PT1265604E

PT1265604E - Processo para a recuperação de compostos de estatina de um caldo de fermentação

Info

Publication number: PT1265604E
Application number: PT00980834T
Authority: PT
Inventors: Vilmos Keri; Lajos Deak; Ilona Forgacs; Csaba Szabo; Edit Arva Nagyne
Original assignee: Teva Gyogyszergyar Zartkoeruen
Priority date: 1999-11-30
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2006-12-29
Also published as: CY1105925T1; DE60037687D1; ZA200203912B; JP2008109948A; HUP0204012A2; ATE342717T1; HUP0204012A3; ES2273737T3; JP2006055174A; US20040115781A1; ES2239937T1; RU2002114072A; DE60031447D1; EP1265604A4; DK1265604T3; ATE382344T1; SK7342002A3; JP4343987B2; CA2393057C; JP3881240B2

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A RECUPERAÇÃO DE COMPOSTOS DE ESTATINA DE UM CALDO DE FERMENTAÇÃO" A presente invenção refere-se a métodos para isolamento de produtos químicos desejados de reacções realizadas em caldos de fermentação aquosos. A invenção refere-se ainda ao isolamento de pravastatina de um caldo de fermentação e em especial com o isolamento de pravastatina produzida por fermentação de compactina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As complicações de doença cardiovascular, tais como enfarte do miocárdio, acidente vascular e doença vascular periférica, são responsáveis por metade das mortes nos Estados Unidos. Um nível elevado de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na circulação sanguínea foi associado à formação de lesões coronárias que obstruem o caudal de sangue e podem sofrer ruptura e promover a trombose. Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics 879 (9th ed. 1996). Demonstrou-se que a redução dos níveis de LDL no plasma reduzem o risco de eventos clínicos em doentes com doença cardiovascular e em doentes que estão isentos de doença cardiovascular mas têm hipercolesterolemia. Scandinavian Simvastatin Survival Study Group, 1994; Lipid Research Clinics Program, 1984a, 1984b. 1

Os fármacos de estatina são actualmente os fármacos terapeuticamente mais eficazes disponíveis para redução do nivel de LDL na circulação sanguínea de um doente em risco de doença cardiovascular. Esta classe de fármacos inclui, inter alia, compactina, lovastatina, simvastatina, pravastatina e fluvastatina. 0 mecanismo de acção dos fármacos de estatina foi elucidado com algum pormenor. Eles interrompem a sintese do colesterol e de outros esteróis no figado por inibição competitiva da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A redutase ("HMG-CoA redutase"). A HMG-CoA redutase catalisa a conversão de HMG-CoA em mevalonato, gue é o passo determinante da velocidade da biossintese do colesterol. Consequentemente, a sua inibição leva a uma redução na velocidade de formação de colesterol no figado.

Pravastatina é o nome medicinal vulgar do composto quimico ácido [13-[1α(β*,δ*)2α, 6oí,8P(R*),8aa]]-l,2,6,7,8,8a-hexa-hidro-β,β,6-tri-hidroxi-2-metil-8-(2-metil-l-oxobutoxi)-1-naftaleno-heptanóico (N° de registo CAS 81093-370). A estrutura molecular da pravastatina na forma de ácido livre é representada pela fórmula (Ia) em que R=OH. A forma de lactona é representada pela fórmula (Ib), com átomos marcados para indicar a numeração dos átomos.

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A pravastatina, compactina (fórmula Ib, R=H), lovastatina (fórmula Ib, R=CH3) , simvastatina e fluvastatina possuem cada uma delas uma cadeia alquilo que é terminada por um grupo ácido carboxílico fechado numa lactona e que contém dois grupos hidroxilo nas posições α e β em relação ao grupo ácido carboxílico. Esta cadeia alquilo é a porção da molécula que se liga à HMG-CoA redutase. 0 grupo ácido carboxílico e o grupo hidroxilo na posição 8 têm tendência a lactonizar como ilustrado na fórmula (Ib) . Os compostos lactonizáveis, como as estatinas, podem existir na forma de ácido livre ou na forma de lactona ou como uma mistura em equilíbrio de ambas as formas. A lactonização causa dificuldade de processamento no fabrico de fármacos de estatina porque as formas de ácido livre e de lactona dos compostos têm polaridades diferentes. Um método de purificação de uma forma provavelmente vai remover a outra forma conjuntamente com as impurezas resultando num rendimento mais baixo. Consequentemente, normalmente tem de se ter muito cuidado quando se manuseia compostos lactonizáveis de forma a isolá-los com rendimento elevado. A pravastatina apresenta uma vantagem terapêutica importante em relação a outras estatinas. A pravastatina inibe selectivamente a síntese do colesterol no fígado e intestino delgado mas deixa substancialmente não afectada a síntese do colesterol nas células periféricas. Koga, T. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1045, 115-120. Esta selectividade parece ser devida, em parte, à presença de um grupo hidroxilo na posição C-6 do núcleo de hexa-hidronaftaleno. A posição C-6 está ocupada por um átomo de hidrogénio na compactina e por um grupo metilo na lovastatina. A pravastatina é menos capaz de permear as membranas lipófilas de células periféricas do que os outros congéneres mais lipófilos, Serajuddin et al., J. Pharm. Sei., 3 1991, 80, 830-34, e crê-se que a solubilidade limitada da pravastatina é responsável pela sua acção mais localizada no figado e intestino.

De acordo com a patente U.S. 4346227, a pravastatina é descrita como tendo sido primeiramente isolada como um metabolito da compactina por M. Tanaka et ai. durante um estudo do metabolismo da compactina. De acordo com a patente '227, a pravastatina pode ser obtida por fermentação de compactina utilizando uma variedade de microrganismos: esporos de Absidia coerulea IFO 4423, Cunninghamella echinulata IFO 4445, Streptomyces rosochromogenus NRRL 1233, Syncephalastrum racemosum IFO 4814 e Syncephalastrum racemosum IFO 4828. Após a fermentação, a pravastatina foi separada do caldo de fermentação por acidificação do caldo a um pH de 3 e extracção da pravastatina e outros componentes orgânicos não hidrófilos com acetato de etilo, seguida por lavagem com solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A pravastatina na forma de ácido livre foi lactonizada por adição de uma quantidade catalítica de ácido trifluoroacético, depois neutralizada com bicarbonato de sódio diluido, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") preparativa em fase reversa. Um especialista na técnica entenderá que HPLC em fase reversa não é um método económico de purificação para a preparação em grande escala de um composto químico. A patente U.S. N° 5942423 relaciona-se com a hidroxilação microbiana de compactina a pravastatina utilizando uma estirpe de Actinomadura. O único método de isolamento apresentado nos exemplos é o isolamento de quantidades mínimas resultante da análise por HPLC em escala analítica do caldo de fermentação. De 4 acordo com uma discussão mais geral sobre o isolamento de pravastatina do caldo, o método de isolamento preferido é HPLC. 0 pedido PTC copendente da mesma requerente com o n° de série PCT/US00/19384 (W001/03647) refere-se com a hidroxilação microbiana de compactina para a pravastatina utilizando uma estirpe de Micromonospora maculata que é invulgarmente resistente aos efeitos antifúngicos da compactina. A patente U.S. N° 5202029 refere-se a um processo de purificação de inibidores de HMG-CoA redutase utilizando HPLC. Após a separação das impurezas na coluna de HPLC, o inibidor de HMG-CoA redutase elui da coluna de HPLC como um soluto dissolvido no eluente. O eluente é parcialmente evaporado e, depois, adiciona-se água para induzir a cristalização do inibidor de HMG-CoA redutase. A patente U.S. N° 5616595 relaciona-se com um processo em continuo para recuperação de compostos insolúveis em água de um caldo de fermentação por filtração tangencial. O caldo de fermentação é passado em ciclos através de um filtro. O caldo é crescentemente concentrado com cada ciclo devido à perda de água través do filtro. Uma vez atingida uma concentração desejada, o caldo concentrado é então suspenso com um solvente em que o composto desejado é solúvel. A suspensão é, então, passada em ciclos através do filtro. A solução do composto desejado é recolhida como o filtrado e o composto desejado é então isolado do filtrado e opcionalmente submetido a purificação adicional. Afirma-se que o método é aplicável a uma grande variedade de compostos incluindo lovastatina, pravastatina e simvastatina. 5

Um processo para o isolamento de lovastatina na forma de lactona está descrito na patente U.S. N° 5712130. Neste processo, a lovastatina é extraída de um caldo de fermentação com acetato de butilo. A solução resultante é então centrifugada e uma fase aquosa que se separa é eliminada. A fase orgânica é destilada em vácuo acima de 40 °C, o que, para além da concentração da solução, promove a lactonização por remoção da água. Os cristais de lactona de lovastatina cristalizam por arrefecimento e são recristalizados até uma pureza de 90% ou mais. Os especialistas na técnica entenderão que este método é desadequado para o isolamento da forma de ácido carboxílico livre ou de um sal de carboxilato de uma estatina.

Presentemente, o método mais economicamente exequível de produzir pravastatina é por hidroxilação enzimática de compactina na posição C-6. Contudo, os métodos conhecidos de isolamento de uma estatina de um caldo de fermentação são desadequados para isolamento de pravastatina como o seu sal de sódio, não conseguem um nível de pureza farmaceuticamente aceitável, ou requerem separação cromatográfica para conseguir pureza elevada. A presente invenção responde a uma necessidade da técnica quanto a um método eficiente de isolamento de pravastatina com pureza elevada a partir de um caldo de fermentação, com alto rendimento, em escala preparativa e sem necessidade de purificação cromatográfica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objectivo da presente invenção proporcionar um método eficiente de isolamento de um composto estatina de um caldo de fermentação aquoso. Em especial, a presente invenção proporciona 6 um método em escala preparativa industrial para purificação de pravastatina sem necessidade de separação cromatográfica. É objectivo adicional da invenção obter pravastatina em forma altamente pura e rendimento elevado de modo a que a notável estereosselectividade e regiosselectividade das transformações microbianas possa atingir também um rendimento elevado e uma maior economia. A pravastatina é separada do caldo com o consumo minimo de solvente, purificada com alto rendimento e transformada no seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável. 0 processo envolve a extracção da pravastatina de um caldo de fermentação aquoso com um solvente orgânico, re-extracção da pravastatina com uma solução aquosa básica e, opcionalmente, a re-extracção com um solvente orgânico ou concentração da solução aquosa, resultando numa solução aquosa ou orgânica que está enriquecida em pravastatina em relação à concentração inicial de pravastatina no caldo de fermentação. A pravastatina é obtida a partir da solução enriquecida por precipitação do seu sal de um metal ou de amónio e depois purificada por recristalização do sal de pravastatina. 0 sal recristalizado é, então, trans-salificado para formar sal de sódio de pravastatina e qualquer excesso de iões sódio é capturado com um resina de permuta iónica. 0 sal de sódio de pravastatina pode então ser isolado da solução por recristalização, liofilização ou outro meio.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção é um processo para isolamento de pravastatina de um caldo de fermentação aquoso. A invenção é 7 ilustrada pelo isolamento de pravastatina de sódio de um caldo de fermentação.

Hidroxilação Enzimática de Compactina A pravastatina de sódio é sintetizada por hidroxilação enzimática de compactina tal como descrito nas patentes U.S. N° 5942423 e 4346227. O caldo de hidroxilação do qual vai ser isolada a pravastatina pode ser qualquer dos caldos aquosos conhecidos para fermentação em escala industrial de compactina. Se o caldo está neutro ou básico quando fica completada a fermentação, então adiciona-se um ácido para levar o caldo a um pH entre cerca de 1 e 6, de um modo preferido entre 1 e 5,5 e de um modo mais preferido entre 2 e 4. Os ácidos que podem ser utilizados incluem ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido trifluoroacético ou qualquer outro ácido prótico, de um modo preferido um com um pH inferior a 1 como uma solução 1 M em água. A acidificação do caldo de fermentação converte quaisquer sais de carboxilato de pravastatina no caldo para o ácido livre e/ou lactona.

Isolamento de Pravastatina de Sódio 0 processo da presente invenção envolve os passos de formação de uma solução enriquecida de pravastatina, obtenção de um sal de pravastatina a partir da solução enriquecida, purificação do sal de pravastatina, trans-salificação do sal de pravastatina ao sal de sódio de pravastatina e isolamento do sal de sódio da pravastatina.

No primeiro passo, a pravastatina é obtida do caldo de fermentação aquoso numa solução de concentração relativamente elevada por uma sequência de operações de extracção e re-extracção. A fermentação é normalmente realizada numa diluição muito elevada. Através de diluição, o caldo atinge um potencial enzimático máximo mais elevado. Uma desvantagem da alta diluição é que tem de ser manipulado um grande volume de meio de fermentação até o produto desejado ser obtido numa forma mais enriquecida. 0 grande volume também coloca requisitos exigentes no método de isolamento. Os métodos cromatográficos geralmente são impraticáveis para separação de volumes tão grandes, especialmente quando o solvente é água. Se o isolamento for realizado por extracção, o solvente orgânico de extracção tem de ter polaridade suficiente para competir com a água para uma partilha favorável do produto mas não ser tão polar que seja substancialmente solúvel em água. Se a extracção for ineficiente, são necessários grandes volumes de solvente orgânico para isolar o produto desejado com rendimento elevado, com os riscos inerentes para a saúde e segurança dos trabalhadores na e na vizinhança da unidade de fermentação.

Verificou-se que os formatos de C2-C4 alquilo e os ésteres C1-C4 alquilicos de ácidos Ci-C4 carboxilicos são capazes de uma extracção altamente eficiente de pravastatina de um caldo de fermentação aquoso. 0 coeficiente de partilha da lactona de pravastatina tipicamente é de 1000:1 ou superior e o coeficiente de partilha do ácido livre tipicamente é de 10:1 ou superior. O grupo alquilo pode ser linear, ramificado ou ciclico. Os ésteres preferidos incluem formato de etilo, formato de n-propilo, formato de i-propilo, formato de n-butilo, formato de s-butilo, formato de i-butilo, formato de t-butilo, acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de n-propilo, acetato de i-propilo, 9 acetato de n-butilo, acetato de s-butilo, acetato de i-butilo, acetato de t-butilo, propionato de metilo, propionato de etilo, propionato de n-propilo, propionato de i-propilo, propionato de butilo, butirato de metilo, butirato de etilo, butirato de n-propilo, butirato de í-propilo, butiratos de butilo, isobutirato de metilo, isobutirato de etilo, isobutiratos de propilo e isobutiratos de butilo. Destes solventes orgânicos preferidos verificou-se que são especialmente bem adequados acetato de etilo, acetato de i-butilo, acetato de propilo e formato de etilo. 0 solvente de extracção mais preferido é o acetato de i-butilo. Os ésteres podem ser substituídos por outros solventes orgânicos. Pode utilizar-se halogenocarbonetos halogenados, compostos aromáticos, cetonas e éteres, tais como diclorometano, clorofórmio, tetracloreto de carbono, 1,2-dicloroetano, benzeno, butilmetilcetona, éter dietilico e éter t-butilmetílico.

No passo de enriquecimento da presente invenção, forma-se um extracto orgânico fazendo contactar um solvente orgânico de extracção, de um modo preferido seleccionado da lista apresentada acima, com o caldo de fermentação. O pH do caldo de fermentação está entre cerca de pH 1 e cerca de pH 6. De um modo preferido, o pH está entre cerca de pH 2 e cerca de pH 4.

Pode utilizar-se qualquer equipamento adaptado para misturar grandes volumes de liquido num processo descontinuo ou continuo. Uma vez que a fermentação é tipicamente conduzida como um processo descontinuo, um processo de isolamento descontinuo é uma escolha natural. Em conformidade, pode utilizar-se misturadores e tanques de sedimentação de grande volume convencionais ou equipamento adaptado simultaneamente para mistura e separação de fases. No modo preferido deste aspecto da 10 invenção faz-se contactar uma fracção minoritária, de um modo preferido inferior a 50% (v/v), do solvente de extracção com o caldo de fermentação, de um modo preferido com agitação mecânica suave. Após o contacto e a separação das fases, o solvente de extracção contendo pravastatina é separado do caldo de fermentação empobrecido em pravastatina. Pode então fazer-se contactar o caldo com solvente orgânico de extracção uma ou mais vezes e pode combinar-se cada um dos extractos orgânicos resultantes. O volume do extracto orgânico de pravastatina resultante pode ser maior ou menor do que o volume do caldo de fermentação. A segunda operação para formação de uma solução enriquecida de pravastatina é a re-extracção da pravastatina para uma solução aquosa básica. A re-extracção retira algumas ou todas as impurezas orgânicas não polares e, se estiver presente lactona da pravastatina, promove a reabertura do anel de lactona da pravastatina. Embora não pretendendo ficar de forma alguma limitado por uma teoria ou mecanismo químico específico, de acordo com a teoria química aceite, a pravastatina está na forma de anião carboxilato no extracto aquoso básico. A re-extracção pode ser utilizada para concentrar a pravastatina por utilização de um volume de base aquosa que é inferior ao volume do extracto orgânico. A base é de um modo preferido NaOH, NH4OH ou KOH, de um modo mais preferido NH4OH ou NaOH, e a solução aquosa básica de um modo preferido tem um pH entre cerca de 7,0 e cerca de 13,7, de um modo mais preferido entre cerca de 7 e cerca de 13, de um modo mais preferido ainda entre cerca de 7,5 e cerca de 11. Faz-se contactar o solvente de extracção com a solução aquosa básica até a quantidade de pravastatina na fase orgânica ter sido substancialmente esgotada como determinado por cromatografia em camada fina ou qualquer outro método incluindo a avaliação 11 subjectiva de que ocorreu contacto suficiente para extracção completa. Pode realizar-se múltiplas re-extracções para recuperação óptima. Contudo, uma única re-extracção é altamente eficiente quando a fase orgânica é acetato de butilo. De um modo preferido, a re-extracção é realizada com um volume de solução aquosa básica que é inferior a um terço do volume do extracto orgânico, de um modo mais preferido inferior a um quarto e de um modo mais preferido ainda, cerca de um quinto do volume do extracto orgânico. A gama de concentrações preferida da solução aquosa enriquecida da qual é mais tarde obtida no processo a pravastatina vai desde cerca de 2 até cerca de 50 g/L, de um modo mais preferido desde cerca de 5 até cerca de 15 g/L. O extracto aquoso pode ser adicionalmente concentrado por destilação, de um modo preferido destilação em vácuo, para aumentar a concentração da solução. Antes da concentração adicional do extracto aquoso por destilação o pH deve ser ajustado para entre cerca de pH 7 e cerca de pH 13,7, de um modo preferido para entre cerca de pH 7,5 e cerca de pH 11 e de um

modo mais preferido ainda para entre cerca de pH 8 e cerca de pH 10. A destilação em vácuo pode ser feita por aquecimento do extracto aquoso desde cerca de 30 °C até cerca de 80 °C a 5-120 mm Hg de pressão absoluta. A escolha de outras condições de destilação em vácuo está dentro das capacidades dos especialistas nas na técnica com que se relaciona este processo.

Como alternativa para obtenção de pravastatina de uma solução aquosa enriquecida numa fase posterior do processo, a pravastatina pode ser obtida de uma solução orgânica enriquecida. A solução orgânica enriquecida de pravastatina é formada por re-extracção da pravastatina com um solvente orgânico depois de o extracto aquoso ter sido reacidifiçado com 12 um ácido, de um modo preferido ácido trifluoroacético, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido acético ou ácido fosfórico, de um modo mais preferido ácido sulfúrico ou fosfórico, até um pH de cerca de 1,0 a cerca de 6,5, de um modo mais preferido cerca de 2,0 a cerca de 4,0. Dependendo das condições, o anião carboxilato de pravastatina pode ser protonado ao ácido livre da pravastatina, que é menos polar do que o carboxilato ou lactonizado a uma forma ainda menos polar. A pravastatina é reextraida com um solvente de re-extracção seleccionado dos solventes orqânicos descritos anteriormente como adequados para extracção de pravastatina do caldo de fermentação. O solvente orqânico pode ser, mas não tem de ser, o mesmo solvente utilizado para extrair a pravastatina do caldo de fermentação. Nesta re-extracção, realiza-se um enriquecimento adicional por re-extracção com uma quantidade de solvente orgânico que é de um modo preferido inferior a cerca de 50% (v/v) do extracto aquoso, de um modo mais preferido desde cerca de 33% (v/v) a cerca de 20% (v/v) e ainda de um modo mais preferido cerca de 25% (v/v) do volume do extracto aquoso. Em conformidade, como exemplificado adicionalmente no Exemplo 1, a pravastatina pode ser concentrada desde 100 L de caldo de fermentação para 8 L de solução orgânica enriquecida com 89% de rendimento a partir do extracto orgânico inicial. Será entendido pelos especialistas na técnica que pode ser atingido um rendimento mais elevado de pravastatina purificada por realização de extracções múltiplas onde só foi descrita uma única extracção neste modo preferido da prática da invenção. Este modo preferido consegue um equilíbrio de economia de solvente e rendimento elevado de produto. Os desvios em relação a este modo preferido que aumentam mais o rendimento por extracções repetidas onde acima só foi descrita uma não se 13 afastam necessariamente do espírito da invenção. Antes de avançar para a obtenção de pravastatina da solução orgânica enriquecida por saturação com sal ("salting out"), a solução orgânica enriquecida é de um modo preferido seca, o que pode ser feito utilizando um agente secante convencional tal como MgSCU, Na2SC>4, CaSC>4, sílica, perlite e semelhantes, e opcionalmente descorada com carvão activado. Uma solução orgânica enriquecida seca e/ou descorada é então separada convencionalmente por exemplo por filtração ou decantação.

No passo seguinte do presente processo, obtém-se um sal de pravastatina a partir da solução aquosa ou orgânica enriquecida, consoante o caso. 0 sal é obtido por precipitação a partir da solução enriquecida. A precipitação é induzida por adição à solução enriquecida de um sal de um metal, amoníaco, uma amina, um sal de amónio ou um sal de uma amina.

Os sais de metais que podem ser utilizados incluem hidróxidos, alcóxidos, halogenetos, carbonatos, boratos, fosfatos, tiocianatos, acetatos, nitratos, sulfatos, tiossulfatos ou quaisquer outros sais que tenham uma solubilidade elevada em água. Os metais dos sais de metais incluem lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobre, ferro, níquel, manganês, estanho, zinco e alumínio. Os sais preferidos são sais dos seguintes catiões de metais: Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,

Cu2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+, Mn2+, Sn2+, Zn2+ e Al3 . Os catiões de metais mais preferidos de sais para indução da precipitação de um sal de metal de pravastatina são Na+ e K+. A pravastatina também pode ser precipitada como um sal de amónio ou de amina por adição de amoníaco ou de uma amina. A amina pode ser uma amina primária, secundária ou terciária. Pode 14 utilizar-se qualquer alquil ou arilamina que não seja tão obstruída que impeça a interacção iónica entre o azoto da amina e o grupo carboxilo de pravastatina. As aminas incluem, mas não estão limitadas a metil, dimetil, trimetil, etil, dietil, trietil e outras aminas em C1-C6 primárias, secundárias e terciárias; e incluem ainda morfolina, N-metilmorfolina, isopropilciclo-hexil amina, piperidina e semelhantes. Independentemente da ausência, presença ou multiplicidade de substituição no azoto, um sal formado por reacção de amoniaco ou de uma amina é daqui em diante referido como um sal de amónio. 0 seu significado pretende abranger sais de aminas bem como um sal de amoniaco. A precipitação do sal de amónio de pravastatina também pode ser induzida por adição de um sal de amónio só ou em associação com amoniaco, uma amina ou um sal de um metal. Os sais de amónio preferidos são os seguintes sais de amónio: NH4C1, NH4Br, NH4I, (NH4)2S04, NH4N03, (NH4)3P04, (NH4)2S204, NH4OAc e NH4SCN, sendo NH4C1 o muito preferido.

Os sais de metais, os sais de amónio e as aminas liquidas com ponto de ebulição elevado e sólidas podem ser adicionados por meios convencionais, de um modo preferido numa área com boa ventilação, quer como sólidos, liquidos puros ou soluções em solventes aquosos ou orgânicos. A adição de amoniaco gasoso requer equipamento especial para manuseamento de gases cáusticos. Esse equipamento, incluindo reactores de pressão, reguladores, válvulas e linhas, estão amplamente disponíveis. 0 amoniaco pode ser introduzido no espaço de cabeça acima da solução enriquecida à pressão ambiente ou se se utilizar um reactor de pressão, a pressão elevada. Alternativamente, o amoniaco pode ser borbulhado na solução, que é de um modo 15 preferido agitada para reduzir a obstrução do tubo de entrada por sal de amónio de pravastatina precipitado.

Numa forma de realização preferida do processo da invenção, a pravastatina é obtida a partir da solução enriquecida como um sal de amónio por adição de amoniaco ou de uma amina. Numa forma de realização mais preferida, a pravastatina é obtida a partir da solução enriquecida como o sal de amoniaco da pravastatina por adição de amoníaco gasoso à solução enriquecida. O amoníaco dá um sal de amónio da pravastatina altamente polar que é facilmente precipitado em rendimento elevado com um antissolvente. Na forma de realização muito preferida, a pravastatina é obtida como o sal de pravastatina de amoníaco por adição de amoníaco gasoso e um sal de amónio. 0 sal de amónio muito preferido é NH4C1, que tem a vantagem de formar uma solução aquosa concentrada de cloreto de amónio no caso de secagem incompleta da solução orgânica enriquecida. A temperatura à qual o sal de metal, amoníaco, amina e/ou sal de amónio deve ser adicionado pode ser determinada por experimentação corrente realizando a reacção em pequena escala e monitorizando a exotermia da reacção. De um modo preferido, não se permite que a temperatura da solução exceda 40 °C. Embora possam ser utilizadas temperaturas tão altas como 80 °C sem decomposição significativa da pravastatina, muitos solventes orgânicos desta invenção terão um ponto de ebulição a uma temperatura inferior. Quando se utiliza amoníaco, a gama de temperaturas preferida é desde cerca de -10 °C até cerca de 40 °C.

Quando a precipitação parece cessar ou uma vez determinado por outros meios que o consumo da pravastatina está 16 substancialmente completo, a adição deve ser terminada. Quando se utiliza amoniaco ou uma amina volátil, o reactor deve ser ventilado para dispersar o excesso de gases. Os cristais são então isolados por filtração, decantação do solvente, evaporação do solvente ou outro desses métodos, de um modo preferido a filtração.

Após lavagem opcional dos cristais precipitados, o sal de pravastatina é purificado por uma ou mais recristalizações. Para purificar o sal de pravastatina, o sal é primeiro dissolvido em água. De um modo preferido utiliza-se uma quantidade minima de água. A dissolução geralmente irá requerer mais água se tiver sido obtido um sal de amina, em vez de um sal de metal ou sal de amoniaco. Uma vez completamente dissolvido o sal de pravastatina, a polaridade da solução é diminuída por adição de um antissolvente. 0 antissolvente é um solvente orgânico ou mistura de solventes solúvel em água em que o sal de pravastatina é fracamente solúvel. Os solventes orgânicos solúveis em água adequados incluem acetona, acetonitrilo, acetatos de alquilo, i-butanol e etanol. 0 sal de pravastatina pode ser deixado recristalizar espontaneamente, ou pode ser induzido a recristalizar tomando passos adicionais tais como adição de um ião comum, arrefecimento ou adição de um cristal para nucleação. Para induzir mais a recristalização por adição de um ião comum, adiciona-se à mistura um sal do mesmo ião metálico ou amónio que o sal de pravastatina. Sais adequados para induzir a recristalização dos sais de pravastatina são os sais dos mesmos metais ou amónio que podem ser utilizados para precipitar o sal de pravastatina da solução enriquecida. De acordo com o processo preferido em que a pravastatina é obtida como um sal de amónio, 17 adiciona-se o sal cloreto de amoníaco ou da amina anteriormente utilizada para obter o sal de pravastatina para induzir a recristalização do sal de pravastatina. Na forma de realização mais preferida, em que é obtido o sal de pravastatina de amoníaco, o sal adicional é mais NH4C1. A recristalização pode ser realizada entre cerca de -10 °C e cerca de 60 °C, de um modo preferido entre cerca de 0 °C e cerca de 50 °C e de um modo muito preferido ainda entre cerca de 0 °C e cerca de 40 °C. Depois de o sal de pravastatina ter sido substancialmente recristalizado da solução, os cristais são isolados e podem ser lavados, por exemplo, com uma mistura 1:1 de acetato de í-butilo e acetona e, depois, secos. A secagem pode ser realizada à temperatura ambiente mas é de um modo preferido realizada a temperatura ligeiramente elevada inferior a 45 °C e de um modo preferido cerca de 40 °C. A recristalização pode ser opcionalmente repetida com vantagem como ilustrado nos Exemplos 7 e 8. Cada repetição ocorre com cerca de 92-96% de rendimento.

Mesmo depois da recristalização, a pravastatina contém uma impureza orgânica que tem um tempo de retenção relativo (RRT) de 0,9 no HPLC. Estima-se que a impureza orgânica é cerca de 0,2% da composição total com base no cromatograma obtido por HPLC com detecção no UV. A impureza orgânica pode ser removida como a seguir. O sal de pravastatina é dissolvido em água, de um modo -1 preferido num mínimo ou cerca de 6 mL g e adiciona-se então cerca de 0,2% (v/v) de isobutanol. O pH é aumentado para cerca de pH 8 a cerca de pH 14, de um modo preferido cerca de pH 10 a cerca de pH 13,7 por adição de hidróxido de sódio e a mistura é 18

mantida a uma temperatura de cerca de 10 °C a cerca de 50 °C durante 10-200 minutos, de um modo preferido a uma temperatura

de cerca de 20 °C a cerca de 30 °C durante 60-100 minutos. A solução é então reacidifiçada com um ácido mineral ou orgânico,

de um modo preferido ácido clorídrico ou ácido sulfúrico a um pH de cerca de 4 a cerca de pH 9, de um modo mais preferido cerca de pH 5 a cerca de pH 9, de um modo mais preferido ainda cerca de pH 6 a cerca de pH 7,5. Após ajustamento do pH, adiciona-se então cloreto de amónio à solução para fazer precipitar o sal de pravastatina. Se a quantidade de água utilizada for cerca de -1 6 mL g , então e recomendada a utilização de cerca de 2,0-2,3 g de cloreto de amónio por grama de sal de pravastatina. De um modo preferido o cloreto de amónio é adicionado em porções ao longo de quatro a seis horas.

Após a adição do cloreto de amónio, o sal de amónio da pravastatina pode cristalizar espontaneamente. Ao contrário, a recristalização pode ser induzida por arrefecimento, nucleação ou outros meios convencionais. Embora a recristalização seja de um modo preferido induzida por adição de um ião comum, por exemplo por adição de cloreto de amónio, a recristalização também pode ser induzida por diluição com um antissolvente como é de um modo preferido feito no passo de recristalização descrito anteriormente. Contudo, na operação tem de se tomar cuidado para inadvertidamente não precipitar sais de pravastatina. Como ilustrado com mais pormenor no Exemplo 1, a quantidade de impureza orgânica com um RRT=0,9 foi reduzida para lá de um limite detectável e obteve-se pravastatina de amónio com cerca de 99,3% de pureza, próximo de um nivel de pureza que é aceitável para utilização farmacêutica. Nesta fase do processo da invenção, pode obter-se um sal de amónio de pravastatina com menos do que cerca de 0,7% (p/p) de impurezas orgânicas. 19

Após a remoção das impurezas orgânicas por recristalização, o sal de pravastatina é trans-salifiçado a pravastatina de sódio. Trans-salificação tal como aqui utilizado refere-se a qualquer processo através do qual o catião de um sal de uma molécula orgânica é permutado com outro catião. Na trans-salificação, a pravastatina é primeiro libertada do seu sal de um metal ou de amónio por dissolução do sal num solvente aquoso, adição de qualquer ácido prótico tal como ácido clorídrico, sulfúrico, fosfórico, trifluoroacético ou acético à solução aquosa e extracção da pravastatina da solução aquosa com um solvente orgânico. 0 ácido prótico é adicionado à solução aquosa numa quantidade que a neutraliza ou acidifica, de um modo preferido a acidifica a um pH de cerca de 1 a cerca de 6, de um modo mais preferido cerca de 2 a cerca de 4. Quer antes quer depois da adição do ácido prótico à solução aquosa, faz-se contactar a solução aquosa com um solvente orgânico imiscível com água tal como acetato de i-butilo ou qualquer outro solvente orgânico imiscível com água. Depois de se ter feito contactar a solução aquosa com um solvente orgânico imiscível com água e tratado com o ácido prótico, a fase orgânica resultante contendo pravastatina é então separada da fase aquosa e, após lavagem opcional com água para remover os resíduos de amoníaco, a pravastatina é reextraída com hidróxido de sódio aquoso. É preferível utilizar uma quantidade de NaOH que é apenas um modesto excesso molar em relação à quantidade de pravastatina, de um modo preferido menos do que 1,1 equivalentes, de um modo mais preferido menos do que 1,02 equivalentes.

Após a extracção com hidróxido de sódio aquoso, o excesso de catiões sódio é capturado para atingir uma equivalência próxima de 1:1 de catião sódio e pravastatina. A captura é 20 realizada utilizando resinas de permuta iónica insolúveis em água. As resinas de permuta iónica adequadas são as resinas catiónicas e do tipo quelato, sendo as preferidas resinas de permuta ácida forte e fraca.

Entre as resinas de permuta catiónica ácidas fortes que podem ser utilizadas estão as que têm grupos ácido sulfónico - + ® (S03 H ) . Estas incluem os produtos comerciais Amberlite IR-118, IR-120, 252H; Amberlyst® 15, 36; Amberjet° 1200 (H) (Rohm and

Haas); as resinas de permuta iónica Dowex® série 50WX, Dowex® HCR-W2, Dowex" 650C, Dowex" Marathon C, Dowex DR-2030 e Dowex" HCR-S (Dow Chemical Co.); a série de resinas Diaion SK 102 a 116 (Mitsubishi Chemical Corp.) e Lewatit SP 120 (Bayer) . As resinas ® de permuta catiónica ácidas fortes preferidas são Amberlite 120, ® ®

Dowex 50WX e a série Diaion SK.

As resinas de permuta catiónica ácidas fracas incluem as que têm grupos ácido carboxilico pendentes. As resinas de permuta catiónica ácidas fracas incluem os produtos comerciais

Amberlite CG-50, IRP-64, IRC 50 e C67, série Dowex° CCR, série ® ®

Lewatit CNP e série Diaion WK, de que as mais preferidas são

Amberlite" IRC50, Lewatit8 CNP 80 e Diaion'8 WK 10. As menos preferidas são as resinas de permuta do tipo quelato. Algumas ® das variedades comerciais que estão disponíveis incluem Duolite C-718 e C-467 (Rohm & Haas).

Pode fazer-se contactar a solução contendo sal de sódio de pravastatina e excesso de catiões sódio com a resina de permuta iónica por qualquer método conhecido na técnica, incluindo passagem da solução através de uma coluna ou leito da resina ou por agitação de uma quantidade suficiente da resina num balão 21 com a solução. 0 modo de contacto não é crítico. Após captura do excesso de iões sódio, o pH de uma solução de pravastatina de sódio deve estar na gama de cerca de 6,5 a cerca de 10, de um modo preferido cerca de 7,4 a cerca de 7,8, embora o pH vá variar com diluição. A redução do pH da solução de pravastatina de sódio de um pH mais alto para um pH mais baixo e depois o nivelamento do pH ao nível mais baixo é uma indicação de que a + captura do excesso de iões Na está substancialmente completa. Depois de completada a captura, a solução de pravastatina de sódio é separada da resina de modo convencional. Pode também ser recolhida como o eluente de uma coluna ou leito ou pode ser separada por filtração, decantação e semelhantes. A pravastatina de sódio pode ser isolada da solução de pravastatina de sódio por cristalização. Uma cristalização eficiente pode requerer primeiro a remoção parcial da água, que pode ser realizada por destilação em vácuo ou por nano- filtração. De um modo preferido, a solução aquosa de sal de sódio de pravastatina é concentrada desde cerca de 20 a cerca de 50% p/v antes da cristalização. Se necessário, depois da concentração a solução aquosa de pravastatina de sódio pode ser ajustada para um pH entre cerca de 7 e cerca de 10 com uma + resina de permuta iónica na forma H . A adição de um solvente orgânico ou mistura de solventes orgânicos solúvel em água à solução de pravastatina de sódio auxiliará a cristalização. Em especial, pode referir-se acetona e misturas de acetona/acetonitrilo, etanol/acetonitrilo e etanol/acetato de etilo. Um dos sistemas de solventes mais preferido para cristalização de pravastatina de sódio é uma mistura de água/acetona/acetonitrilo 1/3/12 formada por concentração da solução de pravastatina de sódio até cerca de 22 30% p/v e depois adição do volume apropriado de mistura de acetona/acetonitrilo 1/4. A outra mistura de cristalização de solventes mais preferida é água-acetona (1:15). A pravastatina de sódio também pode ser isolada por liofilização da solução aquosa de pravastatina de sódio.

Quer isolada por cristalização ou por outro meio que melhore a pureza do produto, a pravastatina de sódio que é isolada na prática do processo da presente invenção está substancialmente isente de lactona de pravastatina. Como demonstrado nos exemplos a seguir, a pravastatina de sódio pode ser isolada com um teor de impurezas totais inferior a 0,5% (p/p) . Além disso, a pravastatina de sódio pode ser isolada com um teor de impurezas totais de 0,2% (p/p) ou menos por escolha das formas de realização preferidas da invenção, duas das quais estão exemplificadas nos Exemplos 1 e 15. As impurezas principais que são parte do teor de impurezas totais incluem epipravastatina de sódio, 3'-OH compactina de sódio, 6-hidroxi isocompactina de sódio e lactona de pravastatina. EXEMPLOS EXEMPLO 1

Purificação de Pravastatina O caldo de fermentação (100 cerca de 2,5 a cerca de 5,0 por caldo de fermentação acidificado i-butilo (3 x 50 L) . Verificou-se L) foi acidificado a pH desde adição de ácido sulfúrico. O foi extraido com acetato de que o rendimento da extracção 23 de acetato de i-butilo era de 95% por análise por HPLC calibrada com o padrão interno no caldo. Condições de HPLC (Fase inversa): coluna: Cis, tamanho de partículas 5 ym, comprimento 150 mm, diâmetro 4,6 mm; fase móvel: 45% de metanol/água, 0,1% de Et3N, 0,1% de ácido acético glacial; caudal de 1,3 mL min-1; temperatura da coluna 25 °C; volume de injecção 10 yL; padrão interno para-hidroxibenzoato de etilo; detecção: UV λ=238 nm.

As fases combinadas de acetato de i-butilo foram então extraídas com água (35 L) a cerca de pH 7,5 a cerca de pH 11,0 por adição de hidróxido de amónio concentrado. A solução aquosa de pravastatina resultante foi então reacidifiçada a um pH de cerca de 2,0 a cerca de 4,0 por adição de ácido sulfúrico 5 M e re-extraida com acetato de i-butilo (8 L) . A solução de pravastatina em acetato de i-butilo resultante foi parcialmente seca sobre Perlite e Na2S04. A solução de pravastatina foi decantada e depois separada dos agentes secantes por filtração e descolorada sobre carvão activado (1,7 g) . A solução foi então filtrada para retirar o carvão e transferida para um balão equipado com uma entrada de gás.

Introduziu-se então amoníaco gasoso no espaço superior acima da solução a 15-25 °C com agitação rápida. Depois parecer ter terminado a precipitação, desligou-se o amoniaco e adicionou-se cloreto de amónio à mistura para facilitar a filtração. Os cristais precipitados de sal de amónio de carboxilato de pravastatina foram recolhidos por filtração e lavados com acetato de i-butilo e, depois, com acetona o que deu sal de amónio de pravastatina com cerca de 94% de pureza determinada por HPLC com detecção no UV a λ=238 nm. 24 0 sal de amónio da pravastatina foi adicionalmente purificado por cristalização de uma solução saturada de cloreto de amónio como a seguir. O sal de pravastatina contendo 162 g de substância activa foi dissolvido em água (960 mL) e diluído com acetona (96 mL) e acetato de i-butilo (96 mL) a cerca de 35-40 °C. A solução foi arrefecida a cerca de 30-32 °C e induziu-se a pravastatina de amónio a cristalizar por adição de NH4CI sólido até mais adição não resultar em evidente aumento na formação de cristais. Depois da adição de cloreto de amónio, a solução foi arrefecida a cerca de 0-26 °C. Os cristais de pravastatina de amónio foram recolhidos por filtração e lavados com acetato de i-butilo e acetona, como anteriormente, e depois secos a cerca de 40 °C. Os cristais de sal de amónio de pravastatina (155,5 g) foram obtidos com cerca de 98% de pureza determinada por HPLC utilizando as condições anteriormente referidas. O sal de amónio de pravastatina foi adicionalmente purificado por outra cristalização como se segue. O sal de amónio de pravastatina (155,5 g de substância activa) foi dissolvido em água (900 mL). Adicionou-se isobutanol (2 mL) e em seguida o pH foi aumentado para cerca de pH 10 a cerca de pH 13,7 por adição de uma solução concentrada de hidróxido de sódio e a solução foi agitada durante 75 min à temperatura ambiente. A solução foi neutralizada a um pH de cerca de 7 por adição de ácido sulfúrico e a cristalização de pravastatina de amónio foi induzida por adição de NH4C1 sólido. Os cristais (150 g) foram recolhidos por filtração e lavados com acetona. Verificou-se que a pravastatina de amónio era cerca de 99,3% pura por detecção por HPLC utilizando as condições descritas acima. A pravastatina de amónio foi então trans-salifiçada ao sal de sódio como se segue. Os cristais de sal de amónio de 25 pravastatina foram dissolvidos em água (1800 mL) . Adicionou-se acetato de i-butilo (10,5 L). A solução foi então acidificada a um pH entre cerca de pH 2 e cerca de pH 4, por adição de ácido sulfúrico, que reconverteu a pravastatina no seu ácido livre. A fase de acetato de i-butilo, contendo pravastatina, foi lavada com água (5 x 300 mL) . A pravastatina foi então convertida no seu sal de sódio e reextraida com outra fase aquosa por agitação da solução de acetato de i-butilo solução com água (900-2700 mL) com adição intermitente de NaOH 8m até ser atingido um pH entre cerca de pH 7,4 e cerca de pH 13. A solução de sal de sódio de pravastatina foi então tratada com uma resina de permuta iónica para captura do excesso de catiões sódio. Após a separação, a fase aquosa foi agitada com resina de permuta Amberlite® IRC 50 na forma H+ durante 30 min à temperatura ambiente. Continuou-se a agitação até ser atingido um pH de cerca de pH 7,4 a cerca de pH 7,8. A solução foi então filtrada para remover a resina e parcialmente concentrada sob vácuo até um peso de 508 g. A solução foi então diluida com acetonitrilo (480 mL) , dando um solvente que é uma mistura de acetonitrilo:água 1,4:1. A solução foi agitada com carvão activado (5 g) para descolorar. Após filtração do carvão activado, obteve-se pravastatina de sódio como cristais por cristalização com 90% de rendimento após adição de mais acetona e acetonitrilo para formar uma mistura de água/acetona/acetonitrilo 1/3/12 (5,9 L) com arrefecimento a cerca de -10 a cerca de 0 °C. A pravastatina de sódio foi obtida com rendimento global de 65% com cerca de 99,3% de pureza a partir da substância activa fermentada determinada por HPLC utilizando as condições descritas acima. 26 EXEMPLO 2

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, mas omitindo a recristalização da mistura de água/acetona/acetonitrilo, obteve-se pravastatina de sódio por liofilização da solução concentrada de pravastatina de sódio em água com cerca de 99% de pureza e cerca de 72% de rendimento. A comparação da pureza final deste exemplo com o Exemplo 1 demonstra que a recristalização da pravastatina de sódio em vez da liofilização dá um produto um tanto mais puro. EXEMPLOS 3-6

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, isolou-se pravastatina de sódio de um caldo de fermentação com o rendimento e pureza indicados na Tabela 1, quando se utilizou o correspondente solvente orgânico no processo de trans-salificação.

Tabela 1

Exemplo n° Solvente Orgânico Rendimento (%) Pureza (%) 3 CH2C12 63 9 6,6 4 acetato de etilo 58 99, 5 5 formato de etilo 51 9 9,6 6 butilmetilcetona 61 99, 5 27 EXEMPLO 7

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, mas purificando adicionalmente o sal de amónio de pravastatina repetindo uma vez a cristalização do sal de amónio de pravastatina, obteve-se pravastatina de sódio com cerca de 99,6% de pureza e 58,4% de rendimento. EXEMPLO 8

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, mas purificando adicionalmente o sal de amónio de pravastatina repetindo duas vezes a cristalização do sal de amónio de pravastatina, obteve-se pravastatina de sódio com cerca de 99,8% de pureza e 53% de rendimento. EXEMPLO 9

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, o caldo de fermentação (100 L) foi acidificado a pH desde cerca de 2,5 a cerca de 5,0 por adição de ácido sulfúrico. O caldo de fermentação acidificado foi extraido com acetato de i-butilo (3 x 50 L) . As fases de acetato de i-butilo combinadas foram então extraídas com água (35 L) tendo sido basificadas a pH de cerca de pH 7,5 a cerca de pH 11,0 por adição de hidróxido de amónio concentrado.

Em vez de se reacidificar o extracto aquoso e extrair com acetato de i-butilo para se obter mais solução orgânica enriquecida como foi feito no Exemplo 1, o extracto aquoso foi 28 concentrado sob vácuo para 140 g/L. A solução concentrada

resultante tinha um pH de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 8. O excesso de amoníaco foi removido por evaporação.

Adicionou-se então lentamente cristais de cloreto de amónio (405 g) à solução concentrada em porções ao longo de quatro horas e deixou-se que o sal de amónio de pravastatina cristalizasse à temperatura ambiente. Os cristais foram então isolados por filtração e lavados com uma solução saturada de cloreto de amónio. Os cristais foram então adicionados a água (1 L) a 40 °C. Após a dissolução, a temperatura foi reduzida para 30 °C e adicionou-se cloreto de amónio (330 g) à solução em porções ao longo de duas horas. A solução foi então agitada durante 15 h à temperatura ambiente e os cristais de sal de amónio de pravastatina foram recuperados por filtração e lavados com acetato de i-butilo e depois disso com acetona e secos. Os cristais resultantes foram então adicionalmente purificados por recristalização transposta para o sal de sódio e isolados como descrito no Exemplo 1. Obteve-se pravastatina de sódio com pureza de cerca de 99,6% e 64,7% de rendimento. EXEMPLO 10

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, mas o sal de sódio de pravastatina foi cristalizado de mistura de água/acetona 1/15 com um rendimento global a partir da substância activa fermentada de partida de 64% e com 99,6% de pureza determinada por HPLC. 29 EXEMPLO 11

Seguindo o método do Exemplo 9, primeiros dois parágrafos, obteve-se um extracto aquoso concentrado (140 g.L x) . O extracto aquoso concentrado foi dividido em três partes iguais. A solução concentrada resultante foi então acidificada para um pH de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 8,0 por adição de HC1 1 M. Seguindo o método do Exemplo 9, terceiro parágrafo, mas substituindo os sais da Tabela 2 por cloreto de amónio, precipitou um sal de pravastatina de cada uma das porções e foi transposto em sal de sódio.

Tabela 2

Sais Pureza (%) Rendimento (%) KC1 99, 3 42 NaCl 99, 4 38 LiCl 99, 1 34

Lisboa, 3 de Novembro de 2006 30

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de isolamento de um sal de sódio de pravastatina de um caldo de fermentação compreendendo os passos de: a) formação de uma solução enriquecida de pravastatina; b) obtenção de um sal de pravastatina da solução enriquecida; c) purificação do sal de pravastatina; d) trans-salificação do sal de pravastatina a sal de sódio de pravastatina por: i) libertação da pravastatina do seu sal, ii) contacto da pravastatina com uma solução aquosa de hidróxido de sódio formando assim uma solução aquosa do sal de sódio de pravastatina, e iii) captura do excesso de iões sódio por contacto da solução aquosa de sal de sódio sal de pravastatina com uma resina de permuta iónica insolúvel em água; e e) isolamento do sal de sódio de pravastatina da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a solução enriquecida é uma solução aquosa enriquecida que é formada pelos passos de: a) contacto de um caldo de fermentação ácido com um solvente orgânico de extracção e formando assim de um extracto orgânico pravastatina; b) re-extracção do extracto orgânico por contacto com uma solução aquosa básica formando assim um extracto aquoso; e 1 c) concentração do extracto aquoso formando assim uma solução aquosa enriquecida de pravastatina.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a solução enriquecida é uma solução orgânica enriquecida que é formada pelos passos de: a) contacto de um caldo de fermentação ácido com um solvente orgânico de extracção e formando assim de um extracto orgânico de pravastatina; b) re-extracção do extracto orgânico por contacto com uma solução aquosa básica formando assim um extracto aquoso de pravastatina; e c) re-extracção da pravastatina do extracto aquoso por contacto com um solvente orgânico de re-extracção formando assim uma solução orgânica enriquecida de pravastatina. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que a concentração do extracto aquoso é realizada por destilação em vácuo. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que o contacto do caldo de fermentação ácido < com c > solvente orgânico de extracção é realizado a um pH entre cerca de pH 1 e cerca de pH 6. Processo de acordo com a . reivindicação 2 ou 3 em que a re- extracção com uma solução aquosa básica é realizada a um pH entre cerca de pH 7,0 e cerca de pH 13,7.
7. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que o solvente orgânico de extracção é seleccionado do grupo que 2 consiste em formatos de C2-C4 alquilo, ésteres C1-C4 alquilicos de ácidos C2-C4 alquilcarboxílicos, diclorometano, dicloroetano, clorofórmio, tetracloreto de carbono e butilmetilcetona.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7 em que o solvente orgânico de extracção é um acetato.
9. Processo de acordo com a reivindicação 3 em que a re-extracção de pravastatina com um solvente orgânico é realizada a um pH entre cerca de pH 1 e cerca de pH 6.
10. Processo de acordo com a reivindicação 3 em que o solvente orgânico de extracção e o solvente orgânico de re-extracção são, cada um deles, seleccionado independentemente do grupo que consiste em formatos de C2-C4 alquilo, ésteres C1-C4 alquilicos de ácidos C2-C4 alquilcarboxílicos, diclorometano, dicloroetano, clorofórmio, tetracloreto de carbono e butilmetilcetona.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10 em que o solvente orgânico de extracção e o solvente orgânico de re-extracção são acetatos.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11 em que o solvente orgânico de extracção e o solvente orgânico de re-extracção são acetato de i-butilo.
13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que a obtenção do sal de pravastatina é realizada a uma temperatura entre cerca de -10 °C e cerca de +60 °C. 3
14. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que a obtenção do sal de pravastatina compreende a precipitação do sal de pravastatina por adição de um sal de um metal, amoníaco, uma amina ou um sal de amónio à solução enriquecida.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o sal de pravastatina é precipitado por adição de um sal de amónio.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15 em que o sal de amónio é seleccionado do grupo que consiste em NH4C1, NH4Br, NH4I, (NH4) 2S04, NH4N03, (NH4)3P04, (NH4)2S204, NH4OAc e NH4SCN.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16 em que o sal de amónio é NH4C1.
18. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o sal de pravastatina é precipitado por adição de amoníaco gasoso.
19. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o sal de pravastatina é precipitado por adição de amoníaco gasoso e de um sal de amónio.
20. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o sal de p ravastatina é precipitado por adição de um sal de um metal.
21. Processo de acordo com a reivindicação 20 em que o sal de um metal é seleccionado do grupo que consiste em sais de lítio, sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio, sais de magnésio, sais de cobre, sais de ferro, sais de níquel, sais 4 de manganês, sais de estanho, sais de zinco e sais de alumínio.
22. Processo de acordo com a reivindicação 21 em que o sal de um metal é seleccionado dos contendo os iões metálicos Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+, Mn2+, Sn2+, Zn2+ e Al3+.
23. Processo de acordo com a reivindicação 14 em que o sal de pravastatina é precipitado por adição de um sal de amina.
24. Processo de acordo com a reivindicação 25 em que o sal de amina tem um componente amina seleccionado do grupo que consiste em C1-C3 alquilaminas primárias, secundárias e terciárias.
25. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o passo de purificação do sal do composto compreende o passo de recristalização do sal de pravastatina.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25 em que a recristalização do sal de pravastatina compreende os passos de: a) dissolução do sal de pravastatina em água formando assim uma solução aquosa do sal de pravastatina; b) diluição da solução aquosa do sal de pravastatina com um antissolvente; e c) adição de um sal do mesmo metal, ião amónio ou aminio como o sal de pravastatina. 5
27. Processo de acordo com a reivindicação 26 em que o antissolvente é seleccionado do grupo que consiste em acetato de etilo, acetato de i-butilo, i-butanol, acetona, acetonitrilo e etanol.
28. Processo de acordo com a reivindicação 26 em que o sal do mesmo metal, ião amónio ou aminio como o sal de pravastatina é um sal de amónio.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28 em que o sal de amónio é seleccionado do grupo que consiste em NH4C1, NH4Br, NH4I, (NH4)2S04, NH4N03, (NH4)3P04, (NH4)2S204, NH4OAc e NH4SCN.
30. Processo de acordo com a reivindicação 29 em que o sal de amónio é NH4C1.
31. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que a libertação de pravastatina do sal de pravastatina compreende os passos de: a) dissolução do sal de pravastatina em solvente aquoso, b) adição de um ácido prótico ao solvente aquoso, e c) extracção da pravastatina do solvente aquoso com um solvente orgânico para formar uma solução orgânica de pravastatina, em que se faz ainda contactar a pravastatina com solução aquosa de hidróxido de sódio por re-extracção da solução orgânica de pravastatina com a solução aquosa de hidróxido de sódio. 6 32 . Processo de acordo com a reivindicação 31 em que a extracção da pravastatina é realizada a um pH entre cerca de pH 1 e cerca de pH 6. 33. 34. 35. Processo de acordo com a reivindicação 31 em que o solvente orgânico é seleccionado do grupo que consiste em formatos de C2-C4 alquilo, C2-C4 alcanatos de C1-C4 alquilo, diclorometano, dicloroetano, clorofórmio, tetracloreto de carbono e butilmetilcetona. Processo de acordo com a reivindicação 33 em que o solvente orgânico é acetato de i-butilo. Processo de acordo com a reivindicação 31 em que a re-extracção da solução orgânica de pravastatina com solução aquosa de hidróxido de sódio é realizada a um pH entre cerca de pH 6,5 e cerca de pH 13,7. 36. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que 0 isolamento do sal de sódio de pravastatina compreende os passos de: a) concentração da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina e b) diluição da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina com um solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos. Processo de acordo com a reivindicação 36 em que a concentração da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina é realizada por destilação em vácuo. 7 37 . 38. Processo de acordo com a reivindicação 36 em que a concentração da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina é realizada por nano-filtração.
39. Processo de acordo com a reivindicação 36 em que a solução aquosa do sal de sódio de pravastatina é diluida com acetona.
40. Processo de acordo com a reivindicação 36 em que a solução aquosa do sal de sódio de pravastatina é diluida com uma mistura de solventes orgânicos seleccionada do grupo que consiste em misturas de acetona/acetonitrilo, misturas de etanol/acetonitrilo e misturas de etanol/acetato de etilo
41. Processo de acordo com a reivindicação 36 em que o isolamento do sal de sódio de pravastatina é realizado a uma temperatura entre cerca de -10 °C e cerca de +60 °C.
42. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 41 em que o isolamento do sal de sódio de pravastatina compreende o passo de liofilização da solução aquosa do sal de sódio de pravastatina ou o passo de cristalização do sal de sódio de pravastatina da solução do sal de sódio de pravastatina. Lisboa, 3 de Novembro de 2006