CN116145424B - 一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体，涉及细胞培养技术领域，所述长效表面改性载体的原料采用材质为PET、结构为纵横交错设置的膜网支架立体结构的多层纤维卷膜，PET膜经过等离子体改性方法对表面进行亲水处理，再经过接枝工艺对表面进行二次亲水改性处理，形成具有长效表面改性载体。本发明中，等离子体长效改性处理过的PET膜，由于亲水性能的大幅度提高，细胞的贴附率提高显著，最大效率的利用细胞接种悬液，避免了生物材料的不必要浪费，提高细胞的接种密度，减少未贴壁死细胞沉积带来的细胞毒性影响，使细胞生产达到质和量的双重提升。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及到一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体。
背景技术
细胞治疗和基因治疗(CGT)可在分子层面通过基因表达、沉默或体外改造的手段来实现疗法升级或治疗罕见病。细胞培养是指在适宜的体外环境下，细胞离体生长和增殖，并保持自身特性和功能的技术。大多动物或人体来源的细胞为单层贴壁生长，只要没有被驯化为非贴壁依赖性的，则必须贴附在合适的细胞培养载体上，才能实现铺展生长。
贴壁细胞培养载体包括2D和3D两种载体结构，传统的2D培养主要是实验室常用的细胞培养皿或细胞培养瓶，其平面结构为细胞提供的生长空间有限，导致体外培养有明显的接触抑制的缺点，例如，一个传统的75cm2培养皿仅可支持2×107个细胞贴附生长，并需耗费15-30ml的培养基。为了增加细胞生长面积，扩大细胞培养空间，人们开始使用细胞转瓶、滚瓶、以及中空纤维管等柱形结构的细胞培养载体，但此种培养载体有额外的转动装置等配件需求以及对操作人员的工艺技术要求比较高，人员需进行技术培训、劳动强度大、实验室试剂消耗大，细胞接种产量虽有所提升但还是达不到生产需求，操作过程中容易造成污染，耗时耗力，不能满足现今社会对贴壁细胞的规模化、集约化生产需求。
3D细胞培养载体包括微载体、生物反应器等，可用于模拟体内细胞生长的微环境，其中生物反应器的培养效果更为卓越，为细胞生长提供足够的营养物质，并可进行实时监控和程序化管理，数据上精确控制细胞生长的各种条件，从而实现细胞体外大量扩增，展现出极大的应用和生产潜力，尤为适合应用于大规模工业化生产。
其中生物反应器中的关键部件为细胞培养PET(Polyethylene terephthalate)膜，是一种新型的细胞培养材料，经螺旋卷曲后形成长轴式圆柱状的膜柱(图1)，PET膜的结构为规则的纵横交错设置的膜网支架结构，为贴壁细胞的生长繁殖提供了一种三维立体环境，但是由于贴壁细胞对培养载体表面亲水性的特殊要求，导致未经特殊处理的普通PET膜难以满足细胞贴壁的条件，细胞接种环节中部分细胞未能成功贴壁，死细胞产生的细胞毒性反向影响正常细胞的生长，一定程度上影响体外细胞实验的效果。
由于表面处理技术难度的限制，目前用于生物反应器的细胞培养PET膜具有普遍存在未经表面处理、细胞贴附能力低等问题，极大的影响了贴壁细胞接种密度的提高，导致其不能满足细胞生产中提高产量的实际需求，现今急需一种经表面贴壁技术处理的细胞培养PET膜。
随着生物制造、疫苗生产、细胞治疗和组织工程等技术领域突飞猛进的发展，对规模化贴壁细胞培养技术的需求日益增加。培养膜经过亲水改性处理以适于细胞贴附和生长，提高细胞的接种密度，增加细胞的产量，满足生产需求，然而表面处理的效能会随着时间延长而降低，短效的性能不能满足持续性地生产需求，所以保证细胞培养载体的表面处理的时效性和性能稳定性对贴壁细胞的大规模培养同样有非常重要的意义。
现有技术中，大型企业一般采用离子溅射对2D平面细胞培养载体进行处理，制备细胞粘附液，然后将其加入细胞培养载体，进行蒸发干燥，从而使细胞培养板的表面涂覆一层细胞粘附物质，使细胞更易附着。然而，这种方法的流程复杂繁琐，大型机器成本贵，处理时间较长，限制了大规模生产，生产效率较低，且细胞粘附液成本较高，进一步限制了大规模生产应用。
因此，需要提供一种成本低、处理更加简单、时效保持更久，能够适应大规模3D细胞培养的表面改性载体，本发明提出一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体及其制备方法。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体，具体方案如下：
一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体，所述长效表面改性载体的原料采用材质为PET、结构为纵横交错设置的膜网支架立体结构的多层纤维卷膜，PET膜经过等离子体改性方法对表面进行亲水处理，再经过接枝工艺对表面进行二次亲水改性处理，形成具有长效表面改性载体。
进一步的，长效表面改性载体的制备方法具体包括如下步骤：
预处理：将清洗干净的PET膜进行活化，活化后置于真空袋中保存备用；
等离子体亲水处理：采用非聚合性气体处理从真空袋中取出PET膜，使其表面生成化学活性点，通过等离子体放电在材料表面形成自由基，引发单体在PET膜表面聚合，发生亲水化，亲水化后置于真空袋中保存备用；
二次亲水改性处理：对等离子体亲水处后的PET薄膜进行以DETA作为改性剂的接枝溶液的接枝工艺。
进一步的，预处理的具体过程为：PET膜经过乙醇和丙酮清洗三次后置于烘干箱内80℃烘干15min，干燥后的PET膜平铺在两电极之间的绝缘玻璃板上，置于电极辉光放电中心的位置活化30min后置于真空袋中保存备用。
进一步的，等离子体亲水处理中，等离子体放电通过等离子体电晕处理设备完成。
进一步的，等离子放电电晕处理设备中充有非聚合性气体，其内部还设有过料辊、电极组、接地的电晕辊，电极组连接有高压高频电源，其与电晕辊之间的间隙设为2-3mm，电晕辊的两侧分别设有一个过料辊，未经处理的PET膜依次绕过过料辊、电晕辊以及过料辊，当电极组被通电时，电晕辊被电极组施加高频、高压电，产生高频、高压放电，对经过电晕辊的PET膜进行冲击处理。
进一步的，等离子放电电晕处理设备连通有臭氧排风系统，臭氧排风系统用于处理放电时产生的臭氧。
进一步的，二次亲水改性处理的具体过程中为：预先将配置好的DETA接枝溶液置于恒温水浴锅内37℃加热保温，将等离子体亲水处理过后的PET膜从真空袋取出并浸润于DETA接枝溶液中，接枝后用蒸馏水超声清洗，洗涤三次后干燥。
进一步的，PET膜浸润于DETA接枝溶液中的DETA接枝活化时间为5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)等离子改性方法能够处理常规方法难以实现的复杂的三维物体和微通道，是一种没有任何化学物质的清洁方法，过程完全环保。应用范围广，自动化程度高，可一次性轻松增加表面能量，实现对PET膜材料表面的处理，处理时间短，流程简单易规模化操作。
在等离子体亲水处理中，非聚合性气体作为反映介质，运行成本低，可大量节省成本，生产出具有高附加值新型细胞培养载体。非聚合性气体采用压缩空气即可，具有良好的安全性，低耗能，没有污染废气的产生，不会有排废气的问题，安全且环保，处理过程高效稳定，适合长时间工作，可用于大规模连续生产。
(2)短效处理的等离子体PET膜经过接枝工艺，即在接枝溶液浸泡后，可长效维持亲水效果，使PET膜性能保持长期稳定，避免因时间效期的原因导致产品性能不稳定，亲水性逐渐减退的状况，产品性能发挥更稳定。
(3)大型固定床生物反应器可以使用该种等离子长效改性的PET膜，此种改性载体尺寸裁剪灵活，可适用于各种规格的生物反应器，亲水贴附力成倍提高，提高贴壁细胞生产效率，解决了PET膜亲水性较低，细胞贴壁难的问题，弥补市面上缺乏表面亲水改性的规模化3D培养细胞载体的现状。
其次，在贴壁细胞培养的实验中，等离子体长效改性处理过的PET膜，由于亲水性能的大幅度提高，细胞的贴附率提高显著，最大效率的利用细胞接种悬液，避免了生物材料的不必要浪费，提高细胞的接种密度，减少未贴壁死细胞沉积带来的细胞毒性影响，使细胞生产达到质和量的双重提升，等离子体长效改性处理过的PET膜在3D贴壁细胞培养体系中实现规模化贴壁细胞生产。
附图说明
图1为PET膜的正视图。
图2为水滴角直观概念示意图；
图3为等离子能量转换示意图；
图4为PET膜表面分子被氧化的状态示意图；
图5为等离子体亲水处理PET膜工作原理示意图；
图6为二次亲水改性处理PET膜工作原理示意图；
图7PET膜表面亲疏水的状态示意图；
图8为PET膜未经改性处理的细胞贴附率的折线图；
图9为PET膜经过等离子体亲水处理后的细胞贴附率的折线图；
图10为PET膜经过长效改性处理后的细胞贴附率的折线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。
现有技术中，培养膜经过亲水改性处理以适于细胞贴附和生长，提高细胞的接种密度，增加细胞的产量，满足生产需求，然而表面处理的效能会随着时间延长而降低，短效的性能不能满足持续性地生产需求，为克服现有技术的不足，为提高膜的亲水性，本发明对PET膜经过等离子体改性方法对表面进行亲水处理，同时为保持良好的时效性，再经过接枝工艺对表面进行二次亲水改性处理，形成具有长效表面改性载体，保证PET膜长效的亲水性。
此制备方法操作简单、成本低，为大规模贴壁细胞培养提供了一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体，可提高细胞的贴附率，解决生物反应器缺少表面改性细胞培养膜的耗材问题，从而满足现代贴壁细胞规模化培养的生产需求。
首先，作为适合3D细胞培养的膜材料，本发明选取的PET膜的微观结构为纵横交错设置的膜网支架立体结构的多层纤维卷膜，延展性好。如图1所示，此三维镂空结构具有良好的支撑力，可承受数量更多的细胞大量贴壁生长，膜纤维结构可以给细胞提供足量的生长空间，培养基等营养物质可以从空间缝隙中流过，很好地模拟了体内细胞生长的环境，提高了体外细胞实验的生物仿真度。PET膜的透光性好，适合在显微镜下观察，生物相容性好，对细胞没有毒副作用，是一种适合临床医疗和生物实验的安全材料。
其次，亲水材料更利于细胞黏附与铺展，疏水(或超疏水)环境不利于细胞的黏附。贴壁培养的细胞对培养载体的表面亲水性要求较高，若细胞培养载体的表面具有较低的表面能，则细胞无法很好地贴壁附着，因此一般需要对细胞培养材料进行亲水处理。本发明选定的PET薄膜具有透明度高、耐化学腐蚀、成本低等优点而被广泛应用。但PET薄膜在选择时若要满足材料中纤维的支撑度和延展性以适应细胞培养的环境要求，其亲水性的性能难以得到保证，故因其疏水性、难以湿润性使其在细胞生产中的应用受到限制，细胞无法良好地贴壁，导致配制的细胞悬液无法得到充分的利用，造成生物预制品和培养基等试剂的不必要浪费，影响产出。因此改善PET薄膜的亲水性(图2)以提高细胞的贴附率是提高工艺产量、拓宽其实用性的关键。
通过物理或化学方法改善物质表面性能的方法称为表面改性。现代生物工业生产中，表面改性的技术手段有很多，例如化学接枝、熔融共聚、电子束辐照、表面涂覆、等离子体处理等。这些技术通过在薄膜表面引入含氧极性官能团来提高薄膜表面的表面能和润湿性。
众所周知，固体、液体和气体是物质的三种常见状态，我们可以通过增加或减少能量(例如加热/冷却)在其中两种状态之间转换，如果继续增加足够的能量，气体分子将被电离(失去一个或多个电子)，并因此携带净正电荷(图3)。若将足够多的分子离子化，则能够影响物质的整体电学特性，则该种状态下的物质称为等离子体。因此，等离子通常被称为物质的第四态。
利用等离子的高能粒子与材料表面发生物理和化学反应，可以实现对材料表面进行激活、蚀刻、除污等多种工艺处理，以及对材料的摩擦因数、粘合和亲水等各种表面性能进行改良的目的。等离子是干式加工，不涉及使用化学品，所以不存在废水排放以及废水处理的问题。
因此，本发明采用离子体方法对PET膜表面进行亲水处理，能够根据需要在PET膜纤维表面引入某种功能团或引发交联、接枝、聚合等一系列反应，使PET膜纤维表面化学性能和物理形态发生变化，改善PET膜纤维的使用性能，并可以赋予PET膜纤维一些新的功能，提高产品的性能和附加值。
再其次，虽然经过等离子体方法处理后能在PET膜的表面引入极性基团，但是随着时间的推移，改性后的样品保存时间越久，PET膜材料表面的亲水性能又会逐渐恢复到处理前的疏水状态，等离子体对聚合物材料表面改性处理的效果并不持久。这种现象通常被称为等离子体对聚合物表面性能影响的时效性。
二乙烯三胺(DETA)是两端含有极性且仅次于羧基和羟基的氨基化合物，是具有吸湿性的透明粘稠液体，溶于水、乙醇，不溶于乙醚，具有仲胺的反应特性，易与多种化合物及聚合物反应，并且极易吸收空气中的水分和二氧化碳。DETA主要用于合成聚酰胺树脂、表面活性剂等，是一种易洗除、稳定的改性剂。因其良好的稳定特性，所以在进一步提高PET膜亲水性的同时，EDTA能够大幅度地提高等离子体处理后样品的时效性。
对此，本发明对于以PET膜为原料制备促进细胞贴壁的长效表面改性载体的方法具体包括以下三个步骤，预处理→等离子体亲水处理→二次亲水改性处理。
其中，预处理的内容是将清洗干净的PET膜进行活化，活化后置于真空袋中保存备用，具体的过程为，PET膜经过乙醇和丙酮清洗三次后置于烘干箱内80℃烘干15min，干燥后的PET膜平铺在两电极之间的绝缘玻璃板上，置于电极辉光放电中心的位置活化30min后，再置于真空袋中保存备用。
然后，等离子体亲水处理的内容是采用非聚合性气体处理从真空袋中取出PET膜，使其表面生成化学活性点，通过等离子体放电在材料表面形成自由基，引发单体在PET膜表面聚合，发生亲水化，亲水化后置于真空袋中保存备用。具体的过程为，在等离子放电电晕处理设备中充有非聚合性气体，非聚合性气体采用压缩空气即可，具有良好的安全性，低耗能，没有污染废弃的产生，也不会有排废气的问题，安全且环保，处理过程高效稳定，适合长时间工作，可用于大规模连续生产。等离子放电电晕处理设备的内部还设有过料辊、电极组、接地的电晕辊，如图5所示，电极组设置为管状电极结构，放电不受被处理物的形态影响，电极组连接有高压高频电源，其与电晕辊之间的间隙设为2-3mm，电晕辊的两侧分别设有一个过料辊，未经处理的PET膜依次绕过过料辊、电晕辊以及过料辊。
在电极组和电晕辊之间的间隙，由于PET膜轻薄，可随意调整其形态，有合理的等离子反应空间，处理均匀，适应不同张力的PET膜处理。优化的，等离子放电电晕处理设备的运动速度和正反转方向可调节，实现正反面均一处理，集成化控制系统，操作方便。
需要说明的是，PET膜在电极组与电晕辊间隙通过时的运行速度为6m/min，速度较快，当电极组被通电时，电晕辊被电极组施加高频、高压电，产生高频、高压放电，产生细小密集的紫蓝色火花，电极组和电晕辊之间的电晕放电通过它们之间的紫蓝色火花可见，对经过电晕辊的PET膜进行冲击处理表面分子被氧化(图4)，具有更大的表面张力。举例来说，一块长30m的PET膜，只需5min便可完成在其表面的等离子体改性处理，赋予其具有亲水性的功能，效率高，操作方便。
采用等离子放电电晕处理设备的优点在于，通过等离子放电电晕处理设备产生等离子体，等离子体中的各种活性粒子(电子、正离子、自由基、激发态原子/分子和紫外光子等)通过辐射、离子流、中性分子流与纤维、高分子材料表面相互作用并使材料表面获得改性。具体来说，在等离子体系中的粒子通过连续不断地轰击表面将能量转移给PET膜。这些粒子的能量具有四种形式：动能、振动能、离解能和激化能。动能和振动能只对PET膜起加热作用，而自由基离解能则是通过引起PET膜表面的各种化学反应而得到消散的，激化分子和原子是以与固体表面碰撞而达到消散的。这些准稳态分子和原子的能量通常大于PET膜的离解能，因而在碰撞过程中会产生聚合物自由基。
所以把PET膜材料密封置于等离子放电电晕处理设备产生的电场，电场中产生的大量等离子体极其高能的自由电子，能促使PET膜纤维表层产生腐蚀、交换、接枝和共聚反应。
此外，压缩空气电离后产生的氧离子在强电场的作用下，加速并冲击处理PET薄膜，使膜材表面分子的化学键断裂而降解，增加表面粗糙度和表面积，由于PET膜纤维材料在处理过程中，等离子体中的分子、原子和离子渗入到材料表面，材料表面的原子逸入等离子体中。这个过程使膜纤维表面大分子链断裂，从而使膜纤维受到等离子体粒子的刻蚀，表面产生粗糙的凹坑，使材料表面的吸湿性和粘着性增加，纤维之间的摩擦力增加，伴随着可能产生的化学反应，使PET膜表面产生化学和物理改性。
需要说明的是，放电时还会产生大量的臭氧，臭氧是一种强氧化剂，能使膜材分子氧化，产生羰基与过氧化物等极性较强的基团，从而提高了其表面能。等离子放电电晕处理设备配置有臭氧排风系统，可随时排放处理气体，不会对人体产生影响，并且臭氧在空气中30分钟就会彻底分解，不产生有害物质，不会污染环境。
总的来说，等离子体亲水处理仅仅涉及PET膜纤维材料的表面，因此不会影响到PET膜纤维材料的整体性能，对细胞的生物学性能不会产生毒副作用，等离子体亲水处理作为一种清洁、无污染且对样品本体损伤小的改性方法，在保持样本本身的效用和性能的同时，实现PET膜亲水性的改善。
最后，二次亲水改性处理的内容为对等离子体亲水处后的PET薄膜进行以DETA作为改性剂的接枝溶液的接枝工艺，如图6，具体过程中为预先将配置好的DETA接枝溶液置于恒温水浴锅内37℃加热保温，将等离子体亲水处理过后的PET膜从真空袋取出并浸润于DETA接枝溶液中，接枝后用蒸馏水超声清洗，洗涤三次后干燥，当活化后的PET膜浸润到DETA接枝溶液时，氨基与PET膜表面发生键接缔合作用。将DETA作为改性剂，对PET薄膜进行接枝工艺的二次亲水改性处理，通过提高材料表面的化学稳定性保证处理后样品的时效性，此方法操作简单、成本低、处理效果好，对高分子聚合材料的性能影响小，对细胞生长过程中的毒副作用小，能充分满足当今分子生物学领域体外细胞实验的要求。
为提高接枝工艺的处理效率，本发明还对DETA接枝溶液活化工艺的时间进行筛选。活化初期，随着处理时间的延长，PET膜表面静态接触角呈现下降趋势；当活化时间超过5min时，膜表面静态接触角呈上升趋势。由此可得出，活化时间为5min时，PET膜经过等离子体活化后表面新引入的极性基团最多，即PET膜表面的悬挂键最多，可为接枝DETA提供更多活性位点。
综述，本发明还对表面改性处理的PET膜进行如下的亲水性测试：
一、等离子体亲水处理后的改性效果
水和任何固体接触都会产生一个角度，即水滴角。通常可以通过测试物质表面的水滴角大小来判断其表面能。接触角越小，表示表面润湿性越好(亲水性)，细胞易贴附；接触角越大，表示疏水性、表面附着力越差(图7)。PET膜经过等离子改性处理后，使用水滴角测定仪进行测量，测出处理前水滴角数值为108.59°，处理后水滴角数值为9.25°。PET膜经等离子改性后由疏水态转为极亲水态。
测试结果表明：未处理前的PET膜表面几乎完全不润湿，附着力差，而当PET膜样品经过亲水改性处理后，附着力变好，效果显著。
二、二次亲水改性处理后的改性效果以及时效性验证
从测试一中选取五个经过等离子体亲水处理后的PET膜样品，其中一个样品不做任何处理，作为参照，简称PET膜A。另外四个样品进行活化时间分别为3min、5min、10min、15min的接枝工艺，完成二次亲水改性处理，分别简称为PET膜B、PET膜C、PET膜D、PET膜E。
对比接枝溶液浸泡改性做长效处理的四种PET膜与只进行一次等离子处理的一种PET膜的亲水性测试结果，长效处理后的PET膜B、PET膜C、PET膜D、PET膜E的水滴角数值分别为7.8°、6.2°、11°、18°，等离子处理的PET膜A的水滴角数值为9.36°。
而且，这五种PET膜在时隔6个月之后再次进行亲水性测试，PET膜A的水滴角数值恢复到109°左右，而PET膜B、PET膜C、PET膜D、PET膜E的水滴角数值分别变动为8.2°、6.4°、11.5°、18.6°。
测试结果表明：可以看出，长效处理后有两种PET膜(PET膜B、PET膜C)的水滴角数值不仅小于10°，还小于PET膜A的水滴角数值，以PET膜C的水滴角数值最小，可知，以DETA作为改性剂的接枝溶液的接枝工艺进行的二次亲水改性处理中，活化时间为5min的接枝工艺处理后的表面改性载体的亲水性最好。说明，等离子体亲水处理后的PET膜的亲水性提高不仅和进行了接枝活化的长效处理有关，还和活化时间的长短有关，长效处理后的PET膜的亲水性得到了提高，但是并不是长效处理时长越短或者越长便可改善亲水性能，活化时间保持在5min即可。
另外，一定时间后，长效处理后的四种PET膜的水滴角数值的变化几乎很小，而PET膜A的水滴角数值变化很大，几乎恢复至原始数值。可知，与PET膜A对比来说，长效处理后的PET膜不仅进一步提高了亲水性能，还可长期间维持亲水性能，避免因时间效期的原因导致产品性能不稳定，亲水性逐渐减退的状况，能实现规模化的细胞生产。而且，以DETA作为改性剂的接枝溶液的接枝工艺进行的二次亲水改性处理中，活化时间为5min的接枝工艺处理后的表面改性载体的长效性最具有稳定性。
三、细胞贴附率实验结果以及时效性验证
分别在未经改性处理的PET膜、经过等离子体亲水处理后的PET膜、经过长效等离子体改性处理(等离子体亲水处理+二次亲水改性处理(接枝工艺中的活化时间采用5min))的PET膜上进行HEK293细胞的体外细胞培养实验，简称为PET膜a、PET膜b、PET膜c，HEK293细胞在PET膜a上接种6h后贴附率最高仅达到40％，且随着接种时间的延长贴附率逐渐降低至20％(图8)；HEK293细胞在PET膜b上接种3h后贴附率可达到80％左右，且随着接种时间的延长贴附率降低至75％左右(图9)；HEK293细胞在PET膜c上接种3h后贴附率最高可达到85％，且随着接种时间的延长贴附率依旧稳定在高水平的85％左右(图10)。
PET膜b、PET膜c两种PET膜进行真空袋中密封避光保存6个月之后，以PET膜b、PET膜c两种再次进行HEK293细胞的体外细胞培养实验，PET膜b的贴附率最高只能维持在45％左右，PET膜c的贴附率最高还能维持在82％左右。以此类推，将密封避光保存时间延长至一年，以PET膜b、PET膜c两种再次进行HEK293细胞的体外细胞培养实验，PET膜b的贴附率最高只能维持在40％左右，PET膜c的贴附率最高还能维持在81％左右。
测试结果表明：长效等离子体改性处理后的PET膜可实现贴壁细胞的高贴附率，较未经处理的PET膜细胞贴附率增长至2倍以上，只经过等离子体亲水处理的PET膜由于其表面只做过亲水处理，虽然较未经处理的PET膜细胞贴附率也有一定的增长，但是还是稍微低于长效等离子体改性处理后的PET膜细胞贴附率，而且随着接种时间的延长贴附率会逐渐降低，无法维持在高水平。
因此，长效等离子体改性处理后的PET膜不仅显著提高膜细胞的贴附率，而且贴附率具有长效稳定性，使细胞生产达到质和量的双重提升。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种促进细胞贴壁的长效表面改性载体，其特征在于，所述长效表面改性载体的原料采用材质为PET、结构为纵横交错设置的膜网支架立体结构的多层纤维卷膜，PET膜经过等离子体方法对表面进行亲水处理，再经过接枝工艺对表面进行二次亲水改性处理，形成具有长效表面改性载体；
长效表面改性载体的制备方法具体包括如下步骤：
预处理：PET膜经过乙醇和丙酮清洗三次后置于烘干箱内80℃烘干15min，干燥后的PET膜平铺在两电极之间的绝缘玻璃板上，置于电极辉光放电中心的位置活化30min后置于真空袋中保存备用；
等离子体亲水处理：采用非聚合性气体处理从真空袋中取出PET膜，使其表面生成化学活性点，通过等离子体放电在材料表面形成自由基，引发单体在PET膜表面聚合，发生亲水化，亲水化后置于真空袋中保存备用；
二次亲水改性处理：对等离子体亲水处后的PET薄膜进行以DETA作为改性剂的接枝溶液的接枝工艺；
等离子体亲水处理中，等离子体放电通过等离子体电晕处理设备完成；
等离子放电电晕处理设备中充有非聚合性气体，其内部还设有过料辊、电极组、接地的电晕辊，电极组连接有高压高频电源，其与电晕辊之间的间隙设为2-3mm，电晕辊的两侧分别设有一个过料辊，未经处理的PET膜依次绕过过料辊、电晕辊以及过料辊，当电极组被通电时，电晕辊被电极组施加高频、高压电，产生高频、高压放电，对经过电晕辊的PET膜进行冲击处理。
2.根据权利要求1所述的促进细胞贴壁的长效表面改性载体，其特征在于，等离子放电电晕处理设备连通有臭氧排风系统，臭氧排风系统用于处理放电时产生的臭氧。
3.根据权利要求1所述的促进细胞贴壁的长效表面改性载体，其特征在于，二次亲水改性处理的具体过程中为：预先将配置好的DETA接枝溶液置于恒温水浴锅内37℃加热保温，将等离子体亲水处理过后的PET膜从真空袋取出并浸润于DETA接枝溶液中，接枝后用蒸馏水超声清洗，洗涤三次后干燥。
4.根据权利要求3所述的促进细胞贴壁的长效表面改性载体，其特征在于，PET膜浸润于DETA接枝溶液中的DETA接枝活化时间为5min。
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