CN114957759A - 一种核壳结构微载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核壳结构微载体，由内部核区和壳区构成；所述内部核区为海藻酸钙凝胶微球；所述壳区为具有细胞黏附位点、力学性能可调的天然大分子；所述天然大分子在所述海藻酸钙凝胶微球的表面进行交联形成涂层并交联，在所述海藻酸钙凝胶微球的外部形成一层凝胶外壳。采用本发明的技术方案，与常规的微载体相比，根据油包水乳液和水凝胶交联的原理，制备过程中通过管道组合、管口直径和流速控制，以及涂层交联强度的控制的方法，制备得到具有单一分散性和促进细胞粘附/增殖的海藻酸钙凝胶微球‑天然大分子结构的核壳结构微载体，细胞可以在核壳结构微载体上实现“球转球”行为，并有效将细胞的指数增长周期从第5天延长至第7天。

Description

一种核壳结构微载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞扩增领域，具体涉及一种核壳结构微载体及其制备方法。
背景技术
细胞微载体是一种能够给贴壁细胞附着和生长提供支持的三维结构的微米级颗粒，与传统的二维培养相比，细胞微载体可以实现短时间内细胞大量增殖的同时保持其特异形态及表型。然而，目前微载体在科学研究及临床应用中仍然存在诸多不足，如微载体的粒径分布不均一，无法做到精确可控；再如针对不同类型的细胞，其生长基质所需的力学强度大小不同，但是现有的微载体无法根据不同细胞的生长需要有针对性地调整其力学性能。
壳核结构微球一般指粒径在微米尺度范围内，且由不同材料构成壳层与内核结构的复合球形颗粒。壳核结构微球尺寸小且具有多功能层，近年来被广泛应用于药物载体、食品化工、医学诊断等领域。通过设计壳核结构微球的组成、结构、尺寸等参数，可以实现对其功能的优化调控。例如，通过改变壳核载药微球的壳层的聚合度、厚度、孔隙率等，可调节药物的缓释速率；通过分别采用不同亲疏水性的壳核材料，可以实现亲水活性物质与疏水活性物质的协同负载，克服了传统匀质实心微球无法同时负载不同亲疏水性物质的缺点；通过采用可响应特定外界刺激的壳层材料，能实现活性物质对光、电、声、磁、温度等信号的响应性释放。微球的传统制备方法主要有乳化法、喷雾干燥法、超临界CO2法等，制备方法的不同导致制得的微载体的性能存在差异，包括形貌、内部结构、细胞粘附率等，而这些性能的差异决定所得微载体是否能够有效促进细胞粘附/增殖以及更进一步的应用，而且这些方法制备的壳核结构微球大多分散性较差，会影响壳核结构微球内部活性物质的精确负载与释放。所以对微载体制备方法的选择和优化至关重要。需要强调的是微球的直径越均一，越能准确评估细胞对它们的反应。此外，核壳结构微载体相比单一组分微载体功能更加完备，能够精准简便地调控其壳区的力学性能，从而使微载体能促进最初的细胞粘附或是加强预期细胞功能。
海藻酸钙凝胶因其制备简易和良好的生物相容性，成为研究最多的生物凝胶之一。高稳定性核-壳结构聚合物微容器通常是中空的微囊或微球，因不同制备方法具有不同的内腔、壳层结构、透过性能和表面性能，可实现对药物、酶、细胞或其他生物活性分子的有效保护和控制释放，显示出了诱人前景。中国发明专利CN101857698A公开了一种核壳结构的聚苯乙烯/海藻酸钙复合凝胶微球及其制备方法，所制备的复合凝胶微球在经溶剂进一步溶解除去内核后可得到中空的海藻酸钙微球，该中空微球可作为一种微米级的亲水性化学反应器及药物、酶、细胞或其他生物活性分子的载体。采用该方法制备的核壳结构的聚苯乙烯/海藻酸钙复合凝胶微球是经溶剂进一步溶解除去内核后可得到中空的海藻酸钙微球，均一性和分散性较差。中国发明专利CN111569798A公开了一种可降解核壳式氧化海藻酸钙凝胶微球及其制备方法和应用，基于微流控进行可降解核壳式氧化海藻酸钙凝胶微球的制备，将内油相流体、水相流体和外油相流体形成油/水/油双重乳液液滴，再在油/水/油双重乳液液滴的下游引入含有机酸的酸性油相流体，油/水/油双重乳液液滴的水相中的盐酸钙纳米颗粒迅速溶解并释放游离钙离子，引发水相中的氧化海藻酸钠与钙离子迅速交联形成凝胶状的氧化海藻酸钙壳层，得到可降解核壳式氧化海藻酸钙凝胶微球，该制备方法得到的可降解核壳式氧化海藻酸钙凝胶微球解决了现有技术中的均一和分散性的问题。但是采用该方法制备的核壳式氧化海藻酸钙凝胶微球与现有技术其它细胞微载体一样无法根据不同细胞的生长需要有针对性地调整其力学性能。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种核壳结构微载体，可用于细胞扩增及组织再生支架材料。本发明优选符合生产需求、同时具有生物相容性的海藻酸盐，和具有细胞附着位点、力学性能可调的天然大分子材料，并通过合理的组分配比，使核壳结构微载体能促进细胞粘附/增殖，实现细胞的扩增。
本发明的另一目的在于提供核壳结构复合微载体的制备方法。具体的，利用油包水乳液和水凝胶交联的原理，通过特定管道组合、管道尺寸来控制乳液形成和水凝胶交联，并进行外部涂层的方法，使核壳结构微载体具备单一分散性、清晰分明的核壳结构。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案是：
一种核壳结构微载体，由内部核区和壳区构成；所述内部核区为海藻酸钙凝胶微球；所述壳区为具有细胞黏附位点、力学性能可调的天然大分子；
所述天然大分子在所述海藻酸钙凝胶微球的表面进行外部涂层，在所述海藻酸钙凝胶微球的外部形成一层凝胶外壳，形成海藻酸钙凝胶微球-天然大分子复合结构的、随细胞的生长调整力学性能的所述核壳结构微载体。
进一步地，所述海藻酸钙凝胶微球占所述核壳结构微载体(干重)质量百分比为60～90％；所述天然大分子占所述核壳结构微载体(干重)质量百分比为10～40％。
进一步地，所述海藻酸钠中的古罗糖醛酸含量大于60％。
进一步地，所述天然大分子选自胶原、明胶、丝素蛋白中的至少一种。
本发明还提供了上述的核壳结构微载体的制备方法，包括利用油包水乳液和水凝胶交联原理，通过特定管道组合、管道尺寸来控制乳液形成和水凝胶交联，并进行外部涂层；具体包括如下步骤：
步骤一，取海藻酸钠与乙二胺四乙酸二钠钙(Ca-EDTA)溶于水中，所得溶液作为分散相W；
步骤二，取亲油性表面活性剂溶于油性溶剂，所得溶液作为连续相O；
步骤三，取亲油性表面活性剂、冰乙酸溶于油性溶剂，所得溶液作为预凝胶相P；
步骤四，取亲水性表面活性剂、氯化钙溶于去离子水，所得溶液作为收集液Wo；
步骤五，使所述分散相W、所述连续相O与所述预凝胶相P分别通过自组装形成微通道，得到预凝胶的海藻酸钙微球；
步骤六，将步骤五得到的所述预凝胶的海藻酸钙微球在搅拌的条件下接收于所述收集液Wo中，洗涤后得到所述海藻酸钙凝胶微球；
步骤七，取天然大分子溶于去离子水中,所得溶液作为壳区溶液C；
步骤八，步骤六得到的海藻酸钙凝胶微球浸于所述壳区溶液C中，洗涤后使用化学交联剂进行交联，洗涤后冷冻干燥得到所述核壳结构微载体。
进一步地，通过调控所述分散相W、所述连续相O的流量，来调控核壳结构微载体的尺寸；所述分散相W的流量为0.1mL/h～0.8mL/h，所述连续相O的流量为1mL/h～10mL/h，所述预凝胶相P的流量为10～20mL/h。
进一步地，通过所述壳区溶液C的浓度大小，来调控壳区的力学强度；所述壳区溶液C的浓度为0.5～3wt％。
进一步地，所述分散相W中，Ca-EDTA的浓度为30～80mM，海藻酸钠的浓度为0.2～1.5wt％；所述预凝胶相P中，乙酸的浓度为0.5～3wt％；所述收集液Wo中，氯化钙的浓度为1～10wt％。
进一步地，所述化学交联剂选自京尼平、戊二醛、甲醛中的至少一种；所述化学交联剂的浓度为0.5～4wt％。
进一步地，步骤二和步骤三种，所述亲油性表面活性剂选自司盘85、司盘83、司盘80中的任一种或多种；所述亲油表面活性剂的浓度分别为1～4wt％；步骤四中，所述亲水性表面活性剂选自吐温80、吐温60、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的至少一种；所述亲水性表面活性剂的浓度为1～4wt％。
利用微流体间的剪切力及表面张力，制备出的海藻酸微乳液滴粒径均一，再将均一的液滴与预凝胶相P中的乙酸接触，液滴内部的Ca-EDTA遇酸释放Ca2+，从内部开始与海藻酸钠交联，形成海藻酸钙预凝胶微球；步骤六中海藻酸钙预凝胶微球在搅拌的作用下穿破油层与氯化钙接触，Ca2+从外部与海藻酸钠交联，内外钙源双向交联形成粒径、结构均一的海藻酸钙凝胶微球；再将其与天然大分子采用涂层并交联的方式，在海藻酸钙凝胶微球外部形成一层具有细胞黏附位点、且力学强度可调的凝胶外壳，形成了核壳结构微载体，从而使得制得的核壳结构微载体大小均匀一致、力学强度可调，显著优于现有技术的方法。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.采用本发明的技术方案，与常规的微载体相比，根据油包水乳液和水凝胶交联的原理，制备过程中通过管道组合、管口直径和流速控制，以及涂层交联强度的控制的方法，制备得到具有单一分散性和促进细胞粘附/增殖的海藻酸钙凝胶微球-天然大分子结构的核壳结构微载体，细胞可以在核壳结构微载体上实现“球转球”行为，并有效将细胞的指数增长周期从第5天延长至第7天。
2.采用本发明的技术方案，制备的海藻酸钙凝胶微球外部形成一层具有细胞黏附位点、且力学强度可调的凝胶外壳，形成了核壳结构微载体，制得的核壳结构微载体大小均匀一致、力学强度可调，显著优于现有技术的方法。
附图说明
图1为本发明中实施例的微通道装置结构示意图。
图2为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体的光学显微镜图。
图3为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体的尺寸分布图。
图4为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体的扫描电镜图。
图5为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体的溶胀图。
图6为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体上人脐带间充质干细胞的CCK8测试图。
图7为本发明中实施例的海藻酸钙-明胶核壳结构微载体上人脐带间充质干细胞细胞转移实验中的细胞生长曲线。
图8为本发明中对比例的海藻酸钙水凝胶微球的光学显微镜图。
图9为本发明中对比例的海藻酸钙水凝胶微球的尺寸分布图。
图10为本发明中对比例的海藻酸钙水凝胶微球的扫描电镜图。
图11为本发明中对比例的海藻酸钙水凝胶微球的溶胀图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种海藻酸钙-明胶核壳结构微载体(即，AG核壳结构微载体)，包括内部核区和壳区，其中，以质量百分比计，内部核区的海藻酸钙占AG核壳结构微载体(干重)的质量百分比为60％～90％；壳区的天然大分子占占AG核壳结构微载体(干重)的质量百分比为40％～10％。
进一步地，内部核区的海藻酸钠的古罗糖醛酸含量大于60％。壳区的具有细胞黏附位点、力学性能可调的天然大分子选自但不限于胶原、明胶、丝素蛋白等。
本发明利用油包水乳液和水凝胶交联原理，通过特定的管道组合和特定的管道尺寸来控制乳液形成和水凝胶交联，并进行外部涂层；具体包括如下步骤：
步骤一，取海藻酸钠与乙二胺四乙酸二钠钙(Ca-EDTA)溶于水中，所得溶液作为分散相W；分散相W中Ca-EDTA的浓度为30mM～80mM，海藻酸钠的浓度为0.2wt％～1.5wt％。
步骤二，取亲油性表面活性剂溶于油性溶剂，所得溶液作为连续相O；
步骤三，取亲油性表面活性剂、冰乙酸溶于油性溶剂，所得溶液作为预凝胶相P。
其中，上述步骤二和步骤三中，油性溶剂选自但不限于油酸、液体石蜡、大豆油等。预凝胶相P中冰乙酸的浓度为0.5wt％～3wt％，优选地为2wt％。
上述步骤二和步骤三中，亲油性表面活性剂选自但不限于：司盘85、司盘83、司盘80等；浓度为1wt％～4wt％，优选地为2wt％。
步骤四，取亲水性表面活性剂、氯化钙溶于去离子水，所得溶液作为收集液Wo。收集液Wo中氯化钙的浓度为1wt％～10wt％，优选地为2wt％。
亲水性表面活性剂选自但不限于吐温80、吐温60、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；亲水性表面活性剂的浓度为1wt％～4wt％，优选地，为2wt％。
步骤五，使分散相W、连续相O与预凝胶相P分别进入特定的管道组合的微通道进行自组装得到预凝胶的海藻酸钙微球；
步骤六，将步骤五得到的预凝胶的海藻酸钙微球在搅拌的条件下接收于所述收集液Wo中，洗涤后得到所述海藻酸钙凝胶微球；
步骤七，取天然大分子溶于去离子水中,所得溶液作为壳区溶液C；溶液C的浓度为0.5wt％～3wt％。
步骤八，步骤六得到的海藻酸钙凝胶微球浸于所述壳区溶液C中，洗涤后使用化学交联剂进行交联，洗涤后冷冻干燥得到所述核壳结构微载体。化学交联剂选自京尼平、戊二醛、甲醛中的至少一种；浓度为0.5～4wt％。
特定的管道组合包括但不限于：Y型、T型、同向流动型、流动聚焦型等，均可实现本发明的技术方案。本发明优选用的特管道组合为微通道装置，微通道装置的结构见图1。微通道装置的制作方法参见中国发明专利CN111569798A。
参阅图1，微通道装置包括分散相W的通道Ⅰ、连续相O的通道Ⅱ、预凝胶相P的通道Ⅲ和主通道Ⅳ。通道Ⅰ、通道Ⅱ、通道Ⅲ和主通道Ⅳ为均毛细管微通道。通道Ⅰ和和主通道Ⅳ为锥形毛细管，通道Ⅱ和通道Ⅲ呈管状，通道Ⅱ套设于通道Ⅰ的外部，与通道Ⅰ之间的夹层形成通道Ⅱ的微通道。通道Ⅲ套设于主通道Ⅳ的外部，与通道Ⅳ之间的夹层形成通道Ⅲ的微通道。通道Ⅰ的锥形毛细管的尖端插设于主通道Ⅳ的锥形毛细管的尖端内并保留空隙，分散性W、连续相O和预凝胶相P分别通过通道Ⅰ、通道Ⅱ和进入通道Ⅲ主通道Ⅳ内自行组组装形成预凝胶的海藻酸钙微球。
其中，分散相O和连续相的通道的直径来调控核壳结构微载体的尺寸。通道Ⅰ的内径为100μm～400μm，优选地，为150μm。通道Ⅱ的外径为300μm～800μm，优选地，为550μm。
通过调控分散相W、连续相O的流量，来调控核壳结构微载体的尺寸。
分散相W注入微通道装置的通道Ⅰ，注射速率为0.1mL/h～0.8mL/h，优选地，为0.6mL/h；连续相O注入流控装置的通道Ⅱ，注射速率为1mL/h～10mL/h，优选地，为6mL/h；预凝胶相P注入微流控装置的通道Ⅲ，注射速率为10～20mL/h，优选地，为12mL/h。
本发明还可以通过设定壳区溶液C的浓度进行调控壳区的力学强度，即通过溶液C的浓度高低来调控壳区的力学强度大小。优选地，壳区溶液C浓度为0.5wt％～3wt％，更优选地，为2wt％。
实施例
本实施例提供了一种海藻酸钙-明胶核壳结构微载体的制备方法，具体制备的步骤包括：
1.溶液配置：
将Ca-EDTA溶于去离子水中形成50mM的Ca-EDTA水溶液取10mLCa-EDTA水溶液，并加入0.1g海藻酸钠搅拌溶解，得到1wt％海藻酸钠溶液，作为分散相W。
在30mL油酸中加入0.6mL司盘80，作为连续相O。
在30mL油酸中加入0.6mL司盘80和0.6mL冰乙酸，作为预凝胶相P。
配制100mL的2wt％氯化钙水溶液，加入2mL吐温80，作为收集液Wo。
将明胶溶于500mL去离子水，获得2wt％的明胶溶液，作为壳区溶液C。
2.海藻酸钙凝胶微球的制备：
分散相W注入微通道装置的通道Ⅰ中，通道Ⅰ的内径为150μm，注射速率为0.6mL/h；连续相O注入流控装置的通道Ⅱ中，通道Ⅱ的外径为550μm，注射速率为6mL/h；预凝胶相P注入微流控装置的通道Ⅲ中，注射速率为12mL/h。分散相W和连续相O通过在微通道内自组装，利用流体的剪切作用及Ca2+的交联作用，获得尺寸均一海藻酸钙凝胶微球。
3.AG核壳结构微载体的制备：
将海藻酸钙凝胶微球浸入明胶壳区溶液C中12小时，用去离子水洗涤后使用2％戊二醛交联10分钟，使明胶形成涂层于海藻酸钙凝胶微球的外表面，用去离子水洗涤后冷冻干燥24小时后得到AG核壳结构微载体。
4.细胞转移实验：
24孔板的每个孔中加入5mg的AG核壳结构微载体，依次浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、PBS缓冲液浸泡并紫外照射12小时灭菌并水合，然后将人类脐带间充质干细胞(HUMSCs)以3×104个细胞/孔的密度接种到微载体上，将孔板放入培养箱中(5％CO2，37℃)，每2天更换一次生长培养基。
当HUMSCs培养1、3、5天后，通过Cell Counting Kit-8(CCK8)对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个样品的吸光度(ABS)值。
为了研究细胞在AG核壳结构微载体上的转移能力，在培养第五天作为老微载体，并以新鲜微载体：老微载体＝1：1的比例再老微载体内加入新鲜微载体，通过CCK8测量每天的增殖水平并绘制生长曲线，以未添加新鲜微载体的老微载体的培养方案为对照组。
经扫描电子显微镜与光学显微镜观察，湿态AG核壳结构微载体直径约为235μm，微载体表现为透明状态(如图2)，尺寸呈现高度的单分散性(如图3)；干态微载体呈现出粗糙表面(如图4)，但经过水合过程(浸泡在PBS缓冲液中)后仍可恢复原貌(如图5)。
CCK8结果可说明，AG核壳结构微载体对细胞增殖具有显著的促进作用(如图6)，培养5天后，细胞的数量是培养1天的4.72倍。
通过上述细胞转移实验可见，细胞可以在AG核壳结构微载体上实现“球转球”行为，并有效将细胞的指数增长周期从第5天延长至第7天。
本发明中，核壳结构微载体的壳区可以由不同种类的天然大分子构成，亦可调整壳区力学强度以作为多种贴壁型细胞的生长载体。
对比例
本对比例1为制备海藻酸钙水凝胶微球，具体步骤为；
1.溶液配置：将Ca-EDTA溶于去离子水中形成50mM的Ca-EDTA水溶液，加入海藻酸钠搅拌溶解，得到1wt％海藻酸钠溶液，作为分散相W；在油酸中加入2wt％司盘80，作为连续相O；在油酸中加入2wt％司盘80和2wt％冰乙酸，作为预凝胶相P。
2.海藻酸钙凝胶微球的制备：分散相W注入上述实施例中的微通道装置的通道Ⅰ中，通道的内径设置为150μm，注射速率为0.6mL/h；连续相O注入通道Ⅱ中，通道的外径设置为550μm，注射速率为6mL/h；预凝胶相P注入微流控装置的通道Ⅲ，注射速率为12mL/h。
3.AG核壳结构微载体的制备：利用流体的剪切作用及Ca2+的交联作用，获得尺寸均一海藻酸钙水凝胶微球。
4.细胞转移实验：
24孔板的每个孔中加入5mg的海藻酸钙水凝胶微球，依次浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、PBS缓冲液浸泡并紫外照射12小时灭菌并水合，然后将人类脐带间充质干细胞(HUMSCs)以3×104个细胞/孔的密度接种到微球上，将孔板放入培养箱中(5％CO2，37℃)，每2天更换一次生长培养基。
当HUMSCs培养1、3、5天后，通过Cell Counting Kit-8(CCK8)对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个样品的吸光度(ABS)值。
经扫描电子显微镜与光学显微镜观察，湿态海藻酸钙微球直径约为271μm，微球表现为透明状态(如图8)，尺寸呈现高度的单分散性(如图9)；干态微载体呈现出坍塌的“葡萄干”形貌(如图10)，经过水合过程(浸泡在PBS缓冲液中)后无法恢复原貌(如图11)。
CCK8实验结果显示无活细胞，说明海藻酸钙水凝不能支持细胞的黏附与增殖。
通过上述实施例和对照例的可见，采用本发明的技术方案能够获得核壳结构微载体大小均匀一致、力学强度可调的，海藻酸钙凝胶微球-天然高分子复合结构的核壳结构微载体，
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种核壳结构微载体，其特征在于，由内部核区和壳区构成；所述内部核区为海藻酸钙凝胶微球；所述壳区为具有细胞黏附位点、力学性能可调的天然大分子；
所述天然大分子在所述海藻酸钙凝胶微球的表面进行交联形成外部涂层，在所述海藻酸钙凝胶微球的外部形成一层凝胶外壳，形成海藻酸钙凝胶微球-天然大分子复合结构的、随细胞的生长调整力学性能的所述核壳结构微载体。
2.根据权利要求1所述的核壳结构微载体，其特征在于，所述海藻酸钙凝胶微球占所述核壳结构微载体(干重)质量百分比为60～90％；所述天然大分子占所述核壳结构微载体(干重)质量百分比为10～40％。
3.根据权利要求1或2所述的核壳结构微载体，其特征在于，所述海藻酸钠中的古罗糖醛酸含量大于60％。
4.根据权利要求1或2所述的核壳结构微载体，其特征在于，所述天然大分子选自胶原、明胶、丝素蛋白中的至少一种。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，包括利用油包水乳液和水凝胶交联原理，通过特定管道组合、管道尺寸来控制乳液形成和水凝胶交联，并进行外部涂层；具体包括如下步骤：
步骤一，取海藻酸钠与乙二胺四乙酸二钠钙(Ca-EDTA)溶于水中，所得溶液作为分散相W；
步骤二，取亲油性表面活性剂溶于油性溶剂，所得溶液作为连续相O；
步骤三，取亲油性表面活性剂、冰乙酸溶于油性溶剂，所得溶液作为预凝胶相P；
步骤四，取亲水性表面活性剂、氯化钙溶于去离子水，所得溶液作为收集液Wo；
步骤五，使所述分散相W、所述连续相O与所述预凝胶相P分别通过自组装形成微通道，得到预凝胶的海藻酸钙微球；
步骤六，将步骤五得到的所述预凝胶的海藻酸钙微球在搅拌的条件下接收于所述收集液Wo中，洗涤后得到所述海藻酸钙凝胶微球；
步骤七，取天然大分子溶于去离子水中,所得溶液作为壳区溶液C；
步骤八，步骤六得到的海藻酸钙凝胶微球浸于所述壳区溶液C中，洗涤后使用化学交联剂进行交联，洗涤后冷冻干燥得到所述核壳结构微载体。
6.根据权利要求5所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述分散相W中，Ca-EDTA的浓度为30～80mM，海藻酸钠的浓度为0.2～1.5wt％；所述预凝胶相P中，乙酸的浓度为0.5～3wt％；所述收集液Wo中，氯化钙的浓度为1～10wt％。
7.根据权利要求6所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，步骤二和步骤三中，所述亲油性表面活性剂选自司盘85、司盘83、司盘80中的任一种或多种；步骤四中，所述亲水性表面活性剂选自吐温80、吐温60、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，步骤五中，通过调控所述分散相W、所述连续相O的流量，来调控核壳结构微载体的尺寸；所述分散相W的流量为0.1mL/h～0.8mL/h，所述连续相O的流量为1mL/h～10mL/h，所述预凝胶相P的流量为10～20mL/h。
9.根据权利要求8所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，步骤七中，所述壳区溶液C的浓度为0.5～3wt％；通过所述壳区溶液C的浓度大小，来调控壳区的力学强度。
10.根据权利要求5-9任一项所述的核壳结构微载体的制备方法，其特征在于，步骤八中，所述化学交联剂选自京尼平、戊二醛、甲醛中的至少一种；浓度为0.5～4wt％。
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