JP2005187402A - 免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、特殊核酸塩基を含む核酸もしくはその誘導体、または、特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として含有することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
(1) 哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、特殊核酸塩基を含む核酸もしくはその誘導体、または、特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の免疫活性増強剤;
(2) 特殊核酸塩基は、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、2-オキソアデニン、5-ヒドロキシウラシル、5-ホルミルウラシル、5-ホルミルシトシン、8-ニトログアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ヒポキサンチン、オキザニン、ピリミジンダイマー、O6-メチルグアニンおよびO4-メチルチミンからなる群から少なくとも1種類が選択される(1)に記載の免疫活性増強剤;
(3) 特殊核酸塩基は、微生物核酸特異的な修飾塩基である(1)に記載の免疫活性増強剤;
(4) 微生物核酸特異的な修飾塩基は、N6-メチルアデニン、5-ヒドロキシメチルウラシルおよび5-ヒドロキシメチルシトシンからなる群から少なくとも1種類が選択される(3)に記載の免疫活性増強剤;
(5) 微生物核酸特異的な修飾塩基を含む核酸は、配列番号4の塩基配列を有する核酸である(3)に記載の免疫活性増強剤;
(6) 微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸を有するプラスミドを有効成分としてさらに含有する(1)から(5)のいずれかに記載の免疫活性増強剤;
(7) 微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸は、配列番号2の塩基配列を有する核酸である(6)に記載の免疫活性増強剤;
(8) 微生物が、ウイルスまたは細菌である(3)から(7)のいずれかに記載の免疫活性増強剤;
(9) 細菌が、大腸菌である(8)に記載の免疫活性増強剤;
(10) 上記(1)から(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与することによって、培養細胞の免疫活性を増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎症性サイトカインの生産方法;
(11) 上記(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(8)および(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫活性をさらに増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎症性サイトカインの生産方法;
(12) 上記(1)から(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与することによって、免疫活性が増強され、炎症性サイトカインが生産されることを特徴とする培養細胞;
(13) 上記(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(8)および(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫活性がさらに増強され、炎症性サイトカインを生産されることを特徴とする培養細胞;
(14) 培養細胞が、ヒトを含む哺乳動物由来である(12)または(13)に記載の培養細胞;
(15) 上記(1)から(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物の免疫活性を増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増強方法;
(16) 上記(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(8)および(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を有するプラスミドを有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、哺乳動物の免疫活性をさらに増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増強方法;
(17) 上記(1)から(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を非ヒト哺乳動物に投与することによって、免疫活性が増強されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物;
(18) 上記(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(8)および(9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を有するプラスミドを有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、免疫活性がさらに増強されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物;および
(19) 非ヒト哺乳動物が、マウスである(17)または(18)に記載の非ヒト哺乳動物。
(1)Gm6ATC配列と非メチル化CpG配列の合成
表1に示したホスホロチオエート安定化オリゴヌクレオチド(ODN)は、公知の方法(たとえば、Cowdery, J.S., et al., J. Immunol., 156, 4570-4575, 1996等)に従い、GATC配列とGm6ATC配列、非メチル化CpG配列とメチル化CpG配列の4種類の配列をそれぞれ合成した(Sigma Genosys Japan)。この合成ODNは、1nmol/μlとなるようにEndotoxine free TE緩衝液(QIAGEN社)に溶解して調製した。次いで、Limulus Amoebocyte Lysate assay(LAL試験;PYROGENT、BioWhittaker)を行ない、この合成ODN溶液中のエンドトキシンの含有量が、0.006EU/ml以下であることを確認した。
(i)Gm6ATC配列、非メチル化CpG配列の単独投与
表1に示した、GATC-dA(GATC配列を含む配列)、GATC-m6A(Gm6ATC配列を含む配列)、CpG-ODN1668(非メチル化CpG配列を含む配列)およびGpC-ODN1720(メチル化CpG配列を含む配列)をそれぞれ10nmol採取し400μlの生理食塩水に溶解して、、Balb/cマウス(オス、6週齢;三協ラボサービス)の腹腔内投与し、その2時間後に血清中の炎症性サイトカイン(IL-6、IL-12およびTNF-α)の濃度を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法;AN'ALYZA、Genzyme THCHNE corp.)で測定した。
(ii)Gm6ATC配列と非メチル化CpG配列との同時投与
微生物由来のDNA(核酸)は、m6Aだけでなく非メチル化CpG配列を含んでいる。たとえば、非ウイルスベクターによる末梢動脈疾患(peripheral arterial disease)に対する遺伝子治療では、Gm6ATC配列と非メチル化CpG配列が含まれたプラスミドを利用している(たとえば、Baumgartner, I., et al., Circulation, 97, p1114-1123, 1998等)。
2.Gm6ATC配列を含む核酸(オリゴヌクレオチド)を組込んだプラスミドによる炎症反応の誘導
(1)プラスミドの調製
実際の遺伝子治療で使用されるプラスミドを用いて、プラスミドに含まれるGm6ATC配列によって、誘起される炎症反応を検討した。
(2)in vitroでのメチル化反応
上記(1)により得られたpQBI63/SCS110を90μg採取し、120μlのメチラーゼバッファー(50mM Tris-HCl、10mM EDTA、5mM 2-メルカプタトエタノール(pH 7.5))中に入れ、19.2UのDamメチラーゼ(New England BioLabos Inc.)を用いて37℃にて一晩反応させた。この時、メチル基供与体であるS-アデノシルメチオニン(SAM;New England BioLabos Inc.)を80μMとなるよう添加しアデニンをメチル化したものをpQBI63/SAM+、添加せずmockメチル化体としたものをpQBI63/SAM-とした。反応終了後、pQBI63/SAM+およびpQBI63/SAM-を、上記2.(1)と同様にEndo free plasmid mega kit(QIAGEN社)を用いて精製し、エンドトキシンを除去し、混入を防止した。
(3)プラスミドの投与
発明者は、非ウイルスベクターを用いた遺伝子治療において、大腸菌から調製したプラスミドをカチオニック脂質とともに投与する方法は、今後一般的に使用されると考え、この出願の発明おけるプラスミドの投与をカチオニック脂質とともに投与する実施例を一例として示した。
)」を示している。
Claims (19)
- 哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、特殊核酸塩基を含む核酸もしくはその誘導体、または、特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の免疫活性増強剤。
- 特殊核酸塩基は、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、2-オキソアデニン、5-ヒドロキシウラシル、5-ホルミルウラシル、5-ホルミルシトシン、8-ニトログアニン、チミングリコール、シトシングリコール、ヒポキサンチン、オキザニン、ピリミジンダイマー、O6-メチルグアニンおよびO4-メチルチミンからなる群から少なくとも1種類が選択される請求項1に記載の免疫活性増強剤。
- 特殊核酸塩基は、微生物核酸特異的な修飾塩基である請求項1に記載の免疫活性増強剤。
- 微生物核酸特異的な修飾塩基は、N6-メチルアデニン、5-ヒドロキシメチルウラシルおよび5-ヒドロキシメチルシトシンからなる群から少なくとも1種類が選択される請求項3に記載の免疫活性増強剤。
- 微生物核酸特異的な修飾塩基を含む核酸は、配列番号4の塩基配列を有する核酸である請求項3に記載の免疫活性増強剤。
- 微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸、または、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸を有するプラスミドを有効成分としてさらに含有する請求項1から5のいずれかに記載の免疫活性増強剤。
- 微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を含む核酸は、配列番号2の塩基配列を有する核酸である請求項6に記載の免疫活性増強剤。
- 微生物が、ウイルスまたは細菌である請求項3から7のいずれかに記載の免疫活性増強剤。
- 細菌が、大腸菌である請求項8に記載の免疫活性増強剤。
- 請求項1から9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与することによって、培養細胞の免疫活性を増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎症性サイトカインの生産方法。
- 請求項1、2、3、4、5、8および9のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫活性をさらに増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎症性サイトカインの生産方法。
- 請求項1から9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与することによって、免疫活性が増強され、炎症性サイトカインが生産されることを特徴とする培養細胞。
- 請求項1、2、3、4、5、8および9のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫活性がさらに増強され、炎症性サイトカインを生産されることを特徴とする培養細胞。
- 培養細胞が、ヒトを含む哺乳動物由来である請求項12または13に記載の培養細胞。
- 請求項1から9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物の免疫活性を増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増強方法。
- 請求項1、2、3、4、5、8および9のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、哺乳動物の免疫活性をさらに増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増強方法。
- 請求項1から9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を非ヒト哺乳動物に投与することによって、免疫活性が増強されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- 請求項1、2、3、4、5、8および9のいずれかに記載の免疫活性増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸、または、この微生物核酸特異的な非メチル化CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、免疫活性がさらに増強されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物が、マウスである請求項17または18に記載の非ヒト哺乳動物。
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