JP2002517156A - 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法 - Google Patents

免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド組成物に関する。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫刺激オクタヌクレオチド配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫刺激ペプチドまたは抗原と組み合わせて投与され得る。このオリゴヌクレオチドの投与に際しての免疫応答を調節するための方法もまた開示される。さらに、免疫刺激活性を有するオリゴヌクレオチドを同定するインビトロスクリーニング方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法 関連出願の引用 本出願は、係属中の米国仮特許出願第60/048,793号（1997年6月6日出願）の優 先権を主張する。上述の仮出願は、これによって本明細書中で参考としてその全 体が援用される。 技術分野 本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド配列（ISS）を含む免疫調節組成物に 関する。本発明はさらに、少なくとも1塩基が、シトシン上のC-5またはC-6への 電子吸引性部分の付加により修飾される塩基に置換されているISSを含む免疫調 節組成物に関する。これはまた、少なくとも１つの免疫応答を調節するオリゴヌ クレオチド配列の投与にも関する。本発明はさらに、潜在的な免疫調節活性を有 するオリゴヌクレオチドを同定するためのインビトロスクリーニング方法にも関 する。 背景技術 感染または他の抗原性チャレンジに対して生じる免疫応答のタイプは、一般に は応答において含まれるTヘルパー（Th）細胞のサブセットにより区別され得る 。Th1のサブセットは、古典的な細胞媒介性機能（例えば、遅延型過敏症および 細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化）を担うのに対し、Th2のサブセットは、B -細胞活性化のためのヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫 応答のタイプは、一般には抗原に応答する細胞により生成されるサイトカインに より決定される。Th1細胞およびTh2細胞により分泌されるサイトカインにおける 相違は、これら2つのサブセットの異なる生物学的機能を反映すると考えられて いる。 Th1サブセットは、IL-2およびIFN-γ（これらはCTLを活性化させる）を分泌す ることから、ウイルス感染および細胞内病原体に応答するために特に適切であり 得る。IL-4およびIL-5は、IgE産生および好酸球活性化をそれぞれ誘導すること が公知であることから、Th2のサブセットは、独立して生存可能な（free-living ）細菌および寄生虫に対する応答にさらに適切であり得、そしてアレルギー性反 応を媒介し得る。一般には、Th1細胞およびTh2細胞は、異なるパターンのサイト カインを分泌し、従ってあるタイプの応答は他のタイプの応答の活性を緩和し得 る。Th1/Th2のバランスの変化は、例えば、アレルギー応答を、あるいは、CTL応 答の増加を生じ得る。 特定の抗原に対する宿主動物の免疫は、免疫原性形態の抗原を用いて宿主を反 復してワクチン接種することにより伝統的に達成されてきた。大半の現行ワクチ ンは、効果的な体液性(抗体、すなわち「Th2型」)応答を誘発する一方で、これ らは、一般には無いかまたは弱い細胞性応答（特に、主要組織適合複合体（MHC ）クラスI拘束CTL、すなわち「Th1型」応答）を誘発することが出来ない。多く の感染性疾患(例えば、結核およびマラリア)にとって、Th2型応答は、感染に対 して予防的価値がほとんどない。さらに、抗体応答は、特定の適応症において不 適切であり、最も著しくは抗体応答がアナフィラキシーショックを生じ得るアレ ルギーにおいて不適切である。標的抗原由来の低分子ペプチドを使用する提唱さ れるワクチンおよび他の現行で使用される潜在的に感染性であるインタクトなウ イルス粒子の使用を避ける抗原性因子は、治療的効果を達成するために必要な免 疫応答を常に誘発するわけではない。治療上で効果的なヒト免疫不全ウイルス(H IV)ワクチンがないことは、この失敗の不幸な例である。 タンパク質ベースのワクチンは、代表的にはTh2型免疫応答を誘導し、高力価 の中和抗体により特徴付けられるが有意な細胞媒介性免疫がないことにより特徴 付けられる。対照的に、「裸」か、または複合体化されていない、抗原をコード するDNAの皮内送達は、抗原に対する免疫応答をTh1型に偏って刺激し、これはIF N-γ産生CD4+T細胞および細胞傷害性CD8+T細胞の拡大により特徴付けられる。Ma nickanら、（1995）J．Immunol.155:250-265;Xiangら、（1995）Immunity 2:129 -135;Razら、(1995)Proc.Natl．Acad．Sci.USA 93:5141-5145;およびBriodeら、 （1997）J.Allergy Clin．Immunol．99:s129。抗原をコードする裸のDNAの注射 は、コードされた抗原に対する体液性および細胞性の免疫応答の両方を再現可能 に誘導する。PardollおよびBeckerleg（1995）Immunity 3:165-169。DNAワクチ ンは、感染性疾患の予防法の新しいアプローチを提供し得る。例えば、Dixon（1 995）Bio/Technology 13:420およびそこで引用される参考文献を参考のこと。 翻訳されない特定のタイプのDNAは、免疫応答を刺激することが示されてきた 。細菌性DNAは、注射されたマウスにおいて抗DNA抗体を、ならびにマクロファー ジおよびナチュラルキラー（NK）細胞によるサイトカイン産生を誘導する。Pise tsky（1996）J.Immunol.156:421-423；Shimadaら（1986）Jpn．J.Cancer Res.77 :808-816：Yamamotoら、（1992a）Microbiol．Immunol．36:983-897;およびCowd eryら、（1996）J.Immunol．156:4570-4575。 細菌性DNAのＢ細胞およびNK細胞活性化特性は、中心の非メチル化CpGジヌクレ オチドを含む短い配列（6塩基対の六量体）と結び付けられている。Yamamotoら 、（1992a）；およびKriegら、（1995）Nature 374:546-549。2つの5’プリンお よび2つの3’ピリミジンに隣接するCpG配列を含むオリゴヌクレオチドは、B細胞 およびNK細胞の刺激において最も強力であることを示されてきた。例えば、六量 体を含む様々なオリゴヌクレオチドが、マウス脾臓細胞のNK細胞活性を増強する それらの能力について試験された場合、最も免疫原性な六量体として、AACGTT、 AGCGCT、GACGTCが挙げられた。Yamamotoら、（1992b）J.Immunol．148:4072-407 6。オリゴヌクレオチドに応じたＢ細胞活性化を測定した研究では、最も刺激性 のある6量体配列（例えば、AACGTC、AACGTT、GACGTC、GACGTT）はまた、5’-プ リン、プリン、CG、ピリミジン、ピリミジン-3’の配列と一致した。Kriegら、 （1995）。しかし、本明細書で示されるように、この原型となる六量体配列は、 免疫刺激性ではない多くのオリゴヌクレオチドで見出される。従って、Kriegら （1995）により提唱される原型となる六量体配列は、免疫刺激性活性であるとは 予測されない。 細菌性DNAが、マクロファージを刺激してIL-12およびTNF-αを産生した。これ らのマクロファージ産生サイトカインは、脾細胞からIL-12およびIFN-γの産生 を誘導することが見出された。Halpemら、（1996）Cell．Immlunol．167:72-78 。細菌性DNAまたはCpG含有オリゴヌクレオチドのいずれかによる脾細胞のインビ ト ロ処理は、IL-6、IL-12およびIFN-γの産生を誘導した。Klirmanら、（1996）Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 93:2879-2883。これら全てのサイトカインの産生は 、Ｔｈ2型応答ではなくＴｈ1型の免疫応答の誘導を示す。 今日までに、免疫刺激に必要かつ十分の両者である配列については、明確な合 意に到達していない。CpG含有オリゴヌクレオチドに応じたNK活性の誘導を試験 した最近の研究によって、非メチル化CpGモチーフは、NK溶解活性のオリゴヌク レオチド誘導のために必要だが十分ではないことが示唆された。Ballasら、（19 96）J.Immunol．157:1840-1845。CpGに隣接する配列は、オリゴヌクレオチドの 免疫刺激活性に影響するようであった。免疫刺激配列の免疫刺激活性は、アデノ シンのメチル化、およびヌクレオチドが1本鎖であるかまたは2本鎖であるかとは 独立しているようである。例えば、Tokunagaら（1989）Microbiol．Immunol.33: 929;Tokunagaら、（1992）Miclobiol．Immunol．36:55-65;Yamamotoら、（1992b ）；Messinaら、(1993)Cell．Immunol．147:148-157;およびSatoら、（1996）Sc ience 273:352-354を参照のこと。オリゴヌクレオチド長もまた、因子ではない ようである。なぜなら、4kb長の2本鎖DNA（Satoら、(1996)）または15ヌクレオ チド長ほどの短い1本鎖DNA（Ballasら、(1996)）が免疫応答を誘起（illicit） したので。；オリゴヌクレオチド長が8塩基より短くされるか、またはDNAがCpG メチラーゼでメチル化される場合であっても、免疫刺激活性は無くなった。Krie gら、（1995）。 アレルギー性応答（アレルギー性喘息のアレルギー性応答を含む）は、早期段 階応答（これはアレルゲン暴露の数秒以内から数分以内に生じ、そして細胞の顆 粒消失により特徴付けられる）および後期段階応答（これは4〜24時間後に起こ り、そしてアレルゲン暴露部位への好酸球の浸潤により特徴付けられる）により 特徴付けられる。具体的には、アレルギー性応答の早期段階の間ではTh2型のリ ンパ球の活性化は、抗原特異的IgE抗体の産生を刺激し、これは次に、マスト細 胞および好塩基球からのヒスタミンおよび他の炎症メディエーターの放出を引き 起こす。後期段階応答の間には、CD4+Th2細胞によるIL-4およびIL-5産生が上昇 する。これらのサイトカインは、アレルゲン暴露部位（ここでは組織損傷および 機能不全が生じる）への好酸球の補充に有意な役割を果たすようである。 アレルギー性障害についての抗原免疫療法は、少量の、しかし漸増量の抗原の 皮下注射を含む。このような免疫処置は、IgE媒介性アナフィラキシーを誘導す る危険を示し、そしてアレルギー性後期段階応答のサイトカイン媒介性事象には 取り組まない。 特定のDNA含有免疫刺激モチーフでのワクチン接種は、Th1型に偏った免疫応答 を誘導する。例えば、生理食塩水またはアジュバントであるミョウバンの中のEs Cherichia coli(E.coli)のβ-ガラクトシダーゼ（β-Gal）を皮内注射されたマ ウスは、特異的IgG1およびIgE抗体、ならびにIL-4およびIL-5を分泌するがIFN- γを分泌しないCD4+細胞を産生することにより応答し、Ｔ細胞が主にTh2サブセ ットのＴ細胞であることを実証した。しかし、β-Galをコードし、かつISSを含 むプラスミドDNA（生理食塩水中）を皮内に（または尖又皮膚の引っ掻き傷用ア プリケーターで）注射されたマウスは、IgG2a抗体、ならびにIFN-γを分泌する がIL-4およびIL-5を分泌しないCD4+細胞を産生することにより応答し、Ｔ細胞が 主にTh1のサブセットのT細胞であることを実証した。さらに、プラスミドDNAを 注射されたマウスによる特異的IgE産生は、66〜75％減少した。Razら、（1996） Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:5141-5145。一般には、裸のDNAの免疫に対する 応答は、抗原刺激されたCD4+T細胞（これはＴｈ1型の応答を示す）によるIL-2、 TNFαおよびIFN-γの産生により特徴付けられる。これはIgE産生の減少により示 されるようなアレルギーおよび喘息の処置において特に重要である。 別の例では、皮内注射された、抗原をコードするプラスミドベクターにおける 免疫刺激配列（例えば、パリンドロームな六量体であるAACGTT）の存在は、多量 のIFN-α、IFN-βおよびIL-12の産生を刺激した。Satoら、（1996）。IFN-αは 、Th1型の表現型に向かうナイーブＴ細胞の分化において役割を果たし、Th2細胞 を拮抗し、IgE合成を阻害し、IgG2a産生を促進し、そしてTh1表現型の抗原特異 的T細胞のクローンを誘導する。IL-12はT細胞によるIFN-γ産生を促進し、そし てTh1細胞の成熟に好都合である。 特定の抗原に対するTh2型応答をダウンレギュレートしながら同じ抗原に対す るTh1型応答を特異的に増強し得ることが、広範な種々な適応症の処置において 有用である。これらの適応症の処置または軽減は、腫瘍治療、アレルギー性障害 の処置および活発な細胞性免疫応答の誘導を含むがこれらに限定されない。本発 明は、これらの状況において使用され得るオリゴヌクレオチド配列を含む組成物 を提供する。 前節において含まれる全ての引用文献および以下の開示に含まれる引用文献は 、これによって本明細書において参考として援用される。 発明の開示 本発明は、少なくとも１つの免疫刺激（ISS）オクタヌクレオチドを含むオリ ゴヌクレオチドを含む免疫調節組成物を提供する。 好ましい実施態様では、ISSオクタヌクレオチドは、配列5'-プリン、プリン、 シトシン、グアニン、ピリミジン、ピリミジン、シトシン、シトシン-3'を含む 。 別の好ましい実施態様では、ISSオクタヌクレオチドは、配列5'-プリン、プリ ン、シトシン、グアニン、ピリミジン、ピリミジン、シトシン、グアニン-3'を 含む。 さらなる実施態様では、ISSオクタヌクレオチドは、AACGTTCC、AACGTTCG、GAC GTTCC、およびGACGTTCGから選択される。 別の実施態様では、ISSオクタヌクレオチド配列の少なくとも１つのシトシン は、修飾されたシトシンで置換され、ここで修飾されたシトシンは、少なくとも C-5および／またはC-6への電子吸引性基の付加を含む。好ましくは、修飾された シトシンは、5'-ブロモシチジンである。好ましくは、ISSオクタヌクレオチドの 5'末端の３位のＣは、5'-ブロモシチジンで置換されている。 別の実施態様では、免疫調節組成物は、少なくとも１つの免疫刺激オクタヌク レオチドを含むオリゴヌクレオチド、および抗原を含む。 さらなる実施態様では、抗原は、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、および脂 質からなる群より選択される。 別の実施態様では、抗原は、ISSオリゴヌクレオチドに結合体化されている。 別の実施態様では、免疫調節組成物は、少なくとも１つの免疫刺激（ISS）オ クタヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、ならびに補助的刺激分子、サイト カイン、ケモカイン、標的化タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチ ド、および修飾されたアミノ酸を含むペプチドからなる群より選択される促進因 子を含む。 別の実施態様では、免疫調節組成物は、少なくとも１つのISSオクタヌクレオ チドを含むオリゴヌクレオチド、抗原、およびアジュバントを含む。 別の実施熊様では、免疫調節組成物は、免疫調節オリゴヌクレオチド、および 免疫応答を増強するに効果的な距離で近位に会合している抗原を含む。 別の実施態様では、免疫調節組成物は、免疫調節オリゴヌクレオチド、および 免疫標的にオリゴヌクレオチドおよび抗原を共送達するために近位に会合してい る抗原を含む。 別の実施態様では、免疫調節組成物は、免疫調節オリゴヌクレオチド、および アジュバントに会合している抗原を含む。さらに、免疫調節オリゴヌクレオチド と抗原とは、微粒子中で会合している。別の実施態様では、免疫調節オリゴヌク レオチドおよび抗原は、リポソーム中で会合している。 本発明はまた、抗原および少なくとも１つのISSオリゴヌクレオチドを含むオ リゴヌクレオチドを含む免疫調節組成物を投与する工程を包含する、免疫応答を 調節する方法を提供する。 さらなる実施態様では、免疫応答調節は、Th1応答の誘導を含む。 本発明はまた、免疫調節性促進因子および少なくとも１つのISSを含むオリゴ ヌクレオチドを含む免疫調節組成物を投与する工程を包含する、免疫応答を調節 する方法を提供する。 本発明はまた、オリゴヌクレオチドのヒト免疫刺激活性についてスクリーニン グする方法であって、以下の工程：（ａ）マクロファージ細胞および試験される オリゴヌクレオチドのアリコートを提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の細胞およ びオリゴヌクレオチドを適切な時間インキュベートする工程；および（ｃ）細胞 培養上清中のTh1に偏ったサイトカインの相対量を決定する工程を包含する、方 法を提供する。 本発明はまた、ガン、アレルギー性疾患、および感染性疾患を患っている個体 を含むがこれらに限定されない、免疫調節が必要な個体を処置する方法であって 、少なくとも１つのISSを含む免疫調節オリゴヌクレオチドを含む組成物を投与 す る工程を包含する方法を提供する。さらなる実施態様は、Ｂ型肝炎ウイルス、パ ピローマウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスに感染した個体を処置する方法 を提供する。 別の実施態様では、本発明は、ISSおよび抗原を含む免疫調節組成物を投与す る工程を包含する、個体における感染性疾患を予防する方法を提供する。 さらなる実施態様は、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペス ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、およびパピローマウイルスによる感染に起因 する疾患を含むがこれらに限定されないウイルス感染に起因する感染性疾患を予 防する方法を含む。 さらなる実施態様は、Hemophilus influenza、Mycobacterium tuberculosis、 およびBordetella pertussisによる感染に起因する感染性疾患を含むがこれらに 限定されない細菌感染に起因する感染性疾患を予防する方法を含む。 さらなる実施態様は、マラリア性プラスモディウム属、Leishmania種、Trypan osoma種、およびSchistosoma種による感染に起因する感染性疾患を含むがこれら に限定されない寄生性感染に起因する感染性疾患を予防する方法を含む。 図面の簡単な説明 図1は、オリゴヌクレオチドに48時間暴露した後の脾細胞の培養上清中で見出 されたIFN-γのレベルを示したグラフである。オリゴヌクレオチドの同定につい ては表1を参照のこと。 図2は、オリゴヌクレオチドに48時間暴露した後の脾細胞の培養上清中で見出 されたIL-12のレベルを示したグラフである。オリゴヌクレオチドの同定につい ては表1を参照のこと。 図3は、オリゴヌクレオチドに48時間暴露した後の脾細胞の培養上清中で見出 されたIL-6のレベルを示したグラフである。オリゴヌクレオチドの同定について は表1を参照のこと。 図4は、オリゴヌクレオチドに48時間暴露した後の脾細胞の培養上清中で見出 されたIL-6のレベルを示したグラフを示す。オリゴヌクレオチドの同定について は表2を参照のこと。 図5は、オリゴヌクレオチドに48時間暴露した後の脾細胞の培養上清中で見出 されたIL-12のレベルを示したグラフを示す。オリゴヌクレオチドの同定につい ては表2を参照のこと。 図6は、脾細胞の増殖を刺激するための修飾されたシトシンを含む様々なオリ ゴヌクレオチドの効力を示したグラフを示す。細胞増殖は48時間後に培養物中で 決定した。オリゴヌクレオチドの同定については表2を参照のこと。 図7は、処置動物において産生された抗Amb aI IgEの血清レベルを示したグラ フである。 図8は、処置動物において産生された抗Amb aI IgG1の血清レベルを示したグラ フである。 図9は、処置動物において産生された抗Amb aI IgG2aの血清レベルを示したグ ラフである。 図10は、処置動物の脾細胞からのCTL応答を示したグラフである。 図11は、処置動物の脾細胞からのCTL応答を示したグラフである。 図12は、処置動物の脾細胞から産生されたIFN-γを示したグラフである。 図13は、処置動物の脾細胞から産生されたIL-10を示したグラフである。 図14は、一次免疫4週間後の抗HBsAg抗体の血清レベルを示したグラフである。 図15は、二次免疫1週間後の抗HBsAg抗体の血清レベルを示したグラフである。 図16は、二次免疫4週間後の抗HBsAg抗体の血清レベルを示したグラフである。 発明を実施するための態様 オリゴヌクレオチド配列内の特定のセットのオクタヌクレオチド配列は、オリ ゴヌクレオチドが免疫応答を調節し得るようにすることがここで見出された。こ のようなオリゴヌクレオチド配列は、免疫刺激オクタヌクレオチド配列（ISS） を含む。本発明の組成物は、ISSオクタヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドを 単独で、または免疫調節剤（例えば、ペプチド、抗原、および／またはさらなる アジュバント）と組合せて含む。オリゴヌクレオチド自体は、アジュバント活性 を有することが見出されており、そして単独でのアジュバントとしての使用に適 切であり、そしてまた別のアジュバントの効果を増強することが見出されている 。 以前に記載された免疫刺激配列は、中心のCpGジヌクレオチドを有するヘキサ マー配列を含有すると定義されている。残念ながら、免疫刺激活性が予測される ヘキサマー配列に頼ると、大部分では、免疫学的に不活性なオリゴヌクレオチド を生ずる。例えば、実施例１に示されるように、ヘキサマーAACGTTを有する５つ の異なるオリゴヌクレオチドは、明白な免疫刺激活性を明らかに有し、一方、AA CGTTを有する５つの他のオリゴヌクレオチドは、はるかに減少した免疫刺激活性 を有した。従って、以前のヘキサマーアルゴリズムは、免疫刺激活性を予測でき ない。 本発明のISSは、以前に記載されたヘキサマーおよびヘキサマーの3'側の２つ のさらなるヌクレオチドを含むオクタヌクレオチド配列を含む。好ましくは、IS Sオクタマーは、5'-プリン、プリン、シトシン、グアニン、ピリミジン、ピリミ ジン、シトシン、グアニン-3'を含むか、またはISSオクタマーは5'-プリン、プ リン、シトシン、グアニン、ピリミジン、ピリミジン、シトシン、シトシン-3' を含む。より好ましくは、ISSオクタヌクレオチドは、5'-GACGTTCG-3'または5'- GACGTTCC-3'を含む。なおより好ましくは、ISSオクタヌクレオチドは、5'-AACGT TCG-3'または5'-AACGTTCC-3'を含む。本発明は、ヘキサマーISS配列と比較して 、ISSオクタヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドにおける免疫刺激活性につい ての信頼性の高い予測物であることを実証する。 別の実施態様では、本発明のISSオリゴヌクレオチドはまた、CGジヌクレオチ ドを含み得、ここでＣ残基は、C-5および/またはC-6への電子吸引性部分の付加 により修飾される（「修飾されたISS」）。同じシトシンがメチル化される場合 、オリゴヌクレオチドの全ての免疫刺激活性は失われる。好ましくは、このよう な組成において、5'末端から３位のシトシンは、シトシンアナログ、好ましくは 5-ブロモシチジン、フッ化シトシン、または塩化シトシンで置換され得る。修飾 されたISSのいくつかは、修飾された塩基を有さない同じ配列に比較して、より 大きくはないにしても、ほぼ同じ免疫刺激活性を有する。 本発明のISSオリゴヌクレオチドは、任意の他の生理学的に受容可能な修飾さ れたヌクレオチド塩基を含み得る。 本発明はまた、投与されたISSのアジュバント様効果を介する免疫応答の一般 的な刺激のための方法および組成物を提供する。 本発明はまた、ISS-抗原結合体を含む、免疫応答の増強のための組成物を提供 する。ISS-抗原結合体は、ISSと抗原との間の共有的および／または非共有的相 互作用を介して形成され得る。 本発明はまた、ISS-抗原混合物を含む組成物を提供し、この混合物中でISSお よび抗原は、溶液中のISSおよび抗原の共投与と比較して免疫応答を増強するた めに効果的な距離で近位に会合している。本発明はさらに、ISS-抗原複合体が標 的に利用可能であるまではISSおよび抗原を近位な会合に維持し得る包膜剤を含 む組成物を提供する。ISS-抗原混合物中では、ISSおよび抗原は、ISSおよび抗原 の両方が同じ標的細胞により取り込まれ得るように、近位の会合に維持される。 さらに、混合物中のISSおよび抗原は、免疫応答を調節するのに効果的な濃度で 維持される。好ましくは、ISSおよび抗原は、約0.04μm〜約100μmの距離で、よ り好ましくは約0.1μm〜約20μmの距離で、さらにより好ましくは約0.15μm〜約 10μmの距離で近位に会合される。ISS-抗原結合体またはISS-抗原混合物の標的 は、抗原提示細胞（APC）（例えば、マクロファージ）、樹状細胞、ならびに／ またはリンパ球、リンパ様構造（例えば、リンパ節および／もしくは脾臓）なら びに非リンパ様構造（特に、皮膚、肺、および／もしくは胃腸管のような樹状細 胞が見出されるもの）を含むがこれらに限定されない。 ISSおよび免疫調節剤が近位に会合している組成物による免疫応答の増強とは 、互いに関して自由に可溶性であるISSおよび免疫調節剤の投与後の免疫応答と 比較したこの組成物の投与後の免疫応答の調節をいう。免疫応答の増強は、刺激 、抑制、および免疫応答の型（例えば、Th1型応答とTh2型応答との間）のシフト を含むがこれらに限定されない免疫応答の調節を含む。 本発明はまた、ISS-抗原結合体またはISS-抗原混合物およびアジュバントを含 む組成物を提供し、ここで共投与により、ISS-抗原およびアジュバントの会合は 、アジュバントを有さないISS-抗原の共投与と比較して免疫応答を増強するのに 効果的である。このような組成物では、アジュバントは、標的細胞をISS-抗原に 補充および活性化するように、ISS-抗原と会合して維持される。 本発明はまた、免疫応答の刺激における抗原と組合せたISSの使用方法を提供 する。好ましくは、このような方法において使用する場合には、ISSは、抗原に 対するTh1型免疫応答の生成においてアジュバント様の活性を提供する。 好ましくは、本発明に従って刺激された免疫応答は、Th1型表現型に偏り、そ してTh2型表現型から離れる。本発明を参照すると、Th1型免疫応答を刺激するこ とは、ISSを伴なわずに処理した細胞からのサントカイン産生と比較して、ISSで 処理した細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、インビトロまたは エキソビボで決定され得る。細胞のサイトカイン生成を決定する方法は、本明細 書中に記載される方法、および当該分野で公知の任意のものを含む。ISS処理に 応答して産生されるサイトカインの型は、細胞による、Th1型またはTh2型に偏っ た免疫応答を示す。本明細書中で使用される用語「Th1型に偏った」サイトカイ ン産生とは、刺激の非存在下でのこのようなサイトカインの産生と比較した場合 の、刺激因子の存在下でのTh1型免疫応答に関連したサイトカインの測定可能な 増加した産生をいう。このようなTh1型に偏ったサイトカインの例は、IL-2、IL- 12、およびIFN-γを含むがこれらに限定されない。対照的に、「Th2型に偏った サイトカイン」とは、Th2型免疫応答に関連したサイトカインをいい、そしてIL- 4、IL-5、Il-10、およびIL-13を含むがこれらに限定されない。ISS活性の決定の ために有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主から単離された初代細胞および／また は細胞株、好ましくはAPCおよびリンパ球、さらにより好ましくはマクロファー ジおよびＴ細胞を含む。 Th1型免疫応答を刺激することはまた、ISS-抗原組成物で処置した宿主におい て測定され得、そして以下を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の任意 の方法により決定され得る：(1)抗原チャレンジの前および後で測定したIL-4の レベルの低下；または抗原でプライミングした、またはプライミングおよびチャ レンジした、ISSなしで処置したコントロールと比較して、ISS-抗原処置宿主に おいてさらに低い（または存在さえしない）レベルのIL-4の検出；(2)抗原チャ レンジの前および後のIL-12、IL-18、および／またはIFN（α、β、もしくはγ ）のレベルの上昇；または抗原でプライミングした、またはプライミングおよび チャレンジした、ISSなしで処置したコントロールと比較して、ISS-抗原処置宿 主におけるさらに高いレベルのIL-12、IL-18、および／またはIFN（α、β、 もしくはγ）の検出；(3)ISSなしで処置したコントロールと比較して、ISS-抗原 処置宿主におけるIgG2a抗体産生；ならびに／あるいは(4)抗原チャレンジの前お よび後で測定した場合の抗原特異的IgEのレベルの低下；または抗原でプライミ ングした、またはプライミングおよびチャレンジした、ISSなしで処置したコン トロールと比較して、ISS-抗原処置宿主においてより低い（または存在さえしな い）レベルの抗原特異的IgEの検出。これらの種々の決定は、APCおよび／または リンパ球、好ましくはマクロファージおよび／またはＴ細胞により作製されるサ イトカインを、インビトロまたはエキソビボで、本明細書中に記載される方法ま たは当該分野で公知の任意の方法を用いて測定することにより行なわれ得る。抗 体産生を決定する方法は、当該分野で公知の任意の方法を含む。 ISS投与の結果として生じる、Th1型に偏ったサイトカイン誘導は、細胞免疫応 答の増強（例えば、NK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Th1ヘルパーおよび記憶細 胞により行なわれるもの）を生じる。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動 物、寄生体、細菌、アレルギー性疾患、および喘息、ならびに腫瘍に対する防御 的または治療的ワクチン接種における使用に特に有益である。 一般的技術 本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内である分子生物学 （組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技 術を用いる。このような技術は、例えば以下の文献において十分に説明される： 「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第２版（Sambrookら，1989）； 「Oligonucleotide Synthesis」(M.J．Gait編，1984)；「Animal Cell Culture 」（R.I.Freshney編，1987）；「Methods in Enzymology」(Academic Press，I nc.)；「Handbook of Experimental Immunology」(D.M．WeirおよびC.C．Black well編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.MillerおよびM .P.Calos編，1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M．Ausub elら編，1987)；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」，（Mullisら編，1994 ）；ならびに「Current Protocols in Immunology」(J.E．Collganら編，1991) 。 ISSを含有する組成物 本発明の組成物は、所望の免疫応答を誘発し得るISSである。本明細書中で使 用される用語「ISS」は、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボで 測定される測定可能な免疫応答をもたらすオリゴヌクレオチド配列をいう。測定 可能な免疫応答の例は、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、リンパ球集 団（例えば、ＮＫ細胞、CD4+Ｔリンパ球、CD8+Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）の 活性化または拡大を含むがこれらに限定されない。好ましくは、ISS配列は、Th1 型応答を優先的に活性化する。組成物のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ のオクタマーISSを含む。 オクタマーISSは、好ましくは、一般的オクタマー配列5'-プリン、プリン、シ トシン、グアニン、ピリミジン、ピリミジン、シトシン（シトシンまたはグアニ ン）-3'である、CG含有配列を含む。最も好ましくは、ISSは、AACGTTCC、AACGTT CG、GACGTTCC、およびGACGTTCGからなる群より選択されるオクタマーを含む。 免疫刺激オリゴヌクレオチドがRNA配列を含む場合、ISSは好ましくは、AACGUU CC、AACGTTCG、GACGUUCC、およびGACGUUCGからなる群より選択される一本鎖また は二本鎖の配列を含む。 本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのISSを含み、そし て複数のISSを含み得る。ISSは、オリゴヌクレオチド内で隣接し得るか、または オリゴヌクレオチド内でさらなるヌクレオチド塩基により隔てられ得る。 本明細書中で交換可能に用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリ ヌクレオチド」は、一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖RNA（ssR NA）、および二本鎖RNA（dsRNA）、修飾されたオリゴヌクレオチド、およびオリ ゴヌクレオシド、またはこれらの組合せを含む。オリゴヌクレオチドは、直鎖状 または環状の構造であり得るか、またはオリゴヌクレオチドは、直鎖状および環 状のセグメントの両方を含み得る。 ISSは、長さが６塩基または塩基対よりも長い、好ましくは15塩基または塩基 対よりも長く、より好ましくは20塩基または塩基対よりも長い任意の長さのもの であり得る。 一般に、dsRNAは、免疫刺激効果を発揮し、そして本発明により包含される。I SSの修飾は、当該分野で公知の任意のもの（3'OHまたは5'OH基の修飾、ヌクレオ チド塩基の修飾、糖成分の修飾、およびリン酸基の修飾）を含むがこれらに限定 されない。種々のこのような修飾は以下に記載される。 修飾された塩基および塩基アナログ オリゴヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合により連結されたヌク レオシドのポリマーである。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニンも しくはグアニンまたはそれらの誘導体）あるいはピリミジン（チミン、シトシン 、もしくはウラシル、またはそれらの誘導体）塩基からなる。DNAにおける４つ のヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシ ン、デオキシチミジン、およびデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、 ヌクレオシドのリン酸エステルである。 任意の組合せの複数の塩基、糖、またはリン酸は、ISS中で置換され得る。 本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド（唯一のまたは主な糖成分 としてリボースを含有する）、デオキシリボヌクレオチド（主な糖成分としてデ オキシリボースを含有する）を含み得るか、または当該分野の状態に従って、修 飾された糖または糖アナログがISS中に取り込まれ得る。従って、リボースおよ びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘ キソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキ ソース、および糖「アナログ」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシル 形態またはフラノシル形態であり得る。ISSでは、糖部分は、好ましくは、リボ ース、デオキシリボース、アラビノース、または2'-O-メチルリボースのフラノ シドであり、そして糖は、それぞれの複素環式塩基にαまたはβアノマー配置の いずれかで結合され得る。これらの糖または糖アナログおよびそれぞれの「ヌク レオシド」（ここでこのような糖またはアナログは、複素環式塩基（核酸塩基） 自体に結合している）の調製は公知であり、そしてこのような調製が任意の特定 の例に関与し得る程度以外にはここで記載する必要はない。 本発明のオリゴヌクレオチドにおいて糖または糖アナログ部分に結合し得る亜 リン酸誘導体（または修飾されたリン酸基）は、モノホスフェート、ジホスフェ ート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホス ホロチオエート、ホスホロジチオエートなどであり得る。ホスホロチオエート結 合は、ホスホジエステル結合の代わりに用いられ得る。上記のリン酸アナログの 調製、ならびにヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、およびオリゴヌクレオ チドへのそれらの取込み自体もまた公知であり、ここで詳細に記載する必要はな い。Peyrottesら（1996）Nucleic Acids Res．24:1841-1848;Chaturvediら（199 6）Nucleic Acids Res．24:2318-2323;およびSchultzら（1996）Nucleic Acids Res．24:2966-2973。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ オエート結合を含む。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、 ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性であり得、そ して宿主への注射後の分解にさらに耐性であるようである。Braunら（1988）J.I mmunol．14:2084-2089;およびLatimerら（1995）Mol．Immunol．32:1057-1064。 ISS中に取り込まれる複素環式塩基、すなわち核酸塩基は、天然に存在する主 なプリンおよびピリミジン塩基（すなわち、上記のようにウラシルまたはチミン 、シトシン、アデニン、およびグアニン）、ならびにこの主な塩基の天然に存在 する修飾物および合成の修飾物であり得る。 当業者は、種々の複素環式塩基および種々の糖部分（および糖アナログ）を含 む多数の「合成」非天然ヌクレオシドが当該分野で利用可能であること、そして 本発明の他の基準が満たされる限り、ISSは、天然に存在する核酸の主な５つの 塩基成分以外の１または数個の複素環式塩基を含み得ることを認識する。しかし 、好ましくは、ISS中の複素環式塩基は、ウラシル-5-イル、シトシン-5-イル、 アデニン-7-イル、アデニン-8-イル、グアニン-7-イル、グアニン-8-イル、4-ア ミノピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2,3-d]ピリミ ジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2,3-d]ピリミジン-3-イル基（ここで、 プリンは９位を介して、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を 介して、そしてピラゾロピリミジンは１位を介して、ISSの糖部分に結合してい る）を含むがこれらに限定されない。 １つの実施態様では、ISSは、少なくとも１つの修飾された塩基を含む。本明 細書中で用いられる用語「修飾された塩基」は、「塩基アナログ」と同義語であ り、例えば「修飾されたシトシン」は、「シトシンアナログ」と同義語である。 同様に、「修飾された」ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、本明細書中で、ヌ クレオシドまたはヌクレオチド「アナログ」と同義語であると定義される。好ま しい実施態様では、ISSのシトシンは、シトシンのC-5および/またはC-6への、電 子吸引性部分の付加により修飾されたシトシンで置換される。好ましくは、電子 吸引性部分は、ハロゲンである。このような修飾されたシトンンは、アザシトシ ン、5-ブロモシトシン、ブロモウラシル、5-クロロシトシン、塩化シトシン、シ クロシトシン、シトシンアラビノシド、フッ化シトシン、フルオロピリミジン、 フルオロウラシル、5,6-ジヒドロシトシン、ハロゲン化シトンン、ハロゲン化ピ リミジンアナログ、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、5-ニトロシトシン、ウ ラシル、および任意の他のピリミジンアナログもしくは修飾されたピリミジンを 含み得るがこれらに限定されない。 ISSを用いて免疫応答を調節する方法 １つの実施態様では、本発明は、ISSを免疫学的に活性な唯一の物質として含 む組成物を提供する。投与に際し、このようなISSは、免疫系の刺激を誘導する 。 他の実施態様では、ISSは、抗原（タンパク質、糖タンパク質、多糖類、およ び脂質を含むがこれらに限定されない）を含む免疫調節分子のグループの１つ以 上のメンバー、ならびに／または免疫調節促進因子（例えば、補助的刺激分子（ サイトカイン、ケモカイン、標的化タンパク質リガンド、トランス活性化因子、 ペプチド、および修飾されたアミノ酸を含むペプチドを含むがこれらに限定され ない）ならびにアジュバント（ミョウバン、脂質エマルジョン、およびポリラク チド／ポリグリコリド微粒子を含むがこれらに限定されない））と組みあわせて 投与され得る。本明細書中で用いられる用語「免疫調節」は、免疫刺激効果なら びに免疫抑制効果を含む。免疫刺激効果は、細胞性または体液性の免疫応答を直 接的または間接的に増強する効果を含むがこれらに限定されない。免疫刺激効果 の例は、抗原特異的抗体産生の増加；リンパ球集団（例えば、NK細胞、CD4+Ｔリ ンパ球、CD8+Ｔリンパ球、マクロファージなど）の活性化または増殖；IL-1、IL -2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-αなどを含むがこれらに限定さ れない免疫刺激サイトカイン合成の増加を含むがこれらに限定されない。免疫抑 制効果は、細胞性または体液性の免疫応答を直接的または間接的に減少させるこ とを含む。免疫抑制効果の例は、抗原特異的抗体産生の減少（例えば、IgE産生 の減少）；リンパ球または免疫抑制活性を有する他の細胞集団（例えば、免疫寛 容をもたらすもの）の活性化；および特定の細胞機能に対して抑制効果を有する サイトカイン合成の増加を含むがこれらに限定されない。これの１つの例は、IF N-γである。IFN-γは、IgEおよびIgG1へのIL-4誘導性クラススイッチをブロッ クし、それによりこれらの抗体のサブクラスのレベルを低下させるようである。 ISSならびに抗原および／または免疫調節促進因子は、免疫応答を調節するよ うに、結合体の形態で一緒に投与され得るか、または時間的に十分に近接して混 合物中で共投与され得る。好ましくは、ISSおよび免疫調節分子は、同時に投与 される。本明細書中で用いられる用語「共投与」は、少なくとも２つの異なる物 質の投与が免疫応答を調節するのに十分に時間的に近接していることをいう。好 ましくは、共投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時投与をいう。 本明細書中で用いる用語「結合体」は、ISSおよび免疫調節分子が結合してい る複合体をいう。このような結合体の結合は、共有結合および／または非共有結 合を含む。 本明細書中で用いる用語「抗原」は、抗体またはＴ細胞抗原レセプターにより 特異的に認識および結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質 、糖タンパク質、多糖類、ガングリオシド、および脂質；それらの部分、ならび にそれらの組合せを含み得る。抗原は、天然に見出され得るものであり得るか、 または合成物であり得る。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテン は、それ自体は免疫原性ではないが、抗原決定基を含む免疫原性分子と結合体化 された場合に免疫原性にされる低分子量化合物である。 本明細書中で使用されるように、用語「アジュバント」は、免疫原性物質に添 加した場合に、混合物に曝露した際にレシピエント宿主中の因子に対する免疫応 答を非特異的に促進または増強する物質をいう。 免疫応答の刺激において、ほとんどのアジュバントは一般に、注射の部位にお いてマクロファージを刺激することが見出されている。本明細書中に記載される ように、ISSは、マクロファージ細胞からのサイトカイン産生を刺激し、そのよ うにして免疫刺激ポリヌクレオチドは、アジュバントとして機能することが示さ れている。従って、別の実施態様において、本発明は、ISSおよび抗原を含む組 成物を提供する。ISSとともに投与するのに適切な抗原は、B細胞またはT細胞抗 原特異的応答を誘発し得る任意の分子を含む。好ましくは、抗原は、抗原に特異 的な抗体応答を誘発する。広範な種々の分子は、抗原である。これらには、糖、 脂質、およびポリペプチド、ならびに複合糖質およびリン脂質のような高分子が 含まれるが、これらに限定されない。低分子は、抗原性になるためにハプテン化 される必要があり得る。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質（例えば 、ステロール、脂肪酸、およびリン脂質）、Hemophilus influenzaワクチンにお いて使用されるような多糖、ガングリオシド、ならびに糖タンパク質を含む。 本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、そのペプチドがハプテンであ ろうとなかろうと、生物学的応答（例えば、抗体産生またはサイトカイン活性） をもたらすのに十分な長さおよび組成のペプチドおよびタンパク質が含まれる。 代表的には、ペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基長である。用語「ペプチド 」は、改変されたアミノ酸をさらに含み、このような改変には、リン酸化、グリ コシル化、ペグ化、脂質化、およびメチル化が含まれるが、これらに限定されな い。 １つの実施態様において、本発明は、ISSおよび抗原性ペプチドを含む組成物 を提供する。抗原性ペプチドには、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、 組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化もしくは不活化ウイルス、細胞 、微生物、またはこのようなペプチドのフラグメントが含まれる。 多くの抗原性ペプチドおよびタンパク質は、公知であり、そして当該分野で入 手可能である；他は、従来の技術を使用して同定され得る。免疫調節促進因子（ immunomodulatory facilitator）として作用し得るタンパク質抗原には、以下の 例が含まれるが、これらに限定されない。単離された天然のまたは組換えの抗原 は、植物の花粉(例えば、Rafnarら(1991)J．Biol．Chem．266:1229-1236;Breite nederら（1989）EMBO J．8:1935-1938;Elsayedら（1991）Scand．J．Clin．Lab ．Invest．Suppl．204:17-31;およびMalley（1989）J．Reprod．Immunol． 16:173-186を参照のこと)、ダストマイト（dust mite）タンパク質(例えば、Chu aら（1988）J．Exp．Med．167:175-182;Chuaら(1990)Ini．Arch．Allergy Appl ．Immunol．91:124-129;およびJoost van Neervenら（1993）J．Immunol．151:2 326-2335を参照のこと)、動物のふけ（例えば、Rogersら（1993）Mol．Immunol ．30:559-568を参照のこと）、動物の唾液、ハチ毒、および真菌の芽胞から誘導 され得る。生存している、弱毒化された、そして不活化された微生物（例えば、 HIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（Bradleyら(1984)）J ．Med．Virol．14:373-386)、ロタウイルス、ポリオウイルス(Jiangら（1986）J ．Biol．Stand．14:103-109)、Ｂ型肝炎ウイルス、はしかウイルス(Jamesら（19 95）N．Engl．J．Med．332:1262-1266)、ヒトおよびウシパピローマウイルス、 ならびに遅発性脳ウイルスは、ペプチド抗原を提供し得る。腫瘍形成に対する免 疫化について、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞（生存または照射された）、腫瘍 細胞抽出物、または腫瘍抗原のタンパク質サブユニットを含み得る。免疫ベース の避妊のためのワクチンは、ISSとともに投与された精子タンパク質を含むこと によって形成され得る。Leaら（1996）Biochim．Biophys．Acta 1307:263。 ISSおよび抗原は、ISS抗原結合体として投与され得、そして/またはそれらは 混合物の形態（例えば、エマルジョン）で複合体として同時投与され得る。ISS 抗原結合体におけるISSおよび抗原分子の会合は、共有結合相互作用を介して、 および/または非共有結合相互作用（高親和性および/または低親和性相互作用を 含む）を介してであり得る。ISS-抗原結合体においてISSと抗原とを結合させ得 る非共有結合相互作用の例には、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、およ びファンデルワールス力が含まれるが、これらに限定されない。 別の実施態様において、ISSは、1つ以上の免疫調節促進因子と組み合わせて投 与され得る。従って、本発明は、ISSおよび免疫調節促進因子を含む組成物を提 供する。本明細書中で使用される用語「免疫調節促進因子」は、ISSの免疫調節 活性を支持および/または増強する分子をいう。免疫調節促進因子の例には、補 助的刺激分子（例えば、サイトカイン）および/またはアジュバントが含まれ得 る。ISSおよび促進因子は、ISS促進因子結合体として投与され得、そして/また はそれらは混合物の形態（例えば、エマルジョン）において複合体として同時投 与され得る。ISS促進因子結合体におけるISSおよび促進因子分子の会合は、共有 結合的相互作用および/または非共有結合的相互作用（高親和性および/または低 親和性相互作用を含む）を介してであり得る。ISS-促進因子結合体においてISS と促進因子とを結合させ得る非共有結合相互作用の例には、イオン結合、疎水性 相互作用、水素結合、およびファンデルワールス力が含まれるが、これらに限定 されない。 免疫調節促進因子には、補助的刺激分子（サイトカイン、ケモカイン、標的化 タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および改変されたアミノ 酸を含むペプチド）およびアジュバント（例えば、ミョウバン、脂質エマルジョ ン、およびポリラクチド/ポリグリコリド微小粒子）が含まれるが、これらに限 定されない。 ISSとともに投与するための適切な免疫調節サイトカインペプチドは、インタ ーロイキン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3など）、インターフェロン（例えば、IF N-α、IFN-β、IFN-γ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（例えば、G-CS F、M-CSF、GM-CSF)、およびTNF-αである。好ましくは、ISSオリゴヌクレオチド と組み合わせて使用するための免疫刺激ペプチドは、Th1-型免疫応答を刺激する もの（例えば、IL-12(Blissら(1996)J．Immunol．156:887-894)、IL-18、TNF-α 、β、およびγ）、ならびに/またはトランスフォーミング成長因子(TGF)-αで ある。 ISSとともに投与されるペプチドはまた、特異的レセプターへのタンパク質結 合を媒介するか、または特定の細胞型または組織に対する標的化を媒介するアミ ノ酸配列を含み得る。例には、抗体または抗体フラグメント、ヒト成長ホルモン のようなペプチドホルモン、および酵素が含まれるが、これらに限定されない。 免疫調節ペプチドにはまた、ペプチドホルモン、ペプチド神経伝達因子、および ペプチド成長因子が含まれる。B7(CD80)のような補助的刺激分子、トランス活性 化タンパク質（例えば、転写因子）、ケモカイン（例えば、マクロファージ走化 性タンパク質(MCP)、ならびに他の化学誘引物質または走化性ペプチドもまた、I SSとともに投与するために有用なペプチドである。 本発明はまた、アジュバントと組み合わせたISSの投与を提供する。ISSおよび アジュバントと一緒の抗原の投与は、抗原に対する免疫応答の増強を導き、従っ て、ISSおよび抗原単独を含む組成物から生じる免疫応答に比較して、増強され た免疫応答を生じ得る。例えば、本発明者らは、ISSおよびアジュバントと一緒 の抗原の投与が、増強された一次免疫応答を導くことを示した。従って、別の実 施態様において、本発明は、ISS、抗原、およびアジュバントを含む組成物を提 供し、それにより、ISS/抗原/アジュバントが同時に投与される。好ましくは、 免疫原性組成物は、免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバ ントを含む。好ましくは、アジュバントは、水中油エマルジョン、油中水エマル ジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、リポソームおよび微小粒子（ポリスチ レン、デンプン、ポリホスファゼン、およびポリラクチド/ポリグリコシドを含 むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。より好ましく は、ISSおよび抗原は、ミョウバンとともに同時投与される。より好ましくは、I SSおよび抗原は、リポソームとともに同時投与される。なおより好ましくは、IS Sおよび抗原は、水中油エマルジョンとともに同時投与される。 適切なアジュバントはまた、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、 サポニン誘導体、ミコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコー ル酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Ｂ サブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびに免疫刺激複合体(ISCOM )（例えば、Takahashiら(1990)Nature 344:873-875に記載される）、ならびに脂 質ベースのアジュバントおよび本明細書中に記載される他のものが含まれるが、 これらに限定されない。獣医学的使用および動物における抗体の産生については 、フロイントアジュバント（完全および不完全の両方）の分裂促進的な成分が使 用され得る。 全ての免疫原性組成物と同様に、成分の免疫学的に有効な量は、経験的に決定 されなければならない。考慮されるべき因子には、抗原性（ISSおよび/または抗 原が、免疫調節促進因子、アジュバント、またはキャリアタンパク質もしくは他 のキャリアと複合体化しているか、またはそれらに共有結合により結合している かに関わらず）、投与の経路、ならびに投与されるべき免疫化用量の数が含まれ る。このような因子は、ワクチンの分野で公知であり、そして過度の実験を要さ ずにこのような決定をするのに十分に免疫学者の技術範囲内にある。 本発明はさらに、混合物としてのISSおよび免疫調節分子が、ISSおよび免疫調 節分子の投与と比較して、生成された免疫応答を増強するのに効果的な距離にお いて近接に関連している組成物を提供する。従って、本発明は、組成物およびそ の使用のための方法を提供し、この組成物は、複合体が標的に対して利用可能に なるまで、ISSおよび免疫調節分子の近接した結合を維持し得るカプセル化薬剤 含む。好ましくは、ISSを含む組成物、免疫調節分子、およびカプセル化薬剤は 、アジュバント水中油エマルジョン、微小粒子、および/またはリポソームの形 態である。より好ましくは、ISS-免疫調節分子をカプセル化するアジュバント水 中油エマルジョン、微小粒子、および/またはリポソームは、約0.04μm〜約100 μm、より好ましくは約0.1μm〜約20μm、さらにより好ましくは約0.15μm〜約1 0μmのサイズの粒子の形態である。 コロイド分散系（例えば、ミクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプ セル、ならびに脂質ベースの系（例えば、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミ セル、およびリポソーム）は、ISSを含有する組成物の有効なカプセル化を提供 し得る。 カプセル化組成物は、任意の広範な種々の成分をさらに含む。これらには、ミ ョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造(LMS)、ポリエチレングリコール(PEG)、 および他のポリマー（例えば、ポリペプチド、糖ペプチド、および多糖）が含ま れるが、これらに限定されない。 成分のカプセル化に適切なポリペプチドには、当該分野で公知の任意のものが 含まれ、そして脂肪酸結合タンパク質を含むが、これに限定されない。改変され たポリペプチドには、任意の種々の改変が含まれ、グリコシル化、リン酸化、ミ リスチル化、硫酸化、およびヒドロキシル化が含まれるが、これらに限定されな い。本明細書中に使用されるように、適切なポリペプチドは、ISS含有組成物を 保護して、その免疫調節活性を保存するものである。結合タンパク質の例には、 アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)およびえんどう豆アルブミン） が含まれるが、これらに限定されない。 他の適切なポリマーは、薬学の分野で公知の任意のものであり得、天然に存在 するポリマー（例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、および多糖 ）ならびに合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。天然に存在する ポリマーの例には、タンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン、および脂質 が含まれる。さらなるポリマーは、合成ポリマーであり得る。本発明における使 用のために適切な合成ポリマーの例には、ポリアルキルグリコール（PAG）(例え ば、PEG)、ポリオキシエチル化ポリオール（POP）（例えば、ポリオキシエチル 化グリセロール(POG)、ポリトリメチレングリコール(PTG)、ポリポロピレングリ コール(PPG)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール(PV A)、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニ ルピロリドン(PVP)、ポリアミノ酸、ポリウレタン、およびポリホスファゼンが 含まれるが、これらに限定されない。合成ポリマーはまた、直線状もしくは分枝 状、置換されているかもしくは置換されていない、２つ以上の異なる合成モノマ ーのホモポリマー、コポリマー、もしくはブロックコポリマーであり得る。 PEGは、分子の広範な群を構成する。PEGについての一般式は、以下のようであ る： R1O-(CH2CH2O)n-R3 ここで、R1およびR3は、独立して、H、H3C、OH、または直線状もしくは分枝状 の、置換されたかもしくは置換されていないアルキル基であり、そしてｎは１と 約1,000との間の整数である。用語「PEG」には、置換されていない(R1およびR3 ＝H)および置換されたPEGの両方が含まれる。本発明のカプセル化組成物におけ る使用のためのPEGは、化学薬品供給元から購入するか、または当業者に公知の 技術を使用して合成されるかのいずれかである。 本明細書中で使用される用語「LMS」は、極性脂質の極性の頭基（head group ）が、界面の水相に面し、膜構造を形成するように配置されている層状の脂質粒 子を意味する。LMSの例には、リポソーム、ミセル、渦巻き（すなわち、一般的 に円柱状のリポソーム）、ミクロエマルジョン、単層ベシクル、多層ベシクルな どが含まれる。 本発明の好ましいコロイド分散系は、リポソームである。リポソームカプセル 化抗原で免疫したマウスにおいて、リポソームは、抗原に対するTh1型免疫応答 を増強するようであった。Aramakiら(1995)Vaccine 13:1809-1814。本明細書中 で使用される「リポソーム」または「脂質ベシクル」は、少なくとも１つ、そし ておそらく１つより多くの二重層脂質膜によって結合される小さいベシクルであ る。リポソームは、リン脂質、糖脂質、脂質、ステロイド（コレステロール）、 関連する分子、またはこれらの組み合わせから、当該分野で公知の任意の技術（ 超音波処理、押出し、または脂質界面活性剤複合体からの界面活性剤の除去を含 むが、これらに限定されない）によって、人工的に作製される。リボソームはま た、さらなる成分（例えば、組織標的化成分）を任意的に含み得る。「脂質膜」 または「脂質二重層」は、脂質のみからなる必要はなく、膜の一般的構造が疎水 性コアを２つの親水性表面のシートである限り、任意の適切な他の成分（コレス テロールおよび他のステロイド、脂質可溶性化学薬品、任意の長さのタンパク質 、ならびに他の両親媒性分子を含むがこれらに限定されない）をさらに含み得る 。膜構造の一般的な議論については、The Encyclopedia of Molecular Biology 、J．Kendrewによる(1994)を参照のこと。適切な脂質については、Lasic（1993 ）「Liposomes：from Physics to Applications」Elsevier，Amsterdamを参照の こと。 好ましくは、膜が、再現性のある質（例えば、直径）を伴って形成されること を可能にし、そしてリポソームが使用されるところで生じることが予想される要 素（例えば、生理学的緩衝液および循環分子）の存在下で安定であるリポソーム 組成物が選択される。好ましくは、リポソームは、保存、凍結、および薬学的賦 形剤との混合による操作の効果に対して耐性である。 脂質膜構造への取りこみのために適切な脂質には、天然の、半合成のもしくは 合成の、モノ-もしくはジ-グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン(PC)、ホス ファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホルファ チジルイノシトール(PI)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルセリン(PS)、 グリセロおよびカルジオリピンが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ るが、これらに限定されない。スフィンゴミエリン(SM)およびセレブロシドのよ うなスフィンゴ脂質もまた、組み込まれ得る。天然のリン脂質は、sn-3位置のリ ン酸部分ならびにsn-1およびsn-2位置の疎水性鎖とともに生じ得るが、 合成脂質は、代替的な立体化学を、例えば、リン酸基をsn-1またはsn-2位置で有 し得る。さらに、疎水性の鎖は、アシル、エーテル、アルキル、または他の結合 によってグリセロール骨格に付着し得る。これらの脂質の誘導体はまた、リポソ ームへの取りこみに適切である。使用のために適切な誘導体には、ハロアルキル 誘導体（アルキル鎖のすべてのまたはいくつかの水素原子が、例えば、フッ素で 置換されているものを含む）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、コ レステロールおよび他の両親媒性ステロイド、ボラ両親媒性(bolaamphiphiles) （単層膜を形成する分子のいずれかの末端に極性部分を有する脂質）、およびポ リグリセロールモノアルキルエーテル(polyglycerolmonoalkylther)もまた組み 込まれ得る。リポソームは、単一の脂質または２つ以上の異なる脂質の混合物か ら構成され得る。 １つの実施態様において、リポソームの脂質二重層は、主に、リン脂質から形 成される。好ましくは、リン脂質組成物は、複雑な混合物であり、PSおよびさら なる脂質（例えば、PC、PA、PE、PG、およびSM、PI、ならびに/またはカルジオ ン（ジホスファチジルグリセロール））の組み合わせを含む。所望であれば、SM は、より大きな比率のPC、PE、またはこれらの組み合わせで置換され得る。PSは 、必要に応じて、PGで置換され得る。組成物は、LMSに、保存および投与の両方 の間の安定性を付与するように選択される。 当業者は、前記のリストの各リン脂質が、リン脂質のグリセロール部分にエス テル化された脂肪酸部分に依存してその構造が変化し得ることを容易に理解する 。一般に、ほとんどの市販の形態の特定のリン脂質が使用され得る。しかし、特 定の脂肪酸部分を含むリン脂質は、特定の適用について好ましくあり得る。 ISS含有組成物を含有するリポソームを調製するための一般的なプロセスは、 以下の通りである。リポソームの水性の分散液は、リン脂質（例えば、PS、PC、 PG、SM、およびPE）および糖脂質のような膜成分から、任意の公知の方法に従っ て調製される。例えば、Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9:467(1980)を参照のこと 。リポソームはさらに、ステロール、ジアルキルホスフェート、ジアシルホスフ ァチジン酸、ステアリルアミン、α-トコフェノールなどを、リポソーム膜中に 含み得る。 このように調製されたリポソーム分散液に、ISS含有組成物の水性溶液が添加 され、そしてその混合物は、所定の時間、好ましくは、膜の相転移温度より上の 温度に暖められながら、または40℃より上に暖められながら静置され、その後冷 却され、それによりリポソーム膜中にISS含有組成物を含有するリポソームを調 製する。 あるいは、所望のリポソームはまた、上記の膜成分およびISS含有組成物を予 め混合させ、そしてその混合物をリポソームの調製についての公知の方法に従っ て処理することによって調製され得る。 脂質ベシクルは、当該分野で公知の任意の適切な技術によって調製され得る。 方法には、ミクロカプセル化、ミクロフルイダイゼーション、LLC法、エタノー ル注入、フレオン注入、「バブル」法、界面活性剤透析、水和、超音波処理、お よび逆相エバポレーションが含まれるが、これらに限定されない。Watweら（199 5）Curr．Sci．68:715-724に総説される。例えば、超音波処理および透析法は、 一般に、小さい単層のベシクルを生成する；押出しおよび逆相エバポレーション は、一般に、より大きなベシクルを生成する。技術は、最も望ましい性状を有す るベシクルを提供するために組み合わされ得る。 必要に応じて、LMSはまた、膜の硬さを改善するためにステロイドを含む。ス テロイドの任意の量が使用され得る。適切なステロイドには、コレステロールお よびコレスタノールが含まれるが、これらに限定されない。膜の硬さを増大させ るために使用され得る他の分子には、架橋リン脂質が含まれるが、これらに限定 されない。 インビボでの使用に好ましい他のLMSは、細網内皮性系（これは、通常、天然 ではない物質を貪食し、そして破壊する）を回避する増強された能力を有し、そ れにより、リポソームに標的細胞に到達するためにより長い期間を与えるもので ある。この点に関して効果的な脂質組成物は、SMおよびコレステロール、または SMおよびPIの大きな比率を有するものである。延長された循環時間を有するLMS はまた、モノシアロガングリオシドGM1、グルクロニド、またはPEGを含むものを 含む。 本発明は、組織または細胞標的化成分を含むLMSを包含する。このような標的 化成分は、インタクトな動物、器官、または細胞培養物に投与される場合、他の 組織または細胞部位より優先し、特定の組織または細胞部位でのその集積を増強 する、LMSの成分である。標的化成分は、一般にリポソームの外側から接近可能 であり、そしてそれゆえ、好ましくは、外面に結合しているかまたは外側脂質二 分子膜に挿入されるかのいずれかである。標的化成分は、特にペプチド、より大 きなペプチドのある領域、細胞表面分子もしくはマーカーに特異的な抗体、また はそれらの抗原結合フラグメント、核酸、炭水化物、複合体炭水化物のある領域 、特別の脂質、あるいは薬物、ホルモンまたは前記分子のいずれかに付着される ハプテンのような低分子であり得る。細胞型特異的細胞表面マーカーへの特異性 を有する抗体は、当該分野で公知であり、そして当該分野で公知の方法によって 容易に調製される。 LMSは、治療処置が指向されるべき（例えば、免疫応答を調節しそして/または 免疫応答に関与し得る細胞型）に任意の細胞型標的化され得る。このような標的 細胞および器官は、マクロファージ、樹状細胞およびリンパ球のようなAPC、リ ンパ節および脾臓のようなリンパ構造、および非リンパ構造（特に、樹状細胞が 見出される構造）を含むが、これらに限定されない。 本発明のLMS組成物は、さらに界面活性剤を含み得る。界面活性剤はカチオン 性、アニオン性、両親媒性、または非イオン性であり得る。界面活性剤の好まし いクラスは、非イオン性界面活性剤である；水溶性である界面活性剤が特に好ま しい。非イオン性、水溶性界面活性剤は、脂肪性アルコールのポリオキシエチレ ン誘導体、脂肪性アルコールの脂肪酸エステルおよびグリセリルエステルを含み 、ここで、ポリオキシエチレン基は、アルコール基ヘエーテル結合を介して結合 している。例は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエ チレンひまし油誘導体、ポリオキシエチレン硬化ひまし油誘導体、および脂肪酸 ナトリウム塩、コール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよび ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含むが、これらに限定されない。 本発明に包含されるLMS組成物は、ミセルを含む。本明細書で使用されるよう な用語「ミセル」とは、特定の温度（クラフト点）または特徴的な濃度、臨界ミ セル濃度（cmc）を超える水溶液中で界面活性剤(tenside)分子から形成する凝集 体を意味する。cmcを超える場合、モノマー濃度は、実際には、一定なままであ り、そして過剰の界面活性剤(tenside)分子がミセルを形成する。ミセルとは、 界面活性剤物質の熱力学的に安定な会合コロイドである。ここで、モノマーの疎 水性ラジカルは、凝集体の内側に位置し、疎水性相互作用によって結合される； 親水基が水に面し、そして溶媒和によってコロイドの可溶性を提供する。ミセル は、界面活性剤(tenside)の化学的構成および溶液の温度、濃度またはイオン強 度に依存して、種々の形状（球状、棒状、円盤状）を生じる。cmcへの到達は、 表面張力、浸透圧、電導率および粘性の突然の変化により明らかになる。 ISS含有組成物を含むミセルを調製するためのプロセスは、以下のとおりであ る。ミセル形成界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス テル、ポリオキシエチレンひまし油誘導体、ポリオキシエチレン硬化ひまし油誘 導体、および脂肪酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン脂 肪酸エステルおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルグリコシド ）は、ミセル分散物を調製するために、cmcを超える濃度で水に添加される。ミ セル分散物に対して、ISS含有組成物の水溶液が添加され、そしてその混合物は 、所定の時間の間、好ましくは40℃以上の加熱下で、続いて、冷却下で静置され 、それによって、ミセル膜にISS含有組成物を含むミセルを調製する。あるいは 、所望のミセルはまた、上記のミセル形成物質とISS含有組成物とを予め混合し 、そしてミセル形成について公知の方法に従ってその混合物を処理することによ って、調製され得る。ISS 合成 a)ISS ISSは、当該分野で周知の技術および核酸合成装置（これらは、酵素的方法、 化学的方法、およびより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を含むが、これら に限定されない）を使用して合成され得る。例えば、Ausubelら(1987);およびSa mbrookら(1989)を参照のこと。酵素的に構築される場合、個々の単位は、例えば T4 DNAまたはRNAリガーゼのようなリガーゼで連結され得る。米国特許第5,124,2 46号。オリゴヌクレオチドの化学的合成には、従来の自動化方法（例えば、War nerら（1984）DNA 3:401によって開示されるホスホルアミダイト法）が含まれ得 る。米国特許第4,458,066号もまた参照のこと。オリゴヌクレオチド分解は、米 国特許第4,650,675号で例示されるような、ヌクレアーゼへのオリゴヌクレオチ ドの曝露によって達成され得る。 ISSはまた、従来のポリヌクレオチド単離手順を使用して単離され得る。この ような手順は、共有されるヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノム またはcDNAライブラリーとのハイブリダイゼーション、共有される構造上の特徴 を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、およびポリメラーゼ 連鎖反応による特定のネイティブ配列の合成を含むが、これらに限定されない。 環状ISSは単離され得るか、組換え方法によって合成されるかまたは化学的に 合成され得る。環状ISSが単離方法または組換え方法によって得られる場合、好 ましくはISSはプラスミドである。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学的 合成は、文献に記載される任意の方法を使用して実施され得る。例えば、Gaoら （1995）Nucleic Acids Res．23:2025-2029；およびWangら（1994）Nucleic Aci ds Res．22:2326-2333を参照のこと。 ISSはまた、亜リン酸ベースの改変されたオリゴヌクレオチドを含み得る。こ れらは標準的な化学的変態を使用して合成され得る。メチルホスホネートの効率 的な固体支持に基づく構築もまた記載されている。ホスホトリエステル(Miller ら（1971）JACS 93:6657-6665)、ホスホルアミデート(Jagerら（1988）Biochem ．27:7247-7246)、およびホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)のよう な他の亜リン酸ベースの改変されたオリゴヌクレオチドの合成もまた記載されて いる。他の非亜リン酸ベースの改変されたオリゴヌクレオチドもまた使用される 。Stirchakら（1989）Nucleic Acids Res．17:6129-6141。 オリゴヌクレオチドに対してリン酸基改変を作製するための技術は、当該分野 で公知である。１つのこのような有用な技術の総説のために、標的オリゴヌクレ オチド産物のための中間体リン酸トリエステルが調製され、そして水性ヨウ素ま たは他の薬剤（例えば、無水アミン）を用いて天然に存在するリン酸トリエステ ルに酸化される。得られるオリゴヌクレオチドホスホルアミデートは、ホスホロ チオエートを産生するために硫黄で処理され得る。同じ一般的技術（硫黄処理工 程を除いて）がメチルホスホネートからメチルホスホアミダイトを産生するため に適用され得る。米国特許第4,425,732号;同第4,458,066号:同第5,218,103号;お よび同第5,453,496号もまた参照のこと。 塩基改変ヌクレオシドの調製、および前駆体として前記塩基改変ヌクレオシド を使用する改変されたオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、米国特許第4,910, 300号,同第4,948,882号;および同第5,093,232号に記載されている。これらの塩 基改変ヌクレオシドは、化学合成によって、オリゴヌクレオチドの末端位置また は内部位置のいずれかに組み込まれ得るように設計される。オリゴヌクレオチド の末端位置または内部位置のいずれかに存在する、このような塩基改変ヌクレオ シドは、ペプチドまたは他の抗原の付着のための部位として働き得る。糖部分を 改変されたヌクレオシドもまた、記載（例えば、これらは米国特許第4,849,513 号、同第5,015,733号、同第5,118,800号、同第5,118,802号を含むが、これらに 限定されない）され、そして同様に使用され得る。 ｂ）免疫調節分子 弱毒化および不活化したウイルスは、抗原として本明細書における使用のため に適切である。これらのウイルスの調製は、当該分野で周知である。ポリオウイ ルスは、βプロピオラクトンのような化学的薬剤によって不活化され得る。Jian gら(1986)。A型肝炎ウイルスの弱毒化株の増殖は、記載され（Bradleyら、(1984 )）、そして弱毒化麻疹ウイルスの増殖も記載されている（Jamesら、(1995)）。 さらに、弱毒化および不活化ウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウ イルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒトおよび非ヒトパピローマウイル スおよびスローブレインウイルス）は、ペプチド抗原を提供し得る。 アレルゲンは、免疫調節分子として本明細書における使用のために適切である 。多くのアレルゲンの調製は、当該分野で周知であり、ブタクサ花粉アレルゲン 抗原E(Amb al)(Rafnarら1991)、主要粉塵ダニアレルゲンDer pIおよびDer PII(C huaら(1988):およびChuaら(1990))、シラカバ花粉Betvl(Brecitnederら1989)、 イエネコアレルゲンFel dl(Rogersら(1993)、および木の花粉からのタンパク質 抗原(Elsayedら(1991))の調製を含むが、これらに限定されない。インビボ投与 のための草花粉由来のタンパク質抗原の調製が報告されている。Malley(1989)。 免疫調節ペプチドは、ネイチィブであり得るかまたはは化学的もしくは酵素的 に合成され得る。当該分野で公知である化学的合成の任意の方法が、適切である 。溶液相ペプチド合成が中程度のサイズのペプチドの構築のために使用され得、 またはペプチドの化学的構築のためには、固相合成が使用され得る。Athertonら （1981）Hoppe Seylers Z．Physiol．Chem．362:833-839。タンパク質分解性酵 素もまた、ペプチドを産生するようにアミノ酸を結合するために利用され得る。 Kullmann（1987）Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Inc.。あるいは、 ペプチドは、細胞の生化学的機構を使用することによって、または生物学的供給 源からの単離によって得られ得る。組換えDNA技術は、ペプチドの産生のために 使用され得る。Hamesら、（1987）Transcription and Translation:A Practical Approach，IRL Press。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィのよ うな標準的技術を使用して単離され得る。 好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、ステロール、脂肪酸、および リン脂質）、H.インフルエンザワクチンに使用されるようなポリサッカライド、 ガングリオシドおよび糖タンパク質である。これらは、単離、ならび化学的方法 および酵素的方法を使用する、合成を含む、当該分野で公知のいくつかの方法に よって得られ得る。特定の場合（例えば、多くのステロール、脂肪酸およびリン 脂質についての場合）、分子の抗原部分は市販されている。c)ISS- 免疫調節分子結合体 ISS部分は、共有的相互作用および/または非共有的相互作用を含む、種々の方 法で、結合体の免疫調節分子部分と結合され得る。 部分間の連結は、ISSの３’末端もしくは５’末端で、またはISSの内部位置の 適切に改変された塩基でなされ得る。免疫調節分子がペプチドであり、そして適 切な反応性基（例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含む場合、こ れは、シトシン残基のN4アミノ基と直接反応され得る。ISS中のシトシン残基の 数および位置に依存して、１つ以上の残基での特異的標識が、達成され得る。 あるいは、当該分野で公知のような、改変されたオリゴヌクレオシドが、ISS 中の末端または内部位置のいずれかに組み込まれ得る。これらは、ブロックされ た官能基を含み得、脱ブロックされる場合、これは種々の官能基（これは、目的 の免疫調節分子に存在し得るか、またはこれと結合され得る）と反応性である。 免疫調節分子がペプチドである場合、結合体のこの部分は、固体支持体化学に よってISSの３’末端に結合され得る。例えば、ISS部分は、支持体上で予め合成 されたポリペプチド部分に付加され得る。Haralambidisら（1990a）Nucleic Aci ds Res．18:493-499；およびHaralambidisら（1990b）Nucleic Acids Res．18:5 01-505。あるいは、ISSは、３’末端から伸張している切断可能なリンカーを通 して固体支持体へ連結されるように合成され得る。支持体からISSの化学的切断 の際、末端チオール基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に残されるか(Zuckerm annら（1987）Nucleic Acids Res．15:5305-5321;およびCoreyら（1987）Scienc e 238:1401-1403)、あるいは末端アミン基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に 残される(Nelsonら（1989）Nucleic Acids Res．17:1781-1194)。ペプチドのア ミノ基へのアミノ改変されたISSの結合は、Benoitら（1987）Neuromethods 6：4 3-72に記載されるように実施され得る。ペプチドのカルボキシル基へのチオール 改変ISSの結合は、Sinahら（1991）Oligonucleotide Analogues:A Practical Ap proach，IRL Pressに記載されるように実施され得る。ペプチドのシステイン残 基のチオール側鎖への、付加されたマレイミドを有するオリゴヌクレオチドの結 合もまた、記載されている。Tungら（1991）Bioconjug．Chem．2:464-465。 結合体のペプチド部分は、合成の間にオリゴヌクレオチドへ組み込まれたアミ ン、チオール、またはカルボキシル基によって、ISSの５’末端へ結合され得る 。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固体支持体へ固定されるが、一方の末端に 保護されたアミン、チオールまたはカルボキシルを含み、他方にホスホルアミダ イトを含む連結基は、５’ヒドロキシルに共有結合される。Agrawalら（1986）N ucleic Acids Res．14:6227-6245;Connolly（1985）Nucleic Acids Res．13:448 5-4502;Kremskyら（1987）Nucleic Acids Res.15:2891-2909;Connolly（1987）N ucleic Acids Res，15:3131-3139;Bischoffら（1987）Anal．Biochem．164:336- 344;Blanksら(1988)Nucleic Acids Res．16:10283-10299；および米国特許第4,8 49,513号、同第5,015,733号、同第5,118,800号、および同第5,118,802号。 脱保護に続いて、潜在的なアミン、チオールおよびカルボキシル官能性は、ペプ チドへのオリゴヌクレオチドの共有結合のために使用され得る。Benoitら(1987) ；およびSinahら(1991)。 ペプチド部分は、ISSの任意の位置で改変されたシトシンまたはウラシルに結 合され得る。改変された塩基のC-5での、潜在的反応性官能性（例えば、アミン またはカルボキシル基）を有する「リンカーアーム」の組み込みは、ペプチド連 結のためのハンドルを提供する。Ruth，4th Annual Congress for Recombinant DNA Research、123頁。 ISS免疫調節分子結合体はまた、非共有的相互作用（例えば、イオン結合、疎 水性相互作用、水素結合および/またはファンデルワールス力）によって形成さ れ得る。 非共有的に連結された結合体は、ビオチン-ストレプトアビジン複合体のよう な非共有的相互作用を含み得る。ビオチニル基は、例えば、ISSの改変塩基に結 合され得る。Rogetら（1989）Nucleic Acids Res．17:7643-7651。ペプチド部分 へのストレプトアビジン部分の組み込みは、ストレプトアビジン結合ペプチドと ビオチン化オリゴヌクレオチドの非共有結合複合体の形成を可能にする。 非共有的会合はまた、ISSおよび免疫調節分子内の残基（例えば、荷電アミノ 酸）を含むイオン性相互作用によって、またはオリゴヌクレオチドおよび免疫調 節分子の両方と相互作用し得る、荷電した残基を含むリンカー部分の使用によっ て生じ得る。例えば、非共有結合は、全体的に、負に荷電したISSと、ペプチド の正荷電アミノ酸残基（例えば、ポリリジンおよびポリアルギニン残基）との間 に生じ得る。 ISSと免疫調節分子との間の非共有結合は、天然のリガンドとしてのDNAと相互 作用する分子のDNA結合モチーフによって生じ得る。例えば、このようなDNA結合 モチーフは、転写因子と抗DNA抗体に見出され得る。 脂質へのISSの連結は、標準的な方法を使用して形成され得る。これらの方法 は、オリゴヌクレオチド-リン脂質結合体(Yanagawaら（1988）Nucleic Acids Sy mp．Ser．19:189-192)、オリゴヌクレオチド-脂肪酸結合体(Grabarekら（1990） Anal．Biochem．185:131-135；およびStarosら（1986）Anal Biochem．156:220- 222)、およびオリゴヌクレオチド-ステロール結合体の合成を含むが、これらに 限定されない。Boujradら（1993）Proc．Natl Acad．Sci．USA 90:5728-5731。 オリゴサッカライドへのオリゴヌクレオチドの連結は、標準的な公知の方法を 使用して形成され得る。これらの方法は、オリゴヌクレオチド-オリゴサッカラ イド結合体（ここで、オリゴサッカライドは、イムノグロブリンの部分である） を含むが、これらに限定されない。O'Shannessyら（1985）J．Applied Biochem ．7:347-355。 ペプチドまたは抗原への環状ISSの連結は、いくつかの方法で形成され得る。 環状ISSが組換え方法または化学的方法を使用して合成される場合、改変された ヌクレオシドが適切である。Ruth（1991）Oligonucleotides and Analogues:A P ractical Approach，IRL Press。次いで、標準的な連結技術が、抗原または他の ペプチドへ環状ISSを連結するために使用され得る。Goodchild（1990）Bioconju g．Chem．1:165。環状ISSが単離される場合、または組換え方法もしくは化学的 方法を使用して合成される場合、連結は抗原または他のペプチドに組み込まれて いる反応基（例えば、カルベン、ラジカル）を化学的活性化または光活性化する ことによって形成され得る。 オリゴヌクレオチドへのペプチドおよび他の分子の結合のためのさらなる方法 は、米国特許第5,391,723号；Kessler（1992）「Nonradioactive labeling meth ods for nucleic acids」Kricka（編）Nonisotopic DNA Probe Techniques，Aca demic Press；およびGeogheganら（1992）Bioconjug．Chem．3:138-146に見出さ れ得る。ISS に対する免疫応答の評価 ISS含有組成物への免疫応答の分析（定性および定量の両方）は、当該分野で 公知である任意の方法によってされ得、抗原特異的抗体産生、CD4+T細胞またはN K細胞のようなリンパ球の特定集団の活性化、および/またはIFN、IL-2、IL-4、 またはIL-12のようなサイトカインの産生の測定を含むが、これらに限定されな い。特異的抗体応答を測定するための方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA )を含み、そして当該分野で周知である。CD4+T細胞のような特定の型のリンパ 球の数の測定は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)で達成され得る。細胞傷害 性アッセイは、例えば、Razら（1994）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9519-95 23に記載されるように実施され得る。サイトカインの血清濃度は、例えば、ELIS Aによって測定され得る。免疫原への免疫応答を評価するためのこれらのアッセ イおよび他のアッセイは当該分野で周知である。例えば、Selected Methods in Cellular Immunology（1980）MishellおよびShiigi編、W.H．Freeman and Co.を 参照のこと。ISS の投与 ISSは、単独でまたは、他の医薬品および/または免疫原性薬剤および/または 免疫賦活性薬剤と組み合わせて投与され得、そしてそれらの生理学的に受容可能 なキャリアと組み合わされ得る。特定のISS処方物の有効量および投与方法は、 個々の患者、および疾患の段階および当業者に明らかな他の因子に基づいて変化 し得る。特定の適用に有用な投与経路は、当業者に明らかである。投与経路は、 局所的、皮膚、経皮、経粘膜、表皮非経口、消化管、および鼻咽頭、ならびに経 気管支および経肺胞を含む肺を含むが、これらに限定されない。適切な投薬量範 囲は、血液レベルによって測定される約１〜10μMの組織濃度に達するに十分なI SS含有組成物を提供する投薬量範囲である。各患者に与えられる絶対量は、バイ オアベイラビリティー、クリアランス速度、および投与経路のような薬理学的特 性に依存する。 本明細書に記載されるように、APCおよび高濃度のAPCを有する組織が、ISS含 有組成物の好ましい標的である。従って、咄乳動物皮膚および/または粘膜（こ こで、APCは比較的高濃度で存在する）へのISSの投与が、好ましい。 本発明は、生理学的に受容可能な移植物、軟膏剤、クリーム、リンスおよびゲ ルを含むがこれらに限定されない、局所的適用のために適切なISS含有組成物を 提供する。局所投与は、例えば、そこに送達システムが配置されている包帯（ド レッシングまたはバンテージ）によって、あるいは切開または開放創への送達シ ステムの直接投与による。ISS含有組成物が配置されているクリーム、リンス、 ゲル、または軟膏剤は、局所的な軟膏剤または創傷充填薬剤としての使用のため に適切である。 経皮投与の好ましい経路は、侵襲性が最も少ない経路である。これらの中の好 ましい手段は、経皮伝達、表皮投与および皮下注射である。これらの手段の中で 、表皮投与が、皮内組織に存在することが予測される、より高濃度のAPCのため に好ましい。 経皮投与は、ISS含有組成物が皮膚に浸透し、そして血流に侵入することを可 能にし得る、クリーム、リンス、ゲルなどの適用によって達成される。経皮投与 のために適切な組成物は、皮膚に直接適用されるか、あるいは経皮デバイス（い わゆる「パッチ」）ような保護キャリアへ組み込まれる薬学的に受容可能な懸濁 液、オイル、クリーム、および軟膏を含むが、これらに限定されない。適切なク リーム、軟膏などの例は、例えば、Physician's Desk Referenceで見出され得る 。 経皮伝達のためには、イオントフォレーシスが適切な方法である。イオントフ ォレーシスによる伝達は、市販パッチ（これは、数日またはぞれ以上の期間の間 、未破壊の皮膚を通して、その生成物を連続的に送達する）を使用して達成され 得る。この方法の使用は、比較的高濃度の医薬組成物の制御された伝達を可能に し、併用薬物の注入を許容し、そして吸収促進因子の同時使用を可能にする。 この方法に使用するための例示的なパッチ製品は、General Medical Company （Los Angeles，CA）のLECTRO PATCHという商標の製品である。この製品は、中 性pHにリザーバー電極を電気的に保持し、そして異なる濃度の投薬を提供し、連 続的におよび/または周期的に投与するように適合され得る。パッチの調製およ び使用は、LECTRO PATCH製品に添付された製造者の印刷した説明書（これらの説 明書は、参考として本明細書中で援用される）に従って実施ざれるべきである。 経皮伝達のためには、低周波超音波送達もまた、適切な方法である。Mitragot riら(1995)Science 269:850-853。低周波超音波周波数（約1MHz）の適用は、治 療組成物（これは、高分子量の組成物を含む）の、一般的な制御された送達を可 能にする。 表皮投与は、刺激物に対して免疫応答を引き起こすために十分に表皮の最も外 側の層を機械的または化学的に刺激することを本質的に含む。詳細には、刺激は 、刺激部位にAPCを誘引するのに十分であるべきである。 機械的刺激手段は、複数の非常に小さな直径の短い尖叉（これは、尖叉の端か ら移されたISS含有組成物を取り込むように、皮膚を刺激し、そして刺激部位へA pCを誘引するためのに使用され得る）を使用する。例えば、Pasteur Merieux（ リヨン,フランス）によって製造されたMONO-VACC旧ツベルクリン試験は、ISS含 有組成物の導入のために適切なデバイスを含む。 デバイス（これは、Swiftwater、PAのConnaught Laboratories，Inc.によって 米国で販売されている）は、一方の末端にシリンジプランジャーを、他方の末端 に尖叉ディスクを有するプラスチック容器からなる。尖叉ディスクは、表皮細胞 の最も外側の層をちよっと引っ掻く長さの小さな直径の複数の尖叉を支持する。 MONO-VACCキットの各尖叉は、旧ツベリクリンでコートされでいる；本発明にお いて、各針は、ISS含有組成物の薬学的組成物でコートされる。このデバイスの 使用は、好ましくは、デバイス製品と共に含まれる製造者の書面による説明書に 従う。同様のデバイス（これもまた、この実施態様において使用され得る）は、 アレルギー試験を実施するために現在使用されるデバイスである。 ISSの上皮投与に対する別の適切なアプローチは、表皮の最も外側の細胞を刺 激する化学物質の使用により、十分な免疫応答を引き起こして領域に対してAPC を誘引することである。例は、Noxema CorporationによりNAIRの商標のもとで販 売される市販の局所的な脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸のようなケ ラチン分解性薬剤（keratinolytic agent）である。このアプローチはまた、粘 膜における上皮投与を達成するために使用され得る。化学刺激剤はまた、（例え ば、MONO-VACC型枝（tine）もまた化学刺激剤で被膜される場合に生じるような ）機械的な刺激剤と組み合わせて適用され得る。ISSは、化学刺激剤もまた含む キャリア中に懸濁され得るか、またはキャリアと共投与され得る。 ISS含有組成物を投与するための別の送達方法は、合成ポリカチオン性アミノ ポリマーのような非脂質ポリマーを使用する。Leff（1997）Bioworld 86:1-2。 投与の非経口経路には、のような電気的（イオン注入）もしくは中心静脈系統 への直接注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、または皮下注 射のような直接注入が含まれるがこれらに限定されない。非経口投与に適切な組 成物には、薬学的に受容可能な滅菌等張溶液が含まれるがこれに限定されない。 このような溶液には、ISS含有組成物の注射のための、生理食塩水およびリン酸 緩衝化生理食塩水が含まれるがこれらに限定されない。 投与の消化管経路には、摂取および直腸が含まれるがこれらに限定されない。 本発明は、消化管投与に適切なISS含有組成物を含み、これは摂取のための薬学 的に受容可能な粉末、丸剤、または液体および直腸投与のための坐薬を含むがこ れらに限定されない。 投与の鼻咽頭および肺経路には、吸入、経気管支性経路、および経肺胞経路が 含まれるがこれらに限定されない。本発明は、吸入投与に適切なISS含有組成物 を含み、これは吸入のための種々のタイプのエアロゾル、ならびに送達系のため の粉末形態を含むがこれらに限定されない。ISS含有組成物の吸入投与に適切な デバイスは、噴霧器および蒸発器が含まれるがこれらに限定されない。粉末で満 たされた噴霧器および蒸発器は、粉末の吸入送達においての使用に適切な種々の デバイスのうちの１つである。例えば、Lindberg（1993）Summary of Lecture a t Management Forum 6-7 December 1993「Creating the Future for Portable I nhalers」を参照のこと。 注射、局所的適用、噴霧器、および蒸発器に適切なデバイスを産生する方法は 、当該分野で公知であり、詳細には記載しない。 送達経路の選択は、誘発される免疫応答を調節するのに使用され得る。例えば 、IgG力価およびCTL活性は、インフルエンザウイルスベクターが筋肉内経路また は上皮（遺伝子銃）経路を介して投与された場合に同一であった；しかし、筋肉 接種は主にIgG2Aを生じるのに対し、上皮経路はほとんどIgG1を生じた。Pertmer ら（1996）J.Virol．70.6119-6125。従って、当業者は、本発明の免疫調節オリ ゴヌクレオチドを投与する異なる経路によって誘発される、免疫原性におけるわ ずかな差異を利用し得る。 上記の組成物および投与の方法は、本発明のISS含有組成物を投与する方法を 記載することを意味するが、限定されない。種々の組成物およびデバイスを産生 する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書中に詳細には記載されない 。 ISSについてのスクリーニング 本発明はまた、ISSの免疫調節活性についてスクリーニングする方法を提供す る。特に、提供される方法は、インビボでTh1型免疫応答を刺激する能力につい てのISSのインビトロスクリーニングを可能にする。実施例６に記載のように、 スクリーニング方法は、マウス細胞株(例えば、P388D.1)またはヒト細胞株（例 えば、90196.B.）のいずれかの使用を含み得る。これらの細胞株の、潜在的なIS S活性を有するオリゴヌクレオチドでの処置、および続く、処置した細胞からの サイトカイン産生の決定は、インビボで投与された場合のオリゴヌクレオチドの 免疫刺激活性に関する確実な指標を提供した。細胞株(例えば、P338D.1および／ または90109.B.)の使用は、オリゴヌクレオチド組成物の効果が測定され得る容 易に利用可能な一貫した細胞集団を可能にする。一般的には、サイトカイン（例 えば、IL-6および／またはIL-12）産生を刺激する0.1〜10μg/mlの範囲の濃度か ら２ng/mlを越える濃度で培養上清中に投与されたオリゴヌクレオチドは、48〜7 2時間後に、免疫調節活性を示す。このような評価をもたらずのに有用なインビ トロ技術についての詳細は、実施例に記載される；当業者にはまた、本明細書中 に教示されるパラメーターに沿って、サイトカイン分泌および抗体産生を測定す るほかの方法を知っているか、または容易に確認し得る。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが限定しない。 実施例 実施例１ ISSオクタヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドによる サイトカイン産生の刺激 上記のように、ポリヌクレオチドにおけるISS活性を、最初に、非メチル化CpG ジヌクレオチドを含むDNAと関連付けた。ISSエレメントを、ヘキサマー配列、好 ましくは配列5'-プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン-3'としてさら に規定した（Kriegら（1995））。不運なことに、免疫刺激活性を予測するヘキ サマー配列によると、ほとんどの場合、不活性オリゴヌクレオチドを生じる。し かし、本明細書中に提供されるさらなる実験は、ISSヘキサマーの周囲のヌクレ オチドは、ISSエレメントに関連する免疫刺激活性に有意に寄与し得ることを示 す。特に、特定のISS配列は、Th1型免疫応答を刺激することが同定されている。 このようなISSエレメントを同定した実験を、以下に記載する。 150を越える異なるオリゴヌクレオチド（例えば表１を参照のこと）を、マウ ス脾細胞および／またはヒト末梢血単核細胞（hPBMC）における免疫刺激活性に ついて試験した。オリゴヌクレオチドに対する応答における免疫刺激を、培養培 地へのサイトカイン分泌の測定、および細胞増殖によって評価した。培養上清に おけるサイトカインレベルを、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）試験によって 決定した。 オリゴヌクレオチドを、標準的な固相オリゴヌクレオチド技術を用いて合成し た。固相用アナログモノマー（solid phase ready analog monomer）を、Glen R esearch，Sterling，VAから購入し、そして標準的な様式で固相オリゴヌクレオ チド合成器に含めた。オリゴヌクレオチドの合成を、TrLink Bio Technologies Inc.，SanDiego，CAによって行った。 細胞を、標準的な技術を用いて単離し、そして調製した。hPBMCを、健常ドナ ー由来のヘパリン処理した末梢血から、フィコール−ジアトリゾ酸ナトリウム勾 配によって単離した。BALB/cマウスの脾臓を採取し、そして脾細胞を標準的な掻 き裂き法（teasing）を用いて、そしてBioWhittaker，Inc.からのACK溶解緩衝液 で処理して単離した。単離した細胞を、２％熱非働化ウシ胎児血清（FCS）、50 μM 2-メルカプトエタノール、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、および２m M L-グルタミンを補充したRPMI1640培地で洗浄し、そして10％FCS/RPMI（10％熱 非働化FCS、50μM 2-メルカプトエタノール、１％ペニシリン-ストレプトマイシ ン、および２mM L-グルタミンを含むRPMI 1640培地）に、約４×106細胞/mlで再 懸濁した。 一般的には、細胞培養を、細胞を含む10％FCS/RPMI 100μｌ中に96ウェルのフ ラットマイクロタイタープレートにおいて、約４×105細胞/ウェルで三連に設定 した（プレーティング後少なくとも１時間静置させた）。オリゴヌクレオチド活 性アッセイのために、オリゴヌクレオチドを10％FCS/RPMIで希釈し、そして所望 のオリゴヌクレオチド希釈物の100μlを、適切なウェルに添加した。一般的には 、 最終オリゴヌクレオチド濃度は、0.1μg/ml、1.0μg/ml、および10μg/mlを含ん だ。次いで、細胞を、１、２、または３日間インキュベートした。 細胞増殖を測定するために、100μlの上清を、適切な日に各ウェルから採取し 、1.0μMの滴定したチミジンでパルスし、そして一晩インキュベートした。滴定 したチミジンの取り込みを評価するための標準的な方法を使用して、細胞増殖を 測定した。細胞によるサイトカイン産生を、サイトカインに対する市販の抗体を 用いて、培養上清のELISAによって測定した。 このような実験の結果を、図１〜３において図示する。使用したオリゴヌクレ オチドは以下を含んだ： これらの実験で使用した全てのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨 格を含んだ。 図１〜３に示されるように、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド１、２、 および７（それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号７）は、マウス 脾細胞からのIL-12、IFN-γ、およびIL-6の分泌の強力な刺激因子である。これ らのオリゴヌクレオチドはまた、hPBMCからのサイトカイン分泌を刺激する。全 ての３つのこれらのオリゴヌクレオチドは、5'-プリン、プリン、シトシン、グ アノシン、ピリミジン、ピリミジン、シトシン、グアノシン-3'の好ましいオク タヌクレオチド配列を含む（表１を参照のこと）。 免疫刺激活性を有するさらなるオリゴヌクレオチドの例としては、オリゴヌク レオチド４および６（配列番号４および配列番号６）が挙げられる。これらの免 疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、好ましいオクタヌクレオチド配列を含む（表 １を参照のこと）。図１〜３および表１はまた、オリゴヌクレオチドにおけるヘ キサマーISSエレメント（5'-プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン-3 'としてKriegら（1995）によって規定される）の含有は、オリゴヌクレオチドに ついての免疫刺激活性の確実な予測ではなかったことを示した。例えば、オリゴ ヌクレオチド５、および８〜11を参照のこと。 実施例２ 修飾された塩基を含むISSによるサイトカイン産生の刺激 修飾された塩基を含むいくつかのオリゴヌクレオチドを、マウス脾細胞および hPBMCにおける免疫刺激活性について試験した。オリゴヌクレオチドに対する応 答における免疫刺激を、上記のように、培養培地へのサイトカイン分泌の測定、 および細胞増殖によって評価した。細胞培養およびオリゴヌクレオチド活性アッ セイを、上記のように設定し、そして行った。 図４〜６は、マウス脾細胞を表２（ここでｂは、5-ブロモシトシンであり、そ してISSオクタマー配列は、太字および下線を付す）に列挙したオリゴヌクレオ チドとともに培養した実験からのサイトカイン産生および細胞増殖結果を示す。 オリゴヌクレオチドを、1.0μg/mlまたは10μg/mlの最終濃度で使用した。少な くとも１つのISSを含むオリゴヌクレオチドでの細胞の処理は、細胞からのIL-6 およびIL-12の産生、ならびに細胞増殖の刺激を生じた。修飾されたISSを含むオ リゴヌクレオチドは、一般的には、未修飾ISSを含むオリゴヌクレオチドと同程 度またはそれ以上に有効であった。ISSを含まないオリゴヌクレオチドは、IL-6 もしくはIL-12産生または細胞増殖を刺激し得なかった。この実験において使用 した全てのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含んだ。 実施例３ アジュバント共投与での免疫応答の相乗作用 抗原に対する免疫応答における抗原およびISSでのアジュバント共投与の効果 を、アジュバントとして水酸化アルミニウム（ミョウバン）および水中油エマル ジョンアジュバントとしてMF59を用いて実験した。１μg AgE（Amb alとしても 公知、短ブタクサの主要なアレルギー成分）を含む組成物を、マウスに、０、２ 、および４週で、皮内注射した。使用した抗原組成物を表３に列挙する。オリゴ ヌクレオチド２（配列番号２）を、示される組成物において使用した。 マウスの血清における抗AgE抗体の量を、０日および２、４、および６週で測 定した。抗AgE IgG1および抗AgE IgG2a抗体アッセイを、マイクロタイタープレ ート上の被膜抗原として本来のAgEワクチンを使用し、Razら（1996）に記載され る様に、ELISA試験によって行った。抗AgE IgEを、標準的なラジオイムノアッセ イ技術によって測定した。これらの実験の結果を、図７〜９に示す。 図７に示されるように、抗原単独またはISSとの混合物の投与は、ほとんど抗A gE IgG2a産生を生じなかったのに対して、抗原ISS結合体の投与は、優位なレベ ルの抗AgE IgG2a抗体を産生した。抗原ISS結合体およびアジュバントMF59の同時 の共投与は、抗原ISS結合体単独の投与から得られたものと比較して、抗AgE IgG 2a抗体産生において約２倍の増加を生じた。従って、近位の関係（例えば、結合 体の形態）における抗原およびISSの投与、またはMF59および抗原ISSの共投与は 、それぞれ、抗原または抗原ISS結合体によって生成される一次Th1型免疫応答を 増加し、このことはISSが独立したアジュバント活性を有することを示した。 ミョウバンおよび抗原ISS結合体の共投与の結果としての抗AgE IgG2a産生はま た、抗原およびミョウバンの共投与の結果と比較して、ISSに関連する独立した アジュバント活性を示す（図９）。 CpG含有オリゴヌクレオチドは、最近、抗原および不完全フロイントアジュバ ント（IFA）とともに投与された場合、IFAを用いる抗原単独の投与に対し生成さ れるTh2型応答と比較して、Th1型免疫応答を促進することが示された。Chuら（1 997）J.Exp.Med．10:1623-1631。この研究において、オリゴヌクレオチドはいつ も、IFAの存在下で投与された。この研究は、CpG含有オリゴヌクレオチドの抗原 およびアジュバントとの共投与がTh2型応答からTh1型応答への免疫応答における シフトを生じ得ることを示すが、本発明において示されるような、オリゴヌクレ オチドの独立したアジュバント活性を示す実験は、全く行われなかった。 実施例４ ISSを含む組成物の投与後の宿主におけるTh1型応答の選択的誘導 本明細書中に記載したように、Th1型免疫応答は、特定のサイトカイン（例え ば、IFN-γ）の産生に関連し、そしてCTLの産生を生じる。 Th1型免疫応答が、本発明のISSオリゴヌクレオチド組成物を受けるマウスにお いて産生されるかどうかを決定するために、マウスを、種々の組成物中のβ-ガ ラクトシダーゼ（β-Gal）タンパク質で、ISSオリゴヌクレオチドの共投与を伴 うかまたは伴わずに免疫化した。使用した組成物は、１または10μgのβ-Galを 含み、そして表４に列挙する。 BALB/cマウスを、上に示される量および組成で皮内注射し、そして注射２週間 後に屠殺した。抗原依存性CTL応答およびサイトカイン分泌プロフィールを、イ ンビトロで試験した。CTL応答を、Satoら（1996）に記載されるように測定した 。サイトカイン分泌を、ELISA試験によって測定した。未処置のマウスもまた、 実験に含めた。結果を、図10〜13に示した。 免疫応答の初期の時点（組成物の投与後２週間）で、CTL活性を、ISSと結合体 化した抗原10μgを受けるマウスの細胞から見出した（図10）。ISSと結合体化し たβGal１μgを受けるマウス由来の脾細胞は、ISSと結合体化したβGal10μｇを 受けるマウスのものと匹敵するCTL活性の量を生成した（図11）。IFN-γ（Th1に 偏ったサイトカイン）は、ISSと結合体化したβGalを受けたマウスの細胞からの み産生された（図12）。これらのマウスからの細胞はまた、IL-10（Th2に偏った サイトカイン）を産生した（図13）。 実施例５ 抗原ISS組成物に対する霊長類免疫応答 インビトロおよびマウス実験を超えてISSの免疫調節活性を実験するために、I SSの存在下での免疫応答を霊長類において実験する。 カニクイザルを、10μgのＢ型肝炎表面抗原（HBsAｇ）単独、または50μgのオ リゴヌクレオチド２（配列番号２）もしくは500μgのオリゴヌクレオチド２のい ずれかと混合して、０、４、および８週で、筋肉内免疫化した。HBsAgに対する 抗体応答を、Abbott Laboratories AUSABキットを用いて、４週（最初の注射の ４週後）、５週（最初の注射の５週後および第２の注射の１週後）、および８週 （最初の注射の８週後および第２の注射の４週後）で測定した。結果を、図14、 15、および16に示す。実験した各時点で、抗原のISSとの共投与は、抗原に対す るより大きな抗体応答を一般に生じた。従って、霊長類において、ISSは、共投 与した抗原に対する免疫応答の生成において、アジュバント様活性を提供する。 カニクイザルを用いる実験において、ISSおよび抗原を、混合物として投与し た。霊長類におけるISS抗原結合体の免疫調節活性を決定するために、ヒヒを、I SS-Amb al結合体を含む組成物で注射した。適切な間隔で、抗原特異的免疫応答 を、本明細書中に記載したように決定した。例えば、抗原特異的血清抗体レベル を決定し、そして免疫化前の血清におけるそのようなレベルと比較する。 実施例６ 免疫刺激オリゴヌクレオチドについてのスクリーニング方法 潜在的なISS活性を有するオリゴヌクレオチドを同定するために、細胞株を、 試験するべきオリゴヌクレオチドで処理し、そして得られたサイトカイン産生が 存在する場合に測定する。ISS活性のスクリーニングに使用した細胞株は、マウ ス細胞株P388D.1またはヒト細胞株90196.Bであり、これらは両方とも、アメリカ ンタイプカルチャーコレクションより入手可能である。 細胞を、標準的な技術を用いて増殖させ、そして調製する。細胞を、増殖期の 間に採取し、そして２％熱非働化ウシ胎児血清(FCS)、50μM 2-メルカプトエタ ノール、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、および２mM L-グルタミンを補充 したRPMI 1640培地で洗浄し、そして10％FCS/RPMI中に、約４×106細胞/mlで再 懸濁した。 細胞培養を、細胞を含む10％FCS/RPMI 100μl中96ウェルのフラットマイクロ タイタープレートにおいて、約４×105細胞/ウェルで三連に設定する（プレーテ ィング後少なくとも１時間静置させた）。試験するオリゴヌクレオチドを10％FC S/RPMIで希釈し、そしてオリゴヌクレオチド希釈物の100μlを、適切なウェルに 添加する。一般的には、最終オリゴヌクレオチド濃度は、0.1μg/ml、1.0μg/ml 、 および10μg/mlを含む。次いで、細胞を、１、２、または３日間インキュベート する。 細胞増殖を測定するために、100μlの上清を、適切な日に各ウェルから採取し 、1.0μMの滴定したチミジンでパルスし、そして一晩インキュベートした。滴定 したチミジンの取り込みを評価するための標準的な方法を使用して、細胞増殖を 測定した。 細胞によるサイトカイン産生を、サイトカインに対する市販の抗体を用いて、 培養上清のELISAによって測定した。細胞へのオリゴヌクレオチドの添加の48ま たは72時間後の細胞培養上清における２ng/mlを超えるIFN-γおよび／またはIL- 12の検出は、オリゴヌクレオチドにおけるISS活性の指標である。IFN-γおよび ／またはIL-12の産生は、特に、Th1型ISS免疫応答を誘導する活性の指標である 。 前述の発明は、理解を明確にする目的ために例示および実施例としていくらか 詳細に記載されているが、特定の変化および修飾が実施され得ることは当業者に は明らかである。それゆえ、説明および実施例は、添付の請求の範囲によって記 載される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ディナ，ディノ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94618, オークランド，ブエナ ビスタ アベニュ ー 6140 (72)発明者 ラズ，アイル アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014, デル マー，マンゴー ドライブ 13658

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．免疫刺激配列(ISS)を含む免疫調節オリゴヌクレオチドであって、該ISSは以 下： からなる群より選択されるオクタヌクレオチド配列を含む、免疫調節オリゴヌク レオチド。 ２．配列番号２の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ３．配列番号４の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ４．配列番号１の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ５．配列番号６の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ６．配列番号７の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ７．配列番号12の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ８．配列番号15の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 ９．配列番号16の配列を含む、免疫調節オリゴヌクレオチド。 １０．前記オクタヌクレオチド配列の少なくとも１つのシトシンが、修飾された シトシンで置換されている、請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。 １１．前記修飾されたシトシンが少なくともC-5までの電子吸引性基の付加を含 む、請求項１０に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。 １２．前記修飾されたシトシンが少なくともC-6までの電子吸引性基の付加を含 む、請求項１０に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。 １３．前記修飾されたシトシンが5'-ブロモシチジンである、請求項１０に記載 の免疫調節オリゴヌクレオチド。 １４．前記オクタヌクレオチドの５’末端から３位のＣが5'-ブロモシチジンで 置換されている、請求項１０に記載の免疫調節オリゴヌクレオチド。 １５．前記ISSオクタヌクレオチドの５’末端から３位のＣが5'-ブロモシチジン で置換されており、そして該ISSオクタヌクレオチドの５’末端から７位のＣが5 '-ブロモシチジンで置換されている、請求項１０に記載の免疫調節オリゴヌクレ オチド。 １６．請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチドを含む免疫調節組成物であ って、抗原をさらに含む、免疫調節組成物。 １７．前記抗原が、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、および脂質からなる群よ り選択される、請求項１６に記載の免疫調節組成物。 １８．前記抗原が前記免疫調節オリゴヌクレオチドに結合体化されている、請求 項１６に記載の免疫調節組成物。 １９．請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチドを含む免疫調節組成物であ って、補助的刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、標的化タンパク質リガンド 、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾されたアミノ酸を含むペプチドか ら なる群より選択される促進因子をさらに含む、免疫調節組成物。 ２０．前記促進因子が前記免疫調節オリゴヌクレオチドに結合体化されている、 請求項１９に記載の免疫調節組成物。 ２１．請求項１に記載の免疫調節オリゴヌクレオチドを含む免疫調節組成物であ って、抗原をさらに含み、アジュバントをさらに含む、免疫調節組成物。 ２２．前記抗原が、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、および脂質からなる群よ り選択される、請求項２１に記載の免疫調節組成物。 ２３．前記抗原が前記免疫調節オリゴヌクレオチドに結合体化されている、請求 項２１に記載の免疫調節組成物。 ２４．免疫刺激配列（ISS）および抗原を含むポリヌクレオチドを含む免疫調節 組成物であって、該ISSが5'-シトシン、グアニン-3'を含み、そして該ISSと該抗 原とが結合体化しておらず、そして溶液中における該ISSおよび抗原の同時投与 と比較して免疫応答を増強するのに効果的な距離で近位に会合している、免疫調 節組成物。 ２５．前記ISSがパリンドローム領域を含み、そして該パリンドローム領域が5'- シトシン、グアニン-3'配列を含む、請求項２４に記載の免疫調節組成物。 ２６．前記ISSが5'-プリン、プリン、シトシン、グアニン、ピリミジン、ピリミ ジン-3'を含む、請求項２５に記載の免疫調節組成物。 ２７．前記ISSが以下： からなる群より選択される配列を含む、請求項２６に記載の免疫調節組成物。 ２８．前記ISSが以下： からなる群より選択される、請求項２６に記載の免疫調節組成物。 ２９．前記ISSおよび抗原が包膜化によって近位に会合されている、請求項２４ に記載の免疫調節組成物。 ３０．前記包膜化がリポソーム内である、請求項２９に記載の免疫調節組成物。 ３１．前記ISSおよび抗原が、プラットフォーム分子に結合することによって近 位に会合している、請求項２４に記載の免疫調節組成物。 ３２．前記ISSおよび抗原が、約0.04μm〜約100μm間での距離で近位に会合して いる、請求項２４に記載の免疫調節組成物。 ３３．前記距離が約0.1μm〜約20μmである、請求項３２に記載の免疫調節組成 物。 ３４．前記距離が約0.15μm〜約10μmである、請求項３３に記載の免疫調節組成 物。 ３５．前記ISSおよび抗原が、該ISSおよび該抗原が免疫標的に同時に送達される ように近位に会合している、請求項２４に記載の免疫調節組成物。 ３６．前記免疫標的がリンパ性構造である、請求項３５に記載の免疫調節組成物 。 ３７．前記免疫標的が抗原提示細胞である、請求項３５に記載の免疫調節組成物 。 ３８．前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項３７に記載の免疫調節組成物 。 ３９．前記抗原提示細胞がマクロファージ細胞である、請求項３７に記載の免疫 調節組成物。 ４０．前記抗原提示細胞がリンパ球である、請求項３７に記載の免疫調節組成物 。 ４１．アジュバントをさらに含む、請求項２４に記載の免疫調節組成物。 ４２．前記ISSおよび抗原が包膜化によって近位に会合している、請求項４０に 記載の免疫調節組成物。 ４３．前記ISSおよび抗原が、プラットフォーム分子に結合することによって近 位に会合している、請求項４０に記載の免疫調節組成物。 ４４．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項１に記載の免疫調 節オリゴヌクレオチドを、該免疫応答を調節するのに十分な量で該個体に投与す る工程を包含する、方法。 ４５．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項４４に記載 の方法。 ４６．個体における免疫応答を調節する方法であって、配列番号２の免疫調節オ リゴヌクレオチドを、該免疫応答を調節するのに十分な量で該個体に投与する工 程を包含する、方法。 ４７．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項４６に記載 の方法。 ４８．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項１６に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で該個体に投与する工程を包 含する、方法。 ４９．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項４８に記載 の方法。 ５０．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項１８に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、 方法。 ５１．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項５０に記載 の方法。 ５２．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項２１に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、 方法。 ５３．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項５２に記載 の方法。 ５４．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項２４に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、 方法。 ５５．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項５４に記載 の方法。 ５６．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項２８に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、 方法。 ５７．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項５６に記載 の方法。 ５８．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項４１に記載の免疫 調節組成物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、 方法。 ５９．前記免疫応答を調節する工程がTh1応答の誘導を含む、請求項５８に記載 の方法。 ６０．前記個体が、ガン、アレルギー性疾患、喘息、および感染性疾患からなる 群より選択される障害を患っている、請求項４４に記載の方法。 ６１．前記感染性疾患が、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、およびヒト 免疫不全ウイルスからなる群より選択されるウイルスにより引き起こされる、請 求項６０に記載の方法。 ６２．個体における感染性疾患を予防する方法であって、請求項１６に記載の免 疫調節組成物を投与する工程を包含する、方法。 ６３．前記感染性疾患がウイルス感染に起因する、請求項６２に記載の方法。 ６４．前記ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペス ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、およびパピローマウイルスからなる群より選 択される、請求項６３に記載の方法。 ６５．前記感染性疾患が細菌感染に起因する、請求項６２に記載の方法。 ６６．前記細菌が、Hemophilus influenza、Mycobacterium tuberculosis、およ びBordetella pertussisからなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。 ６７．前記感染性疾患が寄生性感染に起因する、請求項６２に記載の方法。 ６８．寄生性因子が、マラリア性プラスモデイウム属、Leishmania種、Trypanos oma種、およびSchistosoma種からなる群より選択される、請求項６７に記載の方 法。 ６９．個体における感染性疾患を予防する方法であって、請求項２に記載の免疫 調節組成物を投与する工程を包含する、方法。 ７０．個体における感染性疾患を予防する方法であって、請求項１８に記載の免 疫調節組成物を投与する工程を包含する、方法。 ７１．個体における感染性疾患を予防する方法であって、請求項２１に記載の免 疫調節組成物を投与する工程を包含する、方法。 ７２．個体における感染性疾患を予防する方法であって、請求項２４に記載の免 疫調節組成物を投与する工程を包含する、方法。 ７３．免疫応答を調節する方法であって、請求項２８に記載の免疫調節組成物を 投与する工程を包含する、方法。 ７４．オリゴヌクレオチドのヒト免疫刺激活性についてスクリーニングする方法 であって、以下の工程: （ａ）マクロファージ細胞および試験されるオリゴヌクレオチドのアリコート を提供する工程； （ｂ）工程（ａ）の細胞およびオリゴヌクレオチドを適切な時間インキュベー トする工程； （ｃ）細胞培養上清中のTh1に偏ったサイトカインの相対量を決定する工程、 を包含する、方法。 ７５．前記細胞が、90196B細胞株およびP388D1細胞株から選択される、請求項７ ４に記載のオリゴヌクレオチドのヒト免疫刺激活性についてスクリーニングする 方法。 ７６．前記決定されたTh1に偏ったサイトカインの少なくとも１つがインターフ エロン-γである、請求項７４に記載のオリゴヌクレオチドのヒト免疫刺激活性 についてスクリーニングする方法。 ７７．前記決定されたTh1に偏ったサイトカインの少なくとも１つがインターロ イキン-12である、請求項７４に記載のオリゴヌクレオチドのヒト免疫刺激活性 についてスクリーニングする方法。 ７８．ポリヌクレオチドを含む免疫調節組成物であって、（ａ）免疫調節配列（ ISS）；（ｂ）抗原；および（ｃ）ミョウバンとは異なるアジュバントを含み、 該ISSが5'-シトシン、グアニン-3'を含み、該ISSと抗原とが結合体化しておらず 、そして該アジュバントは、アジュバントを含まない該ISSおよび抗原の同時投 与と比較して、免疫応答を増強するのに十分な量である、免疫調節組成物。 ７９．前記ISSがパリンドローム領域を含み、そして該パリンドローム領域は5'- シトシン、グアニン-3'配列を含む、請求項７８に記載の免疫調節組成物。 ８０．個体における免疫応答を調節する方法であって、請求項７８に記載の組成 物を、該免疫応答を調節するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
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