JP2003513132A - 特定の特性を有する新規な細胞培養担体、およびその製造 - Google Patents

特定の特性を有する新規な細胞培養担体、およびその製造

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ミラー，アラン・オトン・アンドレ
ロプソン−ケンダ，ナタリー・リリアン・パウル・ギスレーヌ
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４セー・ビオテヒ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、足場依存性細胞培養（ＣＡＤ）のための特定の機能的特徴性を示す、二次元微小担体ビーズ（２Ｄ−ＭＳ）を連続的に得る方法であって、特定の重合体顆粒から重合体薄膜のロールを連続的に製造し；該重合体薄膜を、反応性に富む基を生成するいかなる手段をも用いて活性化し；活性化された重合体薄膜と問題の重合体、共重合体および高分子との間で共有結合によってグラフトし；必要ならば、洗浄して、消費されず、薄膜に固着しなかった単量体を除去した後、グラフト済み薄膜を乾燥し；最後に、穿孔の大きさが、二次元微小担体ビーズに望ましい寸法のそれに応じて選ばれる、連続穿孔によって切断することで構成される一連の工程を含む方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、足場依存性細胞の培養のための二次元（２Ｄ）微小担体を製造する
新規な方法に関する。より正確には、本発明は、動物足場依存性細胞の、潅流に
よるか、またはクラスターでの大量培養に適し、低温感受性、生体適合性、生物
分解性または特異的接着のような特定の特性を発揮する、そのような微小担体を
製造する方法に関する。本発明は、その方法によって得られる微小担体、および
その用途にも関する。
【０００２】 足場依存性細胞（ＡＤＣ）は、増殖するため又はその細胞機能および生存力を
保持するために担体への接着に依存する。この依存性は、懸濁液中で増殖できる
足場依存性細胞からのそれを覆ってＡＤＣが分泌する、生物学的および薬剤学的
物質の産生に対する技術的障害を構成する。この依存性は、元来、密集が生じ、
密集した細胞をトリプシン処理によって分離しなければならない場合に、ＡＤＣ
の増殖が停止するということに由来する。さらに、細胞が栄養培地および酸素を
必要とすることが、微小担体の数および／または表面積を培地の所定の量に限定
している。充分な足場表面積と、ＡＤＣを工業的規模で生成するのを許すことと
を与えることを見込んで、異なる培養系が開発されていて：ローラーボトル、マ
ルチトレーシステム、中空ファイバーおよび微小担体は、表面積／体積比に関し
て特に好都合である。
【０００３】 足場依存性細胞（ＡＤＣ）の大量培養向けに業界で用いられる、多数の微小担
体は、三次元の幾何学（３Ｄ）を特徴とし；製造するのに最も容易なものは、球
形の幾何学を有する。３Ｄマイクロビーズは、細胞培養体をバッチで生成する（
１，０００lまでのバイオリアクター）ために、生物製剤工業によって用いられ
；一例は、Pharmacia（UPPSALA、スウェーデン国）が販売するCytodex（登録商
標）であって、５g/lの量で懸濁させて、２ｘ１０6細胞／ml前後の濃度が得られ
、培養体の７体積％をマイクロビーズが占める。これらは、工業的規格を構成し
ている。しかし、球形の微小担体の表面積／体積比は、バイオリアクター内の微
小担体の濃度を上昇させる助けとはならない。高濃度のＡＤＣ（１０7〜５ｘ１
０7細胞／ml）を培養しようとするならば、バイオリアクター内の微小担体の濃
度は、上昇させることができなければならない。しかし、膨潤した微小担体の体
積が、培養体量のうちの過大な比率を占めて、細胞に利用され得る培地の量を低
減する時点にすぐに到達してしまう。
【０００４】 二次元の幾何学を有する新世代の微小担体が開発され、EP-A-0 579 596に記載
されている。
【０００５】 用語「二次元の幾何学」は、これらの微小担体の厚さが、無限小となり、培養
される細胞の大きさに比して無視し得るようになることを意味する。厚さのこの
減少は、支持体の中、またはその辺縁のいずれにおいても細胞増殖の可能性が存
在せずに、足場の二つの面でのみ存在するにすぎない程度である。そのような２
Ｄ微小担体（２Ｄ−ＭＳ）は、上記のCytodex型のマイクロビーズのようなすべ
ての３Ｄ競合製品より高い、単位体積あたりの足場表面という主要な利点を提供
する。
【０００６】 したがって、バイオリアクター内での与えられた培養体量の占有に対して、そ
れらは、単位体積あたり、より多くの細胞を培養かつ生成することができる。球
体の足場の外表面積（４ｎＲ2）は、赤道に位置して、該球体に内接する２枚の
無限に薄い円盤の全表面積（２ｘ２ｎＲ2）に等しい。しかし、これら２枚の「
赤道上の」円盤の併せた体積は、それを生成するのに用いられた薄膜の厚さが減
少するにつれて減少して、それらを外接させる球体の体積の無限小の部分を占め
るにすぎなくなる。球体中に生成された円盤のすべてに対して１０μmの厚さを
採用することによって、こうして円盤によって与えられる細胞の足場に適する全
表面積は、懸濁液中のそれらのランダムな運動を考慮すると、球体の外表面積よ
り約３．３倍大きい。
【０００７】 こうして、２Ｄ−ＭＳの単位体積あたりの、ＡＤＣにとって利用できる大きな
足場表面積は、工業的規模での高濃度の細胞培養を構想することを可能にする。
【０００８】 足場依存性細胞培養向けの支持体のもう一つの制約は、その支持体に付着した
細胞を、細胞の生物学的または生理学的特性を保持しつつ回収するのに用いられ
る方法の限界である。細胞は、酵素処理（たとえばトリプシン）またはキレート
化剤（たとえばＥＤＴＡ）を用いて、その支持体から引き剥がされるが、これら
は、細胞機能ばかりでなく、連続培養が行われる場合には支持体への再付着をも
損傷しかねない。細胞の生物学的機能が、そのように工業的規模で用いられると
きに、この制約は特別な問題となる。これらの細胞を用いて問題の高分子を産生
するときか、あるいは受容体もしくは膜分子の完全性が、それらのリガンド結合
能力または分子もしくは物質の取り込み能力について、望まれる場合この状況に
遭遇することが多い。
【０００９】 さらに、足場依存性細胞の密集までの培養は、細胞間結合または細胞間連絡の
形成へと導く。これらの細胞間連絡は、細胞の特性に寄与し、そしてそれらの破
壊は、これらの特性の喪失に寄与する。
【００１０】 足場依存性細胞の大量培養に対するこれらの制約も、それが問題の細胞によっ
て通常は合成されるか、またはより一般的には遺伝子組換え手法を用いて、異種
タンパク質をコードしている遺伝子の挿入によって産生されるかにかかわらず、
これらの細胞が産生する生物学的高分子の工業的製造における限界を招く。機能
的な足場依存性細胞の産生容量に関連するこの限界は、発現させ、かつ精製しよ
うとするタンパク質に対する原価を招く可能性があり、そのことは、該タンパク
質を活性素因として含有する薬物のその後の販売価格と両立しない。
【００１１】 したがって、下記の独特の特徴を有する、ＡＤＣ培養向けの微小担体の提供を
求める必要性が存在する：
【００１２】 ・培地の単位体積あたりの細胞の高い収率；
【００１３】 ・微小担体からの剥離後のＡＤＣの生存力に対する最小限の変化；
【００１４】 ・用いられる培養システム、およびこれらの培養細胞の特性に担体を適合させ
るのを可能にする、該担体に固着できる細胞の数および特異性の制御；
【００１５】 ・足場依存性細胞向けのこれらの微小担体の、優れた再現性での、かつ生物学
的関心が持たれる細胞または高分子の生産に対する販売価格と両立する原価での
大規模生産の可能性。
【００１６】 上記の一定数の短所、特に細胞をその担体から引き剥がすのに酵素またはキレ
ート化剤を用いることの必要性を克服するための試行がなされている（すなわち
EP-A-0 387 975およびEP-A-0 382 214において）。これら二つの特許は、慣用の
細胞培養担体を、その望ましい特性が低温感受性である、ポリＮ−アルキル（メ
タ）アクリルアミド誘導体、それらのそれぞれの共重合体、ポリＮ−アクリロイ
ルピペリジン、およびポリＮ−アクリロイルピロリジンから選ばれる親水性単量
体の共重合産物で被覆することを提案している。
【００１７】 その用途では、重合体は、下部臨界温度またはＬＣＳＴ、すなわち重合体化合
物の水和および脱水のための転移温度の関数として選ばれる。ＬＣＳＴが細胞培
養温度より低いとき、細胞は、細胞培養段階の間、重合体担体に固着して存続す
る。それらは、培養温度を、ＬＣＳＴより実質的に低くなるように下げることに
よって、引き剥がすことができる。所定の低いＬＣＳＴの重合体または共重合体
を生成する方法は、EP-B1-0 382 214に記載されている。該特許出願に引用され
た単量体からグラフトされるすべての重合体は、適切ではあるが、本願における
低温感受性に対する適用においてそれらに限定されない。一般的には、重合工程
に親水性単量体を含めることは、ＬＣＳＴを上昇させる傾向があるが、疎水性単
量体の存在は、ＬＣＳＴを低下させる傾向があると言うことができる。親水性単
量体の例は、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリラート、ヒ
ドロキシエチルアクリラート、ヒドロキシメチルメタクリラート、ヒドロキシメ
チルアクリラート、酸性の基とその塩とを包含するアクリル酸およびメタクリル
酸、ビニルスルホン酸、スチリルスルホン酸、ならびに塩基性の基とその塩とを
包含するＮ，Ｎ′−ジメチルアミノエチルメタクリラート、Ｎ，Ｎ′−ジエチル
アミノエチルメタクリラートおよびＮ，Ｎ′−ジメチルアミノプロピルアクリル
アミドである。
【００１８】 疎水性単量体の例は：アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよびメタクリ
ル酸グリシジル等々のようなアクリラートおよびメタクリラートの誘導体、Ｎ−
ｎ−ブチル（メタ）アクリルアミドおよびＮ−イソプロピルアクリルアミド等々
のようなＮ−置換アルキル（メタ）アクリルアミド、ならびに塩化ビニル、アク
リロニトリル、スチレンおよび酢酸ビニル等々である。
【００１９】 しかし、そのような低温感受性の重合体または共重合体を細胞培養担体に結合
するための記載の手段は、
【００２０】 ・細胞培養の密度を制御しなければならないときの特に重要なパラメータであ
る、グラフトされた重合体の量と、したがって厚さとの双方を制御すること；ま
たは
【００２１】 ・培養担体への重合体または共重合体の共有結合による結合を確保すること ができず、それは、担体を、長期間貯蔵することも、再利用することもできない
ことを意味するため、重大な短所である。
【００２２】 本発明は、足場依存性細胞培養（ＡＤＣ）のための特定の特性が与えられた二
次元（２Ｄ）担体を連続的に製造する方法を提供する。それは、図１に例示され
、少なくとも下記の工程を逐次的に含む：
【００２３】 ・３５μmまたはそれ以下の厚さを有する重合体薄膜のロールを、与えられた
重合体の顆粒から連続的に製造する工程；
【００２４】 ・反応性の基、特にラジカルもしくは過酸化物官能基、またはヒドロペルオキ
シド官能基もしくはアミン官能基を生成するためのいかなる手段をも用いて、該
重合体薄膜を活性化する工程；
【００２５】 ・活性化された重合体薄膜と、望ましい特性の、問題の重合体、共重合体また
は高分子との間に、共有結合によるグラフト片を製造する工程（該グラフトは、
単量体の溶液への薄膜の浸漬によって達成し、共重合は、β照射下での活性化に
より生成される遊離基によって開始し、浸漬時間は、薄膜にグラフトされる重合
体の望みの厚さに直接相関されている）；
【００２６】 ・必要ならば、洗浄して、消費されず、かつ薄膜に固着しなかった単量体を除
去する工程；
【００２７】 ・重合体薄膜を、２Ｄ担体の望みの寸法の関数として選ばれる方法によって切
断する工程；
【００２８】 ・必要ならば、滅菌しようとする材料の関数として明確に選ばれる、オートク
レーブ処理または照射のいずれかによる滅菌の工程（材料をオートクレーブ処理
できないときは、物理的方法（γもしくはβ照射）または化学的方法（イソプロ
パノール／Ｈ2Ｏ、７０／３０％v/v）を用いて滅菌しなければならない）。
【００２９】 重合体薄膜は、薄膜の性質に応じて適するいかなる手段によって切断すること
もできる。たとえば、ポリスチレン薄膜は、多数の芳香族の基を有し、エキシマ
ーレーザーを用いた光切断に適する。
【００３０】 この種の切断の比較的不充分な品質にもかかわらず、たとえば、無害な物質を
用いて赤色に着色したセロファンディスクを用いて、熱分解（アルゴンレーザー
）によって切断することを構想することができる。
【００３１】 特に好都合な方法は、連続穿孔によって切断する工程であって、穿孔の寸法は
、望みの２Ｄ微小担体のそれである。
【００３２】 これらの異なる工程の組合せは、活性化、その後の処理された重合体薄膜（基
質）の共有結合によるグラフト、次いで、寸法および幾何学が均質である２Ｄ微
小担体を製造する方法による、共有結合によってグラフトされた重合体、共重合
体または高分子を担持する基質薄膜の切断を包含して、本発明の独創的な性質を
構成する。
【００３３】 薄膜の形態で用いられる出発材料については、重合体は、いかなる性質のもの
であることもできる。本発明によれば、材料が、
【００３４】 ・０．９〜１．２５g/cm3の範囲の、好ましくは１〜１．１g/cm3の範囲の密度
を有して、培地（バイオリアクター）内の懸濁液中で、沈澱または浮遊の危険性
が全くない、攪拌される培養を許すこと；
【００３５】 ・透明であって、細胞の増殖の際のその容易な分析をバイオリアクター内で連
続的に許すこと（用語「透明である」とは、４００〜１，０００nmにわたる波長
に対して、光が、入射光束の強さに比して、放出光の強さの実質的な減衰なしに
、微小担体を通過することを意味する。１％未満の吸収が、全く好都合であると
考えられる）；
【００３６】 ・適切な疎水性／親油性均衡を特徴とすること（それは、より疎水性であるな
らば、水性媒体中で充分に濡れやすいような接触角を有しなければならず、かな
り親水性であるならば、水中で膨潤してはならない；換言すれば、材料の表面と
水性媒体の液滴との接触角θは、３０°〜９０°の範囲でなければならず、ここ
で、接触角は、材料の表面と、液滴、材料表面および空気との間の三叉点での液
滴に対する接線との角度として定義される）； が望ましい。
【００３７】 θ＝０の角度は、完全な濡れに相当し、液体表面は、材料表面に平行である。
θ＞９０°の角度は、濡れの不在に相当し、液滴は、材料表面に形成されたまま
である。３０°〜９０°の接触角θは、不完全な濡れに相当し、材料上での液滴
の部分的な展開に符合する。
【００３８】 本発明によれば、薄膜（基質）を製造するのに用いることができる重合体材料
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラートもしくはポリカ
ルボナート、または主としてこれらのかなり疎水性である重合体を包含するいか
なる共重合体であることもできる。より親水性の薄膜は、セロファン、またはポ
リアクチドもしくはポリヒドロキシブチラートのような脂肪族ポリエステル、な
らびにより親水性であるこれらの材料を主として包含するいかなる共重合体であ
ることもできる。
【００３９】 用いられる重合体が脂肪族ポリエステル型であるときは、薄膜は、本質的に、
生体再吸収性／生物分解性であり、この場合、用いられる重合体が生物医学等級
のものであり、好ましくはＦＤＡによって認められているならば、生体へのイン
プラントとして用いることができる。
【００４０】 好ましくは、微小担体を製造するのに用いられる薄膜は、１０〜２５μmの厚
さである。
【００４１】 薄いか、またはごく薄い重合体ロールは、「押出牽引」手法を用い、所定の重
合体の顆粒から出発して連続的に製造する。この出発材料は、加熱してそれを融
解し、次いで、回転スクリューを通じて押し出し、２枚のプレートの間に注型し
て、薄い重合体薄膜を製造する。そうして、押出機の出口で、程々に薄い薄膜を
、一方向、または直交する二方向のいずれかに熱間牽引して、はるかに低下させ
た厚さの非収縮性薄膜を製造するが、この厚さは、出発材料の熱および機械的特
性の限度内で、製造されたロールの全幅にわたって制御する（１０〜３５μm）
ことができる。
【００４２】 「押出ブロー」手法は、薄膜を連続的に製造するための代替策である。変更は
、第二工程、すなわち薄膜の二つの壁の間の空気の注入にあり、これが、材料を
伸張し、こうし薄膜の厚さの減少を生じさせる。薄い薄膜を製造するためのその
他の手法は、重合体化学の他の適用（たとえばバイオセンサー）に記載されてい
て：回転塗装および溶媒注型は、その二者であるが、これらの手法は、通常、小
型の円盤またはシートを製造するのに用いられ、薄膜の連続ロールの製造にはあ
まり適していない。
【００４３】 第二工程では、好都合には、幅が５〜６０cmの範囲であり、長さが少なくとも
３kmの巻き取り可能な形態であることができる、重合体薄膜を、そうして活性化
させて、グラフトしようとする基質のその他の反応性に富む基との共有結合によ
る結合を形成することができる、反応性の基が生成されるのを可能にする。本文
脈中で、用語「物質」は、特定の特性、特に低温感受性および生体適合性を有す
る有機単量体または重合体を意味し；一定の細胞受容体に特異的な親和性を有す
る、生物学的高分子であってもよい：そうして、そのようなグラフトの結果とし
て得られる２Ｄ微小担体は、細胞の混合物を含む最初の細胞サンプル中に存在す
る、一定の型の細胞の選択的接着を許すことができる。例示のため、分化の異な
る段階での皮膚細胞（ケラチノサイト）、または特定の機能の挿入、活性化もし
くは抑制の結果として、特に該機能を有するか、または細胞性遺伝子の発現を調
節する機能を有する遺伝子の挿入によって得られる細胞を引用することができる
【００４４】 重合体の化学的構造を修飾し、反応性に富む基を生成するには、４種類の方法
が用いられる。それらは、電子ビーム、より詳しくはβ照射、コロナ放電、ＵＶ
処理、および最後にプラズマである。それぞれの操作に対して、二つのパラメー
タ：
【００４５】 ・活性化によって重合体に誘導される化学的な基の性質；
【００４６】 ・材料の厚さへの処理の深さ が、照射を受ける材料の望みの特性に応じた方法の選択を支配する。
【００４７】 すべての場合に、活性化は、結合を破断し、遊離基、すなわち過酸化物官能基
、ヒドロペルオキシド官能基またはアミン官能基のいずれかを生成させる電磁照
射に担体を付すことよりなる。
【００４８】 記載された方法を用いて、必要ならば、発生した遊離基を介してスペーサー分
子をグラフトすることができる。それらは、反応性部位と、重合体薄膜に共有結
合によって結合しようとする単量体、重合体または高分子との間の結合の長さを
増大させ、その結果、それらの移動度を増大させるよう機能する。
【００４９】 活性化は、薄膜を電子衝撃に付すことよりなる。衝撃は、好ましくは、不活性
雰囲気中で達成する。本発明の方法では、活性化工程がグラフト工程に先行する
ことが不可欠である。これら二つの工程が、EP 382 214が該当するとおり、同時
であるときは、グラフトしようとする単量体を、照射に付して、溶液中に非常に
多くの遊離単独重合体を生成するが、これらは担体の表面に吸着する可能性があ
り、そのため洗浄によって除去しなければならない。この場合、遊離した、グラ
フトされなかった鎖のすべてが、洗浄によって除去され、吸着した遊離鎖が、熱
対比による細胞の剥離の際に培地に溶解しないよう確保することは困難である。
【００５０】 活性化の条件は、少なくとも
【００５１】 ・グラフトしようとする重合体薄膜の性質；
【００５２】 ・重合体薄膜に共有結合によって結合しようとする共重合体または高分子の性質
；
【００５３】 ・活性化工程の不連続的または連続的な性質（次いで切断されることになるグラ
フトされた担体は、静的な方式でか、または薄膜の通過により連続的に処理され
ていてよい）； を包含する一定のパラメータの関数として選ぶ。
【００５４】 活性化工程が連続的なときは、薄膜の通過速度は、毎分０．１〜５０mであり
、薄膜を活性化するのに要する照射の総線量と、薄膜の耐熱性の関数として固定
された、照射装置の出力との関数として確立することができる。
【００５５】 ポリスチレン薄膜をβまたはγ線で照射するときは、照射装置の出力は、６ミ
リアンペア（mA）まで上昇させることができ；それを越えると、薄膜は過熱し、
変形する。薄膜通過の速度を実質的に低下させるならば、６mAの固定した強さに
対して、照射装置下の一回の通過の際に、８０〜２００kGyの最大線量を達成す
ることが可能になる。
【００５６】 キログレイ、または１キログラムあたりのジュールは、線量を表す単位であり
、電子ビームユニットの特性に依存する。
【００５７】 コロナ放電を用いるときは、kHz領域の周波数で数千ボルトの電圧でそれを放
射させる。この方法は、環境雰囲気中で実施する。コロナアークの幾何学的振幅
は、より慣用的なシステムについての数ミリメートルから、ブロウンアークシス
テムについての数センチメートルまでである。放電は、物体のいずれかの側に位
置する平行電極を用いて達成する。薄膜を活性化するのにコロナ放電を用いるこ
とは、環境雰囲気中で実施される処理であるという利点を有する。
【００５８】 重合体薄膜は、ＵＶでの予備照射によって活性化することもできる。この操作
は、光開始剤の存在下で実施する。一例として、薄膜を、窒素中４０℃で光開始
剤として作用するベンゾフェノンを担持する、アセトンガスの存在下で１時間、
高圧水銀灯に露光させることができる。
【００５９】 プラズマ薄膜を冷プラズマで活性化することも、高周波領域での放電を発する
電極を用いて実施する。
【００６０】 プラズマは、数ミリバールの残留圧力下の反応室に導入された気体、または気
体混合物の高周波源を用いた、イオン化によって得られる。この高価な操作も、
重合体薄膜に対して連続的に実施することが困難である。しかし、これら４種類
の活性化：βもしくはγ電子ビーム、コロナ放電、ＵＶまたはプラズマは、反応
性の基を発生させるのに適する。
【００６１】 本発明によれば、上記のとおりのアクリルアミドまたはビニル型単量体を薄い
脂肪族ポリスチレンもしくはポリエステル型重合体薄膜の表面に放射線グラフト
する手法は、その性質とは無関係に、照射によって開始しなければならない。そ
うして、グラフト工程は、予備活性化した重合体薄膜を、単量体の溶液、複数の
単量体の混合物、または選ばれた高分子の混合物に投入することによる浸漬によ
って、直接実施する。
【００６２】 有機単量体を用いるならば、重合体薄膜の表面とのその共重合は、予備照射の
際に生成された遊離基によって開始し、形成された重合体鎖は、薄膜に共有結合
によって結合される。この反応は、瞬間的であるが、薄膜の性質に応じて、最高
度のグラフトを生じるために、数秒ないし数分まで延長することができる。グラ
フトのこの度合いは、照射線量、含浸浴内の単量体の濃度、および反応時間に直
接関連する。
【００６３】 そうして、本発明の方法は、とりわけ、上記に引用した四つのパラメータ：す
なわち、照射の性質および線量、グラフト期間、単量体の濃度、並びにグラフト
浴中の溶媒の性質を最適化して、共有結合によってグラフトした重合体、共重合
体または特異的高分子の望みの厚さの層を得ることを含む。下記の例２に示され
ることになるとおり、沈着した重合体層、有機共重合体層または特異的高分子層
の厚さは、Ｘ線光子分光法（ＸＰＳ）によって決定され、浴中の含浸によるグラ
フト工程の持続期間に直接依存する。
【００６４】 予備照射工程を空気中で実施するときは、生成された反応性の基は、空気の存
在下で瞬間的に酸化されやすい。この場合、グラフト工程は、反応性の基を再生
するための特別の化合物を含有する浴中の浸漬によって、即興的に実施する。
【００６５】 本発明の方法では、グラフト工程に、必要ならば、消費されなかったか、およ
び／または重合体薄膜の表面に重合されなかった単量体、重合体もしくは生物学
的高分子残基の除去よりなる、洗浄工程を後続させることができる。これらの洗
浄は、一般的には、水中のイソプロパノールの混合物（７０／３０％v/v）中で
、洗液中に反応物および／または生成物の痕跡がそれ以後存在しなくなるまで実
施する。細胞培養に適用したときは、洗浄は、アクリルアミドや単量体および重
合体及びそれらの誘導体の細胞毒性のために、可能な限り充分であるべきことが
不可欠である。
【００６６】 本発明の方法では、重合体、共重合体または高分子の異なる性質は、１〜１０
ナノメートルの層を構成することができ、接着性細胞がこれに固着かつ増殖する
。全体的または部分的な低温感受性が求められるときは、問題の重合体または共
重合体は、ポリＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド、それらのそれぞれの共重
合体、ポリＮ−アクリロイルピペリジン、およびポリＮ−アクリロイルピロリジ
ン、の誘導体から選ぶ。生体適合性が望ましいときは、表面処理は、たとえば、
アリルアミンのプラズマに予備露光させた重合体薄膜の表面に、アミン含有ポリ
酸化エチレン（ＰＥＯ）のような親水性重合体を共有結合によってグラフトして
、アミン機能を表面に、かつシアニド＝クロリドのような適切な化学的カップリ
ング剤を介して、生成することを含む。この種の処理は、J. Biomed. Mater. Re
s., 1991, 25, 1547に記載されている。
【００６７】 望みの特性が、動物細胞の選択的接着であるときは、抗体、アプタマー、また
は組合せ化学によって得られる分子を用いた、アフィニティクロマトグラフィー
の手法に記載されたもののような、担体に高分子をグラフトする慣用的方法を用
いることができる。当業者は、これらの手法の詳細な説明をJ. Cell. Biol., 19
91, 114, 1089；同1990, 110, 777；J. Biol. Chem., 1992, 267, 14019；同101
33；Artif. Organs, 1992, 16,526；Macromolecules, 1993, 26, 1483に見出す
ことができる。本発明の方法によって製造された担体に好都合にグラフトするこ
とができる、生物学的高分子（オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド等）は、そ
れらと混合できるその他の細胞型の有害物に対する細胞受容体に特異的なリガン
ドであって、培地中の一定の細胞の増殖を実施させることができる。より詳しく
は、それは、自然にか、またはin vitroでの遺伝子組換えの結果として、その膜
で特異的高分子を発現する細胞の増殖を許すことができる。
【００６８】 本発明の方法では、問題の重合体、共重合体または高分子がグラフトされる、
基質重合体薄膜は、次いで、２Ｄ微小担体の望ましい幾何学および寸法の関数、
ならびに重合体薄膜の性質の関数として選ばれる方法を用いて切断する。
【００６９】 本発明の好適実施態様は、その寸法が製造された２Ｄ微小担体のそれに適合す
る穿孔である。
【００７０】 本発明の一好適実施態様では、微小担体の厚さは、好ましくは２５μmまたは
それ以下であり、円盤の形態をなす。そのようなグラフトされた２Ｄ−ＭＳを製
造する方法の最後の工程は、したがって、グラフトされた薄いか、またはごく薄
い重合体薄膜（基質）を、二次元幾何学を特徴とし、細胞が付着し、細胞による
２面間のいかなる浸透もなしに増殖する二つの足場面を含む、μm級の粒子に切
断することを含む。
【００７１】 好適な一切断手法は、機械的穿孔による切断であって、製造された微小円盤の
寸法、形状および厚さに関して、また砕片の不在という面で、優れた品質の微小
円盤を生じる。
【００７２】 寸法の均質性（均質分散性）は、細胞増殖の異なる段階を同調させるのに不可
欠である。異なる寸法の微小担体の存在は、より小さいそれは、大きいそれより
前に密集に到達することを意味すると思われる。この場合、より速く密集に達し
たＡＤＣは、部分的に剥がれ、死亡し、アンモニア、乳酸その他の毒素を放出す
る可能性があり、それらは、より大きい微小担体上で増殖するＡＤＣの増殖に有
害である。
【００７３】 この工程は、独自に予備活性化したか、または予備活性化し、次いでグラフト
された、選ばれた直径（たとえば１５０μm）を有する環状の炭化セラミックの
ポンチを用いて、重合体薄膜を穿孔することによって達成される。重合体薄膜は
、考察中の重合体薄膜の前進の速度の関数として、最適化された切断頻度（１分
あたりの衝撃）で穿孔する。
【００７４】 その他の切断手法、たとえばレーザー光切断、熱分解切断、またはエンボシン
グシステムを構想することができるが、後者は、所定の直径の押印シリンダ上の
固定した線によって構成される回転刀を用い、同じ直径の第二のシリンダがプレ
スとして働く。この後者の手法では、ポンチの所定数（ポンチとシリンダ径との
間の間隔の関数として定義される）の線を、シリンダの３６０°にわたって分布
させ、１線あたり所定数（シリンダ長の関数として定義される）のポンチも分布
させる。二つのシリンダの間を通過する薄膜ロールについての切断速度、したが
ってまた生産性は、必然的に本方法と異なる。これは、すべての寸法および形状
のラベルを販売する企業が用いる、強力な手法である。この場合、切断を生じる
よう印加しなければならない圧力が、工程を限定する危険性がある。
【００７５】 本発明は、足場依存性細胞（ＡＤＣ）の大量培養のための特定の特性を与えた
、上記のとおりの方法によって得られる二次元（２Ｄ）微小担体であって、重合
体薄膜の厚さが、１０〜３５μmにわたり、共有結合によってグラフトされた問
題の重合体、共重合体または高分子の厚さが、１〜１０nmにわたる微小担体にも
関する。
【００７６】 グラフトを受けた２Ｄ−ＭＳの製造における工程の続き具合を、図１に示す。
【００７７】 ２Ｄ−ＭＳが低温感受性であるとき、密集した細胞がその担体から定量的に離
脱しようとするならば、グラフトされた層について最低５nmの厚さが必要である
。熱コントラストによる部分的および非定量的剥離が密集したＡＤＣについて望
まれるときは、厚さの減少が必要とされる。
【００７８】 本発明は、上記に定義された方法を用い、かつ重合体薄膜が構成する基質上で
の重合体、共重合体または生物学的高分子の共有結合による固着を用いて製造さ
れる、特定の特性を与えた２Ｄ−ＭＳ担体を連続的に製造する装置であって、該
装置が、
【００７９】 ・活性化、グラフト、穿孔の各工程に選ばれた速度で運ばれる重合体薄膜を、
巻き戻し／巻き取りするシステムと；
【００８０】 ・薄膜表面を活性化する照射装置と；
【００８１】 ・予備活性化された重合体薄膜が、巻き取り／巻き戻しシステムに運ばれて、所
定の速度で連続的にその中を通過する、グラフトしようとする単量体、重合体ま
たは高分子の溶液を収容するためのグラフト槽と；
【００８２】 ・薄膜を、それが巻き戻されたときに穿孔するための切断工具と を含む装置にも関する。
【００８３】 図２は、（ロール形態での）薄膜の連続切断のための装置の線図を示す。巻き
取り／巻き戻しシステムは、供給し、切断工具から排出するのに役立つ。さらに
、この工具は、１日２４時間操作する。Ｍ１は、ストリップの前進を制御するモ
ータであり；Ｍ２は、ロールを巻き取るためのモータであり、Ｍ３は、ロールを
巻き戻すためのモータである。Ｃ１は、Ｍ３を操作するためのセンサを表し、Ｃ
２は、Ｍ３に対する停止センサであり、Ｃ３は、Ｍ２を操作するためのセンサで
あり、Ｃ４は、Ｍ２に対する停止センサである。最後に、Ｒ１は、ストリップ制
動システムを示す。
【００８４】 好ましくは、薄膜巻き戻し／巻き取りシステムは、該薄膜を、毎分５〜５０m
にわたる速度で前進させることができる。ある場合には、より遅く薄膜を前進さ
せることができ、この前進の速度は、毎分０．０５〜８mにわたる。巻き戻し／
巻き取り速度は、切断工程では、活性化およびグラフト工程の際よりはるかに遅
い。
【００８５】 該装置の核心は、環状のポンチの列、および対応する溝ブロックが、薄膜の長
手方向に、その上に固定された工具ブロックで構成される。例示すると、幅が５
cmである薄膜に対して、工具ブロックは、それぞれ５０個のポンチを有する９列
を含むことになる。このインライン工具ブロックの、幅方向ではなく長手方向で
の配置は、保守の安全性を高める。ポンチの同じラインでは、間隔は、０．２５
mmであり；２ライン間の規則的な距離は、０．２０mmである。明らかに、上記の
配置、ポンチ径、およびそれらの間隔は、最適の提唱であるが、当然、必要条件
に適合させることができ、本質的に限定するものではない。ポンチの全体的な幾
何学的配置を最適化することもできる。
【００８６】 上記に認められたとおり、切断装置は、レーザーで構成することができる。
【００８７】 穿孔の際は、グラフト済みの２Ｄ−ＭＳ微小担体は、連続的に回収される。一
例として、５cmの幅、および３kmの長さのグラフト済みのポリスチレンロールか
ら、１５０μmの直径のポンチを含む本発明の装置は、１５０μmの直径の円盤（
２Ｄ−ＭＳ微小担体）約１kgを製造することができる。材料の表面密度が２６．
２５g/m2であるとすれば、得られる粒子の最少数は、１ロールあたり、または製
造された微小担体１kgあたり２．３８ｘ１０9個の微小担体が得られる。例とし
て上記に引用した配置では、切断収率は、２８％である。
【００８８】 図３は、得られた２Ｄ−ＭＳ微小担体を示す。
【００８９】 微小円盤は、穿孔マトリックスの直下に位置する容器内に回収することができ
る。
【００９０】 下記の非限定的な実施例は、細胞培養のための方法、および該方法によって得
られるような担体の利点を示す。
【００９１】 例１−窒素中で電子ビームを用いる、予備照射を経由しての放射線グラフト： 初めに、本発明者らは、シート（５ｘ１０cm2の薄膜、厚さ２５μmのポリスチ
レン）上の不連続的な放射線グラフトのパラメータ（活性化総線量、溶媒の性質
、単量体の濃度、グラフト浴の温度、グラフト期間）を、工業的装置に比して低
い出力、および低い線量率を特徴とするバンデグラーフの静電電子加速器研究に
よって最適化かつ定義しようとした。これらのシートは、当初、予め脱気した７
５cm3入り培養フラスコに入れ、不活性雰囲気（窒素）中で下記のとおり乾燥照
射した：
【００９２】 ポリスチレン薄膜を内容する培養フラスコを、７０／３０％（v/v）のイソプ
ロパノール／Ｈ2Ｏ混合物中で２回洗浄し、窒素気流中で１５分間乾燥した。
【００９３】 脱気したポリスチレン培養フラスコを、静止高エネルギーＥＢ照射装置（１０
meV）に入れた。１mAの固定強度、および１０kGy／分（１Mrad／分）の線量率の
バンデグラーフ電子加速器を用いた。そうして、フラスコを、固定した時間（分
で示す）ビーム下で照射して、設定総線量（kGyまたはJ/gで示す）を吸収させた
。蓄積された線量は、予め、線量計を用いて較正した。
【００９４】 照射装置の出口で、直ちにフラスコを、溶液（Ｈ2Ｏ）、単量体原液（濃度：
１０〜４０重量％）に窒素雰囲気中で接触させた。直前に調製した単量体の原液
を、加圧窒素システムによって、予備照射したポリスチレンフラスコに移した。
予備照射したフラスコに移したならば、グラフト溶液を、所定の温度（２５〜６
０℃）で平衡させた。グラフト時間（０．５〜２４時間）を所定の温度で変えて
、ポリスチレン培養フラスコ上にある限りでの、薄膜表面のポリＮ−イソプロピ
ルアクリルアミドの層の厚さに対する様々なパラメータの影響を確認した。グラ
フト溶液を、所定時間後にフラスコから排除し、フラスコおよびグラフト済み薄
膜を、３回洗浄し、乾燥した。
【００９５】 例２：ポリスチレン薄膜へのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）
のグラフト： ２．１．反応時間の関数としての沈着厚さの研究： ２５ミクロンの厚さのフラスコを、バンデグラーフ型電子加速器（１０meV）
、および２５０kGyの総線量を用いて、窒素中で照射した。次いで、照射した薄
膜を、直ちに、窒素で３０分間脱気しておいたＮＩＰＡＡｍ水溶液（１０重量％
）中に浸漬した。グラフト溶液の温度は、６０℃であった。異なるグラフト済み
表面を、グラフト溶液中の単量体の濃度、および反応時間を変えることによって
得た。グラフト反応が完了したときに、グラフト済み薄膜を、洗浄し、乾燥し、
Ｘ線光子分光法（ＸＰＳ）によって分析して、外表面の化学的組成を決定した。
【００９６】 反応時間の関数としての沈着厚さを、下記の表１に示す。
【００９７】
【表１】
【００９８】 未処理ポリスチレンのＣ1sピークは、それぞれ、炭化水素結合に関与する炭素
と、芳香族化合物の「シェークアップ」ピーク特性とに対応する、二つの成分（
２８４．８eVおよび２９１．５eV）に分解することができる。文献によれば、こ
の後者のピークは、ポリスチレンのための全炭素に関して、７％の強さを有する
。
【００９９】 薄膜の厚さは、ポリスチレンの特性シェークアップピークＣ1sの表面積（％）
と、９０°での電子捕集角で分析した（定量分析）グラフト済み薄膜サンプルに
ついての総Ｃ1sピークのそれとの比から算出した。純粋なポリスチレンの特性Ｃ 1s シェークアップピークがＸＰＳにおいてそれ以上検出されなかった場合、グラ
フトされた沈着の厚さは、ＸＰＳ手法の分析深度、すなわち５０または６０Åよ
り大であった。
【０１００】 本発明者らは、適切な沈着厚さ（５〜１０nm）を有するグラフトを得るための
、その他の活性化パラメータ、すなわち照射温度の重要性も立証した。液体窒素
の制御注入によって照射室が保たれる、設定温度が低ければそれだけ、グラフト
の速度論は速くなり（表面に保持される活性部位の量が大きくなり）、適切な沈
着厚さを得るためのグラフト時間が短くなり得る（本例では、照射温度を０℃か
ら−２０℃に変化させたとき、時間は、３時間から２時間に短縮された）。
【０１０１】 さらに、水に溶解した（１０重量％）商業的な単量体の純度も、効果的なグラ
フトを得るのに決定的に重要であった。痕跡量（０．１重量％）の安定剤、すな
わちメチルヒドロキノン（ＭＨＱ）の固体単量体中の存在は、製造された水溶液
に黄色の着色を生じ、とりわけ、ポリスチレン薄膜の表面とのＮＩＰＡＡｍの共
重合を阻害し：この未精製溶液中でのグラフト後に、低温感受性沈着は、全く観
察されなかった。連続法の際に最適の低温感受性沈着を得るために、本発明者ら
は、単量体の直前に溶解した水溶液の、活性炭カラムでの混入物の選択的吸着に
よる工業的規模の脱色の方法を開発した（精製は、薄膜予備活性化工程の直前に
実施した）。研究室規模では、１０重量％単量体水溶液の清澄化／脱色に対する
代替策は、商業的に入手できる固体ＮＩＰＡＡｍの、トルエン／ヘプタン混合物
からの再結晶である。この場合、有機相に可溶性のまま残留する安定剤は、再結
晶した単量体の数回の洗浄後に除去された。しかし、連続法（数十リットルの溶
液、かつそのため数kgのＮＩＰＡＡｍの回分を用いる）に対しては、活性炭精製
手法が、より適切である。
【０１０２】 当業者は、ＭＨＱを除去するのに最も適すると推測される、利用できるいかな
る手法も用いることと思われ、これらの手法は、上記の手法との機能的等価体で
あると考えなければならない。
【０１０３】 ２．２． 厚さ２５μmの薄膜を、総線量が１５０kGyのバンデグラーフ型電子加速器（１
０meV）を用いて、窒素中で不連続的に照射した。照射した薄膜を、直ちに、窒
素で３０分間脱気しておいたイソプロパノール中のＮＩＰＡＡｍの溶液（１０重
量％）に３時間浸漬した。グラフト溶液の温度は、２０℃であった。ポリＮ−Ｉ
ＰＡＡｍの沈着は全く観察されなかった。
【０１０４】 ２．３． 厚さ２５μmの薄膜を、総線量が１００kGyで、１５０keVで操作する電子カー
テン型の電子加速器を用いて、空気中で不連続的に照射した。照射した薄膜を、
直ちに、液体窒素中に捕捉し（輸送の際）、非常に低い温度で貯蔵して（−１８
０℃のフリーザー）、表面に生成された過酸化物／ヒドロペルオキシド機能の安
定性を保存した。除霜後、予備照射した薄膜を、直ちに、窒素で３０分間脱気し
ておいた、塩化第一鉄（０．１重量％）を含有するＮＩＰＡＡｍ水溶液（１０重
量％）に浸漬した。この還元剤は、薄膜表面の酸化された機能をＮＩＰＡＡｍの
ラジカル重合を開始する部位へと化学的に分解した。グラフト溶液の温度は、３
７℃であった。単量体／還元剤のモル比と反応時間とは、グラフト収率および沈
着厚さに効果を有した。
【０１０５】 ２．４． ２面のうち一方をアルミニウムシートで遮蔽した、２５μmの厚さの薄膜を、
窒素中で、バンデグラーフ型電子加速器（１０meV）を用い、２５０kGyの総線量
で照射した。照射した薄膜を、直ちに、窒素で３０分間脱気しておいたＮＩＰＡ
Ａｍ水溶液（１０重量％）に浸漬した。グラフト溶液の温度は、６０℃であった
。２面のうち一方のみに選択的にグラフトされた担体を得た。
【０１０６】 本発明者らは、これらの異なる試験から、５nmを越える沈着厚さへと導く最高
のグラフト収率は、２５０kGyの総線量での予備照射（照射時間：２５分）の際
に、予備活性化した薄膜を単量体と接触させて、少なくとも２時間放置すること
によって得られたと結論することができる。グラフト時間がより短いときは、グ
ラフト収率、およびその結果としてのポリスチレン薄膜上で得られた沈着の厚さ
は、より少なかった（５nm未満）。そのような表面は、望みの特性および機能を
部分的にのみ与えたにすぎなかった。
【０１０７】 例３：窒素中でのＵＶによる予備照射を用いた放射線グラフト ポリスチレン薄膜を、光開始剤として作用するベンゾフェノンを担持するアセ
トンガスの存在下で、高圧水銀灯を１時間用いて、窒素中４０℃でＵＶに予備照
射した。次いで、照射した薄膜を、直ちに、窒素で３０分間脱気しておいたＮＩ
ＰＡＡｍ水溶液（１０重量％）に浸漬した。グラフト溶液の温度は、６０℃であ
り、グラフト時間は、３時間であった。
【０１０８】 この手法を用いて、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドをポリスチレン薄膜
の表面にグラフトすることが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、グラフトを受けた２Ｄ−ＭＳの製造における工程の続き具合である。
【図２】 図２は、（ロール形態での）薄膜の連続切断のための装置の線図である。
【図３】 図３は、得られた２Ｄ−ＭＳ微小担体である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B033 NA16 NB36 NC01 ND07 4F073 AA01 BA18 BA19 BA27 CA01 CA21 CA45 4J026 AA12 AA17 AB08 AB17 BA32

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 足場依存性細胞培養（ＡＤＣ）のための特定が特性を与えら
    れた二次元（２Ｄ）担体を連続的に製造する方法であって、少なくとも下記の工
    程： ・３５μm以下の厚さ、および０．９〜１．２５g/cm3の範囲の密度を有する重合
    体薄膜のロールを、所定の重合体の顆粒から連続的に製造する工程； ・反応性の基、特にラジカルおよび／または過酸化物、ヒドロペルオキシドもし
    くはアミン官能基を生成するためのいかなる手段を用いて、該重合体薄膜を活性
    化する工程； ・活性化された重合体薄膜と、望ましい特性の、問題の重合体、共重合体または
    高分子との間に、共有結合によるグラフトを製造する工程（該グラフティングは
    、単量体の溶液中への薄膜の浸漬によって達成し、共重合は、β照射下での活性
    化により生成される遊離基によって開始し、浸漬時間は、薄膜にグラフトされる
    重合体の望みの厚さに直接相関されている）； ・必要ならば、洗浄し、消費されず、かつ薄膜に固着しなかった単量体を除去し
    、次いでグラフト済みの薄膜を乾燥する工程； ・グラフト済みの重合体薄膜を、連続穿孔によって切断する工程（穿孔の寸法は
    、２Ｄ担体の望みの寸法の関数として選ばれる）； を逐次的に含む方法。
  2. 【請求項２】 重合体薄膜の接触角θが、３０°〜９０°の範囲である、請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 活性化が、コロナ放電、プラズマ、ＵＶ照射または電子衝撃
    によって達成される、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 重合体薄膜が、不活性雰囲気中でのβ照射による衝撃によっ
    て電子的に活性化される、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 薄膜表面にグラフトされた重合体層の厚さを、下記のパラメ
    ータ：薄膜が受けるβ照射の総線量、グラフト槽内の単量体の濃度、グラフティ
    ング時間、およびグラフティング温度の組合せによって決定する、請求項１〜４
    のいずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 問題の重合体または共重合体が、その望ましい特性が低温感
    受性である、ポリＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド、ポリＮ−イソプロピル
    アクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、それらのそれぞれの共重合体、ポリＮ−アク
    リロイルピペリジン、およびポリＮ−アクリロイルピロリジン、の誘導体から選
    ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 問題の重合体または共重合体が、その望ましい特性が生体適
    合性である、親水性アミン含有ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）型重合体である
    、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 安定剤のすべての痕跡を、単量体溶液から除去する、請求項
    ６記載の方法。
  9. 【請求項９】 問題の高分子（単数又は複数）が、細胞受容体に特異的な１
    種類以上のリガンドであって、その望ましい特性が、その（それらの）受容体を
    有する細胞の選択的接着である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 重合体薄膜（基質）がポリスチレンであり、かつグラフト
    される重合体が、ポリＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド、それらのそれぞれ
    の共重合体、ポリＮ−アクリロイルピペリジン、またはポリＮ−アクリロイルピ
    ロリジンの誘導体から選ばれる場合に、５０〜２５０kGyの照射総線量と、それ
    ぞれ１〜３時間および５０〜７０℃の単量体溶液への浸漬時間および温度との組
    合せによって、４０〜６０Åの厚さが得られる、請求項６記載の方法。
  11. 【請求項１１】 活性化が、望ましい特性を有する問題の重合体または共重
    合体のグラフティングに先行する、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 足場依存性細胞（ＡＤＣ）の大量培養のための特定の特性
    が与えられた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られる二
    次元（２Ｄ）微小担体であって、重合体薄膜の厚さが、１０〜３５μmの範囲で
    あり、共有結合によってグラフトされた問題の重合体、共重合体または高分子の
    厚さが、１〜１０nmの範囲である、微小担体。
  13. 【請求項１３】 グラフトされる重合体が、ポリＮ−アルキル（メタ）アク
    リルアミド、それらのそれぞれの共重合体、ポリＮ−アクリロイルピペリジン、
    およびポリＮ−アクリロイルピロリジン、の誘導体から選ばれる、低温感受性重
    合体である、請求項１２記載の微小担体。
  14. 【請求項１４】 グラフトされる重合体が、親水性アミン含有ポリエチレン
    オキシド（ＰＥＯ）型重合体である、請求項１２記載の微小担体。
  15. 【請求項１５】 グラフトされる高分子が、細胞受容体に特異的な１種類以
    上のリガンドである、請求項１２記載の微小担体。
  16. 【請求項１６】 上記に定義された方法を用い、かつ重合体薄膜によって構
    成される基質上での重合体、共重合体または生物学的高分子の共有結合による固
    着を用いて調製される、特定の特性が与えられた２Ｄ−ＭＳ担体を連続的に製造
    する装置であって、該装置が、 ・活性化、グラフティング、穿孔の各工程に選ばれた速度で運ばれる重合体薄膜
    を、送り出し／巻き取りするシステムと； ・薄膜のロールを連続的に活性化するよう配置された電子加速器と； ・重合体薄膜が、送り出し／巻き戻しシステムに運ばれて、所定の速度で連続的
    にその中を通過する、グラフトしようとする単量体、重合体または高分子の溶液
    を含む容器と； ・薄膜を、それが巻き戻されたときに穿孔するための切断手段と を含む装置。
  17. 【請求項１７】 薄膜送り出し／巻き取りシステムが、該薄膜を０．０５〜
    ８m／分の範囲の速度で前進させることができる、請求項１６記載の装置。
  18. 【請求項１８】 薄膜送り出し／巻き取りシステムが、該薄膜を５〜５０m
    ／分の範囲の速度で前進させることができる、請求項１６記載の装置。
  19. 【請求項１９】 切断手段が、炭化セラミックの環状ポンチの列および対応
    する溝ブロックが、薄膜の長手方向にその上に固定されたツールブロックで構成
    される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の装置。
  20. 【請求項２０】 切断手段が、レーザーである、請求項１６〜１８のいずれ
    か一項に記載の装置。
  21. 【請求項２１】 切断手段が、円筒状回転刀（エンボシングシステム）で構
    成される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の装置。
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