JP5543050B2 - 抗原にリンクされた免疫刺激配列を含有する免疫調節組成物および該組成物を使用する方法 - Google Patents

Description

関連出願の引照
本出願は、１９９９年１１月１５日出願の米国仮出願６０／１６５，４６７号の優先権を主張し、上記出願明細書の全体を参考のため本明細書中に引用する。

技術分野
本発明は免疫学、より具体的には、免疫応答を調節するために抗原に付着された免疫刺激（賦活）ポリヌクレオチド配列の使用に関する。

背景技術
種々異なる病状、例えばウィルス感染、癌およびアレルギー反応に見られる病状を解消するための免疫応答は、宿主の健康全体にとって重要である。感染症、癌またはアレルギー反応の解消成功は、免疫応答の型および大きさに依存する。さらに免疫応答を導き出すのに抗原を使用する免疫化は、感染症、癌および／またはアレルギー反応を効果的に解消する助けとなり得る。免疫応答を導き出すのに用いられる抗原の型が、疾患によって異なるうえは、免疫系が上述の感染症および疾患全てに対処するのを可能にする免疫化法を有することが望ましい。より具体的には、免疫応答の示差調節を可能にする免疫化法を有することが望ましい。一般的に免疫化は体液（抗体）反応を引き起こす傾向を有しているものの、体液反応（例えばアナフィラキシー・ショック）から生じるおそれのある合併症を回避するために、別の型の免疫応答、つまり細胞免疫応答を引き起こすことが好ましい場合がある。

感染または他の攻撃に対して発生させられる免疫応答型は、一般的に、反応に関わる一部のＴヘルパー（Ｔｈ）セルによって見分けることができる。Ｔｈ１部分集合は、遅延型過敏症および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）の活性化のような古典的な細胞媒介機能をもたらす。これに対してＴｈ２部分集合はＢ細胞活性化のためのヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答の型は、一般的に抗原に応答する細胞によって産出されるサイトカインによって影響される。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によって分泌されるサイトカインの差異は、これら２つの部分集合の異なる生物学的機能を反映すると考えられる。

Ｔｈ１部分集合はウィルス感染症、細胞内病原体、および腫瘍細胞に応答するのに特に適している。なぜならばこのＴｈ１部分集合は、ＣＴＬを活性化するＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌するからである。Ｔｈ２部分集合は、フリー・リビング・バクテリアおよび蠕虫寄生体に応答するのにより適しており、アレルギー反応を媒介する。それというのはＩＬ−４およびＩＬ−５はそれぞれ、ＩｇＥの産出および好酸球の活性化を引き起こすことが知られているからである。一般的に、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、互いに負に調節する区別可能なサイトカインを分泌する。例えば、ＩＬ−２は、免疫応答をＴｈ１に向かってシフトし、Ｔｈ２応答の発生を阻害する。同様に、ＩＬ−１０、つまりＴｈ２サイトカインは免疫応答をＴｈ２に向かってシフトし、Ｔｈ１応答の発生を阻害する。Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスの変化は例えばアレルギー反応、あるいはＣＴＬ応答の増大を招くおそれがある。

多くの感染病、例えば結核やマラリアの場合、Ｔｈ２型応答は感染に対して僅かな予防値しか有さない。標的抗原に由来する小さなペプチドを使用した、提案されたワクチン、および潜在的に感染性の未処理ウィルス粒子の使用を回避するその他の目下使用されている抗原性物質が、治療効果を達成するのに必要な免疫応答を常に導き出すとは限らない。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の治療効果のあるワクチンがないことが、このような失敗の不幸な例である。タンパク質ベースのワクチンがＴｈ２型免疫応答を引き起こすのが典型的である。Ｔｈ２型免疫応答の特徴は、抗体を中和する高力価を有するが、しかし顕著な細胞性免疫を有さないことである。

さらに、或る適応症、最も顕著には、ＩｇＥ抗体応答がアナフィラキシー・ショックを引き起こすおそれのあるアレルギーに不適切な、抗体応答のいくつかの型がある。一般的にアレルギー反応はまた、Ｔｈ２型免疫応答を伴う。アレルギー喘息の応答を含むアレルギー応答は、前期応答、つまりアレルゲン暴露の数秒から数分内に発生し、細胞顆粒消失という特徴を有する応答、および、後期応答、つまり、４〜２４時間後に発生し、アレルゲン暴露部位内への好酸球の浸潤を特徴とする応答により特徴付けられる。具体的には、初期のアレルギー応答中には、アレルゲンはＩｇＥ抗体と、好塩基球および肥満細胞上で架橋結合し、この架橋結合は、顆粒消失を引き起こし、次いで、ヒスタミンおよび他の炎症媒体を肥満細胞および好塩基球から放出する。後期応答中には、好酸球がアレルゲン暴露部位内に潜入する（この部位で組織が損傷し、機能障害が生じる）。

アレルギー障害のための抗原免疫治療は、少量の、しかし量が徐々に増加する抗原の皮下注射を伴う。このような免疫治療は、ＩｇＥによるアナフィラキシーを引き起こすリスクを与え、アレルギー後期応答のサイトカインによる事象を効果的には取り扱わない。今までのところは、このようなアプローチはある程度しか成功していない。

免疫刺激配列または「ＩＳＳ」として一般的に知られている或るＤＮＡ配列の投与は、Ｔｈ１関連のサイトカインの分泌によって示されるＴｈ１型の偏りを伴う免疫応答を引き起こす。抗原を有する免疫刺激ポリヌクレオチドの投与は、投与抗原に対するＴｈ１型免疫応答を生ぜしめる。Roman他(1997) Nature Med. 3: 849-854。例えば、特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥ抗体と、ＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌するがしかしＩＦＮ−γを分泌しないＣＤ４⁺細胞とを産出することにより応答させられる、生理食塩水またはアジュバント・ミョウバン中の大腸菌（E. Coli）β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を皮内注射されたマウスは、Ｔ細胞が主としてＴｈ２部分集合から成ることを明示した。しかし、ＩｇＧ２ａ抗体と、ＩＦＮ−γを分泌するがしかしＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌しないＣＤ４⁺細胞とを産出することにより応答させられる、β−Ｇａｌをコード化してＩＳＳを含有する（生理食塩水中の）プラスミドＤＮＡで皮内注射（または歯状皮膚スクラッチ・アプリケータを用いて）注入されたマウスは、Ｔ細胞が主としてＴｈ１部分集合から成ることを明示した。さらに、プラスミドＤＮＡで注射されたマウスによって産出される特異的ＩｇＥ産出は６６〜７５％減じられた。Raz他(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145。一般的に、裸のＤＮＡの免疫化に対する応答の特徴は、抗原によって刺激されたＣＤ４⁺Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮ−γの産出である。この産出はＴｈ１型応答を示す。このことは、特にＩｇＥ産出の低減により示されるアレルギーおよび喘息を治療する上で特に重要である。Ｔｈ１型免疫応答を刺激する免疫刺激ポリヌクレオチドの能力は、バクテリア抗原、ウィルス抗原およびアレルゲンによって明示されている（例えば国際公開第９８／５５４９５号パンフレット参照）。

抗原にＩＳＳをリンクすることは、ＩＳＳと抗原とを混和状態で共投与するのに比べて、Ｔｈ１免疫応答を著しく向上させることが報告されている。例えば国際公開第９８／１６２４７号、同第９８／５５４９５号の各パンフレットを参照されたい。

ＩＳＳについて記載した他の参考文献には例えば次のものがある。Krieg他 (1989) J. Immunol 143:2448-2451; Tokunaga他 (1992) Microbiol. Immunol. 36:55-66; Kataoka他 (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:244-247; Yamamoto他 (1992a) J. Immunol 148:5072-4076; Yamamoto他 (1992b) Microbiol. Immuno. 36:583-997; Mojcik他 (1993) Clin. Immuno. and Immunopathol. 67:130-136; Branda他 (1993) Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043; Pisetsky他 (1994) Life Sci. 54(2):101-107; Yamamoto他 (1994a) Antisense Research and Development. 4:119-122; Yamamoto (1994b) Jpn. J. Cancer Res. 85:775-779; Raz他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523; Kimura他 (1994) J. Biochem. (Tokyo) 116:994; Krieg他 (1995) Nature 374: 546-549; Pisetsky他 (1995) Ann. N.Y. Acad Sci. 772:152-163; Pisetsky他 (1996a) J. Immunol 156:421-423; Pisetsky (1996b) Immunity 5:303-310; Zhao他 (1996) Biochem. Pharmacol 51:173-182; Yi他 (1996) J. Immuno. 156: 558-564; Krieg (1996) Trends Microbiol. 4(2) 73-76; Krieg他 (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 133-139; Klinman他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2879-2883; Raz他 (1996); Sato他 (1996) Science 273:352-354; Stacey他 (1996) J. Immunol. 157:2116-2122; Ballas他 (1996) J. Immunol. 157:1840-1845; Branda他 (1996) J. Lab. Clin. Med. 128:329-338; Sonehara他 (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:799-803; Klinman他 (1997) J. Immunol. 158:3635-3539; Sparwasser他 (1997) Eur. J. Immunol. 27:1671-1679; Roman他 (1997); Carson他 (1997) J. Exp. Med. 186:1621-1622; Chace他 (1997) Clin. Immunol. and Immunopathol. 84:185-193; Chu他 (1997) J. Exp. Med. 186;1623-1631; Lipford他 (1997a) Eur. J. Immunol. 27: 2340-2344; Lipford (1997b) Eur. J. Immuno. 27:3420-3426; Weiner他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10833-10837; Macfarlane他 (1997) Immunology 91:586-593; Schwartz他 (1997) J. Clin. Invest. 100:68-73; Stein他 (1997) Antisense Technology, Ch. 11 pp. 241-264, C. LichtensteinおよびW. Nellen編, IRL Press; Wooldridge (1997) Blood 89:2994-2998; Leclerc他 (1997) Cell. Immunol. 179:97-106; Kline他 (1997) J. Invest. Med. 45(3):282A; Yi他 (1998a) J. Immunol. 160:12401245; Yi他 (1998b) J. Immuno. 160:4755-4761; Yi他 (1998c) J. Immunol. 160:5898-5906; Yi他 (1998d) J. Immunol. 161:4493-4497; Krieg (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology Ch. 24, pp. 431-448, C.A. SteinおよびA. M. Krieg編、Wiley-Liss, Inc.; Krieg他 (1998a) Trends Microbiol. 6:23-27; Krieg他 (1998b) J. Immuno. 161; 2428-2434; Krieg他 (1998c) proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12631-12636; Spiegelberg他 (1998) Allergy 53 (45S):93-97; Horner他 (1998) Cell Immuno. 190:77-82; Jakob他 (1998) J. Immunol. 161:3042-3049; Redford他 (1998) J. Immuno. 161:3930-3935; Weeratna他 (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8:351-356; McCluskie他 (1998) J. Immunol. 161(9):4463-4466; Gramzinski他 (1998) Mol. Med 4:109-118; Liu 81998) Blood 92:3730-3736; Moldoveanu他 (1998) Vaccine 16: 1216-1224; Brazolot Milan他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15553-15558; Briode他 (1998) J. Immunol. 161:7054-7962; Briode他 (1999) Int. Arch. Allergy Immunol 118:453-456; Kovarik他 (1999) J. Immunol. 162:1611-1617; Spiegelberg他 (1999) Pedatr. Pulmonol Suppl. 18:118-121; Martin-Orozco他 (1999) Int. Immuno. 11:1111-1118; 欧州特許第468,520号明細書；国際公開第96/02555号；国際公開第97/28259号；国際公開第98/16247号；国際公開第98/18810号；国際公開第98/37919号；国際公開第98/40100号；国際公開第98/52581号；国際公開第98/52962号；国際公開第98/55495号；国際公開第98/55609号；国際公開第99/11275号パンフレット； Elkins他 (1999) J. Immuno. 162:2291-2298; 国際公開第98/52962号；国際公開第99/51259号パンフレット；Van Uden他 (1999) J. Allergy Clin. Immunol 104:902-910。また、Zimmermann他 (1998) J. Immuno. 160:3627-3630; Krieg他 (1999) Trends Microbiol. 7:64-65; 国際公開第99/33488号；国際公開第99/33868号；国際公開第99/62923号パンフレット；および米国特許第5,663,153号、同第5,723,335号および同第5,849,719号明細書を参照されたい。また、Liang他 (1996) J. Clin. Invest. 98:1119-1129; Bohle他 (1999) Eur. J. Immunol. 29:2344-2353および国際公開第99/56755号パンフレットも参照されたい。

例えばウィルス感染症またはアレルギー状態において、抗体産出またはサイトカイン産出のレベルが重要である場合、Ｔｈ１型免疫応答を調節する能力があることが望ましい。本発明は、Ｔｈ１型応答へのＴｈ２型応答の示差調節組成物および示差調節法を提供する。

ここに挙げた全ての刊行物全体を本明細書中に参考のため引用する。

発明の開示
本発明は、相異なる区別可能な生物学的特性を有するＩＳＳ抗原複合体クラス（すなわち集団）の組成物を提供する。変化する構造的かつ機能的な特徴について本明細書中に記載し、この特徴は全体的に見て、複合の変化する範囲、（特にＴｈ１応答の観点における）免疫応答の平均調節機能のような変化する機能、抗原に結合するために抗原特異的抗体と競合する平均能力、および（抗原がアレルゲンである場合）ヒスタミン放出を抑制する能力を包含する。種々の実施態様を本明細書中に記載する。ＩＳＳは本明細書中に記載したようなあらゆる免疫刺激配列であってよい。抗原はあらゆる抗原であってよく、その一例として、病原菌、例えばＢ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、乳頭腫ウィルス、（インフルエンザ・ウィルスのような）呼吸器ウィルス、マイコバクテリア、百日咳およびサルモネラ属と関連するアレルゲンおよび抗原が挙げられる。抗原はまた、癌、例えば腫瘍抗原と関連するあらゆる抗原であってもよい。

本発明はまた、これらの組成物を使用した方法、例えば免疫応答を調節する方法、および、アレルギー状態を治療する方法を提供する。

従って１つの観点において本発明は、複合分子集団であって、該複合分子が、抗原と、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成るポリヌクレオチドとを含んで成り、集団中の複合程度が、(ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原の濃度に対する、（ｉ）抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ−抗原複合体の濃度の比が、約３．５〜約６．０であるようになっている、複合分子集団を提供する。いくつかの実施態様では、前記集団の抗原がアレルゲンであり、集団中の複合程度が、(ii)抗原感作個体からの好塩基球からの約４０％のヒスタミン放出に必要な抗原の濃度に対する、（ｉ）抗原感作個体からの好塩基球からの約４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ−抗原複合体の濃度の比が、約１０００を上回るようになっている。

或る観点において、本発明は、複合分子集団であって、該複合分子が、抗原と、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成るポリヌクレオチドとを含んで成り、集団中の複合程度が、(ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原の濃度に対する、（ｉ）抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ−抗原複合体の濃度の比が、約２．５〜約３．０であるようになっている、複合分子集団を提供する。いくつかの実施態様では、前記集団の抗原がアレルゲンであり、集団中の複合程度が、(ii)抗原感作個体からの好塩基球からの約４０％のヒスタミン放出に必要な抗原の濃度に対する、（ｉ）抗原感作個体からの好塩基球からの約４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ−抗原複合体の濃度の比が、約１００〜約２００であるようになっている。

別の観点において、本発明は、複合分子集団であって、該複合分子が、抗原と、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成るポリヌクレオチドとを含んで成り、抗原とポリヌクレオチドとの複合の程度が、複合体集団を受容する個体における抗原特異的抗体が、同一量のリンクされていないポリヌクレオチドおよび抗原、または同一量の抗原のみを受容する場合と比べて抑制されるようになっている、複合分子集団を提供する。或る観点では、抗原特異的抗体の産出程度を減少させることができ、またある観点では、排除することができる。

別の観点では、本発明は、本発明の複合分子集団と、製薬上許容可能な賦形剤とを含んで成る組成物を提供する。

別の観点では、本発明は、個体の免疫応答を調節する方法であって、該方法が、前記個体の前記免疫応答を調節するのに充分な量の、本発明の複合分子集団を含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体の免疫応答を調節する方法を提供する。或る観点では、前記調節が、Ｔｈ１関連サイトカインの産出を刺激することを含んで成る。或る観点では、前記調節が、Ｔｈ２関連サイトカインの産出を減少させることを含んで成る。或る観点では、前記調節が、抗原特異的抗体の産出を減少させることを含んで成る。

別の観点では、本発明は、個体のアレルギー状態を治療する方法であって、該方法が、本発明の複合分子集団から成る組成物を、前記アレルギー状態を軽減するのに充分な量で前記個体に投与することを含んで成る、個体のアレルギー状態を治療する方法を提供する。

別の観点では、本発明は、個体内で抗原によって刺激されたＩｇＥの産出を減少させる方法であって、該方法が、前記抗原によって刺激されたＩｇＥを減少させるのに充分な量で、本発明の複合分子集団を含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体内で抗原によって刺激されたＩｇＥの産出を減少させる方法を提供する。

別の観点では、本発明は、個体のＩｇＥ関連障害を治療する方法であって、該方法が、前記個体のＩｇＥの産出を減少させ前記障害を治療するのに充分な量で、本発明の複合分子集団を含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体のＩｇＥ関連障害を治療する方法を提供する。

別の観点では、本発明は、個体内のＴｈ１リンパ球を刺激する方法であって、該方法が、前記個体内のＴｈ１リンパ球を刺激するのに充分な量で、本発明の複合分子集団を含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体内のＴｈ１リンパ球を刺激する方法を提供する。或る観点では、これらの個体内で、Ｔｈ１関連サイトカインの産出を刺激する。

別の観点では、本発明は、個体内のＴｈ２リンパ球を抑制する方法であって、該方法が、前記個体内のＴｈ２リンパ球を抑制するのに充分な量で、本発明の複合分子集団を含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体内のＴｈ２リンパ球を抑制する方法を提供する。或る観点では、これらの個体において、Ｔｈ２関連サイトカインの産出を抑制する。

発明の実施の形態
われわれは、ポリヌクレオチド免疫刺激配列（ＩＳＳ）と抗原との複合の程度が免疫応答を示差調節することを発見した。例えば具体的に述べるならば、われゎれは、より大きい程度の複合が、抗原特異的抗体の産出全体を抑制することになる一方、Ｔｈ１シフトを保つ（すなわちＴｈ１関連のサイトカインが放出される）ことを発見した。さらにわれわれは、より大きな程度の複合が、アレルギー抗原使用時に、ヒスタミン放出抑制において著しく効果的であることを発見した。

例において説明するように、ＩＳＳオリゴヌクレオチドの、ブタクサアレルゲンＡｍｂ ａ １との異なる程度の複合は、興味深い驚くべき生物学的特性を有する新しい分子クラスを形成する。これらのクラス全ては、マウスにおけるＩｇＧ２ａ抗体およびＩＦＮ−γサイトカインの応答によって測定されるように、Ｔｈ２応答よりもむしろＴｈ１応答を引き起こす。Ａｍｂ ａ １と比べると、ブタクサアレルギーのヒト被験者からの好塩基球を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ検定によって測定されたように、これらの分子はアレルゲン性を減小させた。

説明を簡単にして理解しやすくするために、とりわけ複合程度の異なる（ひいては１つまたは複数の免疫調節特性の異なる）ＩＳＳ抗原集団は、３つの一般的なクラスに分けることができる。これらのクラスを本明細書中では「Ｌ」（低程度複合）、「Ｍ」（中程度複合）、および「Ｈ」（高程度複合）と記す。抗原に複合されたＩＳＳ分子の数は複合体の生物学的特性に影響を与える。低比率（「Ｌ」）のＩＳＳ：タンパク質を含有する複合体は、強力なＴｈ１応答を引き起こし、（Ｔｈ１およびＴｈ２に関連する抗体の組み合わせ測定により測定される）最高抗体応答を引き起こし、（抗原感作細胞におけるヒスタミン応答の範囲まで測定される）そのアレルゲン性の減小率は最低である。中程度の比率（「Ｍ」）のＩＳＳ：タンパク質を含有する複合体は、強力なＴｈ１応答を引き起こし、中程度の抗体応答を引き起こし、そのアレルゲン性の減小率は中程度である。高比率（「Ｈ」）のＩＳＳ：タンパク質を含有する複合体は、強力なＴｈ１応答を引き起こし、極めて小さな抗体応答を引き起こし、そのアレルゲン性の減小率は最高である。複合体の３つの全ての形は細胞障害性Ｔ細胞の活性を引き起こす。複合体の３つの全ての形は種々異なる用途において有用となることができる。Ｌ形複合体は、高い抗体応答とともにＴｈ１応答が所望されるような用途、例えば感染症ワクチンにおいて極めて有用であることが予想できる。Ｈ形複合体は、高抗体力価なしに強力なＴｈ１応答が所望されるような用途、例えばアレルギー免疫療法または或る癌の治療に極めて有用であることが予想できる。Ｍ形複合体は、Ｔｈ１細胞免疫応答と抗体応答との間のバランスが所望される用途に極めて有用であることが予想できる。

一般的な技術
本発明の実施においては、特記しない限り分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学のコンベンショナルな技術を採用することになる。このような技術は当業者の技能の範囲内にある。このような技術は「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」第２版(Sambrook他,1989)；「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M. J. Gait他, 1984)；「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」(R. I. Freshney編, 1987)；「実験免疫学ハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)」(D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編)；「哺乳類細胞のための遺伝子導入ベクター(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)」(J. M. MillerおよびM. P. Calos編, 1987)；「分子生物学の現行プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(F. M. Ausubel他編, 1987)；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ鎖反応(The Polymerase Chain Reaction)」(Mullis他編, 1994)；「免疫学の現行プロトコル(Current Protocols in Immunology)」(J. E. Coligan他編, 1991)；「イムノアッセイ・ハンドブック(The Immunoassay Handbook)」(David Wild編, Stockton Press NY, 1994)；および「免疫学的分析法(Methods of Immumological Analysis)」(R. Masseyeff, W. H. AlbertおよびN. A. Staines編, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)のような文献に全体的に説明されている。

定義
本明細書中に使用したように、単数形は、特記しない限り複数の意味を含む。例えばＩＳＳは１つまたは複数のＩＳＳを含む。

本明細書中に使用した「ＩＳＳ」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで測定される、測定可能な免疫応答をもたらすポリヌクレオチド配列を意味する。測定可能な免疫応答は、抗原特異的抗体産出、サイトカイン分泌、リンパ球集団、例えばＮＫ細胞、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球、ＣＤ８⁺Ｔリンパ球、Ｂリンパ球などの活性化または拡張を含むが、これに限定されるものではない。ＩＳＳ配列はＴｈ１型応答を優先して活性化するのが好ましい。本発明で使用するポリヌクレオチドは少なくとも１つのＩＳＳを含有する。本明細書で使用するように、「ＩＳＳ」はまた、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを省略した用語でもある。

「複合分子集団」とは、ＩＳＳ抗原複合群（すなわち抗原にリンクまたは付着されたＩＳＳ）のことである。本発明の目的のためには、このような集団が抗原分子毎に付着された一定数のＩＳＳを必ずしも有する必要はなく、有していてもいなくてもよいことは明らかである。典型的には、所与の集団が（所与の集団内の変化する複合程度に基づく）分子量の分布を有し、ひいては、抗原に複合された平均ＩＳＳ数を有することになる。本明細書に記載されたどの集団も、例えば不完全な複合および／または精製により、自由抗原（すなわちＩＳＳにリンクされていない抗原）および／または自由ＩＳＳ（すなわち抗原にリンクされていないＩＳＳ）を含有していてよいことは明らかである。本発明の目的のために、本明細書中に記載した集団は複合分子を含有するが、しかし必ずしも含有する必要はない。

所与のパラメータ（例えばＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの数または質量）の「平均」とは、集団の構成部分の数で徐した集団全体に対応するそのパラメータの合計を意味する。例えば、抗原に付着されたＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均数は、複合分子集団中の１抗原分子あたりのＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均数（すなわち抗原分子の総数で徐したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの総数）を意味する。後述するようにこの数は通常の場合、例えば分光法により測定される、抗原に対するポリヌクレオチドの重量測定から導出される。

所与の集団の「中位」の数または重量とは、集団の半分がそれを上回り、集団の半分がそれを下回るような数または重量を意味する。例えば１抗原分子当たりのＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中位数とは、集団中の複合分子の半分が１抗原分子当たり、より少数のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを有しており、半分がより多数のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを有していることを意味する。

本明細書中に交互に使用するように、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾オリゴヌクレオチドおよびヌクレオシド、またはこれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは線形または環状に形成されていてよく、またはオリゴヌクレオチドは線形区分および環状区分の両方を含有していてよい。オリゴヌクレオチドは、一般的にはリン酸エステル結合によってつなげられたヌクレオシドポリマーである。ヌクレオシドは、糖に結合されたプリン（アデニンまたはグアニンまたはその誘導体）またはピリミジン（チミン、シトシンまたはウラシル、またはその誘導体）塩基から成る。ＤＮＡ中の４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。

本明細書中に使用した「免疫調節」または「免疫応答の調節」という語は、免疫活性効果ならびに免疫抑制効果を含む。免疫活性効果は、細胞または体液の免疫応答を直接的または間接的に向上させる効果を含むがこれに限定されるものではない。免疫活性効果は例えば、抗原特異的抗体の産出量の増大；リンパ球集団、例えばＮＫ細胞、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球、ＣＤ８⁺Ｔリンパ球、マクロファージ等の活性化または増殖；例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどを含む免疫刺激サイトカインの合成の増大である。免疫抑制効果は、細胞または体液の免疫応答を直接的または間接的に減小させる効果を含むがこれに限定されるものではない。免疫抑制効果は例えば、ＩｇＥ産出量の減小のような抗原特異的抗体の減小；リンパ球の活性、または、免疫寛容をもたらすような免疫抑制活性を有する他の細胞集団の活性；および或る細胞機能に関する抑制効果を有するサイトカインの合成の増大である。その一例はＩＦＮ−γであり、ＩＦＮ−γは、ＩＬ−４によって誘導された、ＩｇＥおよびＩｇＧ１へのクラス・スイッチをブロックすると考えられ、これにより、これらの抗体部分集合のレベルを低下させる。

「複合体」という用語は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドと抗原とがリンクされている複合体を意味する。このような複合体リンケージは共有および／または非共有リンケージを含む。

「複合の程度」は、所与の集団における平均複合度を意味する。本明細書中に説明したように、複合の程度は、多数の構造的および／または機能的なパラメータのいずれか１つだけ、またはいずれかの組み合わせによって特徴付けられる。

「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識され結合される物質を意味する。抗原はペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合炭水化物、糖、ガングリオシド、脂質およびリン脂質；これらの一部およびこれらの組み合わせを含むことができる。抗原は天然に見出されたものかまたは合成物質であってよい。ＩＳＳと一緒に投与するのに適した抗原は、Ｂ細胞またはＴ細胞の抗原特異的応答を引き出すことができるあらゆる分子をも含む。抗原がその抗原に対して特異的な抗体応答を引き出すことが好ましい。「抗原」の範囲には、ハプテンが含まれる。ハプテンは低分子量化合物であり、この化合物はそれ自体は免疫原性ではないが、しかし、抗原決定基を含有する免疫原性分子と複合されると、免疫原性にされるような化合物である。抗原性にされるためには、小さな分子がハプテン化される必要のある場合がある。本発明の抗原はペプチド、脂質（例えばステロール、脂肪酸およびリン脂質）、ヘモフィルス・インフルエンザワクチンに使用されるような多糖類、ガングリオシドおよび糖タンパク質を含むことが好ましい。

「アジュバント」とは、抗原のような免疫原性作用因子に添加される場合に、混合物に暴露されると、受容宿主内の作用因子に対する免疫応答を非特異的に向上させるかまたは増強する物質を意味する。

「ペプチド」という用語は、このペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的応答、例えば抗体産出またはサイトカイン活性を生ぜしめるのに充分な長さおよび組成を有するポリペプチドである。典型的には、ペプチドは長さにおいて少なくとも６つのアミノ酸残基を有する。「ペプチド」という用語はさらに、（天然または非天然に発生するものであろうとなかろうと）修飾アミノ酸を含む。このような修飾は、リン酸化、グリコシル化、ペギル化、脂質化またはメチル化を含むが、これに限定されるものではない。

「抗原ペプチド」は、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化または不活性化ウィルス、細胞、微生物、またはこのようなペプチドのフラグメントを含むことができる。従って「抗原ペプチド」または「抗原ポリペプチド」は１つまたは複数の抗原特性を呈するポリペプチドの全てまたは一部を意味する。それゆえ例えば、「Ａｍｂ ａ １抗原ポリペプチド」または「Ａｍｂ ａ １ポリペプチド抗原」は、それが配列全体であろうと、配列部分であろうと、かつ／または、抗原特性を呈する（すなわち抗体またはＴ細胞受容体に特異的に結合する）修飾配列であろうと、Ａｍｂ ａ １から成るアミノ酸配列である。

「運搬分子」または「運搬手段」は特定部位への、および／または特定のタイミングに関するＩＳＳおよび／または抗原の運搬を容易にし、可能にし、かつ／または向上させる化学的部分である。運搬手段は付加的に免疫応答を刺激してもしなくてもよい。

「抗原に対するアレルギー応答」とは、一般的に好酸球および／または抗原特異的ＩｇＥおよびこれにより生じた作用の発生によって特徴付けられる免疫応答を意味する。当業者には良く知られているように、ＩｇＥは肥満細胞および好塩基球上でＩｇＥ受容体に結合する。ＩｇＥによって認識された抗原に後で暴露されると、抗原は肥満細胞および好塩基球上でＩｇＥと架橋結合し、これによりこれらの細胞の顆粒消失を引き起こす。この顆粒消失はヒスタミン放出を含むが、これに限定されるものではない。「抗原に対するアレルギー反応」「アレルギー」および「アレルギー状態」という語が、本発明のいくつかの方法の用途に同等に適切であることは明らかであり、またこのことを意図している。さらに、本発明の方法が、アレルギー反応を予防し、事前のアレルギー状態を治療するのに同等に相応しい方法を含むことは明らかであり、またこのことを意図している。

本明細書中に使用したように、「アレルゲン」という用語は、抗原または分子の抗原部分、通常はタンパク質を意味する。タンパク質は被験者に暴露されると、アレルギー反応を引き出す。典型的には、被験者は例えば膨疹紅斑テストにより指示されたアレルゲンに対するアレルギーを有している。分子に対する暴露時に被験者のうちの僅かしかアレルギー（例えばＩｇＥ）免疫反応を呈しなくても、その分子はアレルゲンであるといわれる。多数の単独のアレルゲンが当業者に知られている。これらのアレルゲンは本明細書中に提供した表１に示すものを含むが、これに限定されるものではない。

「脱感作」という用語は、被検体が感作を明示しているアレルゲン用量を増加する投与プロセスを意味する。脱感作に使用されるアレルゲン例は当業者によく知られている。例えばFornadley(1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127を参照されたい。

「抗原特異的免疫療法」とは、抗原を伴い、免疫応答の抗原特異的調節を発生させるあらゆる形の免疫療法を意味する。アレルギーに照らして、抗原特異的免疫療法は脱感作療法を含むが、これに限定されるものではない。

「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物はヒト、霊長類、家畜、狩猟動物、齧歯動物およびペットを含むが、これらに限定されるものではない。

物質の「有効量」または「充分な量」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果をもたらすのに充分な量のことであり、従って「有効量」は、それが適用されている状況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与に照らして、ＩＳＳ抗原複合体から成る組成物の有効量は、抗原だけを投与する場合に得られる免疫応答と比較して、このような調節を達成するのに充分な量を意味する。有効量は１回でまたは複数回にわたって投与することができる。

本明細書中に使用した「共投与」は、免疫応答を調節するために、少なくとも２つの異なる物質を充分に接近した時間内に投与することを意味する。好ましくは共投与は、少なくとも２つの物質を同時に投与することを意味する。

Ｔｈ１応答のような免疫応答の「刺激」は、応答の増大を意味する。この応答の増大は、応答を引き出しかつ／または向上させることから生じることができる。

「アレルギー関連障害」とは、抗原特異的なＩｇＥ免疫応答の作用から生じる障害を意味する。このような作用は、低血圧およびショックを含むが、これに限定されるものではない。アナフィラキシーは、アレルギー関連障害の一例である。この障害発生中、血液循環内に放出されたヒスタミンが血管拡張を招き、毛細血管の透過率を増大させ、その結果血液循環から血漿の著しい損失を伴う。アナフィラキシーの発生は、身体全体にわたって関連作用を蒙る全身性のものと、特異的な標的組織または器官に限定された反応を伴う局所性のものとがあり得る。

ＩｇＥ関連障害は、持続性の有無を問わずＩｇＥレベルの上昇によって部分的に特徴付けられる生理的状態を意味する。ＩｇＥ関連障害は、アレルギーおよびアレルギー反応、（後述の）アレルギー関連障害、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅類毒針アレルギーおよび薬物アレルギー、および寄生虫感染症を含むが、これらに限定されるものではない。この用語はまた、前記障害の関連兆候をも含む。一般的にこのような障害におけるＩｇＥは抗原特異的である。

本明細書中に使用したように、また当業者によく理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不能を問わず、１つまたは複数の症状の緩和または改善、疾患程度の減小、疾患の安定化（つまり悪化のない）状態、疾患の広がりの予防、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の緩和または軽減、および（部分的、全体的を問わず）寛解を含むが、これらに限定されるものではない。「治療」はまた、治療を受けない場合に見込まれる生存時間と比較して生存時間を延長することをも意味する。

疾患または障害の「軽減」は、障害を治療しない場合と比較して、疾患または障害の状態の程度および／または不所望な臨床的症状が減少させられること、および／または、進行の時間的経過が遅くなるかまたは延長されることを意味する。特にアレルギーに照らして、当業者によって良く理解されているように、軽減は、アレルゲンに対する免疫応答を調節すると生じることができる。さらに、軽減は一用量の投与によっては生じるとは限らず、連続用量を投与するとしばしば生じる。従って、応答または障害を軽減するのに充分な量を、一回でまたは複数回にわたって投与することができる。

ＩＳＳ抗原複合体または抗原によって「引き出された」「抗体の力価」または「抗体量」は、複合体または抗原の投与後の或る時点で測定された所与の抗体量を意味する。

「Ｔｈ１関連抗体」は、Ｔｈ１免疫応答と関連して産出されかつ／または増大させられる抗体のことである。例えば、ＩｇＧ２ａはマウス中のＴｈ１関連抗体である。本発明の目的に対応して、Ｔｈ１関連抗体の測定は、１つまたは複数のこのような抗体の測定であってよい。例えばヒトにおいては、Ｔｈ１関連抗体の測定は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３の測定を伴ってもよい。

「Ｔｈ２関連抗体」は、Ｔｈ２免疫応答と関連して産出されかつ／または増大させられる抗体のことである。例えば、ＩｇＧ１はマウス中のＴｈ２関連抗体である。本発明の目的に対応して、Ｔｈ２関連抗体の測定は、１つまたは複数のこのような抗体の測定であってよい。例えばヒトにおいては、Ｔｈ２関連抗体の測定は、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４の測定を伴ってもよい。

サイトカイン産出、抗体産出またはヒスタミン放出のような機能または活性を「抑制」または「阻害」することは、当該状態またはパラメータ以外のその他の点では同一の条件のものと比較して、あるいは、別の状態と比較して、その機能または活性を低減することを意味する。例えば、ヒスタミン放出を抑制する複合集団は、例えば抗原のみによって引き起こされるヒスタミン放出と比較して、ヒスタミン放出を低減する。別の例を挙げるならば、抗体産出を抑制する複合集団は、例えば、抗原のみによって産出される抗体の程度および／またはレベルと比較して、抗体の程度および／またはレベルを低減する。

本発明の組成物
様々な構造特性かつ免疫調整特性を有する複合集団
概ね本発明および本明細書中に記載した複合分子のクラス、または集団は、以下のような多数の構造的および／または機能的特性のいずれかによって、区別および／または規定することができる：
（ａ） 抗原に付着またはリンクされたＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均数；
（ｂ） 抗原に付着またはリンクされたＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中位数
（ｃ） 抗原の平均質量に対するＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量の比；
（ｄ） 抗原の中位質量に対するＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中位質量の比；
（ｅ） (ii)抗原に対する抗原特異的抗体を阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を同一程度に阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比（後述するように、これらの比は通常の場合、５０％の阻害率で算出されるが、これに限定されるものではない）；
（ｆ） アレルゲンである抗原に関して、(ii)抗原感作された個体からの好塩基球からのヒスタミン放出に必要な抗原濃度に対する、(i)抗原感作された個体からの好塩基球からの同一程度のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比（後述するように、これらの比は通常の場合、４０％のヒスタミン放出率で算出されるが、これに限定されるものではない）；
（ｇ） (ii)抗原により引き出されたＴｈ１関連抗体とＴｈ２関連抗体との和に対する、(i)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ１関連抗体とＴｈ２関連抗体との和の比；
（ｈ） (ii)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ２関連抗体に対する、(i)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ１関連抗体の比；
（ｉ） 抗原単独の場合と比較して異なるサイトカイン産出プロフィル
（ｊ） 「本発明の実施の形態」において上述したような、抗原特異的抗体産出を抑制する程度。

本明細書中に記載したこれらのクラスおよび実施例の全ては、上に挙げた特性の１つ、２つ以上、または組み合わせによって説明し規定することができる。従って本発明は、複合分子集団を提供し、該複合分子は、抗原と、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成る１つまたは複数のポリヌクレオチドとを含んで成り、前記集団は、ここに記載した特性のうちの１つまたは複数を、単独または組み合わせて有している。（比を含む）特性は、本明細書中に記載した標準的な技術を使用して測定されてよく、これらの特性がいずれも、脊椎動物や哺乳動物、例えばマウスおよび／またはヒトのようなｉｎ ｖｉｖｏ系を含む種々の系において測定されてよいことは明らかである。

上述の内容に従って、例えば、Ａｍｂ ａ １とＩＳＳ含有２２−ｍｅｒポリヌクレオチド（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；１）との複合体に関連する観察に基づいて、「Ｈ」クラスは以下の特性のいずれか単独で、またはいずれかの組み合わせで規定される：
（ａ） １抗原分子当たり、最小５．５個、より好ましくは６個の平均ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド；
（ｂ） (i)ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と、(ii)抗原の平均質量との比が、(i)約３５あるいは最小約３５：(ii)約４０、(i)約４０あるいは最小約４０：(ii)約４０、または、(i)約４５あるいは最小約４５：(ii)約４０である；
（ｃ） (ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が約３．５〜約６．０以上（例えば７．０，８．０，９．０，１０，０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０またはこれ以上であるが、これらに限定されるものではない）であるか、あるいは、最小でほぼ以下の数値のいずれかである：３．５，４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，８．０，９．０，１０，１５，２０，２５（範囲として表現するならば、上限は前記数値のいずれかであってよい）；
（ｄ） 抗原がアレルゲンである実施例に関して、(ii)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要な抗原濃度に対する、(i)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が、約３００を上回り、好ましくは約５００を上回り、好ましくは約７５０を上回り、より好ましくは約１０００を上回り、より好ましくは約１２５０を上回り、より好ましくは約１４００を上回り、より好ましくは約１５００を上回る（例えば７５０，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３５００，４０００，４５００，５０００，５５００，６０００を含むいずれかの数値が上限である）；
（ｅ） (ii)（投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値未満である：１０，７，５，４，３．５，３．０；２．５，２．０，１．５，１．０，０．７５，０．５，０．４，０．３，０．２，０．１。

（ｆ） (ii)（投与された複合体量と比較して１０倍の、投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値未満である：１．０，０．７，０．６，０．５，０．４，０．３５；０．３；０．２５，０．２，０．１５，０．１１，０．０７５，０．０５，０．０４，０．０３，０．０２，０．０１；
（ｇ） (ii)（投与された複合体量と比較して、投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値未満である：６０，５５，５０，４５，４０，３５，３０，２５，２０，１５，１０，５；
（ｈ） (ii)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ２関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値を上回る：４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０，９．５，１０。範囲として表現するならば、上限は前記数値を含むあらゆる数値であってよく、１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０，７５，８０，９０，１００のような他の数値であってもよい。

（ｉ） 同量のリンクされていないＩＳＳ含有ポリヌクレオチドおよび抗原を投与した場合と比較して、または、同量の抗原を単独で投与した場合と比較して、（Ｔｈ１関連抗体および／またはＴｈ２関連抗体の産出を含む）抗原特異的抗体の産出が抑制される。

「Ｍ」クラスは以下の特性のいずれか単独で、またはいずれかの組み合わせで規定される：
（ａ） １抗原分子当たり、約３個〜約５個の平均ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド；
（ｂ） (i)ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と、(ii)抗原の平均質量との比が、(i)約２０：(ii)約４０、(i)約２５：(ii)約４０、または、(i)約３０：(ii)約４０である；
（ｃ） （ｉｉ）抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が約２．５〜約３．０であるか、あるいは、約３．２５である；
（ｄ） 抗原がアレルゲンである実施例に関して、(ii)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要な抗原濃度に対する、(i)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が、約１００〜約２００、あるいは約１００、あるいは約７５〜約２５０である；
（ｅ） (ii)（投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、約１３、あるいは約１０〜１００または約１２〜約１００（または或る実施例では約１２〜約５０）である；
（ｆ） (ii)（投与された複合体量と比較して１０倍の、投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、約１．３、あるいは約１．０〜約１０または約１．２０〜約１０（または或る実施例では約１．２〜約５．０）である；
（ｇ） (ii)（投与された複合体量と比較して、投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、約７０〜約５００である；
（ｈ） (ii)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ２関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、約２〜約４である。

「Ｌ」クラスは以下の特性のいずれか単独で、またはいずれかの組み合わせで規定される：
（ａ） １抗原分子当たり、約３個未満の平均ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド；
（ｂ） (i)ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と、(ii)抗原の平均質量との比が、(i)約１５：(ii)約４０、あるいは(i)約１５未満：(ii)約４０（或る実施例では、(i)約１０：(ii)約４０あるいは(i)約１０未満：(ii)約４０である；
（ｃ） (ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が約２未満であるか、あるいは、約２．０である；
（ｄ） 抗原がアレルゲンである実施例に関して、(ii)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要な抗原濃度に対する、(i)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が、約７５未満、あるいは約７５（他の実施例では約６０未満あるいは約６０）〜約２００、あるいは約７５（他の実施例では約６０未満あるいは約６０）〜約１００である；
（ｅ） (ii)（投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、約１５０、あるいはほぼ以下のいずれかの数値を上回る：１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６６０，６５０，７００，７５０，８００。範囲として表現するならば、上限は前記数値を含むあらゆる数値であってよい。

（ｆ） (ii)（投与された複合体量と比較して１０倍の、投与された抗原の単位質量で見た場合の）抗原によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１およびＴｈ２関連総抗体の力価比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値を上回る：１０，１２，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０；
（ｇ） (ii)抗原によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、約５００以上、例えば約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、約１０００以上である。範囲として表現するならば、上限は、例えば６００，７００，８００，９００，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２５００，３０００，３５００，４０００，４５００，５０００を含むあらゆる数であってよい。

（ｈ） (ii)ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ２関連抗体の力価に対する、(i)（投与された複合体の１単位質量当たりで引き出された抗体で見た場合の）ＩＳＳ抗原複合体により引き出されたＴｈ１関連抗体の力価の比は、ほぼ以下のいずれかの数値であるか、あるいはほぼ以下のいずれかの数値未満である：２．０，１．５，１．２５。

本明細書中の説明から明らかなように、多数の複合体集団のうちのいずれかを産出することができ、「Ｌ」、「Ｍ」および「Ｈ」の分類は、複合体集団のクラスの一例に過ぎない。複合程度を変化させ、制御する能力、ひいては免疫応答の調節型を制御する能力は、上述の例示集団に加えて他の集団にまで及ぶ。測定可能な構造的かつ機能的な特性が判っているなら、多数の集団のうちのいずれかを生成することは、当業者であれば十分可能である。従って、本発明はまた、以下の事項のうちのいずれか（単独または組み合わせで）によって特徴付けられる複合体集団をも含む：
（ａ） (ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が約１．５，２．０，２．２５，３．０，３．２５，３．５，３．７５，４．０，４．２５，４．５０，４．７５，５．０，５．２５，５．５，５．７５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０，９．５，１０．０のいずれかを上回る。範囲として表現するならば、上限は前記数値を含むいずれの数値であってもよい（例えば複合体集団は、約２．０を上回ってよく、約２．０超〜約５．５未満であってよく、また、約２．０超〜２０．０未満であってよい）。

（ｂ） (ii)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要な抗原濃度に対する、(i)抗原に対する抗原特異的抗体の結合を５０％阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が約１．５，２．０，２．２５，３．０，３．２５，３．５，３．７５，４．０，４．２５，４．５０，４．７５，５．０，５．２５，５．５，５．７５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０，９．５，１０．０のいずれかを下回る。範囲として表現するならば、下限は上述のいずれかの数値ならびにゼロであってよい（例えば複合体集団は、約５．０未満でよく、あるいは約５．０未満かつ２．０超であってよい）。

（ｃ） 抗原がアレルゲンである場合、(ii)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要な抗原濃度に対する、(i)抗原感作された個体からの好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ抗原複合体濃度の比が、最小でほぼ以下の数値のいずれかである：２，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７５，８０，９０，９５，１００，１２０，１３０，１４０，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１１００，１２００，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３２５０，３７５０，４０００，４２５０，４５００，４７５０，５０００。範囲として表現するならば、上限は、上述の数値を含むいずれの数値であってもよい。あるいは、この比は以下のほぼいずれかの数値を下回っていてよい：２，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，６０，７５，８０，９０，９５，１００，１２０，１３０，１４０，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１１００，１２００，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３２５０，３７５０，４０００，４２５０，４５００，４７５０，５０００。範囲として表現するならば、下限は上述のいずれかの数値ならびにゼロであってよい。

（ｄ）抗体の１単位質量当たりで引き出された抗体力価（より具体的には、Ｔｈ１およびＴｈ２関連ＩｇＧ力価の和のようなＩｇＧ力価）に対する、ＩＳＳ抗原複合体の１単位質量あたりで引き出された抗体力価（より具体的には、Ｔｈ１およびＴｈ２関連ＩｇＧ力価の和のようなＩｇＧ力価）の比が、以下のほぼいずれかの数値を少なくとも上回る：０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．７５，１，１．５，２，２．５，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，１０００，１２５０，１５００，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００。範囲として表現するならば、下限はゼロまたは上述の数値のいずれかであってよい。あるいは、この比は、以下のほぼいずれかの数値を下回ってよい：０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．７５，１，１．５，２，２．５，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，１０００，１２５０，１５００，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００。範囲として表現するならば、下限はゼロまたは上述の数値のいずれかであってよい。

（ｅ） 複合体（１単位質量当たり）によって引き出されたＴｈ２関連抗体に対する、複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体の比は、以下のほぼいずれかの数値を下回る：２０，１５，１２，１０，７，５，４．５，４．２５，４．０，３．７５，３．５，３．２５，３．０，２．５，２．０，１．５，１．２５，１．０，０．５。範囲として表現するならば、下限はゼロを含む上述の数値のいずれかであってよい。あるいは、この比は以下のいずれかの数値を上回っていてよい：０．５，０．７５，１．０，１．２５，１．５，２．０，２．５，３．０，３．２５，３．５，４．０，４．５，５．０。範囲として表現するならば、上限は上述の数値のいずれかであってよい。

（ｆ） 抗原（１単位質量当たり）によって引き出されたＴｈ１関連抗体力価に対する、複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体力価の比は、以下のほぼいずれかの数値を下回る：５０００，４５００，４０００，３５００，３０００，２５００，２０００，１５００，１０００，９００，８００，７００，６００，５００，４００，３００，２００，１５０，１００，５０，７５，６０，５０，４０，４５，３０，３５，２５，２０，１４，１０，５。範囲として表現するならば、下限はゼロまたは上述の数値のいずれかであってよい。あるいは、この比は以下のいずれかの数値を上回っていてよい：１０，２０，５０，６０，７５，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，７５０，８００，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，３０００，３５００，４０００，４５００，５０００。範囲として表現するならば、上限は上述の数値のいずれかであってよい。

複合の程度は多数の方法で制御することができる。これらの方法の全ては、本明細書中にも記載した、当業者に良く知られた化学的技術を用いる。複合程度を制御する１つの方法は、抗原におけるリンケージ部位に関連してＩＳＳの当量を変えることである。すなわち、リンケージ部位の一定量または一定数が、ＩＳＳの特定量と反応させられる。例えばマレイミド活性化Ａｍｂ ａ １に基づく、ここに例示するＩＳＳ−Ａｍｂ ａ Ｉ複合体に関しては、５’チオＩＳＳ４モル当量、５’チオＩＳＳ７モル当量、および５’チオＩＳＳ１７モル当量と、Ａｍｂ ａ １１モル当量との反応が、それぞれ「Ｌ」、「Ｍ」および「Ｈ」集団を生ぜしめた。複合程度を制御する別の方法は、ＩＳＳとの反応を飽和させ、抗原における有効リンケージ部位量を変化させることである。リンケージ部位は、例えば、所望の数のリンケージ部位を与えたいくらかのリンケージ分を選択する（例えばアミノ基を介してではなく、炭水化物を介してリンクすることを選択する）ことによって制御でき、あるいは、所望の平均数のリンケージ部位が活性化されるようにリンケージ活性化反応を制御することによって制御できる。

一般的に云って、所与の抗原は、抗原ＩＳＳリンケージの性質に応じて、最大数の潜在的リンケージ部位を有している。複合程度は、ＩＳＳをリンクするのに使用されるこのようなリンケージ部位の数によって制御することができる。従って本発明は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに付着されたリンケージ部位の総数の平均百分率が、最小で以下の数値のほぼいずれか：５％，１０％，２０％，３０％，３３％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８２％，８５％，８８％，９０％，９２％，９５％，９７％，９８％であるような実施例をも含む。あるいは、本発明は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに付着されたリンケージ部位の総数の平均百分率が、以下のほぼいずれかの数値：１０％，２０％，３０％，３３％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８２％，８５％，８８％，９０％，９２％，９５％，９７％，９８％を下回るような実施例をも含む。リンケージ部位総数は、付着形態によって突き止められる。例えば抗原が（リシンにおけるような）遊離アミノ基を介してＩＳＳ含有ポリヌクレオチドにリンクされている場合、リンケージ部位総数はリシンの数である。抗原が、スフルヒドリル基を介して（例えばシステインを介して）リンクされている場合、リンケージ部位総数はスフルヒドリル基の総数である。抗原が炭水化物分を介してリンクされている場合、リンケージ部位の総数は炭水化物分の総数である。これらの実施例のいずれに関しても、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに付着されたリンケージ部位の平均百分率は、上述の免疫調節特性のいずれかによって単独または組み合わせで達成することができる。

ＩＳＳ抗原複合体クラスの特徴付け
本発明の複合集団は、上述のものを含む多数の方法のいずれかによって識別し、かつ／または特徴付けることができる。例えば構造の点から見ると、複合程度は以下のものによって説明することができる：抗原分子に対するＩＳＳの平均数、あるいは中位数；（ｂ）抗原中の総リンケージ部位に対するＩＳＳの比；（ｃ）抗原の（平均であれ中位であれ）質量に対する、ＩＳＳの（平均であれ中位であれ）質量の比；（ｄ）抗原中のＴ細胞エピトープに対するＩＳＳの比；（ｅ）抗原中のＢ細胞エピトープに対するＩＳＳの比。一例として免疫調節を含む機能の点から見ると、本発明の複合体集団は、（ａ）抗原特異的抗体応答度、例えばＩｇＧ応答度；（ｂ）Ｔｈ２関連抗体に対するＴｈ１関連抗体の比；（ｃ）ヒスタミン放出の抑制度；（ｄ）抗原に結合するための抗原特異的抗体との競合度；（ｅ）Ｔｈ２関連免疫応答の抑制度；（ｆ）インターフェロンのようなＴｈ１関連サイトカインの分泌；（ｇ）ＩＬ−４および／またはＩＬ−５のようなＴｈ２関連サイトカインの分泌。

構造的特徴付け
ＩＳＳ抗原複合の程度は、当業者に良く知られたあらゆる数のタンパク質・核酸測定法を使用して、突き止めることができる。例えば、複合の反応生成物を分析するのには、抗原および／またはタンパク質特異的検出法（例えば抗原特異的抗体および／またはクーマシー・ブルー染色）および核酸特異的検出法（例えば検出可能に標識付けされたＤＮＡプローブとのハイブリッド形成）が用いられてよい。適切な定量基準を用いれば、抗体に対するポリヌクレオチド量が突き止められる。

ポリペプチドに結合されたオリゴヌクレオチド量は、複合体のサイズまたは分子量を測定することによって突き止めることもできる。複合体のサイズは、一例としてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析およびゲルろ過クロマトグラフィ（ＳＥＣ）とを含む、当業者には良く知られた方法を使用して突き止めることができる。

ＩＳＳ抗原複合体複合体は、サイズ測定および／または分離法と、核酸およびタンパク質検出法とを組み合わせて分析することができる。例えば、ＳＥＣを用いて複合体反応生成物を分画した後、それぞれの画分のタンパク質および核酸含量を、それぞれ２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの画分吸収度によって突き止めることができる。こうして、複合体と、核酸およびタンパク質との両サイズ検出分析の結果を、複合体の構造の特徴付けと組み合わせることができる。それぞれの複合体画分中のタンパク質の量に対するポリヌクレオチドの量の比は、１抗原分子当たりのＩＳＳ分子の平均数を示す。

機能的特徴付け
ＩＳＳ抗原複合体の投与に応答して発生した抗体の抗原特異性、抗体クラスおよび／またはサブクラスを突き止めるために、当業者に知られた種々の方法を用いることができる。例えば、種々のＩＳＳ抗原複合体に応答して産出された抗体の量、特異性および／または型を検出して測定するのに、標準的なＥＬＩＳＡフォーマット検定が用いられてよい。この検定では、例えば、抗原が基質に付着され、ＩＳＳ抗原複合体から採取された血清とともに保温される。次いで、基質結合抗原に付着された抗原特異的抗体の量が、抗体特異的試薬、例えばＩｇＧａ１、ＩｇＧａ２、ＩｇＧａ３、ＩｇＧａ４などに特異的な抗体を用いて突き止められる。抗原に対する抗原特異的抗体の結合を阻害するのに必要なＩＳＳ抗原複合体の濃度を突き止めるのに、当業者によく知られた方法、例えば本明細書中に記載したような競合的ＥＬＩＳＡ検定が用いられてよい。

ＩＳＳ抗原複合体に応答する、抗原感作された個体からの好塩基球からのヒスタミン放出量を測定するのに、当業者に良く知られた方法を用いることができる。例えば本明細書中に説明するように、アレルギー性抗体の血液から採取した白血球を、ＩＳＳ抗原複合体の濃度および／または調製を変化させながら処理した後、細胞培養液上澄み中に放出されたヒスタミン量を検出することができる。

ＩＳＳ抗原複合体の投与に応答して発生させられたサイトカイン産出プロフィルを突き止めるのに、当業者に良く知られた方法を用いることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＳＳ複合体で処理された細胞の上澄みがサイトカインの存在に関連して分析される。ＩＳＳ抗原複合体に暴露されたリンパ球によって産出されたサイトカインの型および量は、標準的なＥＬＩＳＡフォーマット検定を用いて測定されてよい。ＩＳＳ抗原複合体に応答して産出されたサイトカインプロフィルは、標準的なサイトカイン・バイオアッセイを用いて突き止めることもできる。このバイオアッセイは、細胞生存が特定サイトカイン（例えばＩＬ−２）の存在に依存するアッセイ、および、特定サイトカイン（例えばインターフェロン）がウィルス複製を阻害するアッセイを含むが、これらに限定されるものではない。

複合体投与後の、または抗原単独投与と比較した抗原特異的抗体の抑制程度によって、複合体のクラスを特徴付けることができる。

抗体応答、好ましくは抗原特異的抗体応答、特にＩｇＧ応答の程度によって、複合体のクラスを特徴付けることもできる。上述のように、(ii)抗原単独に応答して産出されたＩｇＧ抗体に対する(i)複合体に応答して産出されたＩｇＧ抗体の比によってクラスを特徴付けることができる。このような特徴付けおよび実施例に関しては、その比は
（ｉ） (ii)抗原によって引き出されたＴｈ１関連抗体およびＴ２関連抗体の和に対する、(i)ＩＳＳ抗原複合体によって引き出されたＴｈ１関連抗体およびＴ２関連抗体の和；
（ｉｉ） (ii)抗原によって引き出されたＴｈ１関連抗体に対する、(i)ＩＳＳ抗原複合体によって引き出された（１つまたは複数の）Ｔｈ１関連抗体；
（ｉｉｉ） (ii)抗原によって引き出されたＴｈ２関連抗体に対する、(i)ＩＳＳ抗原複合体によって引き出された（１つまたは複数の）Ｔｈ２関連抗体であってよい。

Ｔｈ１関連抗体は、Ｔｈ１応答と関連する抗体である。マウスにおいては例えば、ＩｇＧ２ａがＴｈ１応答と関連する。人においては、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３抗体が、Ｔｈ１応答と関連すると考えられる。例えばWidhe他(1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581およびde Martino他(1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164を参照されたい。同様に、Ｔｈ２関連抗体は、Ｔｈ２応答と関連する抗体である。マウスにおいては、ＩｇＧ１がＴｈ２応答と関連する。人においては、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４抗体が、Ｔｈ２応答と関連すると考えられる（Widhe他(1998)およびde Martino他(1999)）。ヒトおよびマウス双方において、ＩｇＥがＴｈ２応答と関連する。このような特徴付けおよび実施例に関して、同一の抗体または抗体産出レベルを、抗原だけで引き出される場合と比較すれば、抗体の１つまたは複数の型を評価できることが明らかである。

このような比を算出するための１つの方法は、抗原の１単位質量当たり産出された（１つまたは複数の）当該抗体の量に対して、複合体の１単位質量当たり産出された（１つまたは複数の）同一抗体の量を見ることである。複合体の単位質量は、複合体の抗原成分の質量、複合体のポリヌクレオチド成分の質量および／または複合体の質量で見てよい。複合体が総分子量１００を有していて、抗原成分が８０を占め、ＩＳＳ成分が２０を占めるとすると、抗体産出レベルを産出し比較することを目的として、単位質量は１００，８０または２０のうちのいずれかであってよい。実施例は、複合体（Ａｍｂ ａ １）の抗原成分の質量が、抗体産出レベルを算出して抗原単独の場合と比較するためのベースとして役立つような算出法を提供する。

さらに、複合体によって産出された抗体と、抗原によって産出された抗体との比を算出する上で、複合体質量と抗原質量とは、１：１であってもなくてもよい。例えばいくつかの実施例では、複合体単位質量によって産出された抗体が、２，３，４，５，６，７，８，１０，１５，２０，２５，３０または４０倍の抗原質量によって産出された抗体と比較される。例えば、Ａｍｂ ａ １の場合、複合体１μｇ（抗原量によって測定；従って複合体中の抗原が１μｇ）によって産出された抗体が、１０μｇのＡｍｂ ａ １によって産出された抗体と比較される。

ＩＳＳ
本発明によれば、免疫調節ポリヌクレオチドは少なくとも１つのＩＳＳを含有しており、複数のＩＳＳを含有することができる。これらのＩＳＳはポリヌクレオチド中で隣接することができ、または、ポリヌクレオチド中で付加的なヌクレオチド塩基によって隔離することもできる。

ＩＳＳは、この分野において説明されてきており、免疫応答の種々の様相、例えばサイトカイン分泌、抗体産出、ＮＫ細胞活性化およびＴ細胞増殖を示す標準的な検定を用いて、容易に識別することができる。例えば国際公開第９７／２８２５９号；同第９８／１６２４７号；同第９９／１１２７５号、の各パンフレット；Krieg他(1995) Nature 374:546-549;Yamamoto他(1992a);Ballas他(1996):Klinman他(1997);Sato他(1996);Pisetsky(1996a);Shimada他(1986)Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816;Cowdery他(1996) J. Immunol. 156:4570-4575;Roman他(1997);およびLipford他(1997a)を参照されたい。

ＩＳＳは、６つを上回る長さの塩基または塩基対を有していてよく、概ね配列５’−シトシン，グアニン−３’から成り、より具体的には配列５’−プリン，プリン，Ｃ，Ｇ，ピリミジン，ピリミジン−３’（例えば５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’）から成り、好ましくは１５個を上回る長さの塩基または塩基対、より好ましくは２０個を上回る長さの塩基または塩基対から成る。ＩＳＳはまた、配列５’−プリン，プリン，Ｃ，Ｇ，ピリミジン，ピリミジン，Ｃ，Ｃ−３’から成る。下記のポリヌクレオチド配列に示すように、ＩＳＳは配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’から成ってもよい。

いくつかの実施例の場合、ＩＳＳは、以下の配列のいずれかから成ってよい：
ＧＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＡＣＧＴＣＣＣ；ＧＡＣＧＴＴＣＣ；ＧＡＣＧＣＣＣＣ；
ＡＧＣＧＴＴＣＣ；ＡＧＣＧＣＴＣＣ；ＡＧＣＧＴＣＣＣ；ＡＧＣＧＣＣＣＣ；
ＡＡＣＧＴＣＣＣ；ＡＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＴＣＣ；ＡＡＣＧＣＴＣＣ；
ＧＧＣＧＴＴＣＣ；ＧＧＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＣＣＣ；ＧＧＣＧＣＣＣＣ；
ＧＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＡＣＧＴＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＴＴＣＧ；
ＡＧＣＧＣＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＣＣＧ；ＡＧＣＧＣＣＣＧ；
ＡＡＣＧＴＣＣＧ；ＡＡＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＡＣＧＣＴＣＧ；
ＧＧＣＧＴＴＣＧ；ＧＧＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＣＣＧ；ＧＧＣＧＣＣＣＧ。

いくつかの実施例の場合、ＩＳＳは、以下の配列のいずれかから成ってよい：
ＧＡＣＧＣＴ；ＧＡＣＧＴＣ；ＧＡＣＧＴＴ；ＧＡＣＧＣＣ；ＧＡＣＧＣＵ；
ＧＡＣＧＵＣ；ＧＡＣＧＵＵ；ＧＡＣＧＵＴ；ＧＡＣＧＴＵ；ＡＧＣＧＴＴ；
ＡＧＣＧＣＴ；ＡＧＣＧＴＣ；ＡＧＣＧＣＣ；ＡＧＣＧＵＵ；ＡＧＣＧＣＵ；
ＡＧＣＧＵＣ；ＡＧＣＧＵＴ；ＡＧＣＧＴＵ；ＡＡＣＧＴＣ；ＡＡＣＧＣＣ；
ＡＡＣＧＴＴ；ＡＡＣＧＣＴ；ＡＡＣＧＵＣ；ＡＡＣＧＵＵ；ＡＡＣＧＣＵ；
ＡＡＣＧＵＴ；ＡＡＣＧＴＵ；ＧＧＣＧＴＴ；ＧＧＣＧＣＴ；ＧＧＣＧＴＣ；
ＧＧＣＧＣＣ；ＧＧＣＧＵＵ；ＧＧＣＧＣＵ；ＧＧＣＧＵＣ；ＧＧＣＧＵＴ；
ＧＧＣＧＴＵ。

いくつかの実施例の場合、免疫調節ポリヌクレオチドは配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）から成る。ＩＳＳは以下の配列のいずれかから成る。
５’−ＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
５’−ＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、Ｂは５−ブロモシトシン；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ｂは５−ブロモシトシン；および
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＢＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、Ｂは５−ブロモシトシン。

ＩＳＳおよび／またはＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは修飾形を含有していてよい。ＩＳＳの修飾形は当業者によく知られているものを含む。その一例としては、３’ＯＨまたは５’ＯＨ基の修飾形、ヌクレオチド塩基の修飾形、糖成分の修飾形およびリン酸基の修飾形が挙げられる。このような種々の修飾形を後述する。

ＩＳＳは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ならびに、二本鎖ＲＮＡまたは他の修飾ポリヌクレオチドであってよい。ＩＳＳは１つまたは複数のパリンドローム域を含んでいてもいなくてもよい。パリンドローム域は、上述の六量体モチーフ内に存在してよく、またはこのモチーフを越えて延びていてよい。ＩＳＳは、付加的なフランキング配列を有していてよい。これらの配列のいくつかを本明細書中に記載する。ＩＳＳは自然発生的な塩基または非自然発生的な修飾塩基を含有していてよく、また、修飾された糖、リン酸および／または末端を含有していてよい。例えばリン酸修飾形は、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステルおよびホスホロジチオエートを含むが、これらに限定されるものではなく、また、これらの組み合わせて用いることもできる。他の非リン酸リンケージを使用することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート・バックボーンから成るのが好ましい。この分野で良く知られた糖修飾形、例えば２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体、および２’−アミノ−ＲＮＡ類似体および２’−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラおよび本明細書中に記載した他のものを製造して、リン酸修飾形と組み合わせることもできる。塩基修飾形の例としては、ＩＳＳのシトシン（例えば５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フロロシトシン、５−ヨードシトシン）のＣ−５および／またはＣ−５への電子吸引分を添加することが挙げられる。

ＩＳＳは当業者に良く知られた技術および核酸合成装置を用いて合成することができる。このような技術は、酵素法、化学法、およびより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を含むが、これらに限定されるものではない。例えばAusubel他(1987);およびSambrook他(1989)を参照されたい。酵素的に集合させる場合には、個々の単位は例えば、Ｔ４ ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼと連結反応させることができる。米国特許第５，１２４，２４６号明細書を参照されたい。オリゴヌクレオチド分解は、米国特許第４，６５０，６７５号明細書に例示されているように、ヌクレアーゼへのオリゴヌクレオチドの暴露により達成することができる。

ＩＳＳはコンベンショナルなポリヌクレオチド隔離手順を用いて隔離することもできる。このような手順は、共有ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリへのプローブのハイブリッド形成、共有構造要素を検出するための発現ライブラリの抗体スクリーニング、および、ポリメラーゼ鎖反応による特定の未処理配列の合成を含むが、これらに限定されるものではない。

環状ＩＳＳは、組換え法によって隔離し、合成することができ、または化学的に合成することができる。環状ＩＳＳを隔離または組換え法により得る場合には、ＩＳＳはプラスミドとなることが好ましい。小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載された方法を用いて実施することができる。例えば、Gao他(1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029;およびWang他(1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照されたい。

オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドを製造するための技術は、当業者に知られている。リン酸ジエステルリンケージを含有する自然発生ＤＮＡまたはＲＮＡは概ね、適切なヌクレオシド・ホスホルアミダイトを、３’−末端で個体支持体に付着された成長オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に順次カップリングし、次いで、中間亜リン酸トリエステルを酸化させてリン酸トリエステルにすることにより合成される。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されると、オリゴヌクレオチドは支持体から取り出され、リン酸トリエステル基は保護解除されることによりリン酸ジエステルとなり、ヌクレオシド塩基は、水性アンモニアまたは他の塩基を用いて保護解除される。例えばBeaucage(1993)「オリゴデオキシリボヌクレオチド合成 (Oligodeoxyribonucleotide Synthesis)」（オリゴヌクレオチドおよび類似体、合成および特性のプロトコル(Protocols for Oliogonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties)）(Agrawal編)Humana Press, Totowa, NJ; Warner(1984) DNA 3:401および米国特許第４，４５８，０６６号明細書を参照されたい。

ＩＳＳはリン酸修飾オリゴヌクレオチドを含有することもできる。修飾リン酸リンケージまたは非リン酸リンケージを含有するポリヌクレオチドの合成も当業者に良く知られている。概観については、Matteucci(1997) 「オリゴヌクレオチド類似体：概要(Oligonucleotide Analogs: an Overview)」（治療薬としてのオリゴヌクレオチド(Oligonucleotides as Therapeutic Agents)），(D.J. Chadwick and G. Cardew) John Wiley and Sons, New York N.Y.を参照されたい。本発明のオリゴヌクレオチド中の糖または糖類似分に付着することができるリン酸誘導体（または修飾リン酸基）は、モノリン酸塩、２リン酸塩、３リン酸塩、ホスホン酸アルキル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどであってよい。上述のリン酸類似物の調整、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド自体への類似物の取り込みも良く知られており、ここにその詳細を記載する必要はない。Peyrottes他(1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi他(1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323;およびSchultz他(1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973。例えばホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの合成は、自然発生オリゴヌクレオチドに関する上述の合成と似ている。異なる点は酸化ステップのかわりにこの場合硫黄処理ステップが生じることである(Zon(1983)「オリゴヌクレオシド・ホスホロチエート(Oligonucleoside Phosphorothioates)」（（オリゴヌクレオチドおよび類似体、合成および特性のプロトコル(Protocols for Oliogonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties)）(Agrawal編)Humana Press,第165〜190頁))。同様に、他のリン酸類似物の合成、例えばリン酸トリエステル（Miller他(1971)JACS 93:6657-6665）、非架橋ホスホルアミデート（Jager他(1988)Biochem. 27:7247-7246）、Ｎ３’〜Ｐ５’ホスホルアミデート（Nelson他(1996)JOC 62:7278-7287）およびホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号明細書）も記載されている。他の非リン酸ベースの修飾オリゴヌクレオチドを使用することもできる（Stirchak他(1989)Nucleic Acids Res. 17:6129-6141）。ホスホロチオエートをバックボーンとするオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステルをバックボーンとするオリゴヌクレオチドよりも大きな免疫原性を有することができ、宿主内への注入後、分解に対して大きな耐性を有すると考えられる。Braun他(1988)J. Immuno. 141:2084-2089;およびLatimer他(1995)Mol. Immunol. 32:1057-1064。

本発明で使用するＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、（唯一または主な糖成分としてリボースを含有する）リボヌクレオチド、（主要な糖成分としてデオキシリボースを含有する）デオキシリボヌクレオチドから成っていてよい。または当業者に知られているように、修飾された糖または糖類似体をＩＳＳ中に取り込むこともできる。このように、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖分はペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソースおよび糖「類似」シクロペンチル基であってよい。糖はピラノシル形またはフラノシル形であってよい。ＩＳＳの場合、糖分は好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’−０一アルキルリボースのフラノシドであり、糖はαまたはβアノマー異性体の各複素環塩基に付着されていてよい。糖修飾形は、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体および２’−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含むが、これらに限定されるものではない。これらの糖または糖類似体、および、このような糖または糖類似体が複素環塩基（核酸塩基）自体に付着されているそれぞれの「ヌクレオシド」の調製は公知であり、ここで説明する必要はない。ただし特定例にこのような調整が関わる場合を除く。糖の修飾形はＩＳＳ調製に際して製造し、リン酸修飾形と組み合わせることもできる。

ＩＳＳ中に取り込まれた複素環塩基または核酸塩基は、自然発生的な主要プリンおよびピリミジン塩基（つまり上述のように、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）であってよく、また、前記主要塩基の自然発生的または合成修飾形であってもよい。

種々の複素環塩基および種々の糖分（および糖類似体）とから成る多数の「合成」非天然ヌクレオシドがこの分野で利用可能であること、また、本発明の他の基準を満たす限りは、ＩＳＳが自然発生核酸の５つの主要塩基成分以外の１つまたは数個の複素環塩基を含んでよいことは、当業者にとっては明らかである。しかしながら好ましくは、ＩＳＳ中の複素環塩基は、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イルの基を含むが、これらに限定されるものではない。これらの基では、プリンは９位置を介して、ピリミジンは１位置を介して、ピロロピリミジンは７位置を介して、ピラゾロピリミジンは１位置を介して、ＩＳＳの糖分に付着される。

ＩＳＳは、例えば共通に所有される米国特許出願第０９／３２４，１９１号明細書および国際公開第９９／６２９２３号パンフレットに記載されたような、少なくとも１つの修飾塩基から成っていてよい。本明細書中に使用したように、「修飾塩基」とは「塩基類似体」と同義であり、例えば「修飾シトシン」とは「シトシン類似体」と同義である。同様に、「修飾」ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、本明細書中においてはヌクレオシドまたはヌクレオチド「類似体」と同義のものとして定義する。塩基修飾形の例は、ＩＳＳのシトシンのＣ−５および／またはＣ−６に電子吸引分を添加することを含むが、これに限定されるものではない。電子吸引分がハロゲンであることが好ましい。このような修飾シトシンは、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシン・アラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、ウラシルおよび他のピリミジン類似体または修飾ピリミジンを含むが、これらに限定されるものではない。

塩基修飾ヌクレオシドの調製、および該塩基修飾ヌクレオシドを前駆体として使用した修飾オリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第４，９１０，３００、同第４，９４８，８８２号および同５，０９３，２３２号の各明細書に記載されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、化学合成によってオリゴヌクレオチドの末端または内部位置に取り込むことができるように構成されている。オリゴヌクレオチドの末端または内部位置に存在するこのような塩基修飾ヌクレオシドは、ペプチドまたは他の抗原の付着部位として役立つことができる。これらの糖分において修飾されたヌクレオシドもまた（例えば米国特許第４，８４９，５１３号、同第５，０１５，７３３号、同第５，１１８，８００号、同第５，１１８，８０２号の各明細書を含むが、これに限定されるものではない）既に説明されており、同様に使用することができる。

いくつかの実施例の場合、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、以下の数値のほぼいずれかの（塩基または塩基対）長さを下回る：１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；１０。いくつかの実施例の場合、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、以下の数値のほぼいずれかの（塩基または塩基対）長さを上回る：８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００。

抗原
本発明の複合集団においては、あらゆる抗原を使用することができる。

いくつかの実施例の場合、抗原はアレルゲンである。組換え抗原の例を表１に示す。多くのアレルゲンの調製は当業者に良く知られており、その一例としては、ブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（Ａｍｂ ａＩ）集団(Rafnar他(1991)J. Biol. Chem. 266:1229-1236)、主要なチリダニ・アレルゲンＤｅｒ ｐＩおよびＤｅｒ ＰＩＩ（Chua他(1988)J. Exp. Med. 167:175-182; Chua他(1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 124-129）、白樺花粉Ｂｅｔ ｖｌ(Breiteneder他(1989)EMBO J. 8:1935-1938)、家ネコ・アレルゲンＦｅｌ ｄ Ｉ（Rogers他(1993)Mol. Immunol. 30:559-568)、および樹木花粉からのタンパク質抗原(Elsayed他(1991)Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31)の調製が挙げられる。表に示すように、樹木からのアレルゲン、例えば樺、杜松、スギは良く知られている。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために花粉からタンパク質抗原を調整することが報告されている。表１が示すように、いくつかの実施例の場合、アレルゲンは、ピーナッツ・アレルゲンのような食物アレルゲン、例えばＡｒａ ｂ Ｉであり、またいくつかの実施例の場合、アレルゲンはライ麦アレルゲン、例えばＬｏｌ ｐ Ｉのような草アレルゲンである。表１は、使用可能なアレルゲンのリストを示す。
表１
組換えアレルゲン

いくつかの態様では、抗原は病原菌から得られる。病原菌は例えば、原生動物性、細菌性、真菌性（単細胞および多細胞のものを含む）、およびウィルス性病原菌である。適切のウィルス性抗原の例を本明細書において説明する。これらの例は当業者に良く知られている。細菌はヘモフィルス属インフルエンザ菌、マイコバクテリウム結核菌および百日咳菌を含む。原生動物病原菌は、マラリア・プラスモジウム、リーシュマニア種、トリパノソーム種および住血吸虫種を含む。真菌は、カンジダ・アルビカンスを含む。

いくつかの態様では抗原はウィルス抗原である。ウィルスポリペプチド抗原は、コアタンパク質、例えば、（膜固着（ＭＡ）タンパク質、コア・キャプシド（ＣＡ）タンパク質およびヌクレキャプシド（ＮＣ）タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない）ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウィルス・マトリックス（Ｍ）タンパク質およびインフルエンザウィルス・ヌクレオキャプシド（ＮＰ）を含むが、これらに限定されるものではない。インフルエンザワクチン接種に関して論じている参考文献の一例としては、ScherleおよびGerhard (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:4446-4450; ScherleおよびGerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128;Granoff他 (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli他 (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida他 (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen他 (1999) Vaccine 17:653-659; GovorkovaおよびSmirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide他 (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuik他 (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura他 (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura他 (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi他 (1990) Vaccine 8:595-599が挙げられる。抗原ポリペプチドの他の例は群または亜群特異抗原である。これらの抗原は多くの病原菌に関して知られている。これらの病原菌は、アデノウィルス、単純ヘルペスウィルス、乳頭腫ウィルス、呼吸器合胞体ウィルスおよびポックスウィルスを含むが、これらに限定されるものではない。

多くの抗原ペプチドおよびタンパク質が知られており、この分野に利用可能であり、コンベンショナルな技術を用いて他の抗原ペプチドおよびタンパク質を識別することができる。腫瘍形成に対する免疫化に関して、免疫調節ペプチドは、（生存しているかまたは照射を受けた）腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物、または腫瘍抗原のタンパク質サブユニット、例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｍａｒｔ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ガングリオシド、ヒト乳脂粒（ＨＭＦＧ）、ムチン（ＭＵＣＩ）、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、およびチロシナーゼを含んでいてよい。免疫をベースとした避妊用ワクチンは、ＩＳＳと一緒に投与された精子タンパク質を含むことによって形成することができる。Lea他 (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263。

抗原として本発明に使用するには、弱毒化および不活性化ウィルスが適している。これらのウィルスの調製は当業者に良く知られており、多くが商業的に入手可能である（例えばPhysicians' Desk Reference (1998),第５２版 Medical Economics Company Inc.参照）。例えばＩＰＯＬ（登録商標）（pasteur Merieux Connaught）およびＯＲＩＭＵＮＥ（登録商標）(Lederle Laboratories)として、ポリオ・ウィルスが利用可能であり、ＶＡＱＴＡ（登録商標）(Merck)として、肝炎ウィルスが利用可能であり、ＡＴＴＥＮＵＶＡＸ（登録商標）(Merck)として、麻疹ウィルスが利用可能であり、ＭＵＭＰＳＶＡＸ（登録商標）(Merck)として、流行性耳下腺炎ウィルスが利用可能であり、ＭＥＲＵＶＡＸ（登録商標）ＩＩ(Merck)として、風疹ウィルスが利用可能である。加えて、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、単純ヘルペスウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ロタウィルス、ヒトまたはヒト以外の乳頭腫ウィルス、およびスロー脳ウィルスがペプチド抗原を提供することができる。

いくつかの実施例の場合、抗原はウィルスベクター、例えば痘疹、アデノウィルスおよびカナリア痘ウィルスから成る。

抗原は、当業者に知られている精製技術を用いてそれらの源から隔離するか、または組換え法を用いて製造するのがより便利である。

抗原ペプチドは、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化および不活性化ウィルス、細胞、微生物、またはこのようなペプチドのフラグメントを含むことができる。免疫調節ペプチドは天然であるか、または、化学的または酵素的に合成されてよい。当業者に知られたどの化学合成法も適している。中程度サイズのペプチドを構成するのには、溶液相ペプチド合成を使用することができ、または、ペプチドを科学的に構成するには、固相合成を採用することができる。Atherton他 (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem.」 362:833-839。アミノ酸をカップリングしてペプチドを製造するのに、タンパク質分解酵素を利用することもできる。Kullmann(1987) 「酵素ペプチド合成(Enzymatic Peptide Synthesis)」, CRC Press, Inc.。あるいは、細胞の生化学機構を用いることにより、または生物源からの隔離により、ペプチドを得ることができる。ペプチドを製造するのに、組換えＤＮＡ技術を採用することができる。Hames (1987) 「転写および翻訳：実践アプローチ(Transcription and Translation: A Paractical Approach)」, IRL Press。アフィニティ・クロマトグラフィのような標準的な技術を用いて、ペプチドを隔離することもできる。

好ましくは抗原は、ペプチド、脂質（例えばステロール、脂肪酸およびリン脂質）、Ｈインフルエンザ・ワクチンで使用されたような多糖、ガングリオシドおよび糖タンパク質である。これらは、化学法および酵素法を用いた隔離および合成を含む、いくつかの方法を介して得ることができる。多くのステロール、脂肪酸およびリン脂質に用いられるような或る事例では、分子の抗原部分が商業的に入手可能である。

対象組成物およびこれらの組成物を用いる方法に役立つウィルス抗原の例は、ＨＩＶ抗原包膜糖タンパク質から誘導された抗原を含むが、これに限定されるものではない。これらの糖タンパク質はｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を含むが、これらに限定されるものではない。ＨＩＶ遺伝子および抗原のための多数の配列が知られている。例えばロスアラモス国立研究所ＨＩＶ配列データベースは、ＨＩＶのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を収集し、管理し、注釈付けを行う。このデータベースはインターネットを介して、http://hiv-web.lanl.gov/でアクセス可能である。年一回の刊行物では、「ヒト・レトロウィルスおよびエイズの概要(Human Retroviruses and AIDS Compendium)」（例えば1998年版）を参照されたい。

病原菌から誘導される抗原は、当業者に知られた方法を用いて、例えば天然のウィルスまたは細菌の抽出物から、病原菌で感染された細胞から、精製されたポリペプチドから、組換え生産されたポリペプチドから、かつ／または合成ペプチドとして得ることができる。

ＩＳＳ−抗原の複合
本明細書中に記載した組成物において、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは抗原と複合されている。ＩＳＳ部分は、共有相互作用および／または非共有相互作用を含む種々の方法で、複合体の抗原部分とカップリングすることができる。

各部分のリンクはＩＳＳの３’または５’末端で、または、ＩＳＳの内部位置における適宜に修飾された塩基で行われる。抗原がペプチドであり、かつ適宜な反応基（たとえばＮ−ヒドロキシスクシニミド・エステル）を含有する場合、この抗原を、シトシン残基のＮ⁴アミノ基と直接的に反応させることができる。ＩＳＳ中のシトシン残基の数および位置に応じて、１つまたは複数の残基において特異的なカップリングを達成することができる。

あるいは、当業者に知られているような修飾オリゴヌクレシドを、ＩＳＳ中の末端または内部位置に取り込むことができる。これらのオリゴヌクレオシドは、ブロックされた官能基を含有していてよい。これらの官能基はブロック解除されると、当該抗原に存在し得るまたは付着され得る種々の官能基と反応可能である。

抗原がペプチドの場合、複合体のこの部分は、固体支持体化学を介して、ＩＳＳの３’末端に付着させることができる。例えば、ＩＳＳは、支持体上で予め合成されているポリペプチド部分に添加することができる。Haralambidis他 (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499;およびHaralambidis他 (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505。あるいは、ＩＳＳは、３’末端から延びる劈開可能なリンカーを介して固体支持体に結合されるように、合成することができる。支持体からＩＳＳが化学的に劈開されると、オリゴヌクレオチドの３’末端に、末端チオール基が残される(Zuckermann他(1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321;Corey 他(1987) Science 238:1401-1403)か、または、オリゴヌクレオチドの３’末端に、末端アミノ基が残される(Nelson他 (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794)。ペプチドのアミノ基へのアミノ修飾ＩＳＳの複合は、Benoit他 (1987) Neuromethods 6:43-72に記載のように行うことができる。ペプチドのカルボキシル基へのチオール修飾ＩＳＳの複合は、Sinha(1991), pp185-210, 「オリゴヌクレオチド類似体：実践アプローチ(Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach)」IRL Pressに記載のように行うことができる。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に、付加されたマレイミドを担持するオリゴヌクレオチドをカップリングすることも既に説明されている。Tung他 (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465。

複合体のペプチド部分は、合成中にオリゴヌクレオチド中に取り込まれたアミン、チオールまたはカルボキシル基を介して、ＩＳＳの５’末端に付着することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固体支持体に固定されている間、保護されたアミン、チオールから成るか、または一方の末端にカルボキシルを、かつ他方の末端にホスホアミダイトを有するリンキング基が５’−ヒドロキシルに共有付着される。Agrawal他 (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky他(1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff他(1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks他(1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299;および米国特許第４，８４９，５１３号、同第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号および同第５，１１８，８０２号の各明細書。保護解除に続いて、アミン、チオールおよびカルボキシル官能価は、オリゴヌクレオチドをペプチドに共有付着するのに使用することができる。Benoit他 (1987);およびSinha他 (1991)。

非共有相互作用、例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合および／またはファン・デル・ワールス誘引を介して、ＩＳＳ抗原複合体を形成することもできる。

非共有リンク複合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有相互作用を含んでよい。例えばＩＳＳの修飾塩基にビオチニル基を付着することができる。Roget 他(1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651。ペプチド部分にストレプトアビジン分を取り込むことにより、ストレプトアビジン複合ペプチドと、ビオチニル化オリゴヌクレオチドとの非共有結合複合体を形成することが可能になる。

非共有的な関連は、電荷アミノ酸のような、ＩＳＳおよび抗原中の残基に関わるイオン相互作用によって、または、オリゴヌクレオチドおよび抗原双方と相互作用可能な荷電残基から成るリンカー部分を使用することによって発生することができる。例えば、非共有複合は、一般的に負に荷電されたＩＳＳと、ペプチドの正に荷電されたアミノ酸残基、例えばポリリシン、ポリアルギニンおよびポリヒスチジン残基との間に発生することができる。

ＩＳＳと抗原との間の非共有複合は、天然リガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して発生することができる。例えば、このようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子および抗ＤＥＮＡ抗体内に見出すことができる。

脂質へのＩＳＳのリンケージは、標準的な方法を用いて形成することができる。これらの方法は、オリゴヌクレオチド−リン脂質複合体(Yanagawa他(1988) Nucleic Acids Symp. Ser 19:189-192)、オリゴヌクレオチド−脂肪酸複合体(Grabarek他 (1990) Anal. Biochem. 185:131-135;およびStaros他 (1986) Anal. biochem. 156:220-222)、オリゴヌクレオチド−ステロール複合体の合成を含むが、これらに限定されるものではない。Boujrad他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5528-5731。

オリゴ糖へのオリゴヌクレオチドのリンケージは、標準的な公知の方法を使用して形成することができる。これらの方法は、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖複合体の合成を含むが、これに限定されるものではない。この場合オリゴ糖は免疫グロブリン分である。O'Shannessy他 (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355。

ペプチドまたは抗原への環状ＩＳＳのリンケージはいくつかの方法で形成することができる。組換え法または化学法を用いて環状ＩＳＳが合成される場合、修飾ヌクレオシドが適切である。Ruth (1991) 「オリゴヌクレオチドおよび類似体：実践アプローチ(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach) pp.255-282, IRL Press。抗原または他のペプチドに環状ＩＳＳを結合するのに、標準リンク技術を使用することができる。組換え法または化学法を用いて環状ＩＳＳが隔離され、または合成される場合、抗原または他のペプチド内に取り込まれた反応基（例えばカルベン、ラジカル）を化学的に活性化するがまたは光活性化することによって、リンケージを形成することができる。

オリゴヌクレオチドにペプチドおよび他の分子を付着するための付加的な方法を、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；Kessler (1992) 「核酸のための非放射性標識付け法(Nonradioactive labeling methods for nucleic acids)」(Kricka) 「非同位体ＤＮＡプローブ技術(Nonistopic DNA Probe Techniques)」, Academic Press; Geoghegan (1992) Bioconjug. Chem. 3: 138-146。

複合集団を含んで成る組成物およびキット
本発明はまた、キットおよび組成物、例えば、本明細書に記載した複合集団のいずれかを含んで成る製剤を提供する。

本発明のキットは、適切なパッケージ内の、本明細書中に記載された複合体集団のいずれかを含んで成る。本発明のキットは任意には、その使用のための指示（例えば、本明細書中に記載した方法のいずれかのための指示）および／または他の適切な構成部分を含有していてよい。

（例えば感染症、癌およびアレルギーと関連して）免疫調節を必要とする個体への投与に特に役立つ本発明の組成物は概ね、免疫応答を調節するのに充分な量の、本明細書中に記載した複合体集団のいずれかを含んで成っている。

一般的に見て本発明の組成物はまた、製薬上許容可能な賦形剤を含んで成り、種々の配合で存在してよい。当業者に良く知られているように、製薬上許容可能な賦形剤は比較的不活性な物質である。この物質は薬理学的に有効な物質の投与を容易にする。例えば、賦形剤は形状またはコンシステンシーを与えることができ、稀釈剤として作用することができる。適切な賦形剤は、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、バッファおよび皮膚浸透エンハンサーを含むが、これらに限定されるものではない。腸管外および非腸管外薬物分配のための賦形剤ならびに製剤が、Remington's Pharmaceutical Sciences 第１９版 Mack Pulishing (1995)に示されている。

他の配合物は、当業者に良く知られた適切なドラッグ・デリバリー形を含む。このようなドラッグ・デリバリー形は、リポソームのようなキャリアを含むが、これに限定されるものではない。Mahato他 (1997) Pham. Res. 14:853-859。リポソーム調製剤は、シトフェクチン、多重ラメラ小胞、単ラメラ小胞を含むが、これに限定されるものではない。

一般的に、これらの組成物は注射による投与（腹膜内、静脈内、皮下、筋内など）のために処方される。従ってこれらの組成物は好ましくは、製薬上許容可能なビヒクル、例えば生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などと組み合わされる。特定の処方計画、つまり用量、タイミングおよび頻度は、特定の個体および個体の病歴に依存することになる。

他の配合物は、当業者に良く知られた適切なドラッグ・デリバリー形を含む。このドラッグ・デリバリー形は、リポソームのようなキャリアを含むが、これに限定されるものではない。Mahato他 (1997) Pharm. Res. 14:853-859。リポソーム調製剤は、シトフェクチン、二重膜小胞、単ラメラ小胞を含むが、これに限定されるものではない。

いくつかの実施例の場合、２つ以上の抗原が組成物中に存在していてよい。このような組成物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗原を含有してよい。この分野ではこのようにしばしば表現されるこの「カクテル」は、例えば２つ以上のアレルゲンに対してアレルギー性を有する個体を治療する上で特に役立つことができる。

本発明は、製薬上許容可能な賦形剤および複合分子集団とを含んで成る、アレルギー免疫療法で用いるための製剤を含む。前記複合分子は、アレルゲンである抗原と、１つまたは複数のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドとを含んで成る。前記集団は、抗原によって引き起こされたヒスタミン放出と比較して、抗原に対して抗原感作された個体からの好塩基球からのヒスタミン放出を抑制する。ヒスタミン放出の抑制程度は、本明細書中に記載した程度であってよい。いくつかの実施例の場合、抗原はＡｍｂ ａ １である。

一般的に、これらの組成物の投与効率は、本明細書中に記載した免疫応答、または他の臨床パラメータにおける変化を測定することにより調整される。

本発明は、本明細書中に記載したＩＳＳ抗原複合体集団と、アジュバントとから成る組成物を提供する。ＩＳＳ−抗原とアジュバントとの関連物質は、アジュバントなしでＩＳＳ抗原が共投与された場合と比較して、免疫応答を向上させるのに効果的である。

このような組成物中では、アジュバントはＩＳＳ抗原と関連した状態で維持され、これにより、ＩＳＳ抗原に対して標的細胞を補充して活性化する。ＩＳＳ抗原複合体のターゲットは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、例えばマクロファージ、樹状細胞、および／またはリンパ球、リンパ構造、例えばリンパ節および／または脾臓、および非リンパ構造、特に樹状細胞が見出される構造、例えば皮膚、肺および／または胃腸管を含むが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施例の場合、本発明は、本明細書中に記載したＩＳＳ−抗原複合体集団とアジュバントとから成る組成物を提供する。これによりＩＳＳ／抗原／アジュバントが投与される。好ましくは、免疫原性組成物は、イムノゲンに対する免疫応答を増強するのに充分な量のアジュバントを含有する。アジュバントは当業者に良く知られており、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、リポソームおよび微粒子を含むが、これらに限定されるものではない。微粒子は、ポリスチレン、澱粉、ポリホスファゼンおよびポリラクチド／ポリグリコシドを含むが、これらに限定されるものではない。他の適宜なアジュバントはまた、ＭＦ５９、ＤＥＴＯＸ（登録商標）（Ｒｉｂｉ）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミール・ペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、例えばTakahashi他(1990) Nature 344:873-875によって記載された複合体、ならびに、脂質ベースのアジュバントおよび本明細書中に記載したその他のものを含むが、これらに限定されるものではない。獣医学の用途のために、また、動物中の抗体を産出するために、（完全および不完全双方の）フロインド・アジュバントのマイトジェン化合物を使用することができる。いくつかの実施例の場合、ＩＳＳ抗原複合体は、共有および／または非共有相互作用を介してアジュバントと関連させることができる。このような非共有相互作用の例は、本明細書中に記載した微粒子へのＩＳＳおよび抗原の吸着を含むが、これに限定されるものではない。

本明細書中に記載したＩＳＳ抗原集団は、１つまたは複数の免疫調節機能との関連において投与することができる。従って本発明は、ＩＳＳ抗原複合体集団と、免疫調節促進因子とを含んで成る組成物を提供する。本明細書中に使用したように、「免疫調節促進因子」という用語は、ＩＳＳの免疫調節しやすさを支援しかつ／または向上させる分子を意味する。免疫調節促進因子の例としては、共刺激分子、例えばサイトカインおよび／またはアジュバントが挙げられる。ＩＳＳとＩＳＳ促進因子複合体中の促進因子分子との関連は、高アフィニティ相互作用および／または低アフィニティ相互作用を含む、非共有相互作用を介して形成することができる。ＩＳＳと、ＩＳＳ促進因子複合体中の促進因子とをカップリングすることができる非共有相互作用の例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合およびファン・デル・ワールス誘引が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

免疫調節促進因子は、共刺激分子（例えばサイトカイン、ケモカイン、ターゲティングタンパク質リガンド、導入活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸から成るペプチド）およびアジュバント（例えばミョウバン、脂質エマルジョン、およびポリラクチド／ポリグリコリド微粒子）を含むが、これらに限定されるものではない。

ＩＳＳと一緒に投与するのに適して免疫調節サイトカインペプチドの中には、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３など）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（例えばＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）およびＴＮＦ−αがある。好ましくはＩＳＳオリゴヌクレオチドと併せて使用するための免疫刺激ペプチドは、Ｔｈ１型免疫応答を刺激するペプチド、例えばＩＬ−１２（Bliss他 (1996) J. Immunol. 156: 887-894）、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、βおよびγ、および／または、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−αである。

ＩＳＳと一緒に投与されるペプチドは、タンパク質が特異的受容体に結合する媒体となるアミノ酸配列、または、特異的な細胞型または組織へのターゲティングの媒体となるアミノ酸配列を含むこともできる。一例としては、抗体または抗体フラグメント、ヒト成長ホルモンのようなペプチドホルモン、および酵素が挙げられる。免疫調節ペプチドはまた、ペプチドホルモン、ペプチド神経伝達物質およびペプチド成長因子を含む。Ｂ７（ＣＤ８０）のような共刺激分子、転写因子のようなトランス活性化タンパク質、マクロファージ化学走化性タンパク質（ＭＣＰ）および他の化学誘引物質、または化学走化性ペプチドも、ＩＳＳと一緒に投与するのに役立つペプチドである。

本発明はまた、コロイド分散系、例えばミクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプセル、および脂質ベース系、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合されたミセルおよびリポソームと共に、ＩＳＳ抗原複合体から成る組成物を提供する。コロイド分散系は、ＩＳＳ含有組成物の効果的なカプセル化を可能にする。

カプセル化組成物はさらに、多種多様の成分のうちのいずれかから成る。これらの成分の一例としては、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造（ＬＭＳ）、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）および他のポリマー、例えばポリペプチド、糖ペプチドおよび多糖が挙げられる。

カプセル化成分に適したポリペプチドは当業者に公知のもののいずれかを含み、脂肪酸結合タンパク質を含むが、これに限定されるものではない。修飾ポリペプチドは、種々の修飾形を含有する。これらの修飾形は、グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化およびヒドロキシル化を含むが、これらに限定されるものではない。本明細書中に使用したように、適切なポリペプチドは、ＩＳＳ含有組成物を保護することによりその免疫調節活性を維持することになるペプチドである。結合タンパク質の一例としては、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびエンドウアルブミンが挙げられる。

他の適切なポリマーは、製薬分野で知られたものであったよく、自然発生ポリマー、例えばデキストラン、ヒドロキシエチル澱粉および多糖、および合成ポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。自然発生ポリマーの一例としては、タンパク質、グリコペプチド、多糖、デキストランおよび脂質が上げられる。付加的なポリマーは合成ポリマーであってよい。本発明における使用に適した合成ポリマーの一例としては、ポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチル化ポリオール、例えばポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタンおよびポリホスファゼンが挙げられる。合成ポリマーはまた、直鎖状または分枝状であってよく、置換されていてもされていなくてもよく、ホモポリマー、コポリマー、または２つ以上の異なる合成モノマーから成るブロック・コポリマーであってよい。

本発明のカプセル化組成物中に使用するためのＰＥＧは、化学品供給業者から購入されるか、または、当業者によく知られた技術を用いて合成される。

「ＬＭＳ」という用語は、本明細書中に使用するように、ラメラ脂質粒子を意味し、この場合、極性脂質の極性頭基は、界面の水相と対面することにより、膜構造を形成するように配置される。ＬＭＳの一例としては、リポソーム、ミセル、コクリート（すなわち一般的には円筒形リポソーム）、マイクロエマルジョン、単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞などが挙げられる。

本発明の好ましいコロイド分散系はリポソームである。リポソームでカプセル化された抗原で免疫化されたマウスにおいて、リポソームは、抗原に対してＴｈ１型免疫応答を向上させるように思われた。Aramaki他 (1995) Vaccine 13: 1809-1814。本明細書中に使用するように、「リポソーム」または「脂質小胞」は、少なくとも１つ、可能な限り２つ以上の二重層脂質膜によって結合された小胞である。リポソームは、リン酸脂質、糖脂質、脂質、ステロイド、例えばコレステロール、関連分子、またはこれらの組み合わせから、当業者によく知られた技術によって人工的に製造される。これらの技術の一例としては、音波処理、抽出、または脂質デタージェント複合体からの洗浄剤の除去が挙げられる。リポソームはまた任意には、付加的な成分、例えば組織標的成分から成っていてもよい。「脂質膜」または「脂質二重層」は、専ら脂質のみから成る必要はなく、付加的に適切な他の成分を含有していてよい。これらの成分は、例えばコレステロールおよびその他のステロイド、脂質可溶性化学物質、あらゆる長さのタンパク質、および、膜の全体的な構造が疎水性コアをサンドイッチする２つの親水性表面から成るシートである場合には、その他の両親媒性分子を含むが、これらに限定されるものではない。膜構造の一般的な議論に関しては、Kendrew著 The Enchclopedia of Molecular Biology (1994)を参照されたい。適切な脂質に関しては、例えばLasic (1993) 「リポソーム：物理学から応用まで（Liposomes: from Physics to Applications）」 Elesevier, Amsterdamを参照されたい。ＩＳＳ含有組成物を含有するリポソームの調製プロセスは、当業者によく知られている。脂質小胞は、当業者によく知られている適切な技術によって調製することができる。これらの方法の一例としては、マイクロカプセル化、マイクロ流動化、ＬＬＣ法、エタノール注入、フレオン注入、「バブル」法、デタージェント透析法、水和、音波処理および逆相蒸発が挙げられる。Watwe (1995) Curr. Sci. 68: 715-724に概説が記載されている。これらの技術を組み合わせることにより、最も望ましい属性を小胞に施すことができる。

本発明は、組織または細胞を標的とした成分を含有するＬＭＳの使用を含む。このようなターゲティング成分は、損傷していない動物、器官、細胞培養への投与時に、他の組織または細胞部位に優先して、或る組織または細胞における蓄積を向上させるＬＭＳ成分である。ターゲティング成分は概ね、リポソーム外側からアクセス可能であり、従って、外面に結合されるか、または外側の脂質二重層内に挿入されることが好ましい。ターゲティング成分は、特にペプチド、大きなペプチドの一領域、細胞表面分子またはマーカーに対して特異的な抗体、またはこれらの抗原結合フラグメント、核酸、炭水化物、複合炭水化物の一領域、特殊脂質、または小分子、例えば薬物、ホルモン、または前述の分子のいずれかに付着されたハプテンであってよい。細胞型特異的な細胞表面マーカーに対する特異性を有する抗体は、当業者に知られており、当業者に知られた方法によって容易に調製される。

ＬＭＤは、治療を施そうとするあらゆる細胞型を標的とすることができる。このような細胞型は、例えば、免疫応答を調節し、かつ／または免疫応答に関与することができる細胞型である。このような標的細胞および器官は、ＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹状細胞およびリンパ球、リンパ構造、例えばリンパ節および脾臓、および、非リンパ構造、特に樹状細胞が見出される構造を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明のＬＭＳ組成物は付加的に界面活性剤から成っていてよい。界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、両親媒性、または非イオン性である。界面活性剤の好ましいクラスは、非イオン性界面活性剤であり、特に好ましくは水溶性界面活性剤である。

投与および免疫応答の評価
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド抗原複合体は、他の薬剤および／または免疫原性物質および／または免疫刺激物質と組み合わせて投与することができ、これらの製薬上許容可能なキャリアと組み合わせることができる。ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、上述のポリヌクレオチドのいずれかであってよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示したように、好ましくは、投与されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’から成る。好ましくは、投与されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、式５’プリン，プリン，Ｃ，Ｇ，ピリミジン，ピリミジン，Ｃ，Ｇ−３’から成り；より好ましくは、５’−Ａ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’から成る。別の好ましい実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を用いる。

全ての免疫原性組成物と共に、特定のＩＳＳ−抗原配合物の投与の免疫学的に有効な量および方法は、どのような状態が治療されることになっているのか、その個体に応じて、また、当業者には明らかな他の要因に応じて変動する可能性がある。考慮されるべき要因は、抗原性、ＩＳＳ抗原複合体がアジュバントまたは運搬分子に複合または共有付着されることになるか否かということ、投与経路、および、投与されるべき免疫化用量数を含む。このような要因は、この分野ではよく知られており、必要以上の実験なしに、免疫学者の技術で充分に見極めることができる。適切な用量範囲は、抗原に対する免疫応答の所望の調節を可能にする範囲である。一般的に云えば、ＩＳＳ抗原複合体の用量範囲は、例えば、以下の数値のほぼいずれかから成ってよい：０１．〜１００μｇ、０１．〜５０μｇ、０１．〜２５μｇ、０１．〜１０μｇ、１〜５００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜３００μｇ、１〜１００μｇ、１００〜２００μｇ、３００〜４００μｇ、４００〜５００μｇ。あるいは、用量は以下の数値のほぼいずれかから成ってよい：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ。従って用量範囲は以下のほぼいずれかの下限を有していてよい：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ。また用量範囲は以下のほぼいずれかの上限を有していてよい：２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ。これらの組成物において、抗原に対するＩＳＳ含有ポリヌクレオチドのモル比は変化することができる。患者毎に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生体利用効率、クリアランス比および投与経路に依存する。

特定のＩＳＳ−抗原配合物の投与の有効量および方法は、個々の患者、疾患の段階、および当業者には明らかな別の要因に応じて変化することが可能である。特定の用途に役立つ投与経路は、当業者に明らかである。投与経路の一例としては局所、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、腸管外、胃腸、および鼻−咽頭、および、経気管支および経肺胞を含む肺が挙げられる。適切な用量範囲は、血中濃度で測定して約１〜１０μＭの組織濃度を達成するのに充分なＩＳＳ含有組成物を提供する範囲である。患者毎に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生体利用効率、クリアランス比および投与経路に依存する。

本明細書中に記載したように、ＡＰＣおよび高濃度のＡＰＣを有する組織は、ＩＳＳおよび抗原含有組成物の好ましい標的である。従ってＩＳＳと抗原とを含有する組成物を、ＡＰＣが比較的高濃度で存在する哺乳類の皮膚および／または粘膜に投与することが望ましい。

本発明は、例えば生理学的に許容可能なインプラント、軟膏、クリーム、リンスおよびゲルを含む局所塗布に適したＩＳＳ−抗原含有組成物を提供する。例えば、内部にデリバリーシステムを拡散された包帯剤または包帯によって、または、デリバリーシステムを切開部または開放創内に直接的に投与することにより、局所投与が行われる。内部にＩＳＳ／抗原含有組成物が拡散されたクリーム、リンス、ゲルまたは軟膏は、局所用軟膏または傷を充填する薬剤として使用するのに適している。

皮膚投与の好ましい経路は、侵襲性が最も少ない投与である。これらの手段のなかで好ましいのは、経皮伝達、表皮投与および皮下注射である。これらの手段のうち、皮内にあると見込まれるより高濃度のＡＰＣにとっては、表皮投与が好ましい。

経皮投与は、ＩＳＳ／抗原含有組成物が皮膚に浸透し、血流に入ることを可能にするクリーム、リンス、ゲルなどを塗布することにより達成される。経皮投与に適した組成物の一例としては、製薬上許容可能な懸濁液、オイル、クリームおよび軟膏が挙げられる。これらは、皮膚に直接的に塗布されるか、または経皮手段（いわゆる「パッチ」）として保護キャリア内に取り込まれる。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えば、Physicians' Desk Referenceに見出すことができる。

経皮伝達に関しては、イオントフォレーゼが適切な方法である。イオントフォレーゼ伝達は、商業的に入手可能なパッチを使用して達成することができる。このパッチはその産出物を数日以上にわたって、傷のない皮膚を通して連続的に供給する。このような方法を用いることによって、比較的高濃度の製薬組成物のコントロールされた伝達が可能になり、組み合わせた薬剤の導入が可能になり、また吸収プロモータの同時使用が可能になる。

この方法に用いるためのパッチ製品の一例は、カリフォルニア州ロサンゼルス在、General Medical Companyの製品ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ（登録商標）である。この製品はリザーバ電極を中性ｐＨに電子的に維持し、種々異なる濃度の用量を提供することにより連続的および／または周期的に投与するように適合させることができる。パッチの調製および使用は、ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ製品に添付の、製造者の印刷された指示書に従って行わなければならない；これらの指示を参考のため本明細書中に引用する。他の密封性のパッチシステムも適切である。

経皮伝達に関して、低周波超音波供給もまた適切な方法である。Mitragotri (1995) Science 269:850-853。低周波超音波周波数（約１ＭＨｚ）の適用により、高分子量組成物を含む治療用組成物の、コントロールされた全体的な供給が可能になる。

表皮性投与は主として、刺激物に対する免疫応答を誘発するのに充分に、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激することを伴う。具体的には、この刺激は、ＡＰＣを刺激部位に引き付けるのに充分でなければならない。

機械的な刺激手段は例えば、極めて小さな直径を有する短い多数の尖叉を採用する。このような尖叉は、皮膚を刺激して刺激部位にＡＰＣを引き付けることにより、尖叉端部から移行したＩＳＳ／抗原含有組成物を取り込むのに使用することができる。例えばフランス国リヨン在、Pasteur Merieuxによって製造されたＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ旧ツベルクリンテストは、ＩＳＳ／抗原含有組成物を導入するのに適した機器を含有する。

（ペンシルベニア州スウィフトウォーター在、Connaught Laboratories, Inc.によって米国に流通している）この機器は、一方の端部に注射器プランジャを、他方の端部に尖叉ディスクを有するプラスチック容器から形成されている。この尖叉ディスクは、小さな直径を有する多数の尖叉を支持している。尖叉は表皮細胞の最外層をちょうど引っかくことになるような長さを有している。ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣキットの各尖叉には、旧ツベルクリンがコーティングされており；本発明では、各ニードルに、ＩＳＳ／抗原含有製薬組成物がコーティングされる。この機器は、機器製品に添付された製造者の指示に従って使用することが好ましい。この実施例にやはり使用可能な同様の機器は、アレルギーテストを実施するのに現在使用されている機器である。

表皮の最も外側の細胞を刺激する化学薬品を使用し、こうしてこの部位にＡＰＣを引き付けるのに充分な免疫応答を誘発させることにより、ＩＳＳの表皮投与への別の適切なアプローチが得られる。その一例が、登録商標ＮＡＩＲとしてNoxema Corporationによって販売されている、商業的に入手可能な局所用脱毛クリーム中で使用されるサリチル酸のようなケラチン分解剤である。このようなアプローチは、粘膜における上皮投与を達成するのにも用いることができる。（例えば、ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ型尖叉に化学的刺激物がコーティングされた場合にも発生するように）機械的な刺激物と共に化学的刺激物を適用することができる。ＩＳＳはキャリヤ中に懸濁することができる。キャリヤはまた、化学的刺激物を含有するか、または一緒に共投与される。ＩＳＳ／抗原含有組成物を投与するための別の供給方法では、非脂質ポリマー、例えば合成ポリカチオンアミノポリマーが利用される。Leff (1997) Bioworld 86:1-2。

腸管外投与経路の一例としては、電気的な注入（イオントホレーゼ）または直接的な注入、例えば中心静脈、静脈内、筋内、腹膜内、皮内注射が挙げられる。

腸管外投与に適した組成物は、製薬上許容可能な滅菌等張液を含むが、これに限定されるものではない。このような等張液は、ＩＳＳ含有組成物を注射するための生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を含むが、これらに限定されるものではない。

胃腸投与経路は、摂取および直腸を含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、胃腸投与に適したＩＳＳ／抗原含有組成物を含む。このような胃腸投与の一例としては、摂取および直腸投与用の座薬のための、製薬上許容可能な粉末、錠剤または液体が上げられる。鼻−咽頭投与経路および肺投与経路の一例としては、吸入、経気管支および経肺胞経路が挙げられる。本発明は、吸入による投与に適したＩＳＳ／抗原含有組成物を含む。このような投与の一例としては、種々のタイプの吸入用エアロゾル、ならびにデリバリーシステムのための粉末形状が上げられる。ＩＳＳ／抗原含有組成物の吸入による投与に適した機器は、噴霧器および気化器を含むが、これらに限定されるものではない。粉末の吸入供給に使用するのに適した種々の機器の中には、粉末を充填された噴霧器および気化器がある。

注射、局所塗布、噴霧器および気化器に適した機器を製造する方法は、当業者によく知られており、詳細な説明はしない。

引き出された免疫応答を調節するのに、供給経路を選択することができる。例えば、インフルエンザウィルス・ベクターを筋内または表皮（遺伝子銃）経路を介して投与した場合、ＩｇＧ力価とＣＴＬ活性とは同一であったが、しかし、筋肉接種が主にＩｇＧ２ａを産出したのに対し、表皮経路は主にＩｇＧ１を産出した。Pertmaer他 (1996) J. Virol. 70: 6119-6125。従って当業者は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの種々異なる投与経路によって引き出された免疫原性の僅かな差を利用することができる。

上述の組成物および投与方法は説明のための一例であり、本発明のＩＳＳ／抗原含有組成物の投与方法を限定するものではない。種々の組成物および機器を製造する方法は当業者の能力内にあるものなので、ここでの詳しい説明は省く。

ＩＳＳ／抗原含有組成物に対する免疫応答の（定性的かつ定量的双方の）分析は、当業者によく知られた方法によって行うことができる。この方法の一例としては、抗原特異的抗体の産出量の測定（特異的抗体のサブクラスの測定を含む）、ＣＤ４⁺Ｔ細胞またはＮＫ細胞のようなリンパ球の特異的集団の活性化、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２のようなサイトカインの産出量の測定、および／またはヒスタミン放出量の測定が挙げられる。特異的抗体応答を測定する方法は、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＺＡ）を含み、当業者によく知られている。例えば、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のような特異型リンパ球の数を測定することができる。例えば、Raz (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523に記載されたように、細胞毒性検定を行うことができる。サイトカインの血清濃度は、例えばＥＬＩＳＡによって測定することができる。イムノゲンに対する免疫応答を評価するためのこれらの検定およびその他の検定は、当業者によく知られている。例えば、Selected Methods in Cellular Immunology (1980) MishellおよびSchigi編 W.H.Freeman and Co.を参照されたい。

Ｔｈ１型応答が刺激される、すなわち引き出されかつ／または増大されることが好ましい。本発明によれば、Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＳＳなしで処理された細胞と比較して、ＩＳＳを伴って処理された細胞からのサイトカイン産出量を測定することによって見極めることができる。細胞のサイトカイン産出量を測定する方法は、本明細書中に記載した方法および当業者に知られている方法を含む。ＩＳＳ治療に応答して産出された型のサイトカインは、細胞による、Ｔｈ１型またはＴｈ２型付勢免疫応答を示す。本明細書中に使用するように、「Ｔｈ１型付勢」サイトカイン産出という用語は、刺激の不存在におけるサイトカイン産出量と比較して、刺激因子の存在においてＴｈ１型免疫応答と関連する、サイトカインの測定可能な産出量の増大を意味する。このようなＴｈ１型付勢サイトカインの一例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが挙げられる。対照的に、「Ｔｈ２型付勢サイトカイン」は、Ｔｈ２型免疫応答と関連するサイトカインを意味し、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を含むが、これに限定されるものではない。ＩＳＳ活性を見極めるのに役立つ細胞は、免疫系の細胞、宿主および／または細胞株から隔離された一次細胞、好ましくはＡＰＣおよびリンパ球、より好ましくはマクロファージおよびＴ細胞を含む。

Ｔｈ１免疫応答の刺激は、ＩＳＳ／抗原含有組成物で治療された宿主中で測定することもでき、当業者によく知られた方法により見極めることができる。このような見極めは、以下のものを含むが、これに限定されるものではない：（１） 抗原負荷前後に測定されたＩＬ−４またはＩＬ−５のレベル減少；または、ＩＳＳなしで治療されて一回目の抗原投与を受けた、または一回目および二回目以降の投与（負荷）を受けた対照と比べた場合の、ＩＳＳ／抗原含有組成物で治療された宿主中のＩＬ−４またはＩＬ−５のより低いレベル（または、ＩＬ−４またはＩＬ−５が存在しない場合もある）の検出；（２）抗原負荷前後に測定されたＩＬ−１２、ＩＬ−１８および／またはＩＦＮ（α、βまたはγ）のレベル増大；または、ＩＳＳなしで治療されて一回目の抗原投与を受けた、または一回目および二回目以降の投与を受けた対照と比べた場合の、ＩＳＳ／抗原含有組成物で治療された宿主中のＩＬ−１２またはＩＬ−１８および／またはＩＦＮ（α、βまたはγ）のより高いレベルの検出；（３）ＩＳＳなしで治療された対照と比較した場合の、ＩＳＳ／抗原で治療された宿主中の「Ｔｈ１型付勢」抗体産出量；および／または（４）抗原負荷前後に測定された抗原特異的ＩｇＥのレベル減少；または、ＩＳＳなしで治療されて一回目の抗原投与を受けた、または一回目および二回目以降の投与を受けた対照と比べた場合の、ＩＳＳ／抗原含有組成物で治療された宿主中の抗原特異的ＩｇＥのより低い（または、ＩｇＥが存在しない場合もある）レベルの検出。種々様々なこのような検出は、本明細書中に記載した方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＡＰＣおよび／またはリンパ球、好ましくはマクロファージおよび／またはＴ細胞によりサイトカインを測定することによって行うことができる。これらの検出のいくつかは、本明細書中に記載した、または当業者によく知られている方法を用いて、抗原特異的抗体のクラスおよび／またはサブクラスを測定することにより行うことができる。

ＩＳＳ／抗原治療に応答して産出された抗原特異的抗体のクラスおよび／またはサブクラスは、細胞による、Ｔｈ１型またはＴｈ２型付勢免疫応答を示す。本明細書中に使用するように、「Ｔｈ１型付勢」抗体産出という用語は、Ｔｈ１型免疫応答と関連する抗体（Ｔｈ１関連抗体）の産出量の測定可能な増大を意味する。１つまたは複数のＴｈ１関連抗体が測定されてよい。このようなＴｈ１型付勢抗体の一例としては、ヒトＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３（例えばWidhe他 (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581およびde Martino他 (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol 83:160-164参照）およびネズミＩｇＧ２ａが挙げられる。対照的に、「Ｔｈ２型付勢抗体」は、Ｔｈ２型免疫応答と関連した抗体を意味し、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４および／またはＩｇＥ（例えば、Widhe他 (1998)およびde Martino他 (1999)参照）、およびネズミＩｇＧ１および／またはＩｇＥを含むが、これらの限定されるものではない。

ＩＳＳ投与の結果として発生するＴｈ１型付勢サイトカイン誘導は、向上された細胞免疫応答を引き起こす。このような応答は例えば、ＮＫ細胞、細胞障害性キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパーおよび記憶細胞によって行われる。これらの応答は、ウィルス、真菌、原生動物寄生虫、細菌、アレルギー疾患および喘息、ならびに腫瘍に対する予防または治療のためのワクチン接種の使用に、特に有益である。

いくつかの実施例の場合、Ｔｈ２応答が抑制される。Ｔｈ２応答の抑制は、例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−５のようなＴｈ２関連サイトカインのレベルの減少、ならびにＩｇＥ減少およびアレルゲンに応答したヒスタミン放出の減少によって見極めることができる。

発明の方法
本発明はまた、免疫応答を調節する方法を含む。この方法は、免疫応答の所望の調節が達成されるように複合体の集団（典型的にはこの集団と、製薬上許容可能な賦形剤とを含んで成る組成物である）を投与することを含んで成る。複合体の投与および免疫応答の評価については上述の通りである。

いくつかの実施例の場合、本発明は、個体内の免疫応答を調節する方法を提供する。この方法は、免疫応答を調節するのに充分な量で、本明細書中に記載したいずれかの集団から成る組成物を個体に投与することを含んで成る。一般的に、例えば疾患状態または疾患が発生するおそれのために、個体はこのような調節を必要としているか、または必要とすることになる。これらの状態の一例としては、アレルギー、癌、感染症（例えばウィルスまたは細菌感染）が挙げられる。

いくつかの実施例の場合、免疫調節は、（１つまたは複数の）Ｔｈ１関連サイトカイン、例えばインターフェロン−γを刺激することを含んで成る。いくつかの実施例では、免疫調節は、Ｔｈ２関連サイトカイン、例えばＩＬ−４および／またはＩＬ−５の産出を抑制することを含んで成る。これらのパラメータは、当業者にとって標準的な上述の方法を用いて測定される。

いくつかの実施例の場合、１つまたは複数のＴｈ１関連サイトカインが産出されるのに対し、抗原特異的抗体は抑制される。これらのパラメータは、当業者にとって標準的な上述の方法を用いて測定される。

或る実施例の場合、免疫調節は、（１つまたは複数の）Ｔｈ１関連サイトカイン、例えばインターフェロン−γを刺激し、抗原特異的抗体の産出を抑制することを含んで成る。Ｔｈ１関連抗体産出およびＴｈ１およびＴｈ２の関連抗体の組み合わせの産出を含む、種々の複合体集団に応じた抗原特異的抗体産出の抑制度は上述の通りであり、これらの方法に当てはまる。

いくつかの実施例の場合、免疫調節はヒスタミン放出を抑制することを含んで成る。種々の複合体集団に応じたヒスタミン放出の抑制度は、上述の通りであり、これらの方法に当てはまる。

例２〜４が伝えるように、本発明はまた、個体中の抗体形成、好ましくは抗原特異的抗体形成の抑制方法を提供する。この場合、Ｔｈ１関連サイトカインの産出の刺激が、ＨクラスのＩＳＳ−抗原複合体の集団を個体に投与することを含んで成り、これにより、Ｔｈ１関連サイトカインが刺激される一方、抗体形成が抑制される。これらのパラメータは、当業者にとって標準的な上述の方法を用いて測定される。

いくつかの実施例の場合、本発明は、個体のアレルギー状態を治療する方法を提供する。この方法は、一般的に抗原に対する免疫応答を調節することによって、抗原がアレルゲンであるような本明細書中に記載した集団のいずれか（一般的には記載の組成物と製薬上許容可能な賦形剤とから成る組成を有する）を、アレルギー状態を改善しまたは軽減するのに充分な量で投与することを含んで成る。軽減は例えば、アレルギーに関連する１つまたは複数の症状の緩和によって見極めることができる。

本発明はまた、抗原、特にアレルゲンのアレルゲン性を低減する方法を提供する。この方法は、抗原単独の場合に比べて（すなわち抗原がＩＳＳにリンクされていない）アレルゲン性が低減されるように、アレルゲンをＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに複合することから成る。いくつかの実施例の場合、本発明は、抗原、特にアレルゲンのアレルゲン性を低減する方法を提供する。この方法は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドにアレルゲンを複合することを含んで成り、抗原に対して低い平均数のＩＳＳを有する複合分子集団と比較して、アレルゲン性が低減されるように、ＩＳＳの平均数が設定される。（Ｔｈ１型およびＴｈ２型応答を含む）免疫応答の種々の面における調節は、上述のように測定される。

いくつかの実施例の場合、本発明は、抗原特異的ＣＴＬの活性を発生させる一方、抗原特異的抗体の産出を抑制するための方法を提供する。

本発明はまた、本明細書中に記載した技術および／またはステップのいずれかから成る複合体クラスを製造する方法を提供する。

以下に例を示すが、これらの例が本発明を限定するものではない。

実施例
例１ ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭまたはＡＩＣ−Ｈの調製
ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈは、ブタクサ・アレルゲンＡｍｂ ａ １とＩＳＳ含有ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とから成る共有複合体である。複合体の３つのクラス全ては、同じＩＳＳ含有ポリヌクレオチドから調製され、同じヘテロ二官能価リンカーを採用する。Ａｍｂ ａ １に複合されたオリゴヌクレオチドの数は、クラスによって異なる。Ａｍｂ ａ １に結合されたオリゴヌクレオチドの数は、複合体のサイズまたは分子量を測定することによって見極めることができる（図１２および１３参照）。ＡＩＣ−Ｌは１Ａｍｂ ａ １分子当たり２〜３個のオリゴヌクレオチド平均数を含有し、ＡＩＣ−Ｍは３．５〜４．５個の平均数を、ＡＩＣ−Ｈは５．５個を上回る平均数を含有している。ＡＩＣのこれら３つのクラスは、後述のような異なる生物学的特性を有している。

５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドの調製および単離
トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を、周囲温度に到達させ、１０ｍＭ ＮａＰＯ₄／１４１ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２中に溶解させた。５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドを周囲温度に到達させ、同じ緩衝液中に溶解し、４０℃で２時間、ＴＣＥＰ溶液で処理した。この材料を直接、隔離ステップに移した。

予めパックされた２つの脱塩カラムを直列につなぎ、１０ｍＭ ＮａＰＯ₄／１４１ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２緩衝液と釣り合わせた。５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチド還元混合物をカラムに装てんし、５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドを無勾配溶離した。

マレイミド活性化Ａｍｂ ａ １の調製および単離
Ｎ−エチル・マレイミド（ＮＥＭ）を周囲温度に到達させ、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）中に攪拌しながら溶解した。Ａｍｂ ａ １を溶かし、２０℃で２時間、ＮＥＭ溶液で処理した。スルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）を周囲温度に到達させ、ＤＭＳＯ中に溶解した。ＮＥＭブロックＡｍｂ ａ １を２０℃で２．５時間、ｓＳＭＣＣで処理した。この材料を直接、隔離ステップに移した。予めパックされた２つの脱塩カラムを直列につなぎ、１０ｍＭ ＮａＰＯ₄／１４１ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２緩衝液と釣り合わせた。Ａｍｂ ａ １活性化混合物をカラムに装てんし、マレイミド活性化Ａｍｂ ａ １を無勾配溶離した。

ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭまたはＡＩＣ−Ｈの調製および単離
４モル当量の５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドと、１モル当量のマレイミド活性化Ａｍｂ ａ １とから成る混合物を保温することにより、粗ＡＩＣ−Ｌ複合体を調製した。同様にして、ただし、５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドをそれぞれ７モル当量および１７モル当量添加することにより、粗ＡＩＣ−Ｍおよび粗ＡＩＣ−Ｈを調製した。予めパックされたゲルろ過カラムを、１０ｍＭ ＮａＰＯ₄／１４１ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２緩衝液と釣り合わせ、粗ＡＩＣ−Ｌ、粗ＡＩＣ−Ｍおよび粗ＡＩＣ−Ｈをカラムに装てんした。ＡＩＣを１０ｍＭ ＮａＰＯ₄／１４１ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２緩衝液で無勾配溶離した。

例２ マウス中のＡＩＣ−Ｈ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｌの免疫原性
１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから成る群を、尾の皮内において、１μｇのＡＩＣ（Ｈ，Ｍ，Ｌ）で免疫化した。対照マウスに１０μｇのＡｍｂ ａ １の同一注射を施した。第１回および第２回免疫化２週間後にマウスから血液を採取し、血清を調製し、Ａｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡによって測定した。マウスの系の場合、ＩｇＧ１応答は、Ｔｈ２型免疫応答と関連するのに対し、ＩｇＧ２ａ応答はＴｈ１型応答と関連する。

いくつかの実験では、マウスを第２回免疫化４週間後に殺し、脾臓を採集し、脾臓細胞培養を調製した。これらの培養をＡｍｂ ａ １で４日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激し、Ａｍｂ ａ １に応答して培地中に分泌されたＩＦＮγおよびＩＬ−５をＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮγはＴｈ１細胞の産出物であるのに対し、ＩＬ−５はＴｈ２細胞の産出物である。

ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡｍｂ ａ １の免疫原性の比較
ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡｍｂ ａ １の抗体応答を表２に示す（平均力価±標準偏差）。ＡＩＣ−Ｍは第１回免疫化後、極めて低いＩｇＧ１応答と、比較的高いＩｇＧ２ａ応答を引き起こした。第２回免疫化後、ＩｇＧ２ａ応答がＩｇＧ１応答よりもなおも約５倍高いのに伴って、ＩｇＧ１応答およびＩｇＧ２ａ応答は双方とも増大した。ＡＩＣ−Ｌは、第１回および第２回免疫化後のＡＩＣ−Ｍよりも高いＩｇＧ１応答およびＩｇＧ２ａ応答を引き起こした。ＡＩＣ−Ｌによる抗体応答もまた、ＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２ａ応答に向かってより重く重み付けされた。ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１を示す、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｌに対する抗体応答は、Ｔｈ１型免疫応答を示唆している。対照的に、修飾されていないＡｍｂ ａ １は、第１回および第２回免疫化後に高いＩｇＧ１応答と低いＩｇＧ２ａ応答とを引き起こした。このような型の抗体応答は、Ｔｈ２型免疫応答を示唆している。従ってＡｍｂ ａ １のＡＩＣ−Ｌ修飾形およびＡＩＣ−Ｍ修飾形は、Ｔｈ２型抗原(Ａｍｂ ａ １)の免疫応答を、Ｔｈ１プロフィルに向かってシフトする。ＡＩＣ−Ｌは、ＡＩＣ−Ｍよりも高い総抗体応答を発生させると考えられた。

ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡｍｂ ａ １の免疫原性の比較
ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡｍｂ ａ １に対する抗体応答を明示する第２の実験を表３に示す（平均力価±標準偏差）。この実験の結果は上述の実験と類似しているが、同一ではない。ＩｇＧ１応答は全体的にこの実験において、上述の実験よりも高かった。その他の点では結論は同じである。Ａｍｂ ａ １のＡＩＣ−ＬおよびＡＩＣ−Ｍ双方の修飾形は、Ｔｈ２型抗原(Ａｍｂ ａ １)の免疫応答を、Ｔｈ１プロフィルに向かってシフトする。ＡＩＣ−Ｌは、ＡＩＣ−Ｍよりも高い総抗体応答を発生させると考えられる。

ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−ＨおよびＡｍｂ ａ １の免疫原性の比較
ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−ＨおよびＡｍｂ ａ １に対する抗体応答を表４に示す（平均力価±標準偏差）。ＡＩＣ−Ｍは前の実験と類似の抗体応答を発生させ、ＩｇＧ２ａ力価はＩｇＧ１力価よりも大きい。ＡＩＣ−Ｈは、第１回および第２回双方の免疫化後、ＡＩＣ−Ｍよりも低いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを引き起こす。ＡＩＣ−Ｈによる抗体応答もまた、ＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２ａ応答に向かってより重く重み付けされる。修飾されていないＡｍｂ ａ １はやはり、第１回および第２回免疫化後に高いＩｇＧ１応答と低いＩｇＧ２ａ応答とを引き起こした。従って、Ａｍｂ ａ １のＡＩＣ−Ｈ修飾形およびＡＩＣ−Ｍ修飾形は、Ｔｈ２型抗原(Ａｍｂ ａ １)の免疫応答を、Ｔｈ１プロフィルに向かってシフトする。ＡＩＣ−Ｈは、ＡＩＣ−Ｍよりも高い総抗体応答を発生させると考えられる。

ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−ＨおよびＡｍｂ ａ １の免疫原性の比較
（表５に要約；平均力価±標準偏差）この実験は、表４に要約した結果を再現し、１つの付加的なＡＩＣ−Ｈロットを含む。この実験はＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈが同様のＴｈ１応答を発生させ、ＡＩＣ−ＨがＡＩＣ−Ｍよりも低い抗体応答を発生させることを確証する。

ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈによる免疫化に対する抗原特異的抗体を、Ａｍｂ ａ １による免疫化に対する応答と比較して、図４，７および１４にも示す。これらの結果は、ＡＩＣ−Ｈによる免疫化が、ＡＩＣ−ＭまたはＡＩＣ−Ｌによる免疫化よりも低い抗原特異的抗体応答をもたらすことを示す。

ＡＩＣ−Ｈによる免疫応答におけるＴｈ２からＴｈ１へのシフト
マウスに第０週に、Ｔｈ２応答を発生させるミョウバン中のＡｍｂ ａ １を初回投与した。第１５週に、これらのマウスにＡｍｂ ａ １またはＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ ５）をそれぞれ１０μｇずつ、２週間の間隔を置いて三回注射して治療した（図１〜３参照、注射を矢印で示す）。Ａｍｂ ａ １に対して特異的なＩｇＧ１、ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡによって測定し、結果を図１〜３にそれぞれ示す。

ＡＩＣ−Ｈ治療は、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型応答へのシフトをもたらす。このシフトは、産出されたＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ１およびＩｇＥの量が減小することと、産出されたＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ２ａの量が増大することにより示唆される。対照的に、修飾されていないＡｍｂ ａ １による治療は、より高いＩｇＧａおよびＩｇＥ応答と、より低いＩｇＧ２ａとをもたらした。

例３ ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈで免疫化され、Ａｍｂ ａ １単独では免疫化されていないマウスにＴｈ１関連サイトカインが引き起こされる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡｍｂ ａ １露出に対する脾臓のサイトカイン応答を表６に示す（平均力価±標準偏差）。ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈによる免疫化は、Ａｍｂ ａ １に応答する高レベルのＩＦＮγおよび低レベルのＩＬ−５を分泌する記憶脾臓細胞を確立した。このことはＴｈ１応答を示唆する。対照的に、修飾されていないＡｍｂ ａ １による免疫化は、低レベルのＩＦＮγおよび高レベルのＩＬ−５を分泌する記憶脾臓細胞を確立した。このことはＴｈ２応答を示唆する。

従ってＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈの双方はＴｈ１応答を確立することができる。ＡＩＣ−Ｍはより低い抗体応答を発生させるが、しかしＡＩＣ−Ｍに対するサイトカイン応答と類似している。

表７（平均力価±標準偏差）のデータは、マウスがＡＩＣ−Ｍおよび２つの異なるロットのＡＩＣ−Ｈで免疫化されている場合に、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）産出を引き起こした状態を示す。対照的に、Ａｍｂ ａ １による免疫化は、ＩＦＮ−γを殆ど産出しなかった。マウスがＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈで免疫化されている場合には、ＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）の産出は殆どまたは全く観察されなかった。Ａｍｂ ａ １免疫化は高レベルのＩＬ−５産出を引き起こした。これらのデータは、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈによるマウスの免疫化が、サイトカイン・プロフィルをシフトするのに際して、強力なＴｈ１型付勢を反映するのに効果的であることを示す。

図５，６，８，９および１５は、ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−ＨおよびＡｍｂ ａ １の投与に応答する、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γの産出を示す。これらのデータは、ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−ＨがＴｈ１型サイトカイン・プロフィルを効果的に引き起こしていることを示す。

例４
この検定では、ブタクサアレルギーのヒト被験者の血液から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を調製した。これらの細胞を５μｇ／ｍｌのＡｍｂ ａ １、ＡＩＣ−ＭまたはＡＩＣ−Ｈと共に２ ｘ １０⁶／ｍｌで６日間培養した。上澄みを収穫し、上澄みのＩＦＮ−γ含量をＥＬＩＳＡによって測定した。いくつかの細胞を第６日に、２．５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）および１０ｎｇ／ｍｌのホルボール・１２−ミリステート・１３−アセテート（ＰＭＡ）で２４時間、再刺激した。その後、上澄み液を収穫して、上澄みのＩＬ−４およびＩＬ−５含量をＥＬＩＳＡによって測定した。ブタクサアレルギーを有する被験者からのＰＢＭＣのサイトカイン応答を表８に示す（平均力価±標準偏差）。ＡＩＣ−ＨおよびＡＩＣ−Ｍの双方は、ブタクサに対してアレルギー性を有する個体からの細胞中のＴｈ１型サイトカイン応答を刺激することができる。対照的に、Ａｍｂ ａ １は、これらの細胞からＴｈ２型サイトカイン応答、すなわち僅かなＩＦＮ−γおよび高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−５を発生させた。これらのデータは、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈが、アレルギー性の個体からのＰＢＭＣｓ中のサイトカイン・プロフィルをシフトする上で、Ｔｈ１型応答付勢を反映するのに効果的であることを示す。

例５ ＡＩＣ−Ｈ、ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−Ｌが、ブタクサアレルギーのヒト被験者の好塩基球からの異なるヒスタミン放出誘発程度を呈する。

ＡＩＣのアレルゲン性を、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒスタミン放出検定を用いてＡｍｂ ａ １と比較した。このテストは抗原のｉｎ ｖｉｖｏアレルゲン性を予測する。この検定では、ブタクサアレルギー患者の血液から、白血球を調製した。これらの白血球を０．０００１〜１．０μｇ／ｍｌの範囲のＡｍｂ ａ １またはＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−Ｈ濃度で、４５分間保温した。次いで細胞を遠心分離によりペレット化し、専用自動アナライザシステムを使用して、ヒスタミン含量に関して上澄みを蛍光分析した。８％ＨＣｌＯ₄で細胞を溶解することにより、１００％のヒスタミン放出を測定する。ＡＩＣ−ＬロットＢＫ１１、ＡＩＣ−ＭロットＢＫ１０、ＡＩＣ−ＨロットＢＫ８の結果を表９に示す（平均力価±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として要約を付けた）。これらの結果をＨＲ₄₀に照らして表現する。ＨＲ₄₀はヒト細胞から４０％のヒスタミン放出を引き起こすのに必要なサンプル濃度（Ａｍｂ ａ １またはＡＩＣ（μｇ／ｍｌ））として規定される。これらの結果は、全てのＡＩＣクラスの、アレルギー患者の好塩基球からヒスタミン放出を引き起こすための能力が著しく低いことを示す。ＡＩＣ−ＬのＨＲ₄₀値は平均するとＡｍｂ ａ １よりも６２倍高く、ＡＩＣ−ＭのＨＲ₄₀値は平均するとＡｍｂ ａ １よりも１３２倍高く、ＡＩＣ−ＨのＨＲ₄₀値は平均するとＡｍｂ ａ １よりも１４１７倍高い（例えば、ヒスタミン放出を引き起こすのに、Ａｍｂ ａ １よりも６２倍多い、１３２倍多い、または１４１７倍を超えて多いＡＩＣが必要となる）。アレルゲンによって引き起こされるヒスタミン放出を、図１０および１１に示す。

これらのデータは、ＡＩＣ種が天然Ａｍｂ ａ １アレルゲンよりも、ｉｎ ｖｉｖｏで、著しく低いアレルゲン性を有さなければならないことを予測する。アレルゲン性の低減は、アレルゲンに結合されたＩＳＳオリゴヌクレオチドの数に関連する。従って、ＡＩＣ−ＬはＡＩＣ形の最大アレルゲン性を有し、ＡＩＣ−Ｍは中間アレルゲン性を有し、ＡＩＣ−Ｈは最小アレルゲン性を有する。

免疫化マウスにおいてＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ、ＡＩＣ−Ｈ複合体が示す互いに異なる免疫調節特性を表９に要約する。これらのデータは、ＩＳＳ複合体がＡｍｂ ａ １（抗原単独）とは、Ｔｈ１型応答に向かって免疫応答を付勢する能力で異なっていることを明示している。ＡＩＣ−Ｌは、高い抗体産出と、Ｔｈ１極性に向かう中程度のシフトと、中程度のヒスタミン放出抑制とを引き起こす。対照的に、ＡＩＣ−Ｍは、それよりも僅かに低い抗体産出と、ＩＦＮ−γの高い産出と、免疫化後早期に発生する、Ｔｈ１極性に向かう強度のシフトと、より強いヒスタミン放出抑制とを引き起こす。さらに対照的に、ＡＩＣ−Ｈは、低い抗体産出と、これら３つの組成物のうちでは最も高いＩＦＮ−γ産出と、免疫化後遅れて発生するＴｈ１極性に向かう強度のシフトと、最強のヒスタミン放出抑制とを引き起こす。

表１１は、いくつかの実験中の異なる時点で複合物に応答して発生した、Ｔｈ２抗体に対する、Ａｍｂ ａ １特異的Ｔｈ１抗体の比の要約である。

例６ ＡＩＣ複合体集団がＣＴＬ活性を引き起こす
種々異なるクラスの抗原ＩＳＳ複合体を、マウスの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を引き起こす能力に関してテストした。

ＯＩＣ−Ｌ ＩＳＳ、ＯＩＣ−Ｍ ＩＳＳ、ＯＩＣ−Ｈ ＩＳＳは抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）と、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とから成る複合体である。ＯＩＣ−Ｍ対照Ａは、ＯＶＡと非ＩＳＳポリヌクレオチド５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）とから成る共有複合体である。ＯＩＣ−Ｍ対照Ｂは、ＯＶＡと非ＩＳＳポリヌクレオチド５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）とから成る共有複合体である。これらの複合体を、本質的に例１に記載したように調製した。

マウスを１０μｇのＯＶＡ複合体またはＯＶＡ抗原単独で２回（２週間の間隔を置いて）、皮内において免疫化した。第二回免疫化の４週間後に、脾臓を収穫し、ＯＶＡ特異的な細胞長が異性Ｔリンパ球活性に関して検定した。簡略に述べると、脾臓をワイヤスクリーンを通して解離し、細胞培地中に再懸濁させ、カウントした。各脾臓からの細胞の一部を、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）として作用するように、Ｈ−２ｂマウスによって認識されるＯＶＡ ＣＴＬエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）に特異的なペプチドで処理した。これらの細胞をペプチド（１μｇ／ｍｌ）と共に１時間、３７℃で、７％ＣＯ₂で保温し、次いで洗浄して、フラットな底部を有する２４ウェル組織培養プレート内に、１ ｘ １０⁶個の細胞／ウェルの濃度で平板培養した。平板培養のための細胞培地に、ＩＬ−２源としてＲａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍを追加し、これらのエフェクター細胞を３７℃で、７％ＣＯ₂で７日間保温した。細胞を３日目に搬送し、洗浄し、５日目に再培養した。７日目に、ＥＬ−４標的細胞を（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）ペプチドで）ペプチドパルスし、洗浄した。７日目にエフェクター細胞をカウントし、種々のエフェクター：標的比（４０：１、１０：１、２．５：１）を達成するように、標的細胞と一緒に平板培養し、３７℃で、７％ＣＯ₂で４時間保温した。各ウェルからの上澄みを捕集し、細胞破壊の指標として、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に関して検定し、％溶解率を算出した。

このような実験から生じたＣＴＬ結果を図１６に示す。全てのクラス（Ｈ，ＭおよびＬ）の抗原−ＩＳＳ複合体は、抗原単独または非ＩＳＳポリヌクレオチドと複合された抗原よりも、マウスにおいて大きなＣＴＬ活性を引き起こした。

例７ ＡＩＣ複合体集団は、抗原に結合するために抗原特異的抗体と競合する、種々異なる程度の能力を呈する。

競合ＥＬＩＳＡを実施することにより、種々異なるＡｍｂ ａ １複合体集団がＡｍｂ ａ １に結合するためにＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＥと競合する能力を比較した。

９６個ウェルプレートに、コーティング緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ₂ＰＨＯ₄、ｐＨ９．０）中１．０μｇ／ｍｌのＡｍｂ ａ １を、１００μｌ／ウェルで一晩、４℃で塗布した。プレート・ウォッシャを使用して、プレートを洗浄緩衝液（１ Ｘ ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で６回洗浄した。２００μｌのブロック緩衝液を添加し、プレートを約１時間またはそれ以上、室温で保温した。次いで洗浄緩衝液でプレートを６回洗浄した。Ａｍｂ ａ １および複合体の連続稀釈を９６ウェルプレートで調製した。以下のものを、抗原塗布プレートに添加した：（ａ）１００μｌ稀釈緩衝液を全ての空いたウェルへ；（ｂ）Ａｍｂ ａ １または複合体および血清と一緒に予め保温された各サンプル１００μｌを重複して、適切なウェルへ。プレートを３０分間室温で保温し、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。抗体検出のために、ヤギの抗ヒトＩｇＥビオチン複合抗体１００μｌ／ウェルを、希釈緩衝液中１：５０で、全てのウェルに添加し、次いで、室温で１時間保温した。プレートを６回洗浄緩衝液で洗浄した。１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（稀釈緩衝液中１：５０，０００）を全てのウェルに添加し、次いで室温で１時間保温した。プレートを６回洗浄緩衝液中で洗浄し、現像した。この実施例の場合、現像時間はほぼ２２分であった。プレートを４５ｎｍにおいて読み取り、６５０ｎｍにおいて減算した（ＥｍａｘおよびＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ）（ソフトウェア・バージョン２．６．１、分子用デバイス(Molecular Devices)）。Ａｍｂ ａ １、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈに関して、５０％阻害におけるｎｇ／ｍｌはそれぞれ４０，１２０および１９０であった（ＡＩＣ−Ｈは２つのロットでテストし、同一値を得た）。５０％阻害に対応する、Ａｍｂ ａ １に対するＡＩＣ−Ｍの比は３であった。５０％阻害に対応する、Ａｍｂ ａ １に対するＡＩＨ−Ｈの比は４．７５であった。

本発明をわかりやすく明白にするために、その詳細について図面および例によって説明してきたが、これらに変化や変更を加えることが可能であることは当業者には明らかである。従って上記記載事項および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示される。

ＡＩＣ−Ｈ（すなわち高程度の複合、Ａｍｂ ａ １およびＩＳＳ）を受容したマウスの抗Ａｍｂ ａ １ ＩｇＧ１産出値を示すグラフである。中黒三角形はＡＩＣ−Ｈを、中黒四角形はＡｍｂ ａ １を示す。簡略に説明すると、第０週において、Ｔｈ２応答を生ぜしめるミョウバン中のＡｍｂ ａ １でマウスを準備する。開始１５週間後、マウスをＡｍｂ ａ １またはＡＩＣ−Ｈ(ロット５)で、２週間の間隔を置いて３回注射した（１０μｇずつ；矢印で示す）。例の項目で説明するように、ＩｇＧ１をＥＬＩＳＡを使用して測定した。 ＡＩＣ−Ｈ複合集団を受容したマウスにおける抗Ａｍｂ ａ １ ＩｇＥ産出値を示すグラフである。中黒三角形はＡＩＣ−Ｈを、中黒四角形はＡｍｂ ａ １を示す。図１に関する凡例に記載したように実験を行った。ＩｇＥをＥＬＩＳＡを使用して測定した。 ＡＩＣ−Ｈ複合集団を受容したマウスにおける抗Ａｍｂ ａ １ ＩｇＧ２ａ産出値を示すグラフである。中黒三角形はＡＩＣ−Ｈを、中黒四角形はＡｍｂ ａ １を示す。図１に関する凡例に記載したように実験を行った。例の項目で説明するように、ＩｇＥをＥＬＩＳＡを使用して測定した。 ＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ５およびＢＫ９）、ＡＩＣ−Ｍ（ロットＢＫ１０およびＢＫ１２）およびＡＩＣ−Ｌ（ロットＢＫ１１）を受容したマウスの第１回免疫化２週間後の、Ａｍｂ ａ １に対する抗Ａｍｂ ａ １ ＩｇＧ１（左の棒）およびＩｇＧ２ａ（右の棒）の産出値を示す棒グラフである。 Ａｍｂ ａ １の受容と比較した、ＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ５およびＢＫ９）受容後のマウスにおける第２回免疫化４週間後のＩＬ−５産出値を示す棒グラフである。 Ａｍｂ ａ １の受容と比較した、ＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ５およびＢＫ９）を受容したマウスにおける第２回免疫化４週間後のインターフェロンγの産出値を示す棒グラフである。 負荷前にＡｍｂ ａ １による免疫化を２ラウンド受けたマウスと比較した、負荷前にＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ５およびＢＫ９）による免疫化を２ラウンド受けたマウスにおけるＡｍｂ ａ １負荷２週間後のＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ１（左の棒）およびＡｍｂ ａ １特異的ＩｇＧ２ａ（右の棒）の産出値を示す棒グラフである。 負荷前にＡｍｂ ａ １による免疫化を２ラウンド受けたマウスと比較した、負荷前にＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ９）による免疫化を２ラウンド受けたマウスにおけるＡｍｂ ａ １負荷４週間後のＩＬ−５産出値を示す棒グラフである。 負荷前にＡｍｂ ａ １による免疫化を２ラウンド受けたマウスと比較した、負荷前にＡＩＣ−Ｈ（ロットＢＫ９）による免疫化を２ラウンド受けたマウスにおけるＡｍｂ ａ １負荷４週間後のインターフェロンγ産出値を示す棒グラフである。 Ａｍｂ ａ １（中黒ダイヤ形）、ＡＩＣ−Ｌ（中黒四角形）、ＡＩＣ−Ｍ（中黒三角形）またはＡＩＣ−Ｈ（中黒円）による刺激から、アレルギー患者（「ＪＭＷ」）から隔離された好塩基球のヒスタミン放出レベルを比較するグラフである。 Ａｍｂ ａ １（中黒ダイヤ形）、ＡＩＣ−Ｌ（中黒四角形）、ＡＩＣ−Ｍ（中黒三角形）またはＡＩＣ−Ｈ（中黒円）による刺激から、アレルギー患者（「ＪＦ」）から隔離された好塩基球のヒスタミン放出レベルを比較するグラフである。 （Ａ）および（Ｂ）は、ゲルをクーマシー・ブルー（Ａ）または銀（Ｂ）で染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動実験（ＰＡＧＥ）のハーフトーン複製である。ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭまたはＡＩＣ−Ｈはそれぞれ標識Ｌ，Ｍ，Ｈを付せられる。 ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｈのゲルろ過クロマトグラフィ分離を示すグラフである。 ＡＩＣ−Ｈ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｌを受容したマウスの第２回免疫化２週間後の、Ａｍｂ ａ １に対する抗Ａｍｂ ａ １ ＩｇＧ１（左の棒）およびＩｇＧ２ａ(右の棒)の産出値を示す棒グラフである。 Ａｍｂ ａ １を受容したマウスと比較して、ＡＩＣ−Ｈ、ＡＩＣ−ＭおよびＡＩＣ−Ｌを受容したマウスの第２回免疫化４週間後のＩＬ−５（左の棒）およびインターフェロンγ（右の棒）の産出値を示す棒グラフである。 抗原のみ、つまりアボアルブミン（ＯＶＡ、中黒ダイヤ形）を受容したマウスと比較した、種々の複合体クラスを受容するマウスからの抗原特異的ＣＴＬを示すグラフである。結果は次の複合体より示す：ＯＩＣ−Ｈ ＩＳＳ（白抜き四角形）、ＯＩＣ−Ｍ ＩＳＳ（中黒三角形）、ＯＩＣ−Ｌ ＩＳＳ（中黒円）、ＯＩＣ−ＭコントロールＡ（Ｘ）、ＯＩＣ−ＭコントロールＢ（白抜き円）。

Claims (17)

1. 複合分子集団であって、該複合分子が、抗原と、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成るポリヌクレオチドとを含んで成り、当該集団中の複合程度が、１抗原分子あたり平均で少なくとも５．５のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドが存在するものである、複合分子集団。
   
2. １抗原分子あたり少なくとも６ＩＳＳ含有分子が存在する、請求項１に記載の複合分子集団。
   
3. 前記抗原がアレルゲンである、請求項１又は２に記載の集団。
   
4. 前記アレルゲンがＡｍｂ ａ １である、請求項３に記載の集団。
   
5. 製薬上許容可能な賦形剤に配合された請求項１〜４のいずれか１項に記載の集団を有することを特徴とする、組成物。
   
6. 個体の免疫応答を調節するための医薬組成物であって、前記免疫応答を調節するのに充分な量の、請求項５に記載の組成物を含んで成る、前記医薬組成物。
   
7. 前記調節が、Ｔｈ１関連サイトカインの産出を刺激することを含んで成る、請求項６に記載の医薬組成物。
   
8. 前記調節が、Ｔｈ２関連サイトカインの産出を減少させることを含んで成る、請求項６に記載の医薬組成物。
   
9. 前記調節が、抗原特異的抗体の産出を抑制することを含んで成る、請求項６に記載の医薬組成物。
   
10. 個体のアレルギー状態を治療するための医薬組成物であって、前記アレルギー状態を軽減するのに充分な量の請求項３に記載の集団と製薬上許容可能な賦形剤とを含んで成る、前記医薬組成物。
    
11. Ｔｈ１関連サイトカインの産出を刺激する、請求項１０に記載の医薬組成物。
    
12. 個体内で抗原によって刺激されたＩｇＥの産出を減少させるための医薬組成物であって、前記個体内で前記抗原によって刺激されたＩｇＥを減少させるのに充分な量の請求項５に記載の組成物を含んで成る、前記医薬組成物。
    
13. 個体のＩｇＥ関連障害を治療するための医薬組成物であって、前記個体のＩｇＥの産出を減少させ前記障害を治療するのに充分な量の請求項５に記載の組成物を含んで成る、前記医薬組成物。
    
14. 個体内のＴｈ１リンパ球を刺激するための医薬組成物であって、前記個体内のＴｈ１リンパ球を刺激するのに充分な量の請求項５に記載の組成物を含んで成る、前記医薬組成物。
    
15. Ｔｈ１関連サイトカインの産出を刺激する、請求項１４に記載の医薬組成物。
    
16. 個体内のＴｈ２リンパ球を抑制するための医薬組成物であって、前記個体内のＴｈ２リンパ球を抑制するのに充分な量の請求項５に記載の組成物を含んで成る、前記医薬組成物。
    
17. Ｔｈ２関連サイトカインの産出を抑制する、請求項１６に記載の医薬組成物。

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