DE60034140T2

DE60034140T2 - Immunmodulierende zusammensetzungen die eine an antigen gebundene immunstimulierende sequenz enthalten und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60034140T2
Application number: DE60034140T
Authority: DE
Inventors: Stephen Berkeley TUCK; Gary Martinez VAN NEST
Original assignee: Dynavax Technologies Corp
Current assignee: Dynavax Technologies Corp
Priority date: 1999-11-15
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: WO2001035991A3; EP1229933A2; JP2003513680A; WO2001035991A2; ATE357930T1; CA2391507A1; DE60034140T3; US7223398B1; DE60034140D1; AU779957B2; US7628990B2; JP5543050B2; CA2391507C; EP1229933B1; US20070190073A1; AU1612101A; EP1229933B2

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Prioritätsnutzung der vorläufigen US-Anmeldung 060/165,467, eingereicht am 15. November 1999, welche hierin durch Bezugnahme in ihrer Gänze mitaufgenommen ist.
FACHGEBIET
Diese Erfindung betrifft das Fachgebiet der Immunologie, genauer gesagt die Verwendung von an Antigen gebundenen immunstimulatorischen Polynukleotidsequenzen, um eine Immunreaktion zu modulieren.
HINTERGRUND
Immunreaktionen zur Auflösung verschiedener Pathologien, wie sie zum Beispiel bei vitalen Infektionen, bakteriellen Infektionen, Krebs und allergischen Reaktionen erfolgen, sind für die Gesamtgesundheit des Wirts wichtig. Eine erfolgreiche Auflösung von Infektionen, Krebs oder allergischen Reaktionen kann von der Art und Größe der Immunantwort abhängen. Immunisierungen, bei denen Antigen zur Hervorrufung weiterer Immunantworten eingesetzt wird, können bei einer erfolgreichen Auflösung der Infektionen, Krebsformen und/oder allergischen Reaktionen hilfreich sein. Da die Art von Antigen, die zur Hervorrufung einer Immunantwort verwendet wird, von einer Krankheit zur nächsten verschieden ist, wäre es wünschenswert, eine Immunisierungsmethode zur Verfügung zu haben, die das Immunsystem befähigen würde, sich auf alle zuvor genannten Infektionen und Erkrankungen zu richten. Genauer gesagt wäre es wünschenswert, eine Immunisierungsmethode zur Verfügung zu haben, die eine differenzielle Modulation der Immunantworten ermöglichen würde. Da Immunisierungen im allgemeinen eher auf humorale (Antikörper) Reaktionen abgezielt haben, ist es möglicherweise vorzuziehen, eine andere Art von Immunreaktion hervorzurufen, nämlich eine zelluläre Immunreaktion, um die Komplikationen zu vermeiden, die aus einer humoralen Reaktion entstehen können (z.B. anaphylaktischer Schock).
Die Art von Immunantwort, die auf eine Infektion oder andere antigene Provokation hin generiert wird, kann generell anhand des Subsets von T-Helfer-(Th)-Zellen unterschieden werden, das an der Reaktion beteiligt ist. Das Th1-Subset ist für klassische zellvermittelte Funktionen verantwortlich, wie etwa eine Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und eine Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), wohingegen das Th2-Subset wirksamer als ein Helfer für die B-Zellaktivierung dient. Die Art von Immunantwort auf ein Antigen wird allgemein durch die Zytokine beeinflusst, die durch die Zellen produziert werden, die auf das Antigen reagieren. Die Unterschiede bei den Zytokinen, die von Th1- und Th2-Zellen sekretiert werden, werden als die verschiedenen biologischen Funktionen dieser beiden Subsets widerspiegelnd angenommen.
Das Th1-Subset kann besonders zur Reaktion auf virale Infektionen, intrazelluläre Pathogene und Tumorzellen geeignet sein, da es IL-2 und IFN-γ sekretiert, welche CTLs aktivieren. Das Th2-Subset kann zum Reagieren auf freilebende Bakterien und helminthische Parasiten geeigneter sein und kann allergische Reaktionen vermitteln, da von IL-4 und IL-5 bekannt ist, dass sie eine IgE-Produktion bzw. Eosinophilen-Aktivierung hervorrufen. Generell sekretieren Th1- und Th2-Zellen unterschiedliche Muster von Zytokinen, die sich gegenseitig negativ regulieren. Zum Beispiel verschiebt IL-2 die Immunreaktion zu Th1 hin und hemmt die Entwicklung der Th2-Reaktion. Entsprechend verschiebt IL-10, ein anderes Th2-Zytokin, die Immunreaktion zu Th2 hin und hemmt die Entwicklung der Th1-Reaktion. Eine Verschiebung im Th1/Th2-Gleichgewicht kann zum Beispiel zu einer allergischen Reaktion führen, oder kann alternativ zu einer gesteigerten CTL-Reaktion führen.
Für viele Infektionskrankheiten, wie Tuberkulose und Malaria, sind Reaktionen vom Th2-Typ von geringem schützenden Wert gegen Infektionen. Vorgeschlagene Impf stoffe unter Verwendung von kleinen Peptiden, die von dem Zielantigen abgeleitet sind, und anderen derzeit verwendeten antigenen Agenzien, mit denen die Verwendung potenziell infektiöser intakter viraler Partikel vermieden wird, lösen nicht immer die zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung erforderliche Immunreaktion aus. Das Fehlen eines therapeutisch wirksamen Impfstoffs gegen das humane Immunschwäche-Virus (HIV) stellt ein unglückliches Beispiel dieses Versagens dar. Auf Protein basierende Impfstoffe rufen typischerweise Immunreaktionen vom Th2-Typ hervor, die durch hohe Titer an neutralisierenden Antikörpern, doch keine signifikante zellvermittelte Immunität, gekennzeichnet sind.
Darüber hinaus sind einige Arten von Antikörper-Reaktionen bei bestimmten Indikationen ungeeignet, am deutlichsten bei Allergien, bei denen eine IgE-Antikörperreaktion zu einem anaphylaktischen Schock führen kann. Allgemein sind an allergischen Reaktionen auch Immunreaktionen vom Th2-Typ beteiligt. Allergische Reaktionen, einschließlich die des allergischen Asthmas, sind durch eine Frühphasenreaktion gekennzeichnet, die innerhalb von Sekunden bis Minuten auf die Allergenexposition hin auftritt und die durch eine zelluläre Degranulation gekennzeichnet ist, und eine Spätphasenreaktion, die 4 bis 24 Stunden später eintritt und durch Infiltration von Eosinophilen in die Stelle der Allergenexposition gekennzeichnet ist. Spezifisch vernetzt während der Frühphase der allergischen Reaktion das Allergen die IgE-Antikörper an Basophilen und Mastzellen, was wiederum eine Degranulation und die anschließende Freisetzung von Histamin und anderen Vermittlern einer Entzündung aus Mastzellen und Basophilen hervorruft. Während der Spätphasenreaktion infiltrieren Eosinophile in die Stelle der Allergenexposition (wo eine Gewebeschädigung und Dysfunktion resultiert).
Die Antigen-Immuntherapie für allergische Störungen bezieht die subkutane Injektion von kleinen, doch schrittweise steigenden Mengen an Antigen ein. Solche Immunisierungsbehandlungen bergen das Risiko, eine IgE-vermittelte Anaphylaxie zu induzieren, und richten sich nicht wirksam auf die Zytokin-vermittelten Ereignisse der allergischen Spätphasenreaktion. Bisher hat dieser Ansatz lediglich begrenzten Erfolg erzielt.
Die Verabreichung bestimmter DNA-Sequenzen, die allgemein als immunstimulatorische Sequenzen oder "ISS" bekannt sind, induziert eine Immunreaktion mit einer Neigung zum Th1-Typ, wie durch die Sekretion von Th1-assoziierten Zytokinen angezeigt. Die Verabreichung eines immunstimulatorischen Polynukleotids mit einem Antigen führt zu einer Immunreaktion vom Th1-Typ auf das verabreichte Antigen. Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-854. Zum Beispiel reagierten Mäuse, die intradermal mit Escherichia coli (E. coli) β-Galactosidase (β-Gal) in Saline oder in dem Adjuvans Alaun injiziert wurden, indem sie spezifische IgG1- und IgE-Antikörper und CD4⁺-Zellen, die IL-4 und IL-5 sekretierten, jedoch nicht IFN-γ, produzierten, was zeigte, dass die T-Zellen vorwiegend vom Th2-Subset waren. Allerdings reagierten Mäuse, die intradermal (oder mit einem Tyne-Hautritzapplikator) mit Plasmid-DNA (in Saline), die für β-Gal codierte und eine ISS enthielt, injiziert wurden, indem sie IgG2a-Antikörper und CD4⁺-Zellen, die IFN-γ sekretierten, jedoch nicht IL-4 und IL-5, produzierten, was zeigte, dass die T-Zellen vorwiegend vom Th1-Subset waren. Darüber hinaus war die spezifische IgE-Produktion durch die Plasmid-DNA-injizierten Mäuse um 66 – 75 % reduziert. Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145. Im Allgemeinen ist die Reaktion auf eine Immunisierung mit nackter DNA durch die Produktion von IL-2, TNFα und IFN-γ durch Antigen-stimulierte CD4⁺-T-Zellen charakterisiert, was eine Reaktion vom Th1-Typ anzeigt. Dies ist besonders wichtig bei der Behandlung von Allergie und Asthma, wie durch die verminderte IgE-Produktion gezeigt. Die Fähigkeit von immunstimulatorischen Polynukleotiden, eine Immunreaktion vom Th1-Typ zu stimulieren, ist mit bakteriellen Antigenen, viralen Antigenen und mit Allergenen nachgewiesen worden (siehe zum Beispiel WO 98/55495).
Es ist berichtet worden, dass die Knüpfung von ISS an Antigen zu einer signifikanten Steigerung der Th1-Immunreaktion führt, im Vergleich zur gleichzeitigen Verabreichung von ISS und Antigen in einer Beimengung. Siehe zum Beispiel WO 98/16247; WO 98/55495.
Zu weiteren Literaturstellen, in denen ISS beschrieben wird, zählen: Krieg et al. (1989) J. Immunol. 143:2448-2451; Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Immunol. 36:55-66; Kataoka et al. (1992) Jpn. J.
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Die Fähigkeit, die Immunreaktion vom Th1-Typ zu modulieren, wäre in Situationen wünschenswert, bei denen die Mengen der Antikörperproduktion oder Zytokinproduktion wichtig sein können, zum Beispiel bei viralen Infektionen oder allergischen Bedingungen. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen für eine differenzielle Modulation der Reaktionen vom Th2-Typ zu Reaktionen vom Th1-Typ bereit.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen von Klassen (d.h. Populationen) von ISS-Antigen-Konjugaten mit abweichenden und unterschiedlichen biologischen Eigenschaften bereit. Die variierenden strukturellen und funktionellen Charakteristika sind hierin beschrieben und umfassen im Allgemeinen einen variierenden mittleren Umfang der Konjugation und eine variierende Funktion, wie etwa die mittlere Modulation der Immunreaktion (insbesondere in Bezug auf die Th1-Antwort), mittlere Konkurrenzfähigkeit mit Antigen-spezifischem Antikörper um die Bindung an Antigen und Unterdrückungsvermögen der Histamin-Freisetzung (in Fällen, in denen das Antigen ein Allergen ist). Die verschiedenen Ausführungsformen sind hierin beschrieben. Die ISS kann jegliche immunstimulatorische Sequenz sein, die hierin beschrieben ist. Das Antigen kann jegliches Antigen sein, einschließlich Allergenen, und Antigene, die mit infektiösen Agenzien assoziiert sind, wie etwa Hepatitis B-Virus, HIV, Papillomavirus, respiratorische Viren (wie etwa Influenza-Virus), Mycobakterien, Pertussis und Salmonella. Das Antigen kann auch jegliches mit Krebs assoziierte Antigen sein, wie zum Beispiel ein Tumor-Antigen.
Wir beschreiben auch Methoden unter Verwendung dieser Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Methoden zur Modulierung einer Immunreaktion und Methoden zur Behandlung einer allergischen Bedingung.
Demgemäß stellt die Erfindung in einem Aspekt eine Population von Konjugatmolekülen bereit, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein Polynukleotid, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass vorliegen:

(a) im Mittel wenigstens 5,5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül; oder
(b) im Mittel von 3 bis 5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül.

Wir beschreiben auch eine Population von Konjugatmolekülen, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein Polynukleotid, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration des Antigens, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung des Antigen-spezifischen Antikörpers an Antigen erforderlich ist, etwa 3,5 bis etwa 6,0 beträgt. Bei einigen Ausführungsformen ist das Antigen der Population ein Allergen, und ist der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher, dass das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für etwa 40 % Histamin-Freisetzung aus den Basophilen aus einem Antigensensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine etwa 40 % Histamin-Freisetzung aus den Basophilen eines Antigensensibilisierten Individuums erforderlich ist, größer als etwa 1000 ist.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir eine Population von Konjugatmolekülen, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein Polynukleotid, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung des Antigenspezifischen Antikörpers an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration des Antigens, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung des Antigen-spezifischen Antikörpers an Antigen erforderlich ist, etwa 2,5 bis etwa 3,0 beträgt. In einigen Ausführungsformen ist das Antigen der Population ein Allergen, und ist der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher, dass das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine etwa 40 % Histamin-Freisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration des Antigens, die für etwa 40 % Histamin-Freisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, etwa 100 bis etwa 200 beträgt.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung eine Population von Konjugatmolekülen bereit, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein Polynukleotid, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei der Umfang der Konjugation des Antigens und des Polynukleotids ein solcher ist, dass die Antigen-spezifische Antikörperproduktion in einem Individuum, das die Konjugatpopulation erhält, unterdrückt ist im Vergleich zu dem Erhalt derselben Menge an ungebundenem Polynukleotid und Antigen oder derselben Menge an Antigen alleine. In einigen Aspekten kann der Umfang der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion reduziert oder, in einigen Aspekten, eliminiert werden.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Wir beschreiben Methoden zur Modulierung einer Immunreaktion in einem Individuum, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um die Immunreaktion in dem Individuum zu modulieren. In einigen Aspekten umfasst das Modulieren einer Immunreaktion das Stimulieren der Produktion eines Th1-assoziierten Zytokins. In einigen Aspekten umfasst das Modulieren einer Immunreaktion das Reduzieren der Produktion eines Th2-assoziierten Zytokins. In einigen Aspekten umfasst das Modulieren einer Immunreaktion das Reduzieren der Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern.
Wir beschreiben auch Methoden zur Behandlung eines allergischen Zustands in einem Individuum, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um den allergischen Zustand zu mildern.
Wir beschreiben außerdem Methoden zur Verringerung der Antigen-stimulierten IgE-Produktion in einem Individuum, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um die durch das Antigen stimulierten IgE-Produktion zu verringern.
Wir beschreiben auch Methoden zur Behandlung einer IgE-bezogenen Störung in einem Individuum, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um die IgE-Produktion zu verringern und die Störung in dem Individuum zu behandeln.
Wir beschreiben außerdem Methoden zur Stimulierung von Th1-Lymphozyten in einem Individuum, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um Th1-Lymphozyten in dem Individuum zu stimulieren. In einigen Aspekten wird die Produktion eines Th1-assoziierten Zytokins in diesen Individuen stimuliert.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Methoden zur Unterdrückung von Th2-Lymphozyten in einem Individuum bereit, umfassend das Verabreichen an das Individuum einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von Konjugatmolekülen der Erfindung in einer Menge, die ausreicht, um Th2-Lymphozyten in dem Individuum zu unterdrücken. In einigen Aspekten wird bei diesen Individuen die Produktion eines Th2-assoziierten Zytokins unterdrückt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Schaubild, das die anti-Amb a 1-IgG1-Produktion in Mäusen darstellt, die eine AIC-H (d.h. einen hohen Umfang der Konjugation, Amb a 1 und ISS) Konjugatpopulation erhalten. Schwarze Dreiecke, AIC-H; schwarze Vierecke, Amb a 1. Kurz gesagt wurden die Mäuse bei Woche 0 mit Amb a 1 in Alaun geprimt, was eine Th2-Reaktion erzeugte. Beginnend fünfzehn Wochen später wurden die Mäuse mit Amb a 1 oder AIC-H behandelt (Lot 5), bei 3 Injektionen im Abstand von 2 Wochen (jeweils 10 μg; angegeben durch Pfeile). IgG1 wurde unter Anwendung von ELISA gemessen, wie im Abschnitt der Beispiele beschrieben.
2 zeigt ein Schaubild, das die anti-Amb a 1-IgE-Produktion in Mäusen darstellt, die eine AIC-H-Konjugat-Population erhalten. Schwarze Dreiecke, AIC-H; schwarze Vierecke, Amb a 1. Das Experiment wurde durchgeführt, wie in der Legende für 1 beschrieben. IgE wurde unter Anwendung von ELISA gemessen.
3 zeigt ein Schaubild, das die anti-Amb a 1-IgG2a-Produktion in Mäusen darstellt, die eine AIC-H-Konjugat-Population erhalten: Schwarze Dreiecke, AIC-H; schwarze Vierecke, Amb a 1. Das Experiment wurde durchgeführt, wie in der Legende für 1 beschrieben. IgG2a wurde unter Anwendung von ELISA gemessen, wie in dem Abschnitt der Beispiele beschrieben.
4 zeigt ein Balkendiagramm, das die anti-Amb a 1-IgG1- (linker Balken) und -IgG2a- (rechter Balken) -Produktion zwei Wochen nach der ersten Immunisierung in Mäusen darstellt, die AIC-H (Lots BK5 und BK9), AIC-M (Lots BK10 und BK12) und AIC-L (Lot BK11), gegenüber Amb a 1, erhalten.
5 zeigt ein Balkendiagramm, das die IL-5-Produktion vier Wochen nach der zweiten Immunisierung in Mäusen darstellt, die AIC-H (Lots BK5 und BK9) erhalten, im Vergleich zum Erhalt von Amb a 1.
6 zeigt ein Balkendiagramm, das die Interferon γ-Produktion vier Wochen nach der zweiten Immunisierung in Mäusen darstellt, die AIC-H (Lots BK5 und BK9) erhalten, im Vergleich zum Erhalt von Amb a 1.
7 zeigt ein Balkendiagramm, das die Amb a 1-spezifische IgG1- (linker Balken) und Amb a 1-spezifische IgG2a- (rechter Balken) -Produktion zwei Wochen nach der Amb a 1-Provokation in Mäusen darstellt, die zwei Runden einer Immunisierung mit AIC-H (Lots BK5 und BK9) vor der Provokation erhalten haben, vergleichen zu Mäusen, die zwei Runden einer Immunisierung mit Amb a 1 vor der Provokation erhalten haben.
8 zeigt ein Balkendiagramm, das die IL-5-Produktion vier Wochen nach der Amb a 1-Provokation in Mäusen darstellt, die zwei Runden einer Immunisierung mit AIC-H (Lot BK9) vor der Provokation erhalten haben, im Vergleich zu Mäusen, die zwei Runden einer Immunisierung mit Amb a 1 vor der Provokation erhalten haben.
9 zeigt ein Balkendiagramm, das die Interferon γ-Produktion vier Wochen nach der Amb a 1-Provokation in Mäusen darstellt, die zwei Runden einer Immunisierung mit AIC-H (Lot BK9) vor der Provokation erhalten haben, im Vergleich zu Mäusen, die zwei Runden einer Immunisierung mit Amb a 1 vor der Provokation erhalten haben.
10 zeigt ein Schaubild, das die Mengen der Histamin-Freisetzung von Basophilen vergleicht, die aus einem allergischen Patienten ("JMW") aus der Stimulation durch Amb a 1 (schwarze Raute), AIC-L (schwarzes Quadrat), AIC-M (schwarzes Dreieck) oder AIC-H (schwarzer Kreis) isoliert wurden.
11 zeigt ein Schaubild, das die Mengen der Histamin-Freisetzung von Basophilen vergleicht, die aus einem allergischen Patienten ("JF") aus der Stimulation durch Amb a 1 (schwarze Raute), AIC-L (schwarzes Quadrat), AIC-M (schwarzes Dreieck) oder AIC-H (schwarzer Kreis) isoliert wurden.
12(A) und (B) sind Halbton-Reproduktionen von SDS-Polyacrylamidelektrophorese-Experimenten (PAGE), bei denen die Gele mit Coomassie Blau (A) oder Silber (B) gefärbt wurden. AIC-L, AIC-M und AIC-H sind als L, M bzw. H bezeichnet.
13 zeigt ein Schaubild einer größenausschlusschromatographischen Trennung von AIC-H, AIC-M und AIC-L.
14 zeigt ein Schaubild, das die anti-Amb a 1-IgG1 (linker Balken) und IgG2a-(rechter Balken) -Produktion zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung in Mäu sen, die AIC-H, AIC-M und AIC-L erhalten, gegenüber Amb a 1, darstellt.
15 zeigt ein Schaubild, das die IL-5- (linker Balken) und Interferon γ- (rechter Balken) -Produktion zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung in Mäusen, die AIC-H, AIC-M und AIC-L erhalten, im Vergleich zum Erhalt von Amb a 1, darstellt.
16 zeigt ein Schaubild, das Antigen-spezifische CTL-Reaktionen von Mäusen darstellt, die verschiedene Konjugatklassen erhalten, im Vergleich zu dem Erhalt von Antigen alleine, Ovalbumin (OVA, schwarze Raute). Die Ergebnisse sind von den folgenden Konjugaten dargestellt: OIC-H ISS (weißes Quadrat), OIC-M ISS (schwarzes Dreieck), OIC-L ISS (schwarzer Kreis), OIC-M Kontrolle A (X), OIC-M Kontrolle B (weißer Kreis).
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Wir haben entdeckt, dass der Umfang der Konjugation von Polynukleotid-immunstimulatorischen Sequenzen (ISS) mit Antigen die Immunantwort differenziell moduliert. Zum Beispiel haben wir insbesondere entdeckt, dass ein größerer Umfang der Konjugation wiederum zu einer Unterdrückung der gesamten Antigen-spezifischen Antikörperproduktion unter Beibehaltung einer Th1-Verschiebung führt (d.h. Th1-assoziierte Zytokine werden freigesetzt). Wir haben ferner entdeckt, dass ein umfangreichere Konjugation besonders wirksam ist in der Unterdrückung der Histamin-Freisetzung, wenn ein allergenes Antigen verwendet wird.
Wie in den Beispielen beschrieben, schaffen die unterschiedlichen Umfänge der Konjugation eines ISS-Oligonukleotids an das Ambrosia-(Ragweed)-Allergen Amb a 1 neue Klassen von Molekülen mit interessanten und überraschenden biologischen Eigenschaften. Alle dieser Klassen induzieren eher Th1- als Th2-Reaktionen, wie durch IgG2a-Antikörper- und IFN-γ-Zytokin-Reaktionen in Mäusen gemessen. Im Vergleich zu Amb a 1 weisen diese Moleküle eine verminderte Allergenität auf, wie durch in vitro-Histamin-Freisetzungsassays unter Verwendung von Basophilen von gegen Ragweed allergischen menschlichen Individuen gemessen.
Zur Vereinfachung der Beschreibung und des Verständnisses können Populationen von ISS-Antigen-Konjugaten, die, unter anderem, hinsichtlich des Umfangs der Konjugation differieren (und somit in ein oder mehreren immunmodulatorischen Eigen schaften differieren) in drei allgemeine Klassen unterteilt werden, die hierin als "L" (geringer Umfang der Konjugation), "M" (mittlerer Umfang der Konjugation) und "H" (hoher Umfang der Konjugation) bezeichnet sind. Die Anzahl der ISS-Moleküle, die an das Antigen konjugiert sind, beeinflusst die biologischen Eigenschaften des Konjugats. Konjugate, die geringe Verhältnisse von ISS:Protein ("L") enthalten, induzieren starke Th1-Reaktionen, induzieren die höchsten Antikörperreaktionen (wie durch kombinierte Messung der Th1- und Th2-assoziierten Antikörper gemessen) und schaffen die geringste Verminderung der Allergenität (wie am Umfang der Histaminreaktion in Antigen-sensibilisierten Zellen gemessen). Konjugate, die mäßige ISS:Antigen-Verhältnisse ("M") enthalten, induzieren starke Th1-Reaktionen, induzieren mäßige Antikörperreaktionen und bieten eine mäßige Verringerung der Allergenität. Konjugate, die hohe ISS:Antigen-Verhältnisse ("H") enthalten, induzieren starke Th1-Reaktionen, induzieren sehr geringe Antikörperreaktionen und bieten die höchste Verringerung der Allergenität. Alle drei Formen der Konjugate induzieren eine zytotoxische T-Zellaktivität. Alle drei Formen der Konjugate könnten bei unterschiedlichen Anwendungen nützlich sein. L-Form-Konjugate könnten erwartungsgemäß bei Anwendungen am nützlichsten sein, bei denen eine Th1-Reaktion gemeinsam mit hohen Antikörperreaktionen gewünscht wird, wie etwa bei Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten. H-Form-Konjugate könnten erwartungsgemäß dort am nützlichsten sein, wo starke Th1-Reaktionen ohne hohe Antikörpertiter erwünscht sind, wie etwa in der Allergie-Immuntherapie oder Behandlung bestimmter Krebsformen. M-Form-Konjugate könnten erwartungsgemäß bei Anwendungen am nützlichsten sein, bei denen ein Gleichgewicht zwischen Th1-zellulären Immunantworten und Antikörperreaktionen erwünscht ist.
Allgemeine Techniken
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, die herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie anwenden, die innerhalb der Fachkenntnis des Gebiets liegen. Diese Techniken sind umfassend in der Literatur erläutert, wie zum Beispiel Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J Gait., Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, Hrsg., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, Hrsg.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, Hrsg., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. Hrsg., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., Hrsg., 1991); The Immunoassay Handbook (David Wild, Hrsg., Stockton Press NY, 1994); und Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert und N.A. Staines, Hrsg., Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1993).
Definitionen
Wie hierin verwendet, umfasst die Singularform "ein/eine/eines" und "der/die/das" die Pluralformen, sofern nicht anders angegeben. Zum Beispiel umfasst "eine" ISS eine oder mehrere ISS.
Der Begriff "ISS", wie hierin verwendet, bezieht sich auch Polynukleotidsequenzen, die eine messbare Immunreaktion, wie in vitro, in vivo und/oder ex vivo gemessen, bewirken. Zu Beispielen der messbaren Immunreaktionen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Antigen-spezifische Antikörperproduktion, Sekretion von Zytokinen, Aktivierung oder Expansion von Lymphozyten-Populationen, wie etwa NK-Zellen, CD4⁺ T-Lymphozyten, CD8⁺ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und ähnliches. Vorzugsweise aktivieren die ISS-Sequenzen präferenziell eine Reaktion vom Th1-Typ. Ein Polynukleotid zur Verwendung in der Erfindung enthält mindestens eine ISS. Wie hierin verwendet, ist "ISS" auch eine Abkürzung für ein ISS-enthaltendes Polynukleotid.
Eine "Population von Konjugatmolekülen" ist eine Gruppe von ISS-Antigen-Konjugaten (d.h. ISS, geknüpft oder gebunden an Antigen). Für die Zwecke dieser Erfindung sollte klar sein, dass solche Populationen nicht notwendigerweise eine konstante Anzahl von ISS an jedes Antimolekül angelagert aufweisen oder besitzen können oder auch nicht. Typischerweise wird eine gegebene Population eine Verteilung der Molekulargewichte (basierend auf dem variierenden Umfang der Konjugation innerhalb einer gegebenen Population) und somit eine mittlere Anzahl von ISS in Konjugation an Antigen aufweisen. Es ist klar, dass jegliche der hierin beschriebenen Populationen Moleküle von freiem Antigen (d.h. nicht an ISS gebundenes Antigen) und/oder freier ISS (d.h. nicht an ein Antigen geknüpfte ISS) zum Beispiel aufgrund von unvollständiger Konjugation und/oder Reinigung enthalten kann. Für die Zwecke dieser Erfindung enthalten die hierin beschriebenen Populationen Konjugatmoleküle, brauchen aber nicht ausschließlich Konjugatmoleküle zu enthalten.
Ein "Mittelwert" eines gegebenen Parameters (wie etwa die Anzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotide oder der Masse) in einer gegebenen Population meint die Summe für jenen Parameter aus der gesamten Population, dividiert durch die Anzahl der Mitglieder der Population. Zum Beispiel bezieht sich die mittlere Anzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotide, die an Antigen gebunden sind, auf die mittlere Anzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotide pro Antigenmolekül in einer Population von Konjugatmolekülen (d.h. die Gesamtzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotide, dividiert durch die Gesamtzahl der Antigenmoleküle). Wie nachstehend beschrieben, wird diese Zahl gewöhnlich von Gewichtsbestimmungen von Polynukleotid zu Antigen abgeleitet, wie zum Beispiel mittels Spektroskopie gemessen.
Ein "Medianwert" der Anzahl oder des Gewichts für eine gegebene Population bezieht sich auf eine Anzahl oder Gewicht, bei der die Hälfte der Population darüber und die Hälfte der Population darunter liegt. Zum Beispiel meint eine Medianzahl an ISS-enthaltenden Polynukleotiden pro Antigenmolekül, dass die Hälfte der Konjugatmoleküle in der Population eine geringere Anzahl an ISS-enthaltenden Polynukleotiden pro Antigenmolekül und die andere Hälfte eine höhere Anzahl aufweist.
Wie hierin austauschbar verwendet, umfassen die Begriffe "Polynukleotid" und "Oligonukleotid" einzelsträngige DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA), einzelsträngige RNA (ssRNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA), modifizierte Oligonukleotide und Oligonukleoside oder Kombinationen davon. Das Oligonukleotid kann linear oder zirkulär konfiguriert sein, oder das Oligonukleotid kann sowohl lineare als auch zirkuläre Segmente enthalten. Oligonukleotide sind Polymere von Nukleosiden, die im Allgemeinen durch Phosphoester-Verknüpfungen verbunden sind. Ein Nukleosid besteht aus einer Purin- (Adenin oder Guanin oder Derivat davon) oder Pyrimidin- (Thymin, Zytosin oder Uracil, oder Derivat davon) -Base in Bindung an einen Zucker. Die vier Nukleosideinheiten (oder Basen) in DNA werden als Desoxyadeno sin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin und Desoxycytidin bezeichnet. Ein Nukleotid ist ein Phosphatester eines Nukleosids.
Der Begriff "immunmodulatorisch" oder "eine Immunantwort modulierend", wie hierin verwendet, umfasst immunstimulatorische als auch immunsuppressive Wirkungen. Immunstimulatorische Wirkungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, solche, die zelluläre oder humorale Immunantworten direkt oder indirekt verstärken. Beispiele der immunstimulatorischen Wirkungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine erhöhte Antigen-spezifische Antikörperproduktion; die Aktivierung oder Proliferation einer Lymphozyten-Population, wie etwa NK-Zellen, CD4⁺ T-Lymphozyten, CD8⁺ T-Lymphozyten, Makrophagen und ähnliches; eine erhöhte Synthese von immunstimulatorischen Zytokinen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α und ähnliches. Immunsuppressive Wirkungen umfassen solche, die zelluläre oder humorale Immunantworten direkt oder indirekt vermindern. Zu Beispielen der immunsuppressiven Wirkungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Verminderung der Antigenspezifischen Antikörperproduktion, wie etwa eine reduzierte IgE-Produktion; die Aktivierung von Lymphozyten oder anderen Zellpopulationen, die immunsuppressive Aktivitäten aufweisen, wie etwa solche, die zu einer Immuntoleranz führen; und eine erhöhte Synthese von Zytokinen, die suppressive Wirkungen auf bestimmte zelluläre Funktionen zeigen. Ein Beispiel dafür ist IFN-γ, welches den IL-4-induzierten Klassenübergang zu IgE und IgG1 zu blockieren scheint und dabei die Mengen dieser Antikörper-Subklassen reduziert.
Der Begriff "Konjugat" bezieht sich auf einen Komplex, in dem ein ISS-enthaltendes Polynukleotid und ein Antigen verknüpft sind. Solche Konjugatbindungen umfassen kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen.
"Umfang der Konjugation" meint den mittleren Grad der Konjugation in einer gegebenen Population. Wie hierin beschrieben, kann der Umfang der Konjugation durch einen beliebigen aus einer Anzahl von strukturellen und/oder funktionellen Parametern, entweder alleine oder in irgendeiner Kombination, charakterisiert sein.
Der Begriff "Antigen" meint eine Substanz, die spezifisch erkannt und gebunden wird durch einen Antikörper oder durch einen T-Zell-Antigenrezeptor. Antigene können Peptide, Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide, komplexe Kohlehydrate, Zucker, Ganglioside, Lipide und Phospholipide; Abschnitte davon und Kombinationen daraus, umfassen. Die Antigene können solche sein, die in der Natur gefunden werden, oder können synthetische sein. Für die Verwendung mit ISS geeignete Antigene umfassen jegliches Molekül, das zur Auslösung einer B-Zell- oder T-Zell-Antigenspezifischen Reaktion fähig sind. Vorzugsweise lösen Antigene eine Antikörperreaktion aus, die für das Antigen spezifisch ist. Haptene sind innerhalb des Rahmens von "Antigen" enthalten. Ein Hapten ist eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, die nicht aus sich selbst heraus immunogen ist, sondern immunogen gemacht wird, wenn sie mit einem immunogenen Molekül, das antigene Determinanten enthält, konjugiert wird. Kleine Moleküle müssen möglicherweise haptenisiert werden, um antigen gemacht zu werden. Vorzugsweise umfassen die Antigene der vorliegenden Erfindung Peptide, Lipide (z.B. Sterole, Fettsäuren und Phospholipide), Polysaccharide, wie etwa solche, die in Hemophilus influenza-Impfstoffen verwendet werden, Ganglioside und Glykoproteine.
"Adjuvans" bezieht sich auf eine Substanz, die bei Zugabe zu einem immunogenen Agens, wie etwa einem Antigen, eine Immunantwort auf das Agens in dem Empfängerwirt auf die Exposition an das Gemisch hin nicht-spezifisch verstärkt oder potenziert.
Der Begriff "Peptid" meint Polypeptide, die von ausreichender Länge und Zusammensetzung sind, um eine biologische Reaktion zu bewirken, z.B. die Antikörperproduktion oder Zytokinaktivität, unabhängig davon, ob das Peptid ein Hapten ist oder nicht. Typischerweise betragen die Peptide wenigstens sechs Aminosäurereste in der Länge. Der Begriff "Peptid" umfasst ferner modifizierte Aminosäuren (unabhängig davon, ob natürlich oder nicht-natürlich vorkommend), wobei solche Modifikationen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Phosphorylierung, Glykosylierung, Pegylierung, Lipidisierung und Methylierung.
"Antigene Peptide" können gereinigte native Peptide, synthetische Peptide, rekombinante Proteine, Rohproteinextrakte, abgeschwächte oder inaktivierte Viren, Zellen, Mikroorganismen oder Fragmente solcher Peptide umfassen. Ein "antigenes Peptid" oder "antigenes Polypeptid" meint demnach alles oder einen Anteil eines Polypeptids, welches ein oder mehrere antigene Eigenschaften zeigt. So ist zum Beispiel ein "Amb a 1 antigenes Polypeptid" oder "Amb a 1 Polypeptid-Antigen" eine Aminosäuresequenz von Amb a 1, und zwar entweder die gesamte Sequenz, ein Abschnitt der Sequenz und/oder eine Modifikation der Sequenz, die eine antigene Eigenschaft zeigt (d.h. spezifisch an einen Antikörper oder einen T-Zellrezeptor bindet).
Ein "Transfermolekül" oder "Transfervehikel" ist eine chemische Komponente, die den Transfer einer ISS und/oder Antigens an eine bestimmte Stelle und/oder bezüglich einer bestimmten Zeitvorgabe erleichtert, zulässt und/oder erhöht. Ein Transfervehikel kann zusätzlich eine Immunantwort stimulieren oder auch nicht.
Eine "allergische Reaktion auf Antigen" meint eine Immunantwort, die allgemein durch die Generierung von Eosinophilen und/oder Antigen-spezifischem IgE und deren resultierenden Wirkungen gekennzeichnet ist. Wie im Fachgebiet wohlbekannt, bindet IgE an IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen. Auf die spätere Exposition an das Antigen, das durch das IgE erkannt wird, vernetzt das Antigen das IgE an den Mastzellen und Basophilen, was eine Degranulation dieser Zellen, einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, eine Histamin-Freisetzung bewirkt. Es ist klar und vorgesehen, dass die Begriffe "allergische Reaktion auf Antigen", "Allergie" und "allergischer Zustand" gleichermaßen geeignet sind für die Anwendung auf einige der Methoden der Erfindung. Weiterhin ist es klar und vorgesehen, dass die Methoden der Erfindung solche umfassen, die gleichermaßen geeignet für die Verhütung einer allergischen Reaktion als auch die Behandlung einer vorbestehenden allergischen Bedingung sind.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Allergen" ein Antigen oder einen antigenen Abschnitt eines Moleküls, gewöhnlich eines Proteins, welches eine allergische Reaktion auf die Exposition an ein Subjekt hin auslöst. Typischerweise ist das Subjekt gegen das Allergen allergisch, wie zurn Beispiel durch den "Wheal and Flare"-Test oder jegliche im Fachgebiet bekannte Methode angezeigt. Ein Molekül wird als ein Allergen bezeichnet selbst dann, wenn lediglich ein kleines Subset der Subjekte eine allergische (z.B. IgE) Immunantwort auf die Exposition an das Molekül hin zeigt. Eine Anzahl isolierter Allergene ist im Fachgebiet bekannt. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die in der hierin angegebenen Tabelle 1 genannten Allergene.
Der Begriff "Desensibilisierung" bezieht sich auf das Verfahren der Verabreichung steigender Dosen eines Allergens, gegen das das Subjekt eine Empfindlichkeit gezeigt hat. Beispiele der für die Desensibilisierung verwendeten Allergendosen sind im Fachgebiet bekannt, siehe zum Beispiel Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127.
"Antigen-spezifische Immuntherapie" bezieht sich auf jegliche Form von Immuntherapie, die Antigen einbezieht und eine Antigen-spezifische Modulation der Immunantwort generiert. Im Zusammenhang mit Allergie umfasst die Antigen-spezifische Immuntherapie, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Desensibilisierungstherapie.
Ein "Individuum" ist ein Vertebrat, vorzugsweise ein Säuger, bevorzugter ein Mensch. Zu Säugern zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Menschen, Primaten, landwirtschaftliche Nutztiere, Sporttiere, Nager und Haustiere.
Eine "wirksame Menge" oder eine "ausreichende Menge" einer Substanz ist jene Menge, die ausreicht, um günstige oder erwünschte Ergebnisse, einschließlich klinischer Ergebnisse, zu erzielen, wobei eine "wirksame Menge" als solche vom Zusammenhang abhängt, in welchem sie angewendet wird. Im Zusammenhang mit der Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine Immunantwort auf ein Antigen moduliert, ist eine wirksame Menge einer Zusammensetzung, umfassend ein ISS-Antigen-Konjugat, eine Menge, die ausreicht, um solch eine Modulierung zu erzielen, verglichen zu der Immunantwort, die erhalten wird, wenn das Antigen allein verabreicht wird. Eine wirksame Menge kann in ein oder mehreren Darreichungen verabreicht werden.
Der Begriff "gleichzeitige Verabreichung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Verabreichung mindestens zweier verschiedener Substanzen in ausreichend dichtem Zeitabstand, um eine Immunantwort zu modulieren. Vorzugsweise bezieht sich eine gleichzeitige Verabreichung auf die gleichzeitige Verabreichung wenigstens zweier verschiedener Substanzen.
"Stimulation" einer Immunantwort, wie etwa der Th1-Reaktion, meint eine Zunahme bei der Reaktion, die aus der Auslösung und/oder Verstärkung einer Reaktion entstehen kann.
Eine "Allergie-bezogene Störung" meint eine Störung, die aus den Wirkungen einer Antigen-spezifischen IgE-Immunreaktion resultiert. Derartige Wirkungen können umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Hypotonie und Schock. Die Anaphylaxie stellt ein Beispiel einer Allergie-bezogenen Störung dar, während welcher in den Blutkreislauf freigesetztes Histamin eine Vasodilation als auch eine erhöhte Durchlässigkeit der Kapillaren mit einem daraus resultierenden deutlichen Verlust an Plasma aus dem Blutkreislauf verursacht. Eine Anaphylaxie kann systemisch auftreten, wobei die damit verbundenen Effekte über den gesamten Körper wahrgenommen werden, oder sie kann lokal auftreten, wobei die Reaktion auf ein spezifisches Zielgewebe oder Organ beschränkt ist.
Eine "IgE-assoziierte Störung" ist ein physiologischer Zustand, der teilweise durch dauerhaft oder nicht-dauerhaft erhöhte IgE-Mengen gekennzeichnet ist. IgE-assoziierte Störungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Allergie und allergische Reaktionen, Allergie-bezogene Störungen (unten beschrieben), Asthma, Rhinitis, Konjunktivitis, Urtikarie, Schock, Hautflüglerstich-Allergien und Medikamentenallergien, als auch Parasiteninfektionen. Der Begriff umfasst auch verwandte Manifestationen dieser Störungen. Generell ist das IgE bei derartigen Störungen Antigenspezifisch.
Wie hierin verwendet im Fachgebiet wohlverstanden, ist „Behandlung" ein Ansatz, um vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate zu erhalten. Im Sinne der Erfindung umfassen vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate, ohne darauf be schränkt zu sein, die Linderung oder Abmilderung eines oder mehrerer Symptome, die Verminderung des Umfangs einer Erkrankung, eine Stabilisierung (d.h. keine Verschlechterung) des Stadiums einer Erkrankung, die Vermeidung des Ausbreitens einer Erkrankung, eine Verzögerung oder Verlangsamung des Voranschreitens einer Erkrankung, die Verbesserung oder Linderung des krankhaften Zustands und die Remission (ob partiell oder total), ob detektierbar oder nicht detektierbar. „Behandlung" kann ebenfalls die Verlängerung des Überlebens im Vergleich zu dem erwarteten Überleben, falls keine Behandlung erfolgt, bedeuten.
„Linderung" einer Erkrankung oder Störung bedeutet, dass das Ausmaß und/oder die unerwünschten klinischen Manifestationen eines Stadiums einer Störung oder eines krankhaften Zustands verringert und/oder der zeitliche Verlauf der Progression verlangsamt oder verzögert wird im Vergleich zu einer Nichtbehandlung der Störung. Insbesondere im Zusammenhang mit einer Allergie, wie es vom Fachmann einzusehen ist, kann eine Linderung nach einer Modulation der Immunantwort auf ein Allergen oder Allergene erfolgen. Außerdem erfolgt eine Linderung nicht notwendigerweise nach Verabreichung einer Dosis, sondern erfolgt oftmals nach der Verabreichung einer Reihe von Dosen. Folglich kann eine ausreichende Menge mit einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht werden, um eine Reaktion oder Störung zu lindern.
Ein "Antikörper-Titer" oder eine "Menge an Antikörper", die durch ein ISS-Antigen-Konjugat oder Antigen "ausgelöst" wird, bezieht sich auf die Menge eines gegebenen Antikörpers, die zu einem Zeitpunkt nach der Verabreichung des Konjugats oder Antigens gemessen wird.
Ein "Th1-assoziierter Antikörper" ist ein Antikörper, dessen Produktion und/oder Zunahme mit einer Th1-Immunreaktion assoziiert ist. Zum Beispiel ist IgG2a ein Th1-assoziierter Antikörper in der Maus. Für die Zwecke dieser Erfindung kann die Messung eines Th1-assoziierten Antikörpers die Messung eines oder mehrerer solcher Antikörper sein. Zum Beispiel könnte im Menschen die Messung eines Th1-assoziierten Antikörpers die Messung von IgG1 und/oder IgG3 umfassen.
Ein "Th2-assoziierter Antikörper" ist ein Antikörper, dessen Produktion und/oder Zunahme mit einer Th2-Immunreaktion assoziiert ist. Zum Beispiel ist IgG1 ein Th2-assoziierter Antikörper in der Maus. Für die Zwecke dieser Erfindung kann die Messung eines Th2-assoziierten Antikörpers die Messung eines oder mehrerer solcher Antikörper sein. Zum Beispiel könnte im Menschen die Messung eines Th2-assoziierten Antikörpers die Messung von IgG2 und/oder IgG4 umfassen.
Um eine Funktion oder Aktivität zu "unterdrücken" oder zu "hemmen", wie etwa die Zytokinproduktion, Antikörperproduktion oder Histaminfreisetzung, wird die Funktion oder Aktivität im Vergleich zu ansonsten gleichen Bedingungen mit Ausnahme einer Bedingung oder eines Parameters von Interesse, oder alternativ im Vergleich zu einer anderen Bedingung, reduziert. Zum Beispiel vermindert eine Konjugat-Population, die die Histaminfreisetzung unterdrückt, die Histaminfreisetzung im Vergleich, zum Beispiel, zur Histaminfreisetzung, die durch Antigen alleine induziert wird. Als ein anderes Beispiel reduziert eine Konjugat-Population, die die Antikörperproduktion unterdrückt, den Umfang und/oder die Mengen an Antikörper, im Vergleich, zum Beispiel, zum Umfang und/oder den Mengen an Antikörper, der durch das Antigen alleine produziert werden.
Zusammensetzungen der Erfindung
Koniugat-Populationen mit variierenden strukturellen und immunmodulatorischen Eigenschaften
Generell können die Klassen, oder Populationen, von Konjugatmolekülen der Erfindung, wie hierin beschrieben, anhand einer Reihe von strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften unterschieden und/oder definiert werden, einschließlich:

(a) der mittleren Anzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotide, die an Antigen gebunden oder geknüpft sind;
(b) der Medianzahl der ISS-enthaltenden Polynukleotiden, die an Antigen gebunden oder geknüpft sind;
(c) Verhältnis von mittlerer Masse des ISS-enthaltenden Polynukleotids zur mittleren Masse des Antigens;
(d) Verhältnis von Medianmasse des ISS-enthaltenden Polynukleotids zur Medianmasse des Antigens;
(e) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für die Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für denselben Umfang der Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist (wie unten erörtert, werden diese Verhältnisse gewöhnlich, müssen aber nicht, als 50 % Inhibition berechnet);
(f) für Antigene, die Allergene sind, das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugat, die für die Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für denselben Umfang der Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist (wie unten erörtert, können diese Verhältnisse, brauchen aber nicht, als etwa 40 % Histaminfreisetzung berechnet werden);
(g) Verhältnis von (i) der Summe der Th1-assoziierten Antikörper und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden, zu (ii) der Summe der Th1-assoziierten Antikörper und Th2-assoziierten Antikörper, die durch Antigen hervorgerufen werden;
(h) Verhältnis von (i) Th1-assoziierten Antikörpern, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden, zu (ii) Verhältnis der Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigenkonjugat hervorgerufen werden;
(i) unterschiedliche Zytokin-Produktionsprofile im Vergleich zu Antigen alleine;
(j) Umfang der Unterdrückung der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion, wie oben in "Ausführungsformen der Erfindung" beschrieben.

Alle diese hierin beschriebenen Klassen und Ausführungsformen können durch eine, mehr als eine und/oder jegliche Kombination der oben aufgelisteten Eigenschaften beschrieben und/oder definiert werden. Demgemäß stellt die Erfindung Populationen von Konjugatmolekülen bereit, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein oder mehrere Polynukleotide, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei diese Populationen eine beliebige oder mehrere der hierin beschriebenen Eigenschaften, entweder alleine oder in jeglicher Kombination, umfassen. Die Eigenschaften (einschließlich Verhältnisse) können unter Anwendung der im Fachgebiet standardmäßigen Techniken und wie hierin beschrieben gemessen werden, wobei klar ist, dass jegliche dieser Eigenschaften in einer Vielfalt von Systemen, einschließlich in vivo-Systemen, wie Vertebraten und Säugern, einschließlich zum Beispiel der Maus und/oder des Menschen, gemessen werden können.
In Entsprechung zu dem obigen beispielsweise und basierend auf Beobachtungen, die ein Konjugat von Amb a 1 und ein ISS-enthaltendes 22-mer-Polynukleotid (5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' SEQ ID NO: 1) betreffen, ist die "H"-Klasse durch jegliche der folgenden Eigenschaften, entweder alleine oder in jeglicher Kombination, definiert:

(a) im Mittel wenigstens etwa 5,5, bevorzugter 6, ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül;
(b) Verhältnis von (i) der mittleren Masse des ISS-enthaltenden Polynukleotids zu (ii) der mittleren Masse an Antigen beträgt (i) etwa oder alternativ wenigstens etwa 35, 40 oder 45 zu (ii) etwa 40;
(c) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, beträgt etwa 3,5 bis etwa 6,0 oder mehr (einschließlich, doch nicht beschränkt auf 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder mehr) oder alternativ wenigstens etwa eines der folgenden ist: 3,5, 4,0, 4,5 ,5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 8,0, 9,0, 10, 15, 20, 25 (wenn ausgedrückt als ein Bereich, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten);
(d) für Ausführungsformen, bei denen das Antigen ein Allergen ist, ist das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, größer als etwa 300, vorzugsweise größer als etwa 500, vorzugsweise größer als etwa 750, noch bevorzugter größer als etwa 1000, noch bevorzugter größer als etwa 1250, noch bevorzugter größer als etwa 1400, noch bevorzugter größer als etwa 1500 (wobei die Obergrenze jegliche Zahl ist, einschließlich, doch nicht beschränkt auf 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000);
(e) Verhältnis von (i) den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich der Einheit Masse des verabreichten Antigens) beträgt etwa oder alternativ weniger als etwa eines der folgenden: 10, 7, 5, 4, 3,5, 3,0; 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,75, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1.
(f) Verhältnis von (i) den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich des 10-fachen der Einheit Masse des verabreichten Antigens, verglichen zu der Menge des verabreichten Konjugats) beträgt etwa oder alternativ weniger als etwa eines der folgenden: 1,0, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,35; 0,3; 0,25, 0,2, 0,15, 0,11, 0,075, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01.
(g) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich der Einheit Masse des verabreichten Antigens, verglichen zu der Menge des verabreichten Konjugats) beträgt etwa oder alternativ weniger als etwa eines der folgenden: 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5;
(h) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th2-assoziierten Antikörper, die durch Konjugat hervorgerufen werden, beträgt etwa oder alternativ mehr als etwa eines der folgenden: 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10. Als ein Bereich ausgedrückt, kann die Obergrenze eine beliebige Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten, als auch anderer, wie etwa 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90, 100;
(i) Unterdrückung der Antigen-assoziierten Antikörperproduktion (einschließlich der Produktion von Th1-assoziierten und/oder Th2-assoziierten Antikörper), verglichen zur Verabreichung derselben Menge des ungebundenen ISS-enthaltenden Polynukleotids und Antigens oder verglichen zur Verabreichung derselben Menge des Antigens allein.

Die "M"-Klasse ist durch jegliche der folgenden Eigenschaften, entweder alleine oder in jeglicher Kombination, definiert:

(a) im Mittel von etwa 3 bis etwa 5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül;
(b) Verhältnis von (i) der mittleren Masse des ISS-enthaltenden Polynukleotids zu (ii) der mittleren Masse an Antigen beträgt (i) etwa 20, etwa 25 oder etwa 30 zu (ii) etwa 40;
(c) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, beträgt etwa 2,5 bis etwa 3,0 oder alternativ etwa 3,25;
(d) für Ausführungsformen, bei denen das Antigen ein Allergen ist, ist das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, etwa 100 bis etwa 200, oder alternativ etwa 100, oder alternativ zwischen etwa 75 bis etwa 250.
(e) Verhältnis von (i) den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich der Einheit Masse des verabreichten Antigens) beträgt etwa 13 oder alternativ zwischen etwa 10 oder etwa 12 bis etwa 100 (oder, bei einigen Aus führungsformen, etwa 12 bis etwa 50);
(f) Verhältnis von den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich des 10-fachen der Einheit Masse des verabreichten Konjugats, verglichen zu der Menge des verabreichten Konjugats) beträgt etwa 1,3 oder alternativ zwischen etwa 1,0 oder etwa 1,20 bis etwa 10 (oder, bei einigen Ausführungsformen, etwa 1,2 bis etwa 5,0);
(g) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich der Einheit Masse des verabreichten Antigens, verglichen zu der Menge des verabreichten Konjugats) beträgt zwischen etwa 70 bis etwa 500; (h) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th2-assoziierten Antikörper, die durch Konjugat hervorgerufen werden, beträgt etwa 2 bis etwa 4.

Die "L"-Klasse ist durch jegliche der folgenden Eigenschaften, entweder alleine oder in jeglicher Kombination, definiert:

(a) im Mittel weniger als etwa 3 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül;
(b) Verhältnis von (i) der mittleren Masse des ISS-enthaltenden Polynukleotids zu (ii) der mittleren Masse an Antigen beträgt (i) etwa 15 oder alternativ weniger als etwa 15 (bei einigen Ausführungsformen etwa 10 oder alternativ weniger als etwa 10) zu (ii) etwa 40;
(c) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, beträgt we niger als etwa 2,0, oder ist alternativ etwa 2,0;
(d) für Ausführungsformen, bei denen das Antigen ein Allergen ist, ist das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, weniger als etwa 75, oder alternativ etwa 75 (bei anderen Ausführungsformen weniger als etwa 60 oder alternativ etwa 60) bis etwa 200, oder alternativ bis etwa 100
(e) Verhältnis von (i) den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich der Einheit Masse des verabreichten Antigens) beträgt etwa 150, oder alternativ mehr als etwa eines der folgenden: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800. Ausgedrückt als ein Bereich, kann die Obergrenze irgendeine Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten Zahlen.
(f) Verhältnis von (i) den Titern der gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) den gesamten Th1- und Th2-assoziierten Antikörpern, die durch Antigen hervorgerufen werden (hinsichtlich des 10-fachen der Einheit Masse des verabreichten Konjugats, verglichen zu der Menge des verabreichten Konjugats) ist etwa oder ist alternativ größer als etwa eines der folgenden: 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80;
(g) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch Antigen hervorgerufen werden, beträgt etwa 500 oder mehr, etwa 600 oder mehr, etwa 700 oder mehr, etwa 800 oder mehr, etwa 900 oder mehr, etwa 1000 oder mehr. Ausgedrückt als ein Bereich, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000;
(h) Verhältnis von (i) dem Titer der Th1-assoziierten Antikörper, die durch ISS- Antigen-Konjugat hervorgerufen werden (in Form der Antikörper, die pro Einheit Masse des verabreichten Konjugats hervorgerufen werden), zu (ii) dem Titer der Th2-assoziierten Antikörper, die durch Konjugat hervorgerufen werden, beträgt etwa oder alternativ weniger als etwa eines der folgenden: 2,0, 1,5, 1,25.

Wie aus der hierin angegebenen Beschreibung klar wird, ist selbstverständlich, dass jede aus einer Anzahl von Populationen der Konjugate erzeugt werden könnte, und dass die Klassifikationen von "L", "M" und "H" mehrere Beispiele der Klassen von Konjugat-Populationen sind. Die Möglichkeit, den Umfang der Konjugation zu variieren und zu kontrollieren und somit den Typ der Modulation der Immunantwort zu kontrollieren, erstreckt sich auf weitere Populationen über die hierin beispielhaft angegebenen hinaus. In Anbetracht der leicht messbaren strukturellen und funktionellen Charakteristika liegt es durchaus innerhalb der Sachkenntnis des Fachgebiets, irgendeine aus einer Anzahl von Populationen zu entwickeln. Demgemäß umfasst die Erfindung auch Konjugat-Populationen, die durch jedes der folgenden (entweder alleine oder in einer beliebigen Kombination) charakterisiert sind:

(a) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, kann irgendeines von mehr als etwa 1,5, 2,0, 2,25, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,50, 4,75, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 sein. Wenn ausgedrückt als ein Bereich, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten (zum Beispiel kann die Konjugat-Population mehr als etwa 2,0, mehr als etwa 2,0 und weniger als etwa 5,5, mehr als etwa 2,0 und weniger als etwa 20,0 sein).
(b) Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 50 %ige Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischem Antikörper an Antigen erforderlich ist, kann irgendeines von weniger als etwa 1,5, 2,0, 2,25, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,50, 4,75, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 sein. Wenn aus gedrückt als ein Bereich, kann die Untergrenze jegliche der aufgelisteten Zahlen sein, als auch Null (zum Beispiel kann die Konjugat-Population weniger als etwa 5,0, oder alternativ weniger als etwa 5,0 und mehr als etwa 2,0 sein).
(c) In Fällen, bei denen das Antigen ein Allergen ist, ist das Verhältnis von (i) der Konzentration des ISS-Antigen-Konjugats, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, zu (ii) der Konzentration an Antigen, die für eine 40 %ige Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum erforderlich ist, wenigstens etwa eines der folgenden: 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000. Wenn als ein Bereich ausgedrückt, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten. Alternativ kann dieses Verhältnis weniger als etwa eines der folgenden sein: 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000. Wenn als ein Bereich ausgedrückt, kann die Untergrenze jegliche der aufgelisteten Zahlen sein, als auch Null.
(d) Verhältnis des Antikörper-Titers (genauer gesagt, IgG-Titers, wie etwa die Summe aus Th1- und Th2-assoziierten IgG-Titern), hervorgerufen pro Einheit Masse an ISS-Antigen-Konjugat, zu dem Antikörper-Titer (genauer gesagt, dem IgG-Titer, wie etwa die Summe aus Th1- und Th2-assoziierten IgG-Titern), hervorgerufen pro Einheit Masse des Antigens, beträgt zumindest mehr als etwa eines der folgenden: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1250, 1500, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000. Wenn ausgedrückt als ein Bereich, kann die Untergrenze Null sein irgendeine der aufgelisteten Zahlen.
(e) Verhältnis von Th1-assoziiertem Antikörper-Titer, hervorgerufen durch Konjugat, zu Th2-assoziiertem Antikörper-Titer, hervorgerufen durch Konjugat (pro Einheit Masse), ist weniger als etwa eines der folgenden: 20, 15, 12, 10, 7, 5, 4,5, 4,25, 4,0, 3,75, 3,5, 3,25, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,25, 1,0, 0,5. Wenn ausgedrückt als ein Bereich, kann die Untergrenze irgendeine der aufgelisteten Zahlen sein, einschließlich Null. Alternativ kann dieses Verhältnis größer sein als eines der folgenden: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,25, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0. Wenn als ein Bereich ausgedrückt, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten.
(f) Verhältnis von Th1-assoziiertem Antikörper-Titer, hervorgerufen durch Konjugat, zu Th1-assoziiertem Antikörper-Titer, hervorgerufen durch Antigen (pro Einheit Masse), ist weniger als etwa eines der folgenden: 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 14, 10, 5. Wenn ausgedrückt als ein Bereich, kann die Untergrenze irgendeine der aufgelisteten Zahlen sein, einschließlich Null. Alternativ kann dieses Verhältnis größer sein als etwa eines der folgenden: 10, 20, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 800, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000. Wenn als ein Bereich ausgedrückt, kann die Obergrenze jegliche Zahl sein, einschließlich der aufgelisteten.

Der Umfang der Konjugation kann in einer Anzahl von Weisen kontrolliert werden, von denen alle im Fachgebiet wohlbekannte chemische Techniken anwenden, die ebenfalls hierin beschrieben sind. Eine Art und Weise der Kontrolle des Umfangs der Konjugation besteht im Variieren der Äquivalente an ISS im Verhältnis zu den Verknüpfungsstellen am Antigen. Das heißt, eine konstante Menge oder Anzahl an Verknüpfungsstellen wird mit einer bestimmten Menge an ISS umgesetzt. Für die hierin beispielhaft veranschaulichten ISS-Amb a 1-Konjugate beispielsweise ließ die Reaktion, basierend auf dem Maleimid-aktivierten Amb a 1, mit vier molaren Äquivalenten von 5'-Thio-ISS, 7 molaren Äquivalenten von 5'-Thio-ISS und 17 molaren Äquivalenten von 5'-Thio-ISS mit 1 molaren Äquivalent von Amb a 1, "L"-, "M"- bzw. "H"-Populationen entstehen. Eine andere Art und Weise der Kontrolle des Umfangs der Konjugation besteht im Sättigen der Reaktion mit ISS und Variieren der Menge an verfügbaren Verknüpfungsstellen am Antigen. Die Verknüpfungsstellen konnten beispielsweise durch Auswählen einer bestimmten Verknüpfungskomponente, die die gewünschte Anzahl an Verknüpfungsstellen ergab (zum Beispiel durch Auswählen einer Verknüpfung über ein Kohlehydrat anstatt über Aminogruppen), oder alternativ durch Kontrollieren einer bindungsaktivierenden Reaktion, so dass die gewünschte mittlere Anzahl an Verknüpfungsstellen aktiviert wird, kontrolliert werden.
Generell weist ein gegebenes Antigen eine maximale Anzahl an potenziellen Verknüpfungsstellen in Abhängigkeit von der Natur der Antigen-ISS-Bindung auf. Der Umfang der Konjugation kann anhand der Anzahl dieser Verknüpfungsstellen, die zur Kopplung einer ISS verwendet werden, kontrolliert werden. Demgemäß umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, bei denen der mittlere Prozentsatz der Gesamtzahl an Verknüpfungsstellen, die an ein ISS-enthaltendes Polynukleotid gebunden sind, wenigstens etwa einer der folgenden ist: 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 33 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %. Alternativ umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, bei denen der mittlere Prozentsatz der Gesamtzahl an Verknüpfungsstellen, die an ein ISS-enthaltendes Polynukleotid gebunden sind, weniger als etwa einer der folgenden ist: 10 %, 20 %, 30 %, 33 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %. Die Gesamtzahl an Verknüpfungsstellen wird durch die Art der Anlagerung bestimmt. Ist ein Antigen beispielsweise an ein ISS-enthaltendes Polynukleotid über eine freie Aminogruppe geknüpft (wie etwa bei Lysin), so verkörpert die Gesamtzahl der Verknüpfungsstellen die Anzahl an Lysinen. Ist ein Antigen über eine Sulfhydrylgruppe verknüpft (wie etwa über Cystein), so stellt die Gesamtzahl der Verknüpfungsstellen die Gesamtzahl der freien Sulfhydrylgruppen dar. Ist das Antigen über eine Kohlehydrat-Komponente verknüpft, so ist die Gesamtzahl der Verknüpfungsstellen gleich der Gesamtzahl der Kohlehydrat-Komponenten. Bezüglich jeglicher dieser Ausführungsformen kann der mittlere Prozentsatz an Verknüpfungsstellen, die an ein ISS-enthaltendes Polynukleotid angelagert sind, durch irgendeine der oben aufgelisteten immunmodulatorischen Charakteristika, und zwar einzeln oder in Kombination, begleitet sein.
Charakterisierung der Klassen von ISS-Antigen-Konjugaten
Die Konjugat-Populationen der Erfindung können anhand irgendeiner aus einer Anzahl von Weisen identifiziert und/oder charakterisiert werden, einschließlich der oben aufgelisteten. Zum Beispiel kann der Umfang der Konjugation hinsichtlich der Struktur beschrieben werden durch: (a) Mittelwert, oder alternativ Medianzahl, von ISS zu Antigenmolekülen; (b) Verhältnis von ISS zu gesamten Verknüpfungsstellen im Antigen; (c) Verhältnis der Masse (ob nun Mittelwert oder Medianzahl) an ISS zur Masse (ob nun Mittelwert oder Medianzahl) des Antigens; (d) Verhältnis von ISS zu T- Zellepi-topen im Antigen; (e) Verhältnis von ISS zu B-Zellepitopen im Antigen. Hinsichtlich der Funktion, welche die Immunmodulation umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, können die Konjugat-Populationen der Erfindung hinsichtlich des (a) Grades der Antigen-spezifischen Antikörperreaktion, wie etwa der IgG-Reaktion, charakterisiert werden; (b) Verhältnis von Th1-assoziierten Antikörpern zu Th2-assoziierten Antikörpern; (c) Grad der Unterdrückung der Histaminfreisetzung; (d) Grad der Konkurrenz mit Antigen-spezifischem Antikörper um die Bindung an Antigen; (e) Grad der Unterdrückung der Th2-assoziierten Immunantwort; (f) Sekretion von Th1-assoziierten Zytokinen, wie etwa Interferon; (g) Sekretion von Th2-assoziierten Zytokinen, wie etwa IL-4 und/oder IL-5.
Strukturelle Charakterisierung
Der Umfang der ISS-Antigen-Konjugation kann unter Anwendung einer Anzahl von im Fachgebiet bekannten Protein- und Nukleinsäure-Messmethoden bestimmt werden. Zum Beispiel können Antigen- und/oder Protein-spezifische Nachweismethoden (zum Beispiel Antigen-spezifische Antikörper und/oder Coomassie Blue-Färbung) und Nukleinsäure-spezifische Nachweistechniken (zum Beispiel die Hybridisierung mit nachweisbar markierten DNA-Sonden) zur Analyse der Konjugations-Reaktionsprodukte verwendet werden. Unter Verwendung geeigneter Quantifizierungsstandards kann die Menge an Polynukleotid zu Antigen bestimmt werden.
Die Menge an Oligonukleotid, die an ein Polypeptid gebunden ist, kann ebenfalls durch Messen von Größe oder Molekulargewicht des Konjugats bestimmt werden. Die Konjugatgröße kann unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese-(SDS-PAGE)-Analyse und Größenausschlusschromatographie (SEC) bestimmt werden.
Die ISS-Antigen-Konjugate können unter Anwendung einer Kombination von Größenbestimmungs- und/oder Trenntechniken und Nukleinsäure- und Protein-Bestimmungstechniken analysiert werden. Zum Beispiel kann nach Fraktionierung der Konjugat-Reaktionsprodukte unter Anwendung der SEC der Protein- und Nukleinsäuregehalt jeder Fraktion durch die Extinktion der Fraktion bei 280 nm bzw. 260 nm bestimmt werden. In dieser Weise können die Ergebnisse sowohl der Größe des Konjugats als auch der Nukleinsäure- und Protein-Detektionsanalyse zur Charakterisierung der Struktur des Konjugats kombiniert werden. Das Verhältnis von Menge des Polynukleotids zur Menge des Proteins in jeder Konjugatfraktion ergibt den Mittelwert an ISS-Molekülen pro Antigenmolekül.
Funktionelle Charakterisierung
Verschiedene im Fachgebiet bekannte Methoden können zur Bestimmung der Antigen-Spezifität und Antikörper-Klasse und/oder -Subklasse der Antikörper, die als Reaktion auf die Verabreichung der ISS-Antigen-Konjugate generiert werden, angewendet werden. Zum Beispiel können standardmäßige Assays im ELISA-Format angewendet werden, um die Menge, Spezifizität und/oder Typ von Antikörper nachzuweisen und zu messen, der als Reaktion auf verschiedene ISS-Antigen-Konjugate produziert wird. Bei diesen Assays beispielsweise wird Antigen an ein Substrat gebunden und mit Serum von einem mit ISS-Antigen-Konjugat behandelten Individuum inkubiert. Die Menge des Antigen-spezifischen Antikörpers, die an das Substratgebundene Antigen angelagert ist, wird dann unter Verwendung von Antikörperspezifischen Reagenzien, wie etwa von Antikörpern, die für IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE etc. spezifisch sind, bestimmt.
Im Fachgebiet bekannte Methoden können zur Bestimmung einer Konzentration an ISS-Antigen-Konjugat, die zur Hemmung der Bindung von Antigen-spezifischen Antikörpern an Antigen erforderlich ist, angewendet werden, wie etwa den hierin beschriebenen kompetitiven ELISA-Assays.
Im Fachgebiet bekannte Methoden zur Messung der Menge der Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Antigen-sensibilisierten Individuum als Reaktion auf das ISS-Antigen-Konjugat können angewendet werden. Wie hierin beschrieben, kann zum Beispiel die Menge des in den Zellkultur-Überstand freigesetzten Histamins bestimmt werden, nachdem die Leukozyten aus dem Blut allergischer Individuen mit variierenden Konzentrationen und/oder Präparationen der ISS-Allergen-Konjugate behandelt wurden.
Im Fachgebiet bekannte Methoden können zur Bestimmung der Zytokin-Produktionsprofile, die als Reaktion auf die Verabreichung von ISS-Antigen-Konjugaten generiert werden, angewendet werden. Zum Beispiel werden die Überstände von Zellen, die mit ISS-Konjugaten in vitro behandelt werden, auf das Vorhandensein von Zytokinen analysiert. Die Typen und Mengen von Zytokinen, die durch Lymphozyten, die den ISS-Antigen-Konjugaten ausgesetzt werden, produziert werden, können unter Anwendung standardmäßiger Assays im ELISA-Format gemessen werden. Ein Zytokin-Profil, das als Reaktion auf ein ISS-Antigen-Konjugat erzeugt wird, kann ebenfalls unter Anwendung standardmäßiger Zytokin-Bioassays bestimmt werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf solche, bei denen das Überleben der Zellen vom Vorhandensein eines bestimmten Zytokins (zum Beispiel IL-2) abhängig ist, und solchen, bei denen ein bestimmtes Zytokin (zum Beispiel Interferon) die Virusreplikation hemmt.
Eine Klasse von Konjugat kann auch anhand des Umfangs der Antigen-spezifischen Antikörper-Suppression nach Verabreichung oder relativ zu der Verabreichung von Antigen alleine charakterisiert werden. Zum Beispiel können die Mengen an Serum-Antikörpern vor und nach der Verabreichung des ISS-Antigen-Konjugats und/oder von Antigen alleine bestimmt werden. Die Antikörpermengen zu verschiedenen Zeitpunkten können dann zur Bestimmung des Umfangs der Antikörper-Suppression verglichen werden.
Eine Klasse von Konjugaten kann auch anhand des Umfangs der Antikörperreaktion, vorzugsweise einer Antigen-spezifischen Antikörperreaktion, insbesondere einer IgG-Reaktion, charakterisiert werden. Wie oben angemerkt, kann eine Klasse anhand eines Verhältnisses von (i) IgG-Antikörpern, die als Reaktion auf Konjugat produziert wurden, zu (ii) IgG-Antikörpern, die als Reaktion auf Antigen alleine produziert wurden, charakterisiert werden. Für diese Charakterisierungen und Ausführungsformen kann das Verhältnis sein

(i) die Summe aus Th1-assoziierten Antikörpern und Th2-assoziierten Antikörpern, wie durch ISS-Antigen-Konjugat hervorgerufen, zu (ii) der Summe aus Th1- assoziierten Antikörpern und Th2-assoziierten Antikörpern, wie durch Antigen hervorgerufen;
(ii) (i) ein/mehrere Th1-assoziierte Antikörper, hervorgerufen durch ISS-Antigen-Konjugat, zu (ii) Th1-assoziierten Antikörpern, hervorgerufen durch Antigen;
(iii) (i) ein/mehrere Th2-assoziierte Antikörper, hervorgerufen durch ISS-Antigen-Konjugat, zu (ii) Th2-assoziierten Antikörpern, hervorgerufen durch Antigen.

Ein Th1-assoziierter Antikörper ist ein mit einer Th1-Reaktion assoziierter Antikörper. Bei Mäusen beispielsweise ist IgG2a mit einer Th1-Reaktion assoziiert. Bei Menschen scheinen IgG1- und/oder IgG3-Antikörper mit einer Th1-Reaktion assoziiert zu sein. Siehe z.B. Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581 und de Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164. Entsprechend ist ein Th2-assoziierter Antikörper ein mit einer Th2-Reaktion assoziierter Antikörper. Bei Mäusen ist IgG1 mit einer Th2-Reaktion assoziiert. Beim Menschen scheint IgG2 und/oder IgG4 mit einer Th2-Reaktion assoziiert zu sein (Widhe et al. (1998) und de Martino et al. (1999)). Sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen ist IgE mit einer Th2-Reaktion assoziiert. Es ist klar, dass bei diesen Charakterisierungen und Ausführungsformen jegliche ein oder mehrere Arten von Antikörpern ausgewertet werden können, solange derselbe Antikörper oder Antikörper-Produktionshöhe zu der verglichen wird, die durch Antigen alleine hervorgerufen wird.
Eine Art und Weise, dieses Verhältnis zu berechnen, bezieht sich auf die Menge an Antikörper (oder Antikörpern) von Interesse, die pro Einheit Masse des Konjugats produziert wird, gegenüber der Menge desselben Antikörpers (oder Antikörpern), der/die pro Einheit Masse des Antigens produziert wird. Die Einheit Masse des Konjugats kann bezüglich der Masse der Antigen-Komponente des Konjugats, der Polynukleotid-Komponente des Konjugats und/oder der Masse des Konjugats ausgedrückt sein. Weist zum Beispiel ein Konjugat ein gesamtes Molekulargewicht von 100 auf, wobei sich die Antigen-Komponente auf 80 beläuft und sich die ISS-Komponente auf 20 beläuft, so kann die Einheit Masse für die Zwecke des Berechnens und Vergleichens der Mengen der Antikörperproduktion eine von 100, 80 oder 20 sein. Die Beispiele stellen Berechnungen bereit, bei denen die Masse der Antigen-Komponente des Konjugats (Amb a 1) als der Grundlage zum Berechnen und Vergleichen der Mengen der Antikörperproduktion im Vergleich zu Antigen allein dient.
Weiterhin kann beim Berechnen des Verhältnisses von durch Konjugat produziertem Antikörper gg. durch Antigen produziertem Antkörper die Masse des Konjugats zur Masse des Antigens 1:1 betragen oder auch nicht. Bei einigen Ausführungsformen beispielsweise wird der pro Einheit Masse des Konjugats produzierte Antikörper zu dem Antikörper verglichen, der durch eines vom 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40-fachen der Masse des Antigens produziert wird. Im Falle von Amb a 1 beispielsweise wird der durch 1 μg Konjugat (wie gemessen anhand der Menge des Antigens; somit 1 μg Antigen in Konjugat) produzierte Antikörper zu dem durch 10 μg Amb a 1 produzierten Antikörper verglichen.
ISS
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das immunmodulatorische Polynukleotid zumindest eine ISS, und kann vielfache ISS enthalten. Die ISS können innerhalb des Polynukleotids nebeneinander liegen oder sie können durch weitere Nukleotidbasen innerhalb des Polynukleotids voneinander getrennt sein.
ISS sind im Fachgebiet beschrieben worden und können unter Anwendung standardmäßiger Assays, die verschiedene Aspekte der Immunreaktion anzeigen, wie etwa die Zytokin-Sekretion, Antikörperproduktion, NK-Zellaktivierung und T-Zellproliferation, ohne weiteres identifiziert werden. Siehe z.B. WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275; Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto et al. (1992a); Ballas et al. (1996); Klinman et al. (1997); Sato et al. (1996); Pisetsky (1996a); Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-4575; Roman et al (1997); und Lipford et al. (1997a).
Die ISS kann von jeglicher Länge größer als 6 Basen oder Basenpaare sein und umfasst im Allgemeinen die Sequenz 5'-Cytosin, Guanin-3', umfasst genauer gesagt die Sequenz 5'-Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-3' (wie etwa 5'-AACGTT-3'), vorzugsweise von mehr als 15 Basen oder Basenpaaren, bevorzugter mehr als 20 Basen oder Basenpaaren in der Länge. Eine ISS kann auch die Sequenz 5'-Purin, Pu rin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin,C, G-3' umfassen. Eine ISS kann auch die Sequenz 5'-Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin, C, C-3' umfassen. Wie in den unten stehenden Polynukleotidsequenzen angegeben, kann eine ISS auch die Sequenz 5'-T, C, G-3' umfassen.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst die ISS irgendeine der folgenden Sequenzen:
GACGCTCC; GACGTCCC; GACGTTCC; GACGCCCC; AGCGTTCC; AGCGCTCC; AGCGTCCC; AGCGCCCC; AACGTCCC; AACGCCCC; AACGTTCC; AACGCTCC; GGCGTTCC; GGCGCTCC; GGCGTCCC;GGCGCCCC; GACGCTCG; GACGTCCG; GACGCCCG; GACGTTCG; AGCGCTCG; AGCGTTCG; AGCGTCCG; AGCGCCCG; AACGTCCG; AACGCCCG; AACGTTCG; AACGCTCG; GGCGTTCG; GGCGCTCG; GGCGTCCG; GGCGCCCG.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst die ISS irgendeine der folgenden Sequenzen:
GACGCT; GACGTC; GACGTT; GACGCC; GACGCU; GACGUC; GACGUU; GACGUT; GACGTU; AGCGTT; AGCGCT; AGCGTC; AGCGCC; AGCGUU; AGCGCU; AGCGUC; AGCGUT; AGCGTU; AACGTC; AACGCC; AACGTT; AACGCT; AACGUC; AACGUU; AACGCU; AACGUT; AACGTU; GGCGTT; GGCGCT; GGCGTC; GGCGCC; GGCGUU; GGCGCU; GGCGUC; GGCGUT; GGCGTU.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst das immunmodulatorische Polynukleotid die Sequenz 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 1). Bei anderen Ausführungsformen umfasst die ISS jegliche der folgenden Sequenzen:
5'-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3' (SEQ ID NO: 3);
5'-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3' (SEQ ID NO: 4);
5'-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3' (SEQ ID NO: 5);
5'-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3' (SEQ ID NO: 6), worin B 5-Bromcytosin ist;
5'-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 7), worin B 5-Bromcytosin ist und
5'-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 8), worin B 5-Bromcytosin ist.
Eine ISS und/oder ISS-enthaltendes Polynukleotid kann Modifikationen enthalten. Modifikationen der ISS umfassen jegliche im Fachgebiet bekannte Modifikationen, ohne darauf beschränkt zu sein, der 3'OH- oder 5'OH-Gruppe, Modifikationen der Nukleotidbase, Modifikationen der Zuckerkomponente und Modifikationen der Phosphatgruppe. Verschiedene solcher Modifikationen sind nachstehend beschrieben.
Eine ISS kann einzelsträngige oder doppelsträngige DNA sein, als auch einzel- oder doppelsträngige RNA oder andere modifizierte Polynukleotide. Eine ISS kann oder kann nicht ein oder mehrere palindrome Regionen enthalten, die in dem oben beschriebenen hexameren Motiv vorhanden sein können und die sich über das Motiv hinaus erstrecken können. Eine ISS kann zusätzliche flankierende Sequenzen umfassen, von denen einige hierin beschrieben sind. Eine ISS kann natürlich vorkommende oder modifizierte, nicht-natürlich vorkommende Basen enthalten und kann modifizierten Zucker, Phosphat und/oder Termini enthalten. Zum Beispiel zählen zu Phosphat-Modifikationen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphoramidat (brückenbildend oder nicht-brückenbildend), Phosphotriester und Phosphordithioat, die in jeglicher Kombination verwendet werden können. Weitere Nicht-Phosphatbindungen können ebenfalls verwendet werden. Vorzugsweise umfassen die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung Phosphorthioat-Rückgrate. Im Fachgebiet bekannte Zuckermodifikationen, wie etwa 2'-Alkoxy-RNA-Analoga, 2'-Amino-RNA-Analoga und 2'-Alkoxy- oder -Amino-RNA/DNA-Chimären und andere hierin beschriebene können ebenfalls vorgenommen werden und mit irgendeiner Phosphat-Modifikation kombiniert werden. Zu Beispielen der Basenmodifikationen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Addition einer Elektronenentziehenden Komponente an C-5 und/oder C-6 eines Cytosins der ISS (z.B. 5-Bromcytosin, 5-Chlorcytosin, 5-Fluorcytosin, 5-lodcytosin).
Die ISS kann unter Anwendung von Techniken und Nukleinsäure-Synthesegeräten synthetisiert werden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf enzymatische Methoden, chemische Methoden und den Abbau größerer Oligonukleotidsequenzen. Siehe zum Beispiel Ausubel et al. (1987); und Sam brook et al. (1989). Bei einem enzymatischen Zusammenbau können die einzelnen Einheiten zum Beispiel mit einer Ligase, wie etwa T4 DANN- oder RNA-Ligase, ligiert werden. US-Patent Nr. 5.124.246. Der Oligonukleotid-Abbau kann durch die Exposition eines Oligonukleotids an eine Nuklease erreicht werden, wie in US Patent Nr. 4.650.675 beispielhaft veranschaulicht.
Die ISS kann auch unter Anwendung herkömmlicher Polynukleotid-Isolierungsverfahren isoliert werden. Zu solchen Verfahrensweisen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Hybridisation von Sonden an genomische oder cDNA-Bibliotheken, um geteilte Nukleotidsequenzen nachzuweisen, das Antikörper-Screening von Expressionsbibliotheken, um geteilte strukturelle Merkmale nachzuweisen, und die Synthese bestimmter nativer Sequenzen mittels der Polymerase-Kettenreaktion.
Zirkuläre ISS kann isoliert, durch rekombinante Methoden synthetisiert oder chemisch synthetisiert werden. Dort, wo die zirkuläre ISS durch Isolierung oder durch rekombinante Methoden erhalten ist, wird die ISS vorzugsweise ein Plasmid sein. Die chemische Synthese kleinerer zirkulärer Oligonukleotide kann unter Anwendung jeglicher in der Literatur beschriebenen Methode vorgenommen werden. Siehe zum Beispiel Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029; und Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333.
Die Techniken zur Herstellung von Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden sind im Fachgebiet bekannt. Natürlich vorkommende DNA oder RNA, die Phosphodiester-Bindungen enthalten, wird allgemein mittels sequenzieller Kopplung des entsprechenden Nukleosidphosphoramidits an die 5'-Hydroxygruppe des wachsenden Oligonukleotids, das an einen festen Träger am 3'-Ende gebunden ist, gefolgt von der Oxidation des intermediären Phosphittriesters zu einem Phosphattriester, synthetisiert. Ist die gewünschte Oligonukleotidsequenz einmal synthetisiert, so wird das Oligonukleotid vom Träger entfernt, werden die Phosphattriestergruppen zu Phosphatdiestern entschützt und werden die Nukleosidbasen unter Verwendung von wässrigem Ammoniak oder anderen Basen entschützt. Siehe zum Beispiel Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in Protocols for Oligonucleo tides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, Hrsg.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401 und US Patent Nr. 4.458.066.
Die ISS kann auch Phosphat-modifizierte Oligonukleotide enthalten. Die Synthese von Polynukleotiden, die modifizierte Phosphatbindungen oder Nicht-Phosphatbindungen enthalten, ist im Fachgebiet ebenfalls bekannt. Für eine Übersicht, siehe Matteucci (1997) "Oligonucleotides Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick und G. Cardew, Hrsg.) John Wiley and Sons, New York, NY. Das phosphorige Derivat (oder die modifizierte Phosphatgruppe), die an die Zucker- oder Zucker-Analogon-Komponente in den Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung gebunden werden kann, kann ein Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Alkylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphordithioat oder ähnliches sein. Die Herstellung der oben genannten Phosphat-Analoga, und deren Einbau in Nukleotide, modifizierte Nukleotide und Oligonukleotide ist als solches ebenfalls bekannt und braucht hierin nicht ausführlich beschrieben zu werden. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; und Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973. Zum Beispiel ist die Synthese von Phosphorthioat-Oligonukleotiden der oben für natürlich vorkommende Oligonukleotide ähnlich, mit der Ausnahme, dass der Oxidationsschritt durch einen Sulfurisierungsschritt ersetzt ist (Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, Hrsg.) Humana Press, S. 165-190). Entsprechend ist die Synthese anderer Phosphat-Analoga, wie etwa von Phosphotriester (Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665), nicht-brückenbildenden Phosphoramidaten (Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247-7246), N3' bis P5'-Phosphoramidaten (Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287) und Phosphordithioaten (US Patent Nr. 5.453.496) ebenfalls beschrieben worden. Andere nicht-phosphorig basierte modifizierte Oligonukleotide können ebenfalls verwendet werden (Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141). Oligonukleotide mit Phosphorthioat-Rückgraten können immunogener sein als solche mit Phosphodiester-Rückgraten und scheinen widerstandsfähiger gegenüber einem Abbau nach Injektion in den Wirt zu sein. Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; und Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064.
Die bei der Erfindung verwendeten ISS-enthaltenden Polynukleotide können Ribonukleotide (enthaltend Ribose als der einzigen oder hauptsächlichen Zuckerkomponente), Desoxyribonukleotide (enthaltend Desoxyribose als der hauptsächlichen Zuckerkomponente) umfassen oder es können, wie im Fachgebiet bekannt, modifizierte Zucker oder Zucker-Analoga in die ISS aufgenommen werden. So kann zusätzlich zu der Ribose und Desoxyribose die Zuckerkomponente Pentose, Desoxypentose, Hexose, Desoxyhexose, Glucose, Arabinose, Xylose, Lyxose und eine Cyclopentylgruppe eines Zucker-"Analogons" sein. Der Zucker in Pyranosyl- oder in einer Furanosyl-Form vorliegen. In der ISS ist die Zuckerkomponente vorzugsweise das Furanosid von Ribose, Desoxyribose, Arabinose oder 2'-O-Alkylribose, und der Zucker kann an die jeweiligen heterozyklischen Basen entweder in einer α- oder β-anomeren Konfiguration gebunden sein. Zu Zuckermodifikationen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, 2'-Alkoxy-RNA-Analoga, 2'-Amino-RNA-Analoga und 2'-Alkoxy- oder -Amino-RNA/DNA-Chimären. Die Präparierung dieser Zucker oder Zucker-Analoga und der jeweiligen "Nukleoside", worin diese Zucker oder Analoga an eine heterozyklische Base (Nukleinsäure-Base) gebunden sind, ist als solche bekannt und braucht hierin nicht beschrieben zu werden, außer in dem Umfange, als eine solche Präparierung irgendein spezifisches Beispiel betreffen kann. Zuckermodifikationen können auch erzeugt und mit jeglicher Phosphat-Modifikation in der Präparierung einer ISS kombiniert werden.
Die heterozyklischen Basen, oder Nukleinsäure-Basen, die in die ISS aufgenommen sind, können natürlich vorkommende hauptsächliche Purin- und Pyrimidinbasen sein (nämlich Uracil oder Thymin, Cytosin, Adenin und Guanin, wie oben erwähnt) als auch natürlich vorkommende und synthetische Modifikationen dieser Hauptbasen.
Fachleute des Gebiets werden erkennen, dass eine große Zahl "synthetischer" nicht-natürlicher Nukleoside, umfassend verschiedene heterozyklische Basen und verschiedene Zuckerkomponenten (und Zucker-Analoga) im Fachgebiet verfügbar ist, und dass, solange andere Kriterien der vorliegenden Erfindung erfüllt sind, die ISS ein oder mehrere andere heterozyklische Basen enthalten kann als die fünf Haupt-Basenkomponenten der natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Vorzugsweise umfasst die heterozyklische Base in der ISS jedoch, ohne darauf beschränkt zu sein, Uracil-5-yl, Cytosin-5-yl, Adenin-7-yl, Adenin-8-yl, Guanin-7-yl, Guanin-8-yl, 4-Aminopyrrolo-[2.3-d]pyrimidin-5-yl, 2-Amino-4-oxopyrrolo-[2.3-d]pyrimidin-5-yl, 2-Amino-4-oxopyrrolo-[2.3-d]pyrimidin-3-yl-Gruppen, wobei die Purine an die Zuckerkomponente der ISS über die 9-Position, die Pyrimidine über die 1-Position, die Pyrrolopyrimidine über die 7-Position und die Pyrazolopyrimidine über die 1-Position gebunden sind.
Die ISS kann mindestens eine modifizierte Base umfassen, wie zum Beispiel beschrieben in der US-Anmeldung desselben Inhabers der laufenden Nummer 09/324.191 und der internationalen Anmeldung WO 99/62923. Wie hierin verwendet, ist der Begriff "modifizierte Base" synonym mit "Basen-Analogon", zum Beispiel ist "modifiziertes Cytosin" synonym mit "Cytosin-Analogon". Entsprechend sind "modifizierte" Nukleoside oder Nukleotide hierin als synonym mit Nukleosid- oder Nukleotid"Analoga" definiert. Zu Beispielen der Basenmodifikationen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Addition einer Elektronen-entziehenden Komponente an C-5 und/oder C-6 eines Cytosins der ISS. Vorzugsweise ist die Elektronen-entziehende Komponente ein Halogen. Zu solchen modifizierten Cytosinen können zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Azacytosin, 5-Bromcytosin, Bromuracil, 5-Chlorcytosin, chloriertes Cytosin, Cyclocytosin, Cytosinarabinosid, 5-Fluorcytosin, Fluorpyrimidin, Fluoruracil, 5,6-Dihydrocytosin, 5-lodcytosin, Hydroxyharnstoff, Ioduracil, 5-Nitrocytosin, Uracil und jegliches andere Pyrimidin-Analogon oder modifizierte Pyrimidin.
Die Herstellung der Basen-modifizierten Nukleoside, und die Synthese der modifizierten Oligonukleotide unter Verwendung der Basen-modifizierten Nukleoside als Vorläufer ist beschrieben worden zum Beispiel in US-Patenten 4.910.300, 4.948.882 und 5.093.232. Diese Basen-modifizierten Nukleoside sind so entworfen worden, dass sie durch chemische Synthese entweder in terminale oder interne Positionen eines Oligonukleotids aufgenommen werden können. Solche Basen-modifizierten Nukleoside, die entweder an terminalen oder internen Positionen eines Oligonukleotids vorhanden sind, können als Stellen für die Anlagerung eines Peptids oder anderen Antigens dienen. In ihrer Zuckerkomponente modifizierte Nukleoside sind ebenfalls beschrieben worden (einschließlich, doch nicht beschränkt auf z.B. US-Patente 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, 5.118.802) und können in ähnlicher Weise genützt werden.
Bei einigen Ausführungsformen ist ein ISS-enthaltendes Polynukleotid weniger als etwa eine der folgenden Längen (in Basen oder Basenpaaren): 10.000; 5.000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25; 10. Bei einigen Ausführungsformen ist ein ISS-enthaltendes Polynukleotid größer als etwa eine der folgenden Längen (in Basen oder Basenpaaren): 8; 10; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000.
Antigen
Jegliches Antigen kann in den Konjugat-Populationen der Erfindung verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen ist das Antigen ein Allergen. Beispiele rekombinanter Allergene sind in Tabelle 1 bereitgestellt. Die Präparierung vieler Allergene ist im Fachgebiet wohlbekannt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Präparierung von Ambrosia- (Ragweed) -Pollenallergen Antigen E (Amb al) (Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236), die wichtigsten Hausstaubmilben-Allergene Der pI und Der PII (Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129), weiße Birkenpollen Bet vI (Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935-1938), Hauskatzen-Allergen Fel d I (Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559-568) und Proteinantigene von Baumpollen (Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31). Wie angegeben, sind Allergene von Bäumen bekannt, einschließlich Allergenen von Birken, Wacholder und Japanischer Zeder. Die Präparierung von Protein-Antigenen aus Graspollen für die in vivo-Verabreichung ist berichtet worden. Malley (1989) J. Reprod. Immunol. 16: 173-186. Wie Tabelle 1 zeigt, ist bei einigen Ausführungsformen das Allergen ein Lebensmittel-Allergen, wie etwa Erdnuss-Allergen, zum Beispiel Ara h I, und ist bei einigen Ausführungsformen das Allergen ein Grasallergen, wie etwa Roggen-Allergen, zum Beispiel Lol p I. Tabelle 1 zeigt eine Liste von Allergenen, die verwendet werden können. TABELLE 1 Rekombinante Allergene
Bei einigen Ausführungsformen ist das Antigen von einem infektiösen Agens, einschließlich Protozoen, bakteriellen, fungalen (einschließlich unizellulären und multizellulären) und viralen infektiösen Agenzien. Beispiele geeigneter viraler Antigene sind hierin beschrieben und im Fachgebiet bekannt. Zu den Bakterien zählen Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis und Bordetella pertussis. Zu den Protozoen-Infektionsagenzien zählen Malaria plasmodia, Leishmania-Spezies, Trypanosoma-Spezies und Schistosoma-Spezies. Zu den Fungi zählen Candida albicans.
Bei einigen Ausführungsformen ist das Antigen ein virales Antigen. Zu viralen Polypeptid-Antigenen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Core-Protein, wie etwa HIV gag-Proteine (einschließlich, doch nicht beschränkt auf Membran-verankerndes Protein (MA), Core-Capsid (CA) Protein und Nucleocapsid (NC) Protein), HIV-Polymerase, Influenzavirus-Matrix- (M) -Protein und Influenzavirus-Nucleocapsid- (NP) -Protein. Zu Literaturstellen, in denen die Influenza-Vakzinierung erörtert werden, zählen Scherle und Gerhard (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450; Scherle und Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff et al. (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova und Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8:595-599. Weitere Beispiele der Antigen-Polypeptide sind Gruppen- oder Subgruppen-spezifische Antigene, die für eine Anzahl infektiöser Agenzien bekannt sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Adenovirus, Herpes simplex-Virus, Papilliomavirus, respiratorisches syncytiales Virus und Pockenviren.
Viele antigene Peptide und Proteine sind bekannt und im Fachgebiet verfügbar; andere können unter Anwendung herkömmlicher Techniken identifiziert werden. Für die Immunisierung gegen eine Tumorbildung können immunmodulatorische Peptide Tumorzellen (lebende oder bestrahlte), Tumorzellextrakte oder Protein-Untereinheiten von Tumorantigenen, wie Her-2/neu, Mart1, karzinomembryonales Antigen (CEA), Ganglioside, humanes Milchfettglobulin (HMFG), Mucin (MUC1), MAGE- Antigene, BAGE-Antigene, GAGE-Antigene, gp100, Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und Tyrosinase umfassen. Impfstoffe für die immunbasierte Kontrazeption können durch Aufnahme von Spermaproteinen, verabreicht mit ISS, gebildet werden. Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263.
Abgeschwächte und inaktivierte Viren eignen sich hierin zur Verwendung als das Antigen. Die Präparierung dieser Viren ist im Fachgebiet wohlbekannt, und viele davon sind kommerziell erhältlich (siehe z.B. Physicians' Desk Reference (1998), 52. Auflage, Medical Economics Company, Inc.). Zum Beispiel ist Polio-Virus erhältlich von IPOL^® (Pasteur Merieux Connaught) und ORIMUNE^® (Lederle Laboratories), Hepatitis A-Virus als VAQTA^® (Merck), Masern-Virus als ATTENUVAX^® (Merck), Mumps-Virus als MUMPSVAX^® (Merck) und Röteln-Virus als MERUVAX^®II (Merck). Außerdem können abgeschwächte und inaktivierte Viren, wie HIV-1, HIV-2, Herpes simplex-Virus, Hepatitis B-Virus, Rotavirus, humanes und nicht-humanes Papilliomavirus und "slow brain"-Viren können Peptidantigene bereitstellen.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Antigen einen viralen Vektor, wie etwa Vacciniavirus, Adenovirus und Kanarienpockenvirus.
Antigene können aus ihrer Quelle unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken isoliert werden oder können, in bequemerer Weise, unter Anwendung rekombinanter Methoden produziert werden.
Zu antigenen Peptiden können gereinigte native Peptide, synthetische Peptide, rekombinante Proteine, Rohproteinextrakte, abgeschwächte oder inaktivierte Viren, Zellen, Mikroorganismen oder Fragmente solcher Peptide zählen. Immunmodulatorische Peptide können nativ oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert sein. Jede im Fachgebiet bekannte Methode der chemischen Synthese ist geeignet. Die Lösungsphasen-Peptidsynthese kann zur Konstruktion von Peptiden einer moderaten Größe angewendet werden, und die Festphasensynthese kann für die chemische Konstruktion von Peptiden angewendet werden. Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839. Proteolytische Enzyme können auch zur Kopplung von Aminosäuren zum Erhalt der Peptide verwendet werden. Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. Alternativ kann das Peptid unter Einsatz der biochemischen Maschinerie einer Zelle oder durch Isolierung aus einer biologischen Quelle erhalten werden. Rekombinante DNA-Techniken können für die Produktion von Peptiden angewendet werden. Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Pracfical Approach, IRL Press. Peptide können auch unter Anwendung standardmäßiger Techniken wie der Affinitätschromatographie isoliert werden.
Vorzugsweise sind die Antigene Peptide, Lipide (z.B. Sterole, Fettsäuren und Phospholipide), Polysaccharide, wie etwa die in H. influenza-Impfstoffen verwendeten, Ganglioside und Glykoproteine. Diese können mittels verschiedener, im Fachgebiet bekannter Methoden, einschließlich der Isolierung und Synthese unter Verwendung von chemischen und enzymatischen Methoden, erhalten werden. In bestimmten Fällen, wie etwa für viele Sterole, Fettsäuren und Phospholipide, sind die antigenen Abschnitte der Moleküle kommerziell verfügbar.
Zu Beispielen der viralen Antigene, die bei den vorliegenden Zusammensetzungen und Methoden unter Verwendung der Zusammensetzungen nützlich sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, HIV-Antigene. Zu diesen Antigenen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, solche Antigene, die von HIV-Hüllglykoproteinen abgeleitet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf gp160, gp120 und gp41. Zahlreiche Sequenzen für HIV-Gene und -Antigene sind bekannt. Zum Beispiel sammelt, verwaltet und notiert die Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database HIV-Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen. Diese Datenbank ist über das Internet unter http://hiv-web.lanl.gov/ und in einer jährlichen Veröffentlichung zugänglich, siehe Human Retroviruses and AIDS Compendium (zum Beispiel Ausgabe von 1998).
Von infektiösen Agenzien abgeleitete Antigene können unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden, zum Beispiel von nativen viralen oder bakteriellen Extrakten, aus Zellen, die mit dem infektiösen Agens infiziert sind, aus gereinigten Polypeptiden, aus rekombinant produzierten Polypeptiden und/oder als synthetische Peptide erhalten werden.
ISS-Antigen-Koniugation
In den hierin beschriebenen Zusammensetzungen wird das ISS-enthaltende Polynukleotid mit dem Antigen konjugiert. Der ISS-Abschnitt kann mit dem Antigen-Abschnitt eines Konjugats in vielfältigen Weisen gekoppelt werden, einschließlich kovalenter und/oder nicht-kovalenter Interaktionen.
Die Verknüpfung zwischen den Abschnitten kann am 3'- oder 5'-Ende der ISS vorgenommen werden, oder an einer geeignet modifizierten Base an einer internen Position in der ISS. Ist das Antigen ein Peptid und enthält es eine geeignete reaktive Gruppe (z.B. einen N-Hydroxysuccinimidester), so kann es direkt mit der N⁴-Aminogruppe der Cytosin-Reste umgesetzt werden. In Abhängigkeit von der Anzahl und Lokalisation der Cytosin-Reste in der ISS kann eine spezifische Kopplung an einem oder mehreren Resten erzielt werden.
Alternativ können modifizierte Oligonukleoside, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, an jedwedem Terminus oder an internen Positionen in der ISS aufgenommen werden. Diese können blockierte funktionelle Gruppen enthalten, die bei Entblockierung mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen reaktiv sind, die vorhanden sein können oder gebunden sein können am Antigen von Interesse.
Wo das Antigen ein Peptid ist, kann dieser Abschnitt des Konjugats an das 3'-Ende der ISS durch Festträgerchemie gebunden sein. Zum Beispiel kann der ISS-Abschnitt an einen Polypeptid-Abschnitt addiert werden, der an einem Träger vorsynthetisiert worden ist. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; und Haralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505. Alternativ kann die ISS so synthetisiert werden, dass sie an einen festen Träger durch einen spaltbaren Linker geknüpft ist, der sich von dem 3'-Ende erstreckt. Auf die chemische Spaltung der ISS vom Träger hin bleibt eine terminale Thiolgruppe am 3'-Ende des Oligonukleotids zurück (Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; und Corey et al. (1987) Science 238:1401-1403) oder eine terminate Aminogruppe bleibt am 3'-Ende des Oligonukleotids zurück (Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794). Die Konjugation der Amino-modifizierten ISS an Aminogruppen des Peptids kann vorgenommen werden, wie beschrieben bei Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72. Die Konjugation der Thiol-modifizierten ISS an Carboxylgruppen des Peptids kann vorgenommen werden, wie beschrieben bei Sinha et al. (1991), S. 185-210, Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Die Kopplung eines Oligonukleotids, das ein anhängendes Maleimid trägt, an die Thiol-Seitenkette eines Cystein-Rests eines Peptids ist ebenfalls beschrieben worden. Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem.2:464-465.
Der Peptidabschnitt des Konjugats kann an das 5'-Ende der ISS durch eine Amin-, Thiol- oder Carboxylgruppe gebunden werden, die in das Oligonukleotid während seiner Synthese eingebaut worden ist. Vorzugsweise wird, solange das Oligonukleotid an dem festen Träger fixiert ist, eine Linkergruppe, umfassend ein geschütztes Amin, Thiol oder Carboxyl an einem Ende, und ein Phosphoramidit am anderen, kovalent an das 5'-Hydroxyl gebunden. Agrawal et a.l. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; und US-Patent Nrn. 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800 und 5.118.802. Nach der Schutzentfernung können die Amin-, Thiol- und Carboxyl-Funktionalitäten zur kovalenten Bindung des Oligonukleotids an ein Peptid verwendet werden. Benoit et al. (1987) und Sinha et al. (1991).
Ein ISS-Antigen-Konjugat kann ebenfalls durch nicht-kovalente Interaktionen gebildet werden, wie etwa ionische Bindungen, hydrophobe Interaktionen, Wasserstoffbindungen und/oder van der Waalsche Anziehungskräfte.
Nicht-kovalent verknüpfte Konjugate können eine nicht-kovalente Interaktion, wie etwa einen Biotin-Streptavidin-Komplex, enthalten. Eine Biotinylgruppe kann zum Beispiel an eine modifizierte Base einer ISS gebunden sein. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. Die Aufnahme einer Streptavidin-Komponente in den Peptidabschnitt erlaubt die Bildung eines nicht-kovalent gebundenen Komplexes des Streptavidin-konjugierten Peptids und des biotinylierten Oligonukleotids.
Nicht-kovalente Assoziationen können auch durch ionische Interaktionen unter Einbeziehung einer ISS und von Resten innerhalb des Antigens, wie etwa geladene Aminosäuren, oder durch die Verwendung eines Linkerabschnitts, umfassend geladene Reste, die sowohl mit dem Oligonoukleotid als auch dem Antigen interagieren können, erfolgen. Zum Beispiel kann die nicht-kovalente Konjugation zwischen einer generell negativ geladenen ISS und positiv geladenen Aminosäureresten eines Peptids, z.B. Polylysin-, Polyarginin- und Polyhistidin-Resten, erfolgen.
Die nicht-kovalente Konjugation zwischen ISS und Antigenen kann durch DNA-Bindungsmotive von Molekülen erfolgen, die mit DNA als ihren natürlichen Liganden interagieren. Zum Beispiel können diese DNA-Bindungsmotive in Transkriptionsfaktoren und Anti-DNA-Antikörpern gefunden werden.
Die Knüpfung der ISS an ein Lipid kann unter Anwendung standardmäßiger Methoden vorgenommen werden. Zu diesen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Phospholipid-Konjugaten (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), Oligonukleotid-Fettsäure-Konjugaten (Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; und Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222) und Oligonukleotid-Sterol-Konjugaten. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
Die Knüpfung des Oligonukleotids an ein Oligosaccharid kann unter Anwendung standardmäßiger bekannter Methoden erzeugt werden. Zu diesen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Synthese von Oligonukleotid-Oligosaccharid-Konjugaten, worin das Oligosaccharid eine Komponente eines Immunglobulins ist. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.
Die Knüpfung einer zirkulären ISS an ein Peptid oder Antigen kann in mehreren Weisen erfolgen. Wo die zirkuläre ISS unter Anwendung rekombinanter oder chemischer Methoden synthetisiert wird, ist ein modifiziertes Nukleosid geeignet. Ruth (1991), S. 255-282, in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. Daraufhin kann eine standardmäßige Verknüpfungstechnologie angewendet werden, um die zirkuläre ISS mit dem Antigen oder anderen Peptid zu verbinden.
Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1:165. Wo die zirkuläre ISS isoliert oder unter Anwendung rekombinanter oder chemischer Methoden synthetisiert wird, kann die Verknüpfung durch chemische Aktivierung, oder Photoaktivierung, einer reaktiven Gruppe (z.B. Carben, Radikal) gebildet werden, die in das Antigen oder andere Peptid eingebaut worden ist.
Zusätzliche Methoden für die Bindung von Peptiden und anderen Molekülen an Oligonukleotide können gefunden werden in US-Patent Nr. 5.391.723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids", in Kricka (Hrsg.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; und Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146.
Zusammensetzungen und Kits, die die Konjugat-Populationen umfassen
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits und Zusammensetzungen bereit, wie etwa pharmazeutische Formulierungen, die irgendeine der hierin beschriebenen Konjugat-Populationen umfassen.
Die Kits der Erfindung umfassen irgendeine der hierin beschriebenen Konjugat-Populationen in einer geeigneten Verpackung. Die Kits der Erfindung können wahlweise Anleitungen zu deren Anwendung enthalten (zum Beispiel Anleitungen für eine der hierin beschriebenen Methoden) und/oder jegliche anderen geeigneten Komponenten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung, die besonders nützlich zur Verabreichung an ein Individuum sind, das einer Immunmodulation (im Zusammenhang beispielsweise mit einer Infektionskrankheit, Krebs und Allergie) bedarf, umfassen allgemein irgendeine der hierin beschriebenen Konjugat-Populationen in einer ausreichenden Menge, um eine Immunantwort zu modulieren.
Generell umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise auch einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und können in verschiedenen Formulierungen vorliegen. Wie im Fachgebiet wohlbekannt, ist ein pharmazeutisch akzeptabler Exzipient eine relativ träge Substanz, die die Verabreichung einer pharmako logisch wirksamen Substanz erleichtert. Beispielsweise kann ein Exzipient Form oder Konsistenz verleihen oder als ein Verdünnungsmittel dienen. Zu geeigneten Exzipienten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Stabilisatoren, Benetzungs- und Emulgiermittel, Salze für eine variierende Osmolarität, Verkapselungsmittel, Puffer und Hautpenetrations-verbessernde Mittel. Exzipienten, als auch Formulierungen für die parenterale und nicht-parenterale Wirkstoffverabreichung, sind angegeben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Auflage, Mack Publishing (1995).
Zu weiteren Formulierungen, einschließlich im Fachgebiet bekannter geeigneter Darreichungsformen, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Träger, wie etwa Liposome. Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Zu liposomalen Präparierungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Cytofectine, multilamellare Vesikel und unilamellare Vesikel.
Allgemein werden diese Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Injektion (z.B. intraperitoneal, intravenös, subkutan, intramuskulär etc.) formuliert. Demgemäß werden diese Zusammensetzungen vorzugsweise mit pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln kombiniert, wie etwa Saline, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und ähnliches. Das spezielle Dosierungsschema, d.h. Dosis, Zeitvorgabe und Wiederholung, wird vom jeweiligen Individuum und der medizinischen Geschichte dieses Individuums abhängen.
Andere Formulierungen enthalten im Fachgebiet bekannte Darreichungsformen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Träger, wie etwa Liposome, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Zu liposomalen Präparierungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Cytofectine, multilamellare Vesikel und unilamellare Vesikel.
Bei einigen Ausführungsformen kann mehr als ein Antigen in einer Zusammensetzung vorhanden sein. Solche Zusammensetzungen können wenigstens ein, wenigstens zwei, wenigstens drei, wenigstens vier, wenigstens fünf verschiedene Antigene enthalten. Solche "Cocktails", wie sie oftmals im Fachgebiet bezeichnet werden, können besonders nützlich für die Behandlung von Individuen sein, die beispielsweise allergisch gegen mehr als ein Allergen sind.
Die Erfindung umfasst auch eine Formulierung zur Verwendung in der Allergie-Immuntherapie, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und eine Population von Konjugat-Molekülen, welche Konjugat-Moleküle ein Antigen umfassen, welches ein Allergen ist, und ein oder mehrere ISS-enthaltende Polynukleotide, wobei die Population die Histaminfreisetzung aus Basophilen von einem Individuum, das gegen das Antigen sensibilisiert ist, unterdrückt, verglichen zur Histaminfreisetzung, die durch das Antigen induziert ist. Der Umfang der Unterdrückung der Histaminfreisetzung kann jeder hierin beschriebene sein. Bei einigen Ausführungsformen ist das Allergen Amb a 1.
Allgemein wird die Wirksamkeit der Verabreichung jeder dieser Zusammensetzungen durch Messen jeglicher Veränderung in der hierin beschriebenen Immunantwort, oder anderer klinischer Parameter, eingestellt.
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die irgendeine der hierin beschriebenen ISS-Antigen-Konjugat-Population und ein Adjuvans umfasst, wobei auf die gemeinsame Verabreichung hin die Assoziierung von ISS-Antigen und Adjuvans darin wirksam ist, eine Immunantwort zu verstärken, im Vergleich zu der Co-Verabreichung des ISS-Antigens ohne das Adjuvans. Bei solchen Zusammensetzungen wird das Adjuvans in Assoziation mit dem ISS-Antigen gehalten, um Zielzellen für das ISS-Antigen zu rekrutieren und zu aktivieren. Zu Zielen des ISS-Antigen-Konjugats zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Lymphozyten, lymphatische Strukturen, wie etwa Lymphknoten und/oder die Milz, und nicht-lymphatische Strukturen, insbesondere solche, in denen dendritische Zellen gefunden werden, wie etwa Haut, Lungen und/oder Magendarmtrakt.
Bei einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend ISS-Antigen-Konjugat-Populationen, wie hierin beschrieben, und ein Adjuvans, wobei ISS/Antigen/Adjuvans gemeinsam verabreicht werden. Vorzugsweise enthält die immunogene Zusammensetzung eine Menge eines Adjuvans, die ausreicht, um die Immunantwort auf das Immunogen zu potenzieren. Adjuvanzien sind im Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Alaun (Aluminiumsalze), Liposome und Mikropartikel, einschließlich, doch nicht beschränkt auf, Polystyrol, Stärke, Polyphosphazen und Polylactid/Polyglykoside. Zu weiteren geeigneten Adjuvanzien zählen außerdem, ohne darauf beschränkt zu sein, MF59, DETOX^TM (Ribi), Squalen-Gemische (SAF-1), Muramylpeptid, Saponin-Derivate, mycobakterielle Zellwandpräparate, Monophosphoryl-Lipid A, Mycolinsäure-Derivate, nicht-ionische Blockcopolymer-grenzflächenaktive Mittel, Quil A, Choleratoxin B-Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate, und immunstimulatorische Komplexe (ISCOMs), wie etwa die von Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875 beschriebenen, als auch auf Lipid basierende Adjuvanzien und andere hierin beschriebene. Für die veterinärmedizinische Verwendung und für die Produktion von Antikörpern in Tieren können mitogene Komponenten von Freund-Adjuvans (sowohl komplettes als auch inkomplettes) verwendet werden. Bei einigen Ausführungsformen kann das ISS-Antigen-Konjugat mit einem Adjuvans durch kovalente und/oder nicht-kovalente Interaktionen assoziiert werden. Zu einem Beispiel solcher nicht-kovalenter Interaktionen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Adsorption der ISS und des Antigens an hierin beschriebene Mikropartikel.
Bei einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen ISS-Antigen-Populationen in Verbindung mit ein oder mehreren immunmodulatorischen Faszilitatoren verabreicht werden. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend ISS-Antigen-Konjugat-Populationen und einen immunmodulatorischen Faszilitator. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "immunmodulatorischer Faszilitator" auf Moleküle, die die immunmodulatorische Aktivität einer ISS fördern und/oder verstärken. Zu Beispielen von immunmodulatorischen Faszilitatoren können costimulatorische Moleküle, wie etwa Zytokine, und/oder Adjuvanzien zählen. Die Assoziation der ISS und der Faszilitator-Moleküle in einem ISS-Faszilitator-Konjugat kann durch kovalente Wechselwirkungen und/oder durch nicht-kovalente Wechselwirkungen erfolgen, einschließlich von Hochaffinitäts- und/oder Niederaffinitäts-Interaktionen. Beispiele für nicht-kovalente Interaktionen, die eine ISS und einen Faszilitator in einem ISS-Faszilitator-Konjugat koppeln können, umfassen, ohne dar auf beschränkt zu sein, Ionenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbindungen und van der Waalsche Anziehungskräfte.
Zu immunmodulatorischen Faszilitatoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, costimulatorische Moleküle (wie etwa Zytokine, Chemikine, Targeting-Proteinligand, transaktivierende Faktoren, Peptide, und Peptide, die eine modifizierte Aminosäure umfassen) und Adjuvanzien (wie etwa Alaun, Lipidemulsionen und Polylactid/Polyglykolid-Mikropartikel).
Zu geeigneten immunmodulatorischen Zytokin-Peptiden für die Verabreichung mit ISS zählen die Interleukine (z.B. IL-1, IL-2, IL-3, etc.), Interferone (z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ), Eryhtropoietin, Kolonie-stimulierende Faktoren (z.B. G-CSF, M-CSF, GM-CSF) und TNF-α. Vorzugsweise sind immunstimulatorische Peptide zur Verwendung in Verbindung mit ISS-Oligonukleotiden solche, die Immunantworten vom Th1-Typ stimulieren, wie etwa IL-12 (Bliss et al. (1996) J. Imunol. 156:887-894), IL-18, TNF-α, β und γ und/oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF)-α.
Mit ISS verabreichte Peptide können auch Aminosäuresequenzen umfassen, die die Proteinbindung an einen spezifischen Rezeptor vermitteln oder die das Targeting auf einen spezifischen Zelltyp oder Gewebe vermitteln. Zu Beispielen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper oder Antikörperfragmente, Peptidhormone, wie etwa humanes Wachstumshormon, und Enzyme. Zu immunmodulatorischen Peptiden zählen auch Peptidhormone, Peptidneurotransmitter und Peptidwachstumsfaktoren. Costimulatorische Moleküle, wie B7 (CD80), transaktivierende Proteine, wie Transkriptionsfaktoren, Chemokine, wie Makrophagen-chemotaktisches Protein (MCP) und andere Chemoattraktanzien oder chemotaktische Peptide stellen ebenfalls nützliche Peptide für die Verabreichung mit ISS dar.
Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die ein ISS-Antigen-Konjugat in Verbindung mit kolloidalen Dispersionssystemen umfassen, wie etwa Mikrokügelchen, Beads, makromolekulare Komplexe, Nanokapseln und Lipidbasierte Systeme, wie etwa Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposome. Kolloidale Dispersionssysteme können eine wirksame Verkapselung von ISS-enthaltenden Zusammensetzungen bieten.
Die Verkapselungs-Zusammensetzung umfasst außerdem jegliche aus einer breiten Vielfalt von Komponenten. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Alaun, Lipide, Phospholipide, Lipidmembranstrukturen (LMS), Polyethylenglykol (PEG) und weitere Polymere, wie etwa Polypeptide, Glykopeptide und Polysaccharide.
Für die Verkapselungs-Komponenten geeignete Polypeptide umfassen jegliche im Fachgebiet bekannte und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Fettsäurebindende Proteine. Modifizierte Polypeptide enthalten jegliche aus einer Vielfalt von Modifikationen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Glykosylierung, Phosphorylierung, Myristylierung, Sulfierung und Hydroxylierung. Wie hierin verwendet, ist ein geeignetes Polypeptid ein solches, das eine ISS-enthaltende Zusammensetzung schützen wird, um seine immunmodulatorische Aktivität zu konservieren. Zu Beispielen der Bindungsproteine zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Albumine, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA) und Erbsenalbumin.
Weitere geeignete Polymere können jegliche im Fachgebiet der Pharmazeutika bekannte sein und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, natürlich vorkommende Polymere, wie etwa Dextrane, Hydroxyethyl-Stärke, Polysaccharide und synthetische Polymere. Zu Beispielen der natürlich vorkommenden Polymere zählen Proteine, Glykopeptide, Polysaccharide, Dextran und Lipide. Das zusätzliche Polymer kann ein synthetisches Polymer sein. Zu Beispielen der synthetischen Polymere, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyalkylglykole (PAG), wie etwa PEG, polyoxyethylierte Polyole (POP), wie etwa polyoxyethyliertes Glycerol (POG), Polytrimethylenglykol (PTG), Polypropylenglykol (PPG), Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyvinylalkohol (PVA), Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyaminosäuren, Polyurethan und Polyphosphazen. Die synthetischen Polymere können außerdem linear oder verzweigt, substituiert oder unsubstituiert, ein Homopolymer, Copolymere oder Blockcopolymere aus zwei oder mehreren unterschiedlichen synthetischen Monomeren sein.
Die PEGs zur Verwendung in den Verkapselungs-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden entweder von chemischen Zulieferern bezogen oder unter Anwendung von Techniken synthetisiert, die den Fachleuten des Gebiets bekannt sind.
Der Begriff "LMS", wie hierin verwendet, meint lamellare Lipidpartikel, worin polare Kopfgruppen eines polaren Lipids so angeordnet sind, dass sie einer wässrigen Phase an einer Grenzfläche zugewandt sind, um so Membranstrukturen zu bilden. Zu Beispielen der LMS zählen Liposome, Mizellen, Cochleate (d.h. im Allgemeinen zylindrische Liposome), Mikroemulsionen, unilamellare Vesikel, multilamellare Vesikel und ähnliches.
Ein bevorzugtes kolloidales Dispersionssystem dieser Erfindung ist ein Liposom. Bei Mäusen, die mit einem Liposom-verkapselten Antigen immunisiert sind, scheinen Liposome eine Immunantwort vom Th1-Typ auf das Antigen zu verstärken. Aramaki et al. (1995) Vaccine 13:1809-1814. Wie hierin verwendet, ist ein "Liposom" oder "Lipidvesikel" ein kleines Vesikel, das durch wenigstens eine und möglicherweise mehr als eine zweischichtige Lipidmembran gebunden ist. Liposome werden künstlich aus Phospholipiden, Glykolipiden, Lipiden, Steroiden, wie etwa Cholesterol, verwandten Molekülen oder einer Kombination davon mittels einer im Fachgebiet bekannten Technik hergestellt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Beschallung, Extrusion oder Entfernung von Detergens von Lipid-Detergens-Komplexen. Ein Liposom kann wahlweise auch zusätzliche Komponenten umfassen, wie etwa eine Gewebe-anzielende Komponente. Es ist selbstverständlich, dass eine "Lipidmembran" oder "Lipid-Doppelschicht" nicht ausschließlich aus Lipiden zu bestehen braucht, sondern zusätzlich jegliche weiteren geeigneten Komponenten enthalten kann, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Cholesterol und andere Steroide, Lipid-lösliche Chemikalien, Proteine einer beliebigen Länge und andere amphipathische Moleküle, vorausgesetzt, dass die allgemeine Struktur der Membran eine Schicht aus zwei hydrophilen Oberflächen ist, die einen hydrophoben Kern umfangen. Für eine allgemeine Erörterung der Membranstruktur, siehe The Encyclopedia of Molecular Biology von J. Kendrew (1994). Für geeignete Lipide, siehe z.B. Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications", Elsevier, Amsterdam.
Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die ISS-enthaltende Zusammensetzungen umfassen, sind im Fachgebiet bekannt. Die Lipidvesikel können mittels jeglicher geeigneten Technik hergestellt werden, die in Fachgebiet bekannt ist. Zu den Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Mikroverkapselung, Mikrofluidisierung, LLC-Methode, Ethanolinjektion, Freaninjektion, die "Blasen"-Methode, Detergens-Dialyse, Hydrierung, Beschallung und Umkehrphasen-Verdampfung. Ein Überblick ist wiedergegeben bei Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68:715-724. Die Techniken können kombiniert werden, um Vesikel mit den erwünschtesten Attributen zu erhalten.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von LMS, die Gewebe- oder Zell-anzielende Komponenten enthalten. Solche anzielende Komponenten sind Komponenten einer LMS, die seine Anhäufung an bestimmten Gewebe- oder zellulären Stellen bevorzugt vor anderen Gewebe- oder zellulären Stellen bei Verabreichung an ein intaktes Tier, Organ oder Zellkultur verstärkt. Eine anzielende Komponente ist allgemein von außerhalb des Liposoms zugänglich und ist daher vorzugsweise entweder an die äußere Oberfläche gebunden oder in die äußere Lipid-Doppelschicht eingeführt. Eine anzielende Komponente kann unter anderem ein Peptid, eine Region eines größeren Peptids, ein für ein Zelloberflächenmolekül oder Marker spezifischer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, eine Nukleinsäure, ein Kohlehydrat, eine Region eines komplexen Kohlehydrats, ein spezielles Lipid oder ein kleines Molekül, wie etwa ein Wirkstoff, Hormon oder Hapten, in Bindung an irgendeines der zuvor genannten Moleküle sein. Antikörper mit Spezifität gegenüber Zelltypspezifischen Zelloberflächenmarkern sind im Fachgebiet bekannt und lassen sich mittels der im Fachgebiet bekannten Methoden ohne weiteres herstellen.
Die LMS können auf jeglichen Zelltyp gezielt werden, auf den eine therapeutische Behandlung gerichtet werden soll, z.B. einen Zelltyp, der eine Immunantwort modulieren und/oder daran teilnehmen kann. Zu solchen Zielzellen und Organen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, APCs, wie etwa Makrophagen, dendritische Zellen und Lymphozyten, lymphatische Strukturen, wie etwa Lymphknoten und die Milz, und nicht-lymphatische Strukturen, insbesondere solche, in denen dendritische Zellen zu finden sind.
Die LMS-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können außerdem grenzflächenaktive Mittel umfassen. Grenzflächenaktive Mittel können kationisch, anionisch, amphiphil oder nicht-ionisch sein. Eine bevorzugte Klasse von grenzflächenaktiven Mitteln sind nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel; besonders bevorzugt sind solche, die wasserlöslich sind.
Verabreichung und Auswertung der Immunreaktion
Das ISS-enthaltende Polynukleotid-Antigen-Konjugat kann in Kombination mit anderen pharmazeutischen und/oder immunogenen und/oder immunstimulatorischen Agenzien verabreicht werden und kann mit einem physiologisch akzeptablen Träger dafür kombiniert werden.
Das ISS-enthaltende Polynukleotid kann irgendeines der oben beschriebenen sein. Wie in SEQ ID NO: 1 angegeben, umfasst das verabreichte ISS-enthaltende Polynukleotid vorzugsweise die Sequenz 5'-T, C, G-3'. Vorzugsweise umfasst das verabreichte ISS-enthaltende Polynukleotid die Formel 5' Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin, C, G-3'; bevorzugter 5'-A, A, C, G, T, T, C, G-3'. Eine andere bevorzugte Ausführungsform verwendet die SEQ ID NO: 1.
Wie mit allen immunogenen Zusammensetzungen, können die immunologisch wirksamen Mengen und die Verabreichungsmethode der jeweiligen ISS-Antigen-Formulierung ausgehend von dem Individuum, der zu behandelnden Bedingung und weiteren Faktoren, die einem Fachmann des Gebiets offensichtlich sind, variieren. Zu den zu erwägenden Faktoren zählen die Antigenität, ob ein ISS-Antigen-Konjugat komplexiert wird mit oder kovalent gebunden wird an ein Adjuvans oder Transfermolekül oder nicht, der Verabreichungsweg und die Anzahl der zu verabreichenden Immunisierungsdosen. Solche Faktoren sind im Fachgebiet bekannt, und es befindet sich durchaus innerhalb der Sachkenntnis von Immunologen, solche Bestimmungen ohne unnötiges Experimentieren vorzunehmen. Ein geeigneter Dosierungsbereich ist ein solcher, der die gewünschte Modulation der Immunantwort auf das Antigen liefert. Generell kann ein Dosierungsbereich der ISS-Antigen-Zusammensetzung zum Beispiel etwa einer der folgenden sein: 0,1 bis 100 μg, 0,1 bis 50 μg, 0,1 bis 25 μg, 0,1 bis 10 μg, 1 bis 500 μg, 100 bis 400 μg, 200 bis 300 μg, 1 bis 100 μg, 100 bis 200 μg, 300 bis 400 μg, 400 bis 500 μg. Alternativ können die Dosen etwa eine der folgenden sein: 0,1 μg, 0,25 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg, 5,0 μg, 10 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg. Demgemäß können die Dosisbereiche solche sein, deren Untergrenze etwa eine der folgenden ist: 0,1 μg, 0,25 μg; 0,5 μg und 1,0 μg; und deren Obergrenze etwa eine der folgenden ist: 25 μg, 50 μg und 100 μg. Bei diesen Zusammensetzungen kann das molare Verhältnis von ISS-enthaltendem Polynukleotid zu Antigen variieren. Die jedem Patienten verabreichte Absolutmenge hängt von pharmakologischen Eigenschaften, wie der Bioverfügbarkeit, Ausscheidungsrate und dem Verabreichungsweg, ab.
Die wirksame Menge und Verabreichungsmethode der jeweiligen ISS-Antigen-Formulierung kann ausgehend von dem individuellen Patienten und dem Stadium der Erkrankung und weiteren Faktoren, die einem Fachmann des Gebiets offensichtlich sind, variieren. Der/die bei einer bestimmten Anwendung nützliche(n) Verabreichungsweg(e) ist/sind für einen Fachmann des Gebiets erkennbar. Zu Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, der topische, dermale, transdermale, transmukosale, epidermale, parenterale, gastrointestinale, und nasopharingeale und pulmonale, einschließlich transbronchiale und transalveolare. Ein geeigneter Dosierungsbereich ist ein solcher, der eine Zusammensetzung liefert, die ausreichend ISS enthält, um eine Gewebekonzentration von etwa 1 – 10 μM zu erzielen, wie anhand der Blutspiegel gemessen. Die jedem Patienten gegebene Absolutmenge hängt von pharmakologischen Eigenschaften wie der Bioverfügbarkeit, Ausscheidungsrate und dem Verabreichungsweg ab.
Wie hierin beschrieben, sind APCs und Gewebe mit einer hohen Konzentration an APCs die bevorzugten Ziele für die ISS- und Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen. Somit ist die Verabreichung von ISS und Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen an Säugerhaut und/oder -schleimhaut, worin APCs in relativ hoher Konzentration vorhanden sind, bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung stellt ISS-Antigen-enthaltende Zusammensetzungen bereit, die für die topische Anwendung geeignet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf physiologisch akzeptable Implantate, Salben, Cremes, Spülungen und Gele. Die topische Verabreichung erfolgt beispielsweise durch einen Verband oder eine Bandage, worin ein Transportsystem dispergiert ist, oder durch direkte Aufbringung eines Verabreichungssystems in Einschnitte oder offene Wunden. Cremes, Spülungen, Gele oder Salben, worin eine ISS/Antigen-enthaltende Zusammensetzung dispergiert ist, sind zur Verwendung als topische Salben oder Wundfüllmittel geeignet.
Bevorzugte Wege der dermalen Verabreichung sind solche, die am wenigstens invasiv sind. Bevorzugt unter diesen Methoden sind die transdermale Übertragung, epidermale Aufbringung und subkutane Injektion. Von diesen Methoden ist die epidermale Verabreichung aufgrund der größeren Konzentrationen an APCs, die im intradermalen Gewebe zu erwarten sind, bevorzugt.
Die transdermale Verabreichung wird durch Auftrag einer Creme, Spülung, Gel etc. erreicht, die dazu in der Lage ist, die ISS/Antigen-enthaltende Zusammensetzung durch die Haut dringen und in den Blutstrom eintreten zu lassen. Zu für die transdermale Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch akzeptable Suspensionen, Öle, Cremes und Salben, die direkt auf die Haut aufgetragen oder in einen schützenden Träger aufgenommen werden, wie etwa ein transdermales Element (sogenanntes "Patch"). Beispiele geeigneter Cremes, Salben etc. können zum Beispiel in der Physician's Desk Reference gefunden werden.
Für die transdermale Übertragung stellt die Iontophorese eine geeignete Methode dar. Die iontophoretische Übertragung kann unter Verwendung handelsüblicher Patches erreicht werden, die ihr Produkt kontinuierlich durch die unverletzte Haut für Zeiträume von mehreren Tagen oder mehr verabreichen. Die Anwendung dieser Methode erlaubt eine kontrollierte Übertragung der pharmazeutischen Zusammenset zungen in relativ hohen Konzentrationen, erlaubt die Infusion von Kombinationswirkstoffen und erlaubt die gleichzeitige Verwendung eines Absorptionsförderers.
Ein Beispiel für ein Patch-Produkt zur Verwendung bei dieser Methode ist das Produkt mit dem Markennamen LECTRO PATCH von General Medical Company of Los Angeles, CA. Dieses Produkt hält Speicherelektroden elektronisch auf einen neutralen pH-Wert und kann so angepasst werden, dass es Dosierungen mit unterschiedlichen Konzentrationen bei kontinuierlicher und/oder periodischer Dosierung abgibt. Die Vorbereitung und Anwendung des Patch sollte gemäß den abgedruckten Anleitungen des Herstellers, die dem LECTRO PATCH-Produkt beiliegen, vorgenommen werden; diese Anleitungen sind hierin durch diese Bezugnahme mitaufgenommen. Andere okklusive Patchsysteme sind ebenfalls geeignet.
Für die transdermale Übertragung stellt der niederfrequente Ultraschall-Transfer ebenfalls eine geeignete Methode dar. Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. Die Anwendung von niederfrequenten Ultraschallfrequenzen (etwa 1 MHz) erlaubt die allgemeine kontrollierte Darreichung therapeutischer Zusammensetzungen, einschließlich solcher von hohem Molekulargewicht.
Die epidermale Verabreichung bezieht im Wesentlichen eine mechanische oder chemische Reizung der äußersten Schicht der Epidermis in ausreichendem Maße ein, um eine Immunantwort gegen den Reizstoff zu provozieren. Spezifisch sollte die Reizung eine ausreichende sein, um APCs an die Stelle der Reizung zu locken.
Ein Beispiel einer mechanischen Reizmethode verwendet eine Vielzahl kurzer Zacken von sehr kleinem Durchmesser, die zur Reizung der Haut und zum Anziehen der APCs an die Stelle der Reizung verwendet werden können, um ISS/Antigenenthaltende Zusammensetzungen aufzunehmen, die von dem Ende der Zacken übertragen werden. Zum Beispiel enthält der MONO-VACC-Alttuberkulintest, der von Pasteur Merieux in Lyon, Frankreich, hergestellt wird, ein Element, das für die Einführung der ISS/Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen geeignet ist.
Die Vorrichtung (das in den USA durch Connaught Laboratories, Inc. in Swiftwater, PA vertrieben wird) besteht aus einem Kunststoffbehälter mit einem Spritzentaucher an einem Ende und einer Zackenscheibe an dem anderen. Die Zackenscheibe trägt eine Vielzahl von Zacken mit engem Durchmesser einer Länge, die die äußerste Schicht der epidermalen Zellen gerade eben einritzen wird. Jede der Zacken im MONO-VACC-Kit ist mit Alttuberkulin beschichtet; bei der vorliegenden Erfindung ist jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung der ISS/Antigenenthaltenden Zusammensetzung beschichtet. Die Anwendung der Vorrichtung erfolgt vorzugsweise gemäß den schriftlichen Anleitungen des Herstellers, die dem Vorrichtungsprodukt beigefügt sind. Ähnliche Elemente, die ebenfalls bei dieser Ausführungsform verwendet werden können, sind solche, die derzeit zur Durchführung von Allergietests verwendet werden.
Ein anderer geeigneter Ansatz für die epidermale Verabreichung von ISS besteht in der Verwendung einer Chemikalie, die die äußersten Zellen der Epidermis reizt und dadurch eine ausreichende Immunreaktion provoziert, um APCs an die Fläche zu locken. Ein Beispiel stellt ein keratinolytisches Agens dar, wie etwa die in der handelsüblichen topischen Enthaarungscreme, die von Noxema Corporation unter dem Handelsnamen NAIR vertrieben wird, verwendete Salicylsäure. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um eine epitheliale Verabreichung in die Schleimhaut zu erzielen. Der chemische Reizstoff kann auch in Verbindung mit dem mechanischen Reizelement angewendet werden (wie es beispielsweise der Fall wäre, wenn die Zacken vom MONO-VACC-Typ außerdem mit dem chemischen Reizstoff beschichtet wären). Die ISS kann in einem Träger suspendiert werden, der außerdem den chemischen Reizstoff enthält, oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden.
Eine andere Darreichungsmethode zur Verabreichung der ISS/Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen wendet Nicht-Lipid-Polymere an, wie etwa ein synthetisches polykationisches Aminopolymer. Leff (1997) Bioworld 86:1-2.
Zu parenteralen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die elektrische (iontophoretische) oder direkte Injektion, wie etwa eine direkte Injektion in eine Zentralvenenleitung, eine intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intra dermale oder subkutane Injektion. Zu für die parenterale Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, pharmazeutisch akzeptable sterile isotonische Lösungen. Zu solchen Lösungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Saline und Phosphat-gepufferte Saline für die Injektion der ISS-enthaltenen Zusammensetzungen.
Zu gastrointestinalen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Ingestion und der rektale. Die Erfindung umfasst ISS/Antigen-enthaltende Zusammensetzungen, die für die gastrointestinale Verabreichung geeignet sind, einschließlich, doch nicht beschränkt auf pharmazeutisch akzeptable Pulver, Pillen oder Flüssigkeiten für die Ingestion und Suppositorien für die rektale Verabreichung.
Zu nasopharyngealen und pulmonalen Verabreichungswegen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Inhalation, transbronchiale und transalveolare Wege. Die Erfindung umfasst ISS/Antigen-enthaltende Zusammensetzungen, die für die Verabreichung durch Inhalation geeignet sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf verschiedene Typen von Aerosolen für die Inhalation, als auch Pulverformen für Darreichungssysteme. Zu den für die Verabreichung durch Inhalation der ISS/-Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen geeigneten Vorrichtungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Atomisatoren und Vaporisatoren. Atomisatoren und Vaporisatoren, die mit den Pulvern befüllt sind, zählen zu einer Vielzahl von Vorrichtungen, die zur Verwendung bei der inhalatorischen Darreichung der Pulver geeignet sind.
Die Methoden zur Produktion geeigneter Vorrichtungen für die Injektion, topische Anwendung, Atomisatoren und Vaporisatoren sind im Fachgebiet bekannt und werden nicht ausführlich beschrieben werden.
Die Wahl der Darreichungswege kann genützt werden, um die hervorgerufene Immunantwort zu modulieren. Zum Beispiel waren die IgG-Titer und CTL-Aktivitäten identisch, wenn ein Influenzavirus-Vektor über intramuskuläre oder epidermale (Genpistole) Wege verabreicht wurde; die muskuläre Einimpfung erbrachte jedoch primär IgG2a, wohingegen der epidermale Weg in erster Linie IgG1 erbrachte. Pert mer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. Somit kann ein Fachmann des Gebiets einen Vorteil aus leichten Unterschieden in der Immunogenität ziehen, die durch die verschiedenen Wege der Verabreichung der immunmodulatorischen Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung hervorgerufen werden.
Die oben genannten Zusammensetzungen und Verabreichungsmethoden sollen die Methoden zur Verabreichung der ISS/Antigen-enthaltenden Zusammensetzungen der Erfindung beschreiben, jedoch nicht beschränken. Die Methoden zur Herstellung der verschiedenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen liegen innerhalb der Sachkenntnisse des Fachgebiets und werden hierin nicht ausführlich beschrieben.
Die Analyse (sowohl qualitativ als auch quantitativ) der Immunantwort auf ISS/-Antigen-enthaltende Zusammensetzungen kann mittels jeglicher, im Fachgebiet bekannter Methode, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Messen der Antigenspezifischen Antikörperproduktion (einschließlich Messen spezifischer Antikörper-Subklassen), Aktivieren spezifischer Populationen an Lymphozyten, wie etwa CD4⁺-T-Zellen oder NK-Zellen, Produzieren von Zytokinen, wie etwa IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 oder IL-12, und/oder Freisetzen von Histamin, erfolgen. Zu Methoden der Messung spezifischer Antikörperreaktionen zählen der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), wobei diese Methoden im Fachgebiet wohlbekannt sind. Die Messung der Zahlen der spezifischen Typen von Lymphozyten, wie etwa CD4⁺-T-Zellen, kann beispielsweise mit der Fluroeszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) erreicht werden. Zytotoxizitäts-Assays können zum Beispiel vorgenommen werden, wie beschrieben bei Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523. Die Serumkonzentrationen der Zytokine können zum Beispiel mittels ELISA gemessen werden. Diese und weitere Assays zur Auswertung der Immunantwort auf ein Immunogen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell und Shiigi, Hrsg., W. H. Freeman und Co.
Vorzugsweise wird eine Reaktion vom Th1-Typ stimuliert, d.h. ausgelöst und/oder verstärkt. Bezüglich der Erfindung kann die Stimulierung einer Immunantwort vom Th1-Typ in vitro oder ex vivo durch Messen der Zytokin-Produktion von Zellen, die mit ISS behandelt sind, im Vergleich zu solchen, die ohne ISS behandelt sind, be stimmt werden. Methoden zur Bestimmung der Zytokin-Produktion von Zellen umfassen solche Methoden, wie sie hierin beschrieben sind, und jegliche im Fachgebiet bekannte Methoden. Der Typ der als Reaktion auf die ISS-Behandlung produzierten Zytokine zeigt eine Immunreaktion durch die Zellen mit einer Neigung zum Th1-Typ oder Th2-Typ an. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung Zytokin-Produktion "mit Neigung zum Th1-Typ" auf die messbare erhöhte Produktion von Zytokinen, die mit einer Immunreaktion vom Th1-Typ assoziiert ist, in Gegenwart eines Stimulators, im Vergleich zur Produktion solcher Zytokine in Abwesenheit der Stimulation. Beispiele solcher Zytokine mit Neigung zum Th1-Typ umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, IL-2, IL-12 und IFN-γ. Im Gegensatz dazu bezieht sich "Zytokine mit Neigung zum Th2-Typ" auf solche in Verbindung mit einer Immunreaktion vom Th2-Typ, zu denen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, IL-4, IL-5 und IL-13. Zu Zellen, die für die Bestimmung der ISS-Aktivität nützlich sind, zählen Zellen des Immunsystems, Primärzellen, die aus einem Wirt und/oder Zelllinien isoliert sind, vorzugsweise APCs und Lymphozyten, sogar noch bevorzugter Makrophagen und T-Zellen.
Die Stimulierung einer Immunreaktion vom Th1-Typ kann auch in einem Wirt gemessen werden, der mit einer ISS/Antigen-enthaltenden Zusammensetzung behandelt wurde, und kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode bestimmt werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf: (1) eine Reduzierung der Mengen an IL-4 oder IL-5, wie vor und nach der Antigen-Provokation gemessen; oder Detektion geringerer (oder sogar abwesender) Mengen an IL-4 oder IL-5 in einem mit ISS/-Antigen behandelten Wirt im Vergleich zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt wurde; (2) ein Anstieg der Mengen an IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) vor und nach der Antigen-Provokation; oder Detektion höherer Mengen an IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) in einem ISS/Antigen-behandelten Wirt im Vergleich zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt wurde; (3) Antikörperproduktion mit "Neigung zum Th1-Typ" in einem ISS/Antigen-behandelten Wirt im Vergleich zu einer Kontrolle, die ohne ISS behandelt wurde; und/oder (4) eine Verringerung der Mengen an Antigen-spezifischem IgE, wie vor und nach der Antigen-Provokation gemessen; oder Detektion geringerer (oder sogar abwesender) Mengen an Antigen spezifischem IgE in einem ISS/Antigen-behandelten Wirt im Vergleich zu einer Antigen-geprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle, die ohne ISS behandelt wurde. Eine Vielzahl dieser Bestimmungen kann durch Messen der Zytokine vorgenommen werden, die durch APCs und/oder Lymphozyten, vorzugsweise Makrophagen und/oder T-Zellen, in vitro oder ex vivo unter Anwendung der hierin beschriebenen oder jeglicher im Fachgebiet bekannter Methoden produziert wurden. Einige dieser Bestimmungen können durch Messen der Klasse und/oder Subklasse der Antigen-spezifischen Antikörper unter Anwendung der hierin beschriebenen oder jeglicher im Fachgebiet bekannter Methoden vorgenommen werden.
Die Klasse und/oder Subklasse der Antigen-spezifischen Antikörper, die als Reaktion auf die ISS/Antigen-Behandlung produziert wurden, zeigt eine Immunreaktion durch die Zellen mit Neigung zum Th1-Typ oder Th2-Typ an. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck Antikörperproduktion mit "Neigung zum Th1-Typ" auf die messbare erhöhte Produktion an Antikörpern in Verbindung mit einer Immunreaktion vom Th1-Typ (d.h. Th1-assoziierte Antikörper). Ein oder mehrere Th1-assoziierte Antikörper können gemessen werden. Zu Beispielen solcher Antikörper mit Neigung zum Th1-Typ zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, humaner IgG1 und/oder IgG3 (siehe z.B. Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581 und de Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164) und muriner IgG2a. Im Gegensatz dazu bezieht sich "Antikörper mit Neigung zum Th2-Typ" auf solche in Verbindung mit einer Immunreaktion vom Th2-Typ, wozu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, humaner IgG2, IgG4 und/oder IgE (siehe z.B. Widhe et al. (1998) und de Martino et al. (1999) und muriner IgG1 und/oder IgE.
Die Zytokin-Induktion mit Neigung zum Th1-Typ, die als Folge einer ISS-Verabreichung eintritt, produziert verstärkte zelluläre Immunreaktionen, wie etwa jene, die durch NK-Zellen, zytotoxische Killerzellen, Th1-Helfer- und Gedächtniszellen angeregt werden. Diese Reaktionen sind besonders nützlich für die Anwendung bei der protektiven oder therapeutischen Impfung gegen Viren, Pilze, protozoischen Parasiten, Bakterien, allergische Erkrankungen und Asthma, ebenso wie Tumoren.
Bei einigen Ausführungsformen wird eine Th2-Antwort unterdrückt. Die Unterdrückung einer Th2-Antwort kann zum Beispiel durch eine Reduzierung der Mengen an Th2-assoziierten Zytokinen, wie etwa IL-4 und IL-5, als auch einer IgE-Reduzierung und Verminderung der Histaminfreisetzung als Reaktion auf das Allergen bestimmt werden.
Methoden der Erfindung
Wir beschreiben auch Methoden zur Modulierung einer Immunantwort, umfassend das Verabreichen einer Population von Konjugaten (typischerweise in einer Zusammensetzung, umfassend die Population und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten), so dass die gewünschte Modulation der Immunantwort erreicht wird. Die Verabreichung der Konjugate und Auswertung der Immunreaktionen sind oben beschrieben worden.
Wir beschreiben Methoden zur Modulierung einer Immunantwort in einem Individuum, welche das Verabreichen einer Zusammensetzung umfassen, die irgendeine der hierin beschriebenen Populationen umfasst, an das Individuum in einer ausreichenden Menge, um die Immunantwort zu modulieren. Allgemein bedarf das Individuum einer solchen Modulation, oder wird einer solchen Modulation bedürfen, zum Beispiel aufgrund eines krankhaften Zustands oder eines Risikos der Entwicklung eines krankhaften Zustands. Beispiele für krankhafte Zustände umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Allergien, Krebs, Infektionskrankheiten (wie etwa eine virale oder bakterielle Infektion).
Bei einigen Ausführungsformen umfasst die Immunmodulation die Stimulierung eines (d.h. eines oder mehrerer) Th1-assoziierten Zytokins, wie etwa Interferon-γ. Bei einigen Ausführungsformen umfasst die Immunmodulation die Unterdrückung der Produktion eines (d.h. eines oder mehrerer) Th2-assoziierten Zytokins, wie etwa IL-4 und/oder IL-5. Die Messung dieser Parameter wendet Methoden an, die im Fachgebiet Standard sind und die oben erörtert worden sind.
Bei einigen Ausführungsformen werden ein oder mehrere Th1-assoziierte Zytokine produziert, wohingegen die Antigen-spezifische Antikörperproduktion unterdrückt ist.
Die Messung dieser Parameter wendet Methoden an, die im Fachgebiet Standard sind und die oben erörtert worden sind.
Bei einer Ausführungsform umfasst die Immunmodulation die Stimulierung eines (d.h. eines oder mehrerer) Th1-assoziierten Zytokins, wie etwa Interferon-γ, und die Unterdrückung der Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern. Die Grade der Unterdrückung der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion für verschiedene Konjugat-Populationen, einschließlich der Th1-assoziierten Antikörperproduktion und die Kombination der Th1- und Th2-assoziierten Antikörperproduktion, sind oben beschrieben worden und gelten für diese Methoden.
Bei einigen Ausführungsformen umfasst die Immunmodulation die Unterdrückung der Histaminfreisetzung. Die Grade der Unterdrückung der Histaminfreisetzung für verschiedene Konjugat-Populationen sind oben beschrieben worden und gelten für diese Methoden.
Wie Beispiele 2 – 4 vermitteln, beschreiben wir außerdem Methoden zur Unterdrückung der Antikörperbildung, vorzugsweise der Antigen-spezifischen Antikörperbildung, in einem Individuum, während die Stimulierung der Produktion eines Th1-assoziierten Zytokins, welche das Verabreichen einer Population eines ISS-Antigen-Konjugats der H-Klasse an das Individuum umfasst, wobei die Antikörperbildung unterdrückt wird, während ein Th1-assoziiertes Zytokin stimuliert wird. Die Messung dieser Parameter wendet Methoden an, die im Fachgebiet Standard sind und die oben erörtert worden sind.
Wir beschreiben auch Methoden zur Behandlung eines allergischen Zustandes in einem Individuum, die das Verabreichen irgendeiner der hierin beschriebenen Populationen, wobei das Antigen ein Allergen ist (im Allgemeinen in einer Zusammensetzung, umfassend solch eine Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten) in einer ausreichenden Menge umfasst, um den allergischen Zustand zu mildern oder zu lindern, im Allgemeinen durch Modulieren der Immunantwort auf das Antigen. Die Linderung kann beispielsweise anhand der Milderung eines oder mehrerer Symptome in Verbindung mit der Allergie bestimmt werden.
Wir beschreiben außerdem Methoden zur Reduzierung der Allergenität eines Antigens, insbesondere eines Allergens, umfassend das Konjugieren des Allergens an ein ISS-enthaltendes Polynukleotid, so dass die Allergenität reduziert ist im Vergleich zu dem Antigen allein (d.h. nicht an ISS geknüpftes Antigen). Wir beschreiben darüber hinaus Methoden zur Reduzierung der Allergenität eines Antigens, insbesondere eines Allergens, umfassend das Konjugieren des Allergens an ISS-enthaltendes Polynukleotid, wobei die durchschnittliche Anzahl an ISS zu Allergen eine solche ist, dass die Allergenität reduziert ist im Vergleich zu einer Population von Konjugat-Molekülen mit einer geringeren durchschnittlichen Anzahl an ISS zu Antigen. Die Messung der Modulation verschiedener Aspekte einer Immunantwort (einschließlich von Reaktionen des Th1- und Th2-Typs) ist oben beschrieben worden.
Wir beschreiben außerdem Methoden zur Generierung einer Antigen-spezifischen CTL-Aktivität, wobei die Produktion der Antigen-spezifische Antikörpern unterdrückt wird.
Wir beschreiben darüber hinaus Methoden zur Herstellung dieser Klassen von Konjugaten, umfassend jegliche der hierin beschriebenen Techniken und/oder Schritte.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung, nicht jedoch zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1. Präparierung von AIC-L, AIC-M oder AIC-H
AIC-L, AIC-M und AIC-H sind kovalente Konjugate des Ambrosia- (Ragweed) -Allergens Amb a 1 und des ISS-enthaltenden Polynukleotid der SEQ ID NO: 1. Alle drei Klassen von Konjugat werden aus demselben ISS-enthaltenden Polynukleotid und unter Verwendung desselben heterobifunktionellen Linkers hergestellt. Anhand der Anzahl der an das Amb a 1 konjugierten Oligonukleotide können die Klassen unterschieden werden. Die Menge des an Amb a 1 gebundenen Oligonukleotids kann durch Messen der Größe oder des Molekulargewichts der Konjugate bestimmt wer den (siehe 12 und 13). AIC-L enthält im Mittel 2 – 3 Oligonukleotide pro Amb a 1-Molekül, AIC-M enthält im Mittel 3,5 bis 4,5 und AIC-H enthält im Mittel > 5,5. Diese drei Klassen der AIC weisen unterschiedliche biologische Eigenschaften auf, wie nachstehend beschrieben.
Präparierung und Isolierung von 5'-Thio-ISS-Oligonukleotid
Triscarboxyethylphosphin (TCEP) durfte Raumtemperatur erreichen und wurde in 10 mM NaPO₄/141 mM NaCl/pH 7,2 gelöst. Das 5' Disulfid-ISS-Oligonukleotid durfte Raumtemperatur erreichen, wurde in demselben Puffer gelöst und mit der TCEP-Lösung für 2 Stunden bei 40 °C behandelt. Dieses Material wurde direkt in den Isolierungsschritt übernommen.
Zwei vorgepackte Entsalzungssäulen wurden in Reihe geschaltet und mit 10 mM NaPO₄/141 mM NaCl/pH 7,2-Puffer äquilibriert. Das 5' Disulfid-ISS-Oligonukleotid-Reduktionsgemisch wurde auf die Säule geladen, und das 5'-Thio-ISS-Oligonukleotid wurde isokratisch eluiert.
Präparierung und Isolierung von Maleimid-aktiviertem Amb a 1
N-Ethylmaleimid (NEM) durfte Raumtemperatur erreichen und wurde unter Rühren in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Amb a 1 wurde aufgetaut und mit der NEM-Lösung für 2 Stunden bei 20 °C behandelt. Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (sSMCC) durfte Raumtemperatur erreichen und wurde in DMSO gelöst. Das NEM-blockierte Amb a 1 wurde mit der sSMCC-Lösung für 2,5 Stunden bei 20 °C behandelt. Dieses Material wurde direkt in den Isolierungsschritt übernommen. Zwei vorgepackte Entsalzungssäulen wurden in Reihe geschaltet und mit 10 mM NaPO₄/141 mM NaCl/pH 7,2-Puffer äquilibriert. Das Amb a 1-Aktivierungsgemisch wurde auf die Säule geladen, und das mit Maleimid aktivierte Amb a 1 wurde isokratisch eluiert.
Präparierung und Isolierung von AIC-L, AIC-M oder AIC-H
Das rohe AIC-L-Konjugat wurde durch Inkubation eines Gemischs von 4 molaren Äquivalenten von 5'-Thio-ISS-Oligonukleotid und 1 molaren Äquivalent des Maleimid-aktivierten Am a 1 für 3 Stunden bei 20 °C zubereitet. Rohes AIC-M und AIC-H wurde in einer ähnlichen Weise zubereitet, jedoch unter Zugabe von 7 bzw. 17 molaren Äquivalenten des 5'-Thio-ISS-Oligonukleotids. Eine vorgepackte Gelfiltrationssäule wurde mit 10 mM NaPO₄/141 mM NaCl/pH 7,12-Puffer äquilibriert, und die rohen AIC-L, AIC-M oder AIC-H wurden auf die Säule geladen. Das AIC wurde isokratisch mit 10 mM NaPO₄/141 mM NaCl/pH 7,2-Puffer eluiert.
Beispiel 2: AIC-H-, AIC-M- und AIC-L-Immunigenität in Mäusen
Gruppen von 10 BALB/c-Mäusen wurden mit 1 μg AIC (H, M oder L) intradermal in den Schwanz immunisiert. Kontrollmäuse erhielten identische Injektionen von 10 μg Amb a 1. Die Mäuse erhielten 2 Immunisierungen bei einem zweiwöchigen Intervall. Zwei Wochen nach den ersten und zweiten Immunisierungen wurden die Mäuse bluten gelassen, die Seren präpariert, und Amb a 1-spezifisches IgG1 und IgG2 wurden mittels ELISA gemessen. In dem Maussystem sind die IgG1-Reaktionen mit Immunantworten vom Th2-Typ assoziiert, wohingegen IgG2a-Reaktionen mit Immunantworten vom Th1-Typ assoziiert sind.
Bei einigen Experimenten wurden Mäuse vier Wochen nach der zweiten Immunisierung geopfert, die Milzen entnommen und Milzzellkulturen angelegt. Diese Kulturen wurden in vitro für 4 Tage mit Amb a 1 stimuliert, und das in das Medium sekretierte IFN-γ und IL-5 als Reaktion auf Amb a 1 wurde mittels ELISA gemessen. IFN-γ ist ein Produkt der Th1-Zellen, wohingegen IL-5 ein Produkt der Th2-Zellen ist.
Vergleich der Immunogenität von AIC-L, AIC-M und Amb a 1
Die Antikörperreaktion auf AIC-L, AIC-M und Amb a 1 ist in Tabelle 2 gezeigt (mittlerer Titer ± Standardabweichung). AIC-M induzierte eine sehr geringe IgG1-Reaktion und eine höhere IgG2a-Reaktion nach der ersten Immunisierung. Nach der zweiten Immunisierung nahmen sowohl die IgG1- als auch IgG2a-Reaktionen zu, wobei die IgG2a-Reaktion etwa fünfmal höher blieb als die IgG1-Reaktion. AIC-L induzierte höhere IgG1 und IgG2a-Reaktionen als AIC-M sowohl nach der ersten als auch der zweiten Immunisierung. Die Antikörperreaktion mit AIC-L wurde ebenfalls als höher zu den IgG2a-Reaktionen als den IgG1-Reaktionen hin gewichtet. Die Antikörperreaktionen sowohl auf AIC-M als auch AIC-L, die IgG2a > IgG1 ergaben, sind indikativ für eine Immunreaktion vom Th1-Typ. Im Gegensatz dazu induzierte unmodifiziertes Amb a 1 hohe IgG1- und niedrige IgG2a-Reaktionen sowohl nach der ersten als auch der zweiten Immunisierung. Dieser Typ von Antikörperreaktion ist indikativ für einen Th2-Typ der Immunreaktion. Somit verschieben sowohl die AIC-L- als auch die AIC-M-Modifikationen von Amb a 1 die Immunreaktion eines Antigens vom Th2-Typ (Amb a 1) zu einem Th1-Profil hin. AIC-L schien höhere Gesamtantikörperreaktionen als AIC-M zu generieren. Tabelle 2. Antikörperreaktion auf AIC-L, AIC-M und Amb a 1
Vergleich der Immunogenität von AIC-L, AIC-M und Amb a 1
Ein zweites Experiment, das die Antikörperreaktion auf AIC-L, AIC-M und Amb a 1 demonstriert, ist in Tabelle 3 gezeigt (mittlerer Titer ± Standardabweichung). Die Ergebnisse dieses Experiments sind ähnlich, jedoch nicht identisch zu dem obigen Experiment. Die IgG1-Reaktionen waren bei diesem Experiment insgesamt höher als in dem obigen Experiment. Ansonsten sind die Schlussfolgerungen dieselben. Sowohl die AIC-L- als auch AIC-M-Modifikationen von Amb a 1 verschieben die Immunreaktion eines Antigens vom Th2-Typ (Amb a 1) zu einem Th1-Profil hin. AIC-L scheint höhere Gesamtantikörperreaktionen zu generieren als AIC-M. Tabelle 3. Antikörperreaktion auf AIC-L, AIC-M und Amb a 1
Vergleich der Immunogenität von AIC-M, AIC-H und Amb a 1
Die Antikörperreaktion auf AIC-M, AIC-H und Amb a 1 ist in Tabelle 4 gezeigt (mittlerer Titer ± Standardabweichung). AIC-M produzierte eine Antikörperreaktion ähnlich den vorangegangenen Experimenten, wobei die IgG2a-Titer größer waren als die IgG1-Titer. AIC-H induzierte geringere IgG1- und IgG2a-Reaktionen als AIC-M sowohl nach der ersten als auch der zweiten Immunisierung. Die Antikörperreaktion mit AIC-H wurde ebenfalls als höher zu den IgG2a-Reaktionen als den IgG1-Reaktionen hin gewichtet. Das unmodifizierte Amb a 1 induzierte auch hier hohe IgG1- und niedrige IgG2a-Reaktionen sowohl nach der ersten als auch der zweiten Immunisierung. Somit verschieben sowohl die AIC-H- als auch AIC-M-Modifikationen von Amb a 1 die Immunreaktion eines Antigens vom Th2-Typ (Amb a 1) zu einem Th1-Profil hin. AIC-H scheint geringere Gesamtantikörperreaktionen zu generieren als AIC-M. Tabelle 4. Antikörperreaktion auf AIC-M, AIC-H und Amb a 1
Vergleich der Immunogenität von AIC-M, AIC-H und Amb a 1
Dieses Experiment (zusammengefasst in Tabelle 5; mittlerer Titer ± Standardabweichung) reproduzierte die in Tabelle 4 zusammengefassten Ergebnisse und umfasste ein zusätzliches AIC-H-Lot. Dieses Experiment bestätigte, dass AIC-M und AIC-H ähnliche Th1-Reaktionen produzierte und das AIC-H geringere Antikörperreaktionen als AIC-M produzierte. Tabelle 5. Antikörperreaktion auf AIC-L, AIC-M und Amb a 1
Antigen-spezifische Antikörperreaktionen auf Immunisierungen mit AIC-L-, AIC-M und AIC-H, verglichen zu den Reaktionen auf die Immunisierung mit Amb a 1, sind auch in 4, 7 und 14 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit AIC-H zu geringeren Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen führt als die Immunisierung mit AIC-M oder mit AIC-L.
Th2- zu Th1-Verschiebung der Immunreaktion mit AIC-H
Die Mäuse wurden bei Woche 0 mit Amb a 1 in Alaun geprimt, was eine Th2-Reaktion generierte. Bei Woche 15 wurden diese Mäuse mit 3 Injektionen im Abstand von zwei Wochen mit jeweils 10 μg an Amb a 1 oder AIC-H (lot BK 5) behandelt (siehe 1 – 3, Injektionen sind durch Pfeile angegeben). Amb a 1-spezifisches IgG1, -IgE und -IgG2a wurden mittels ELISA gemessen, und die Ergebnisse sind jeweils in 1 – 3 dargestellt.
Die AIC-N-Behandlungen führten zu einer Verschiebung von der Th2-Reaktion zu einer Reaktion vom Th1-Typ, wie durch eine Verminderung der produzierten Menge an Amb a 1-spezifischem IgG1 und IgE und einer Zunahme der produzierten Menge an Amb a 1-spezifischem IgG2a angezeigt. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit unmodifiziertem Amb a 1 zu höheren IgG1- und IgE-Reaktionen und einer geringeren IgG2a-Reaktion.
Beispiel 3. Th1-assoziierte Zytokine werden in Mäusen induziert, die mit AIC-M und AIC-H, aber nicht mit Amb a 1 alleine immunisiert sind
Zytokin-Reaktionen von Milzzellen auf eine Amb a 1-Exposition in vitro sind in Tabelle 6 gezeigt (mittlerer Titer ± Standardabweichung). Die Immunisierung mit AIC-M oder AIC-H etablierte Gedächtnis-Milzzellen, die hohe Mengen an IFN-γ und geringe Mengen an IL-5 als Reaktion auf Amb a 1 sekretierten, was für eine Th1-Reaktion indikativ ist. Im Gegensatz dazu etablierte eine Immunisierung mit unmodifiziertem Amb a 1 Gedächtnis-Milzzellen, die geringe Mengen an IFN-γ und hohe Mengen an IL-5 sekretierten, was für eine Th2-Reaktion indikativ ist.
Somit sind sowohl AIC-M als auch AIC-H dazu in der Lage, eine Th1-Reaktion zu etablieren. AIC-H produzierte geringere Antikörperreaktionen, doch ähnliche Zytokinreaktionen auf AIC-M. Tabelle 6. Zytokin-Reaktion auf AIC-M, AIC-H und Amb a 1
Die in Tabelle 7 gezeigten Daten (mittlerer Titer ± Standardabweichung) veranschaulichen die Induktion der IFN-γ (Th1-Zytokin) Produktion, wenn Mäuse mit AIC-M und zwei unterschiedlichen Lots an AIC-H immunisiert wurden. Im Gegensatz dazu produzierte eine Immunisierung mit Amb a 1 wenig IFN-γ. Eine geringe oder keine IL-5 (Th2-Zytokin) Produktion wurde beobachtet, wenn Mäuse mit AIC-M und AIC-H immunisiert wurden. Die Amb a 1-Immunisierung induzierte hohe Mengen der IL-5-Produktion. Diese Daten zeigen, dass die Immunisierung von Mäusen mit AIC-M und AIC-H im Verschieben des Zytokin-Profils, so dass eine starke Neigung zum Th1-Typ gezeigt wird, wirksam ist. Tabelle 7. Zytokin-Reaktion auf AIC-M, AIC-H und Amb a 1
5, 6, 8, 9 und 15 zeigen die IL-5- und IFN-γ-Produktion als Reaktion auf die AIC-L-, AIC-M-, AIC-H- und Amb a 1-Verabreichung. Diese Daten zeigen, dass AIC-L, AIC-M, AIC-H beim Induzieren eines Zytokin-Profils vom Th1-Typ wirksam sind.
Beispiel 4. Th1-assoziierte Zytokine, induziert in menschlichen Zellen mit AIC-H und AIC-M.
Bei diesem Assay wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus Blut von Ragweed-allergischen Personen präpariert. Diese Zellen wurden bei 2 × 10⁶/ml mit 5 μg/ml an Amb a 1, AIC-M oder AIC-H für 6 Tage kultiviert. Die Überstände wurden geerntet, und der IFN-γ-Gehalt des Überstands wurde mittels ELISA gemessen. Einige Zellen wurden am Tag 6 mit 2,5 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA) und 10 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) für 24 Stunden restimuliert, woraufhin die Überstände geerntet und der IL-4- und IL-5-Gehalt der Überstände mittels ELISA gemessen wurde. Die Zytokin-Reaktionen der PBMCs von Ragweed-allergischen Personen sind in Tabelle 8 gezeigt (Mittelwert ± Standardabweichung). Sowohl AIC-H als auch AIC-M sind zur Stimulierung einer Zytokin-Reaktion vom Th1-Typ in Zellen von Individuen, die gegen Ragweed allergisch sind, fähig. Im Gegensatz dazu produzierte Amb a 1 eine Zytokin-Reaktion vom Th2-Typ in diesen Zellen, d.h. ein geringer Gehalt an IFN-γ, doch höhere Mengen an IL-4 und II-5. Diese Daten zeigen, dass AIC-M und AIC-H im Verschieben des Zytokin-Profils in PBMCs von allergischen Individuen, so dass eine Neigung zu einer Reaktion vom Th1-Typ gezeigt wird, wirksam sind. Tabelle 8. Zytokin-Reaktion auf AIC-M, AIC-H und Amb a 1 von PBMCs

* p < 0,05; ** p < 0,005

Beispiel 5. AIC-H, AIC-M und AIC-L zeigen unterschiedliche Umfänge der Induktion der Histaminfreisetzung aus Basophilen von Ragweed-allergischen menschlichen Individuen
Die Allergenität von AIC wurde zu Amb a 1 und Anwendung eines in vitro-Histaminfreisetzungs-Assays verglichen. Der Test sagt die in vivo-Allergenität eines Antigens voraus. Bei diesem Assay wurden Leukozyten aus dem Blut von Ragweedallergischen Patienten präpariert. Diese Zellen wurden für 45 Minuten mit Konzentrationen an Amb a 1 oder AIC-L, AIC-M oder AIC-H im Bereich von 0,0001 bis 1,0 μg/ml inkubiert. Die Zellen wurden dann mittels Zentrifugation pelletiert, und die Überstände wurden fluorimetrisch unter Verwendung eines zweckdienlichen Autoanalysesystems auf den Histamingehalt analysiert. Eine 100 % Histaminfreisetzung wird durch Lysieren von Zellen mit 8 % HClO₄ bestimmt. Die Ergebnisse für AIC-L Lot BK11, AIC-M Lot BK10 und AIC-H Lot BK8 sind in Tabelle 9 gezeigt (wobei die Zusammenfassungen den Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) zeigen). Die Ergebnisse sind als HR₄₀ ausgedrückt, was als die Konzentration einer Probe (Amb a 1 oder AIC in μg/ml), die zur Induzierung einer 40 % Histaminfreisetzung aus den humanen Zellen erforderlich ist, definiert ist. Die Ergebnisse zeigen, dass alle AIC-Klassen eine deutlich verminderte Fähigkeit zur Induzierung der Histaminfreisetzung aus Basophilen von allergischen Patienten aufweisen. HR₄₀-Werte für AIC-L lagen im Durchschnitt 62-mal höher als Amb a 1, für AIC-M lagen sie im Durchschnitt 132-mal höher als Amb a 1 und für AIC-H war der Durchschnitt > 1417-mal höher als Amb a 1 (z.B. ist 62-, 132- oder > 1417-mal mehr AIC als Amb a 1 zur Induzierung der Histaminfreisetzung erforderlich). Die Ergebnisse der Allergen-induzierten Histaminfreisetzung sind ebenfalls in 10 und 11 dargestellt.
Diese Daten sagen voraus, dass AIC-Spezies in vivo wesentlich weniger allergen sein sollten als natives Amb a 1-Allergen. Die Verminderung der Allergenität steht in Bezug zu der Anzahl der ISS-Oligonukleotide, die an das Allergen gebunden sind. Somit weist AIC-L die größte Allergenität auf, AIC-M weist eine mittlere Allergenität auf und AIC-H weist die niedrigste Allergenität der AIC-Formen auf. Tabelle 9. Histaminfreisetzung (HR₄₀) aus humanen Leukozyten, induziert durch Amb a 1 und AIC-L, AIC-M und AIC-H
Die unterschiedlichen immunmodulatorischen Eigenschaften, die AIC-L-, AIC-M- und AIC-H-Konjugate in immunisierten Mäusen zeigen, sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Diese Daten zeigen, dass die ISS-Konjugate von Amb a 1 (Antigen allein) durch ihre Fähigkeit abweichen, die Immunantwort zu einer Reaktion vom Th1-Typ hin zu neigen. Weiterhin weisen die ISS-Konjugate einzigartige Eigenschaften auf, die sie voneinander unterscheiden. AIC-L induziert eine hohe Antikörperproduktion, eine mäßige Verschiebung zur Th1-Polarität hin und eine mäßige Unterdrückung der Histaminfreisetzung. Im Gegensatz dazu induziert AIC-M eine geringfügig niedrigere Antikörperproduktion, eine starke Produktion von IFN-γ, eine starke Verschiebung zur Th1-Polarität hin früh nach der Immunisierung und eine sogar stärkere Unterdrückung der Histaminfreisetzung. Als weiteren Gegensatz dazu induziert AIC-H eine geringe Antikörperproduktion, die höchste Produktion an IFN-γ dieser drei Zusammensetzungen, eine starke Verschiebung zu einer Th1-Polarität hin spät nach der Immunisierung und die stärkste Unterdrückung der Histaminfreisetzung. Tabelle 10. Zusammenfassung der immunmodulatorischen Wirkungen, induziert durch AIC-L, AIC-M, AIC-H oder Amb a 1
Tabelle 11 zeigt eine Zusammenfassung des Verhältnisses von Amb a 1-spezifischen Th1-Antikörpern zu Th2-Antikörpern, generiert als Reaktion auf die Konjugate zu unterschiedlichen Zeitpunkten in mehreren Experimenten. Tabelle 11.
Beispiel 6. AIC-Konjugat-Populationen induzieren CTL-Aktivität
Antigen-ISS-Konjugate verschiedener Klassen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine zytotoxische T-Lymphozyt (CTL) Aktivität in Mäusen zu induzieren.
OIC-L ISS, OIC-M ISS und OIC-H ISS sind Konjugate des Antigens Ovalbumin (OVA) und des ISS-enthaltenden Polynukleotids SEQ ID NR: 1. OIC-M Kontrolle A ist ein kovalentes Konjugat von OVA und Nicht-ISS-Polynukleotid 5'-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3' (SEQ ID NR: 9). OIC-M Kontrolle B ist ein kovalentes Konjugat von OVA und Nicht-ISS-Polynukleotid 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID NR: 10). Diese Konjugate wurden hergestellt, wie im Wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben.
Mäuse wurden zweimal (bei einem Intervall von zwei Wochen) intradermal mit 10 μg an OVA-Konjugat oder OVA-Antigen alleine immunisiert. Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Milzen geerntet und auf die OVA-spezifische zytotoxische T-Lymphozytenaktivität analysiert. Kurz dargestellt wurden die Milzen durch ein Drahtsieb zerteilt, in Zellkulturmedium resuspendiert und gezählt. Eine Portion der Zellen von jeder Milz wurde behandelt, um als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu agieren, mit einem Peptid, das für das OVA CTL-Epitop (SIINFEKL, SEQ ID NR: 11), das durch H-2b-Mäuse erkannt wird, spezifisch war. Diese Zellen wurden mit Peptid (1 μg/ml) für 1 Stunde bei 37 °C mit 7 % CO₂ inkubiert und dann gewa schen und in 24-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/Well ausplattiert. Jedes Well erhielt außerdem zusätzliche 4 × 10⁶ unbehandelte Milzzellen/Well (auf insgesamt 5 × 10⁶ Zellen/Well). Das Zellkulturmedium für die Plattierung wurde mit Ratten T-Stim als einer Quelle von IL-2 ergänzt, und diese Effektorzellen wurden bei 37 °C mit 7 % CO₂ für 7 Tage inkubiert. Die Zellen wurden am Tag 3 gefüttert und gewaschen und am Tag 5 nochmals ausplattiert. Am Tag 7 wurden IL-4-Zielzellen Peptid-gepulst (mit dem SIINFEKL (SEQ ID NR: 11)-Peptid) und gewaschen. Die Tag 7-Effektorzellen wurden gezählt und mit Zielzellen ausplattiert, um verschiedene Effektor:Ziel-Verhältnisse zu erhalten (40:1, 10:1, 2,5:1) und bei 37 °C mit 7 % CO₂ für 4 Stunden inkubiert. Der Überstand aus jedem Well wurde abgenommen und auf Lactatdehydrogenase (LDH) als einem Maß der Zellabtötung analysiert, und die % Lyse wurden berechnet.
Die CTL-Ergebnisse aus diesem Experiment sind in 16 dargestellt. Antigen-ISS-Konjugate aller Klassen (H, M und L) induzierten eine größere CTL-Aktivität in Mäusen als Antigen allein oder als Antigen, das mit Nicht-ISS-Polynukleotiden konjugiert war.
Beispiel 7. AIC-Konjugat-Populationen zeigen unterschiedliche Ausmaße der Fähigkeit, mit Antigen-spezifischem Antikörper um die Bindung an Antigen zu konkurrieren
Ein Kompetitions-ELISA wurde vorgenommen, um die Fähigkeit verschiedener Amb a 1-Konjugat-Populationen, mit Amb a 1-spezifischem IgE um die Bindung an Amb a 1 zu konkurrieren, zu vergleichen.
Sechsundneunzig-Well-Platten wurden mit Amb a 1 bei 1,0 μg/ml in Beschichtungspuffer (0,1 M Na₂PHO₄, pH 9,0) zu 100 μl/Well über Nacht bei 4 °C beschichtet. Die Platten wurden 6-mal mit Waschpuffer (1 × PBS/0,05 % Tween 20) unter Verwendung eines Plattenwaschers gewaschen. Zweihundert μl Blockierpuffer wurden zugegeben, und die Platten wurden etwa 1 Stunde lang oder mehr bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann sechsmal mit Waschpuffer gewaschen. Reihenverdünnungen von Amb a 1 und Konjugat wurden in 96-Well-Platten vorbereitet. Das Folgende wurde zu den Antigen-beschichteten Platten hinzugefügt: (a) 100 μl Verdünnungspuffer allen leeren Wells; (b) 100 μl jeder Probe, vorinkubiert mit Amb a 1 oder Konjugat und Serum, im Duplikat zu den entsprechenden Wells. Die Platten wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 6-maligem Waschen mit Waschpuffer. Für den Antikörper-Nachweis wurden 100 μl/Well an Ziege-Anti-Human-IgE-Biotin-konjugiertem Antikörper bei 1:50 Verdünnungspuffer zu allen Wells hinzugegeben, gefolgt von Inkubationen bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
Die Platten wurden 6-mal in Waschpuffer gewaschen. Einhundert μl/Well an Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) (bei 1:50.000 in Verdünnungspuffer) wurden allen Wells zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde. Die Platten wurden sechsmal in Waschpuffer gewaschen und entwickelt. Bei diesem Experiment betrug die Entwicklungszeit etwa 22 Minuten. Die Platten wurden bei 450 nm mit Subtraktion bei 650 nm ausgelesen (Emax mit SOFTmax Pro (Software Version 2.6.1, Molecular Devices)). Für Amb a 1, AIC-M und AIC-H waren die ng/ml bei 50 % Inhibition 40, 120 bzw. 190 (zwei Lots von AIC-H wurden getestet und ergaben denselben Wert). Das Verhältnis von AIC-M zu Amb a 1 für 50 % Hemmung war 3. Das Verhältnis von AIC-H zu Amb a 1 für 50 % Hemmung war 4, 75. SEQUENZLISTE

Claims

Population von Konjugatmolekülen, welche Konjugatmoleküle ein Antigen und ein Polynukleotid, umfassend eine immunstimulatorische Sequenz (ISS), umfassen, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass vorliegen: (a) im Mittel wenigstens 5.5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül; oder (b) im Mittel von 3 bis 5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül.
Population nach Anspruch 1, wobei im Mittel wenigstens 6 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül vorhanden sind.
Population von Konjugatmolekülen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen ein Allergen ist.
Population nach Anspruch 3, wobei das Allergen Amb a 1 ist.
Zusammensetzung, umfassend die Population nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Verwendung bei der Modulation einer Immunantwort in einem Individuum.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Modulation das Stimulieren der Produktion eines Th1-assoziierten Zytokins oder Verrringern der Produktion eines Th2-assoziierten Zytokins umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass im Mittel wenigstens 5,5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül vorhanden sind und wobei die Modulation das Unterdrücken der Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern umfasst.
Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und eine Population nach Anspruch 3, wobei der Umfang der Konjugation in der Population ein solcher ist, dass im Mittel wenigstens 5,5 ISS-enthaltende Polynukleotide pro Antigenmolekül vorhanden sind, zur Verwendung in der Behandlung eines allergischen Zustands, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung in einer ausreichenden Menge zum Mildern des allergischen Zustands ist.
Zusammensetzung, umfassend die Population nach Anspruch 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, zur Verwendung in der Verringerung einer Antigen-stimulierten IgE-Produktion.
Zusammensetzung, umfassend die Population nach Anspruch 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, zur Verwendung in der Behandlung einer IgE-bezogenen Störung in einem Individuum, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung in einer ausreichenden Menge zur Verringerung der IgE-Produktion und Behandlung der Störung in dem Individuum ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 zur Verwendung in der Stimulierung von Th1-Lymphozyten in einem Individuum.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 12, wobei die Produktion eines Th1-assoziierten Zytokins stimuliert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, zur Verwendung in der Unterdrückung von Th2-Lymphozyten in einem Individuum, wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung in einer ausreichenden Menge zur Unterdrückung der Th2-Lymphozyten in den Individuum ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, und die Produktion eines Th2-assoziierten Zytokins ist unterdrückt.