JP2003172878A - 試料を結像するための顕微鏡対物レンズ、顕微鏡および方法 - Google Patents

試料を結像するための顕微鏡対物レンズ、顕微鏡および方法

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JP2003172878A
JP2003172878A JP2002349926A JP2002349926A JP2003172878A JP 2003172878 A JP2003172878 A JP 2003172878A JP 2002349926 A JP2002349926 A JP 2002349926A JP 2002349926 A JP2002349926 A JP 2002349926A JP 2003172878 A JP2003172878 A JP 2003172878A
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Johann Engelhardt
エンゲルハルト ヨハン
Rafael Storz
シュトルツ ラファエル
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Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Leica Microsystems CMS GmbH
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Abstract

(57)【要約】 【課題】構造がコンパクトで、光軸方向(z走査)の試
料の迅速なフォーカシングまたは迅速な走査を可能にす
る顕微鏡対物レンズを提供する。 【解決手段】対物レンズハウジングを備えると共に複数
のレンズを含む顕微鏡対物レンズが開示され、レンズ
は、フォーカシングするための対物レンズハウジングの
内部に、摺動可能に配置される。さらに、試料を結像す
るための顕微鏡および方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、対物レンズハウジ
ングを備えると共に複数のレンズを含む顕微鏡対物レン
ズに関する。
【0002】さらに本発明は、対物レンズハウジングを
備えると共に複数のレンズを含む顕微鏡対物レンズを有
する顕微鏡に関する。
【0003】さらに本発明は、試料を結像するための本
発明に関する。
【0004】
【従来の技術】顕微鏡検査では、試料または鮮明に結像
されべき試料の領域を対物レンズの焦点面に移動するこ
とが普通である。このため、試料テーブルに通常軸受け
される試料、あるいは対物レンズを光軸に沿って摺動す
ることができる。多くの顕微鏡には対物レンズレボルバ
が装備され、その中に複数の異なる対物レンズを格納す
ることができる。しばしば、レボルバ全体はフォーカシ
ングするために摺動可能に軸受けされる。オートフォー
カスを可能にするために、対物レンズあるいはレボルバ
または試料テーブルを摺動するためのモータが種々のシ
ステムに装備されている。
【0005】対物レンズレボルバと対物レンズとの間に
配置される顕微鏡対物レンズ位置決めシステムが公知で
ある。この顕微鏡対物レンズ位置決めシステムによっ
て、対物レンズをレボルバに対して光軸の方向に摺動す
ることが可能である。例えば、Firma Physik Instrumen
te は、このようなピエゾ制御のシステムを商業ベース
で提供している。
【0006】異なるカバーガラスの厚さを補正するため
の少なくとも1つの補正フレームを備える顕微鏡対物レ
ンズが開示されている(特許文献1参照)。補正フレー
ムは軸方向に摺動可能であり、同時に対物レンズの光軸
を中心にして回転可能である。これによって、補正フレ
ームのジャムが避けられる。
【0007】特にオブジェクト空間内の異なる厚さの平
行平面のプレート用の補正フレームを有する顕微鏡対物
レンズが開示され(特許文献2参照)、この場合、フロ
ントレンズおよびリヤレンズ群は可変の空間距離の結像
側に配置される。補正フレームは、像エラー補正のため
の空間距離の変更と同時に、焦点面の位置を補正するた
めの光学式システム全体の軸方向摺動が実施されるよう
に形成される。
【0008】電磁波をフォーカシングするための装置が
開示されている(特許文献3参照)。この装置は、互い
に垂直に位置する3つの方向に可動のホルダを含む。ホ
ルダを3つの方向に移動するための駆動ユニットが設け
られている。装置は、顕微鏡および共焦点の走査顕微鏡
内で使用することができる。
【0009】走査顕微鏡検査では、試料によって放射さ
れる反射光または蛍光を観察するために、試料は光線で
照明される。照明光線のフォーカスは、制御可能な偏光
装置を用いて、一般的に2つのミラーを傾斜することに
よってオブジェクト面で移動され、この場合偏光軸は通
常互いに垂直に位置するので、1つのミラーはx方向
に、他のミラーはy方向に変位される。ミラーの傾斜
は、例えば、検流計調節要素を用いて実施される。オブ
ジェクトから来る光の出力は、走査光線の位置に基づき
測定され、通常、調節要素には現在のミラー位置を算出
するためのセンサが装備される。
【0010】特に共焦点の走査顕微鏡検査では、オブジ
ェクトは光線のフォーカスにより3次元で走査される。
【0011】共焦点の走査顕微鏡は一般的に光源と、光
源の光が開口絞り、いわゆる励起絞りにフォーカシング
されるフォーカシング光学系と、光線スプリッタと、光
線制御のための偏光装置と、顕微鏡光学系と、検出絞り
と、検出光または蛍光を検出するための検出器とを含
む。照明光は、光線スプリッタを介して結合される。オ
ブジェクトから来る蛍光または反射光は、偏光装置を介
して光線スプリッタに戻り、それを通過し、次に検出絞
りにフォーカシングされるようにされ、検出絞りの後方
には検出器がある。フォーカス領域からは直接来ない検
出光は、他の光路を取り、検出絞りを通過せず、この結
果、オブジェクトの順次走査によって3次元の画像を得
られる点情報が獲得される。通常、3次元画像は層状の
画像データ取入れによって達成され、この場合、オブジ
ェクト上またはその中の走査光線の通路は理想的に波形
模様を描く。(y位置が一定の場合にx方向のラインを
走査し、次にx走査を停止し、またy調節毎に次の走査
すべきラインに揺動し、次にy位置が一定の場合にこの
ラインを負のx方向に走査する、等々)。層状的な画像
データ取入れを可能にするために、試料テーブルまたは
対物レンズは層の走査に従って摺動され、したがって次
の走査すべき層は対物レンズのフォーカス面に運ばれ
る。
【0012】オブジェクトプレートと、オブジェクトプ
レート用のホルダと、オブジェクトプレートをそれらの
水平位置に変更する調節装置とを有する顕微鏡用の微細
フォーカシングテーブルは公知である(特許文献4参
照。)。微細フォーカシングテーブルは、より簡単な構
造でオブジェクトプレートの平行昇降を実現するため
に、好ましくはオブジェクトテーブルまたは顕微鏡の上
に固定するための取付け領域と、オブジェクトプレート
用の結合領域(5)とをホルダが含み、また屈曲部を介
してヒンジ結合される平行アームが取付け領域と結合領
域との間に延在するように形成される。
【0013】レバー配列とレバー配列用の駆動部とを有
する構成部品を微細位置決めするための装置、特に対物
レンズまたは対物レンズレボルバを垂直に微細位置決め
するための装置は公知である(特許文献5参照)。装置
は、レバー配列が回転部に直接作用すること、構成部品
が回転部とフレキシブルに結合されること、および回転
部の回転との結合の意味における結合が、構成部品のた
めに、回転部の上のフレキシブルな結合部を回転するこ
とによって構成部品の位置を変更し、この場合構成部品
の往復運動を惹起する懸架を行うことを特徴とする。
【0014】対物レンズを有する手術用顕微鏡は公知で
ある(特許文献6参照)。対物レンズは2つの部材を含
み、その内の1つは焦点距離を変更するために摺動可能
である。
【0015】電気機械的位置決めユニットが、原子まで
の位置決め精度およびcm範囲までの位置決め距離によ
りオブジェクトを位置決めするための慣性駆動装置とし
て公知である(特許文献7参照)。位置決めユニット
は、電気的に制御可能な慣性運動を回転子の上に伝達す
るための少なくとも1つの好ましくは管状のピエゾ圧電
のアクチュエータを含む。この発明の対象は回転子であ
り、この回転子は、より大きな質量の少なくとも1つの
ユニット(質量ユニット)と、少なくとも1つのフレキ
シブルな曲げ可能ユニット(曲げユニット)から構成さ
れ、このため、摩擦結合の強さは回転子の1つまたは複
数の曲げユニットを介して調節自在であり、また回転子
の質量ユニットは位置決めユニットの大きな負荷能力に
貢献する。質量ユニットと位置決めユニットとのこの組
合せによって、より重いオブジェクトも位置決めし、ま
た工具として使用するために必要な力を及ぼすことがで
きる。
【0016】ディスクドライブ用のピエゾ圧電マイクロ
モータは公知である(特許文献8参照)。
【0017】光軸に沿って試料を走査するための、また
試料の上にフォーカシングするためのこの公知のシステ
ムは、移動される大きな質量のため必然的に動きが鈍
く、遅いという不都合を有する。さらに、レボルバと対
物レンズとの間に配置された装置は、光路(鏡胴長さ)
が著しく長くなるという不都合を有する。
【0018】
【特許文献1】ドイツ公開公報第43 23 721
A1号明細書
【特許文献2】ドイツ公開公報第37 35 324号
明細書
【特許文献3】米国特許第4,796,974号明細書
【特許文献4】ドイツ公開公報第196 50 392
A1号明細書
【特許文献5】ドイツ公開公報第199 24 709
A1号明細書
【特許文献6】ドイツ公開公報第31 05 018
A1号明細書
【特許文献7】ドイツ公開公報第44 40 758
A1号明細書
【特許文献8】米国特許第5,682,076号明細書
【0019】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、構造がコンパクトで、光軸方向(z走査)の試
料の迅速なフォーカシングまたは迅速な走査を可能にす
る顕微鏡対物レンズを提供することである。
【0020】上記課題は、すべてのレンズが対物レンズ
ハウジングの内部に、共通に動力式に摺動可能に配置さ
れることを特徴とする顕微鏡対物レンズによって解決さ
れる。
【0021】本発明のさらなる課題は、迅速なフォーカ
シング、特に光軸方向(z走査)の試料の迅速なオート
フォーカスまたは迅速な走査を可能にする顕微鏡を提供
することである。
【0022】上記課題は、すべてのレンズが対物レンズ
ハウジングの内部に、共通に動力式に摺動可能に配置さ
れることを特徴とする顕微鏡レンズによって解決され
る。
【0023】本発明のさらなる課題は、選択可能な走査
面における試料の迅速な結像または試料領域の迅速な結
像を可能にする方法を提供することである。
【0024】
【課題を解決するための手段】上記課題は、試料を結像
するための方法において、
【0025】・走査面を選択するステップと、
【0026】・対物レンズハウジングを備えると共に複
数のレンズを含む顕微鏡対物レンズと走査面とを調節す
るステップであって、少なくとも1つのレンズが対物レ
ンズハウジングの内部に、動力式に摺動可能に配置され
る、ステップと、
【0027】・調節された走査面の内部の試料を走査し
て、画像データを生成するステップと、を特徴とする方
法によって解決される。
【0028】本発明は、顕微鏡対物レンズを各々の顕微
鏡にはめ込み可能であるという利点を有する。本発明の
さらなる利点は、可動部の小さな質量によってz方向
(光軸に沿って)の試料の迅速な走査も、迅速なフォー
カシングも可能になることである。さらに、レボルバと
対物レンズとの間に取り付けられて、別の対物レンズレ
ボルバが位置決めできない程度に側方に張り出すシステ
ムとは対照的に、顕微鏡のレボルバ全体が利用可能であ
ることは本発明の特別な利点である。本発明のさらなる
利点は、対物レンズの簡単な交換が悪影響を受けないこ
とである。
【0029】好ましい実施態様では、すべてのレンズは
フォーカシングするために摺動可能に共通に配置され
る。他の態様では、複数のレンズが、フレーム内に共通
に配置される少なくとも1つのレンズ群に統合され、こ
の場合フレームは摺動可能である。好ましくは、略光軸
に沿った摺動の実施を保証する案内要素が設けられる。
【0030】特に好ましい実施態様では、動力式の摺動
を行う駆動ユニットが設けられる。駆動ユニットは、好
ましくは少なくとも1つのピエゾ素子を含む。駆動ユニ
ットは、検流計またはモータまたはピエゾモータも含む
ことができる。既述のドイツ公開公報第4440758
A1号から公知の電気機械的位置決めユニットを駆動ユ
ニットとして含む実施態様は、特にコンパクトである。
駆動ユニットは、例えば、誘導的、容量的にまたは負圧
吸引によっても摺動可能なレンズに作用することができ
る。
【0031】さらに、ギヤまたはねじ歯車を設けること
ができる。好ましくは、駆動要素によって行使される動
力と反対方向の戻り力を及ぼすばねが設けられる。これ
によって、好適に再現性が向上し、例えばねじの遊びに
よる不精確さが補正される。
【0032】別の実施態様では、摺動可能なレンズの現
在の位置を算出する位置検出器が設けられる。好ましく
は、位置検出器は、制御システムに転送可能な電気信号
を生成する。位置検出器は広く知られている。容量的ま
たは光学的距離測定器、ガラススケールあるいはリミッ
トスイッチの使用のみが完全に模範的であるとされる。
【0033】対物レンズハウジングを備えると共に複数
のレンズを含み、またフォーカシングするための対物レ
ンズハウジングの内部に少なくとも1つのレンズが摺動
可能に配置される顕微鏡対物レンズは、本発明によれ
ば、顕微鏡内部の作動位置に取り付け可能である。
【0034】顕微鏡の特別な態様は、対物レンズハウジ
ングが駆動ユニットを包囲するように形成される。他の
実施態様では、レボルバは駆動ユニットを含む。また、
レボルバが複数の駆動ユニットを含み、この場合、レボ
ルバ内にねじ込まれた各対物レンズ用に専用の駆動ユニ
ットを設けるようにすることもできる。他の別の実施態
様では、対物レンズ全体またはレボルバ全体は、粗フォ
ーカッシングのために公知の方法で摺動可能である。こ
の別形態では、対物レンズハウジングの内部で摺動可能
なレンズは微細フォーカッシングのために使用される。
【0035】好ましくは、顕微鏡は、少なくとも1つの
レンズの位置を把握して、駆動ユニットを制御する制御
部にこの情報を伝送する位置検出器を含む。特に好まし
い別形態では、制御部はオートフォーカスシステムを含
む。好ましくは、顕微鏡は走査顕微鏡として、特に共焦
点の走査顕微鏡として、あるいは逆畳み込み顕微鏡とし
て形成される。走査顕微鏡では、z方向の走査は、x方
向およびy方向の走査を行う走査機構と同期化されるこ
とが好ましい。好ましい実施態様では、任意の空間位置
の走査断面が可能である。さらに、同期化は、光学系、
例えば画像平坦化エラーのように、特に対物レンズの結
像エラーが調節されるように設計することができる。こ
のことは、例えば、画像エッジ領域の制御により、画像
中心以外の他のz位置を調節することによって行われ
る。
【0036】別形態では、方法は、さらなる走査面を選
択するステップと、顕微鏡対物レンズとさらなる走査面
とを調節するステップと、調節されたさらなる走査面の
内部の試料を走査して、さらなる画像データを生成する
ステップと、画像データとさらなる画像データとから画
像積み重ねを生成するステップとを含む。
【0037】ある態様では、走査は画素に関する。他の
別形態では、走査はラインに関する。好ましい実施態様
では、方法は面の走査を含み、この場合、面は空間内の
任意の位置を有することができるが、x−y断面である
ことが好ましい。本発明による方法によって、有利に、
x−z断面またはy−z断面を迅速に記録することがで
きる。
【0038】好ましくは、本方法は、走査顕微鏡、特に
共焦点の走査顕微鏡によって実施することができる。本
方法は、逆畳み込み顕微鏡により実施することができ
る。
【0039】特に好ましい実施態様では、従来の多くの
対物レンズの既存の保護機構が本発明による方法で利用
され、この機構では、オブジェクトの思いがけない接触
の場合、駆動ユニットによりレンズを保護機構に直接摺
動することによって、少なくともフロントレンズまたは
レンズ群全体がばね力に対抗して後方に沈められる。
【0040】
【発明の実施の形態】図面には、本発明の対象が概略的
に示されており、図面を参照して以下に説明するが、等
しく機能する要素には同一の参照番号が付されている。
【0041】図1は、レボルバ3にねじ込まれる顕微鏡
対物レンズ1を示している。対物レンズのハウジング5
を備える顕微鏡対物レンズ1の内部において、レンズ
7、9、11、13のすべては、光軸29の方向に摺動
可能なスリーブ15内に把持される。スリーブの摺動
は、対物レンズのハウジング内部に配置される駆動ユニ
ット17によって行われる。駆動ユニット17はピエゾ
モータ19として形成されている。コイルスプリング2
1は、破線で示した端部位置にスリーブ15を押す。駆
動ユニット17は、ばね力と反対方向の力を及ぼすの
で、コイルスプリング21はスリーブ15の摺動によっ
て圧縮される。対物レンズのハウジング5に位置検出器
23が取り付けられ、この検出器は、スリーブの現在の
位置を検出して、電気信号形態の情報を、顕微鏡対物レ
ンズ1とレボルバとの間の接点25を介して、図示して
いない制御部に伝送する。制御信号を駆動ユニットに伝
送するため、レボルバと顕微鏡対物レンズ1との間に別
の接点27が設けられる。双方向矢印31は光軸29の
方向のフォーカシング運動を示している。レボルバ3を
揺動することによって、さらなる改造を必要とすること
なく、第2の顕微鏡対物レンズ33または第3の顕微鏡
対物レンズ35を作動位置に取り付けることが可能であ
る。
【0042】図2はレボルバ3内の顕微鏡対物レンズ1
を示している。この態様では、検流計37として形成さ
れる駆動ユニット17は、レボルバ3に配置され、また
レンズ7、9、11、13を把持するスリーブ15の摺
動が、前記駆動ユニット17によってプッシュロッド3
9を介して行われる。駆動ユニット17は、第2または
第3の顕微鏡対物レンズ33、35のフォーカシング機
構または走査機構の駆動ユニット17としても機能する
ように形成される。コイルスプリング21は、破線で示
した端部位置にスリーブ15を押す。駆動ユニット17
は、ばね力に対し反対方向の力を及ぼすので、コイルス
プリング21はスリーブ15の摺動によって引き離され
る。図1に示した顕微鏡対物レンズ1と同様に、位置セ
ンサ23は顕微鏡対物レンズ1内に取り付けられる。し
かし、スリーブの位置をプッシュロッドの位置から誘導
することも可能である。双方向矢印31は光軸29の方
向のフォーカシング運動または走査運動を示している。
【0043】図3は、共焦点の走査顕微鏡が形成される
顕微鏡41を概略的に示している。顕微鏡41は、照明
光線45を放射するレーザ43を含む。励起絞り47を
通過した後、照明光線45は、光線スプリッタ49か
ら、カルダン式に吊設された走査ミラー53を含む走査
モジュール51に反射され、前記走査ミラーは、図示し
ていない複数の光学系を通し、また顕微鏡対物レンズ1
を通して試料55の上方にまたはそれを通して照明光線
45を案内する。顕微鏡対物レンズ1は、第2の顕微鏡
対物レンズ33と第3の顕微鏡対物レンズとを格納位置
に担持するレボルバ3にねじ込まれる。試料55が透明
でない場合、照明光線45は試料表面の上方に案内され
る。試料55が生物学的(プレパラート)であるかまた
は試料55が透明である場合、照明光線45は試料55
を通して案内される。試料55のz位置を粗調節するた
めに試料テーブル57があり、そのテーブル上に試料5
5がz方向に摺動可能に位置する。摺動は、回転ボタン
59を介して精密ギヤによって機械的に行われる。試料
の第1のx−y断面の走査後、PC63として形成され
る制御部61は、次に走査すべきx−y断面と顕微鏡対
物レンズ1とを調節する。顕微鏡対物レンズ1の内部に
は、図示していないレンズのすべてが、光軸方向に摺動
可能なスリーブに把持される。スリーブの摺動は、対物
レンズのハウジング内部に配置される図示していない駆
動ユニットによって行われる。駆動ユニットはピエゾモ
ータとして形成され、PC63によって制御される。こ
のことは、試料55の様々な断面が、照明光線45のフ
ォーカスによって順次走査されることを意味する。次
に、事後の組立によって、試料55のそれぞれ1つの三
次元画像が形成される。試料55を起点とする検出光5
9は、顕微鏡対物レンズ1と図示していない別の光学系
と走査モジュール51とを通して、光線スプリッタ49
に戻り、光線スプリッタを通過し、またマルチバンド検
出器として形成される検出器67上の検出絞り65を通
過した後に命中する。試料55を起点とする検出光59
は、図では破線で示されている。検出器67では、試料
55を起点とする検出光59の出力に比例する電気的な
検出信号が生成され、PC63に転送される。検出信号
は、PC63において試料55の結像69に構成され、
また赤緑表示でディスプレイ71に出力される。走査面
を選択するため、または走査すべき画像の積み重ねを決
定するために、回転調整器を有する操作コンソール73
とキーボード75とが設けられる。
【0044】特定の実施態様に関し、本発明について説
明してきた。しかし、以降の特許請求の範囲の保護範囲
から逸脱することなしに、変更および修正を実施できる
ことが自明である。
【0045】
【発明の効果】本発明では、コンパクトな構造で、光軸
方向(z走査)の試料の迅速なフォーカシングまたは迅
速な走査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 レボルバ内の顕微鏡対物レンズである。
【図2】 レボルバ内の別の顕微鏡対物レンズである。
【図3】 共焦点の走査顕微鏡である。
【符号の説明】
1…顕微鏡対物レンズ 3…レボルバ 5…対物レンズハウジング 7…レンズ 9…レンズ 11…レンズ 13…レンズ 15…スリーブ 17…駆動ユニット 19…ピエゾモータ 21…コイルばね 23…位置検出器 25…接点 27…他の接点 29…光軸 31…二重矢印 33…第2の顕微鏡対物レンズ 35…第3の顕微鏡対物レンズ 37…検流計 39…プッシュロッド 41…顕微鏡 43…レーザ 45…照明光線 47…励起絞り 49…光線スプリッタ 51…走査モジュール 53…走査ミラー 55…試料 57…試料テーブル 61…ロータリボタン 63…PC 65…検出絞り 67…検出器 69…結像 71…ディスプレイ、 73…操作コンソール 75…キーボード
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラファエル シュトルツ ドイツ、デー−69115 ハイデルベルク、 ブルーメンシュトラーセ 44 Fターム(参考) 2H044 BB05 BB07 2H052 AA08 AB05 AC04 AC15 AC27 AC34 AD09 AD18 AD29 AD33 AF14 AF21

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 対物レンズハウジングを備えると共に複
    数のレンズを含む顕微鏡対物レンズにおいて、すべての
    レンズが前記対物レンズハウジングの内部に、共通に動
    力式に摺動可能に配置されることを特徴とする顕微鏡対
    物レンズ。
  2. 【請求項2】 摺動を行う駆動ユニットが設けられるこ
    とを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡対物レンズ。
  3. 【請求項3】 対物レンズハウジングを備えると共に複
    数のレンズを含む顕微鏡対物レンズを有する顕微鏡にお
    いて、すべてのレンズが前記対物レンズハウジングの内
    部に共通に、動力式に摺動可能に配置されることを特徴
    とする顕微鏡対物レンズを有する顕微鏡。
  4. 【請求項4】 摺動を行う駆動ユニットが設けられるこ
    とを特徴とする請求項3に記載の顕微鏡。
  5. 【請求項5】 前記対物レンズハウジングが前記駆動ユ
    ニットを包囲することを特徴とする請求項4に記載の顕
    微鏡。
  6. 【請求項6】 前記レボルバが駆動ユニットを含むこと
    を特徴とする請求項4に記載の顕微鏡。
  7. 【請求項7】 前記レンズの位置を把握する位置検出器
    が設けられることを特徴とする請求項3に記載の顕微
    鏡。
  8. 【請求項8】 前記駆動ユニットを制御する制御部が設
    けられることを特徴とする請求項5または6に記載の顕
    微鏡。
  9. 【請求項9】 前記制御部がオートフォーカスシステム
    を含むことを特徴とする請求項8に記載の顕微鏡。
  10. 【請求項10】 試料を結像するための方法において、 走査面を選択するステップと、 対物レンズハウジングを備えると共に複数のレンズを含
    む顕微鏡対物レンズと走査面とを調節するステップであ
    って、少なくとも1つのレンズが対物レンズハウジング
    の内部に、動力式に摺動可能に配置される、ステップ
    と、 調節された走査面の内部の試料を走査して、画像データ
    を生成するステップと、を特徴とする試料を結像するた
    めの方法。
  11. 【請求項11】 さらなる走査面を選択するさらなるス
    テップと、 前記顕微鏡対物レンズと前記さらなる走査面とを調節す
    るさらなるステップと、 前記調節された走査面の内部の前記試料を走査して、さ
    らなる画像データを生成するさらなるステップと、 前記画像データと前記さらなる画像データとから画像積
    み重ねを生成するさらなるステップと、を特徴とする請
    求項10に記載の試料を結像するための方法
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