_２−Ｃ_４のアルカノエイト、ジクロロメタン、ジクロロ
エタン、クロロフォルム、四塩化炭素、およびブチル・メチルケトンから成る群
から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３６】上記有機溶媒が、イソブチルアセテートである請求項３５
記載の方法。
【請求項３７】上記化合物の有機溶液を水酸化ナトリウム水溶液に逆抽出
する処理が、pH約6.5とpH約13.7の間のpHで行われる請求項３３記載の方法。
【請求項３８】上記化合物のナトリウム塩の単離が、ａ）上記化合物のナトリウム塩の水溶液を濃縮するステップ；およびｂ）上記化合物のナトリウム塩の水溶液に有機溶媒、または有機溶媒の混合
液を希釈するステップ；を含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項３９】上記化合物のナトリウム塩の単離が、上記化合物のナトリ
ウム塩の水溶液を凍結乾燥するステップ含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項４０】上記化合物のナトリウム塩水溶液の濃縮処理が、真空蒸留
によって行われる請求項３８記載の方法。
【請求項４１】上記化合物のナトリウム塩水溶液の濃縮処理が、ナノーろ
過(nano-filtration)によって行われる請求項３８記載の方法。
【請求項４２】上記化合物のナトリウム塩水溶液が、アセトンで希釈され
る請求項３８記載の方法。
【請求項４３】上記化合物のナトリウム塩水溶液は、アセトン／アセトニ
トリル混合物、エタノール／アセトニトリル混合物およびエタノール／酢酸エチ
ルの混合物からなる群から選択される有機溶媒の混合物で希釈される請求項３８
記載の方法。
【請求項４４】上記化合物のナトリウム塩を単離する処理が、約-10℃と
約+60℃の間の温度で行われる請求項３８記載の方法。
【請求項４５】プラバスタチンナトリウムを実質的に伴わないプラバスタ
チンラクトン。
【請求項４６】全不純物の含量が、約0.5%重量かそれに満たない請求項４
５記載のプラバスタチンナトリウム。
【請求項４７】全不純物の含量が、約0.2%重量かそれに満たない請求項４
６記載のプラバスタチンナトリウム。