WO2005063264A1 - 免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法 - Google Patents

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immune activity
mammal
specific
microorganism
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Hiroyuki Kamiya
Hideyoshi Harashima
Hiroyuki Tsuchiya
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/333—Modified A

Definitions

  • the invention of this application relates to an immune activity enhancer and a method for enhancing immune activity using the same. More specifically, the invention of this application relates to an immunological activity enhancer using a nucleic acid containing a special nucleic acid base or a derivative thereof, or a plasmid containing a nucleic acid containing the special nucleic acid base, and an immunological activity using the same. It relates to an augmentation method. Background art
  • Immune reactions in mammals such as mice, rats, and egrets are one of important biological reactions that prevent invasion and infection of living organisms by microorganisms such as bacteria and viruses, and foreign substances such as pollen and chemical substances.
  • “acquired immunity” mainly plays an important role in immune responses, mainly by the function of immune antibodies that specifically bind and detoxify these foreign substances.
  • CpG dinucleotide sequence contained in DNA derived from bacteria (for example, He, i, E, et al, Nature, 408: 740-745, 2000 and Kreig, et al., Et al., Nature, 374: 546-549, 1995).
  • this CpG sequence is found only at a very low frequency, about 1/50 to 1/60 of what is expected from statistics, and most of the CpG sequence
  • the cytosine base is methylated at the 5-position by cytosine 5-methylase specific to the CpG sequence.
  • the CpG sequence contained in the chromosomal DNA of bacteria is about 1/16, which is almost the same as the value expected from statistics.
  • it has no CpG-specific cytosine 5-methylase, so it is reported that it is a CpG sequence that does not contain methylated cytosine (unmethylated CpG sequence) like mammals ( For example, Bird, i.
  • the mammalian innate immune system recognizes the methylation or unmethylation of this CpG sequence and induces an inflammatory response (ie, enhanced immune activity), resulting in bacterial invasion and It is considered to be an immune response that can efficiently protect the organism from infection.
  • a composition that stimulates innate immunity by utilizing the enhancement of immune activity by such an unmethylated CpG sequence Japanese Patent Application Publication No. 2003-5227352
  • a cancer immunotherapy for example, Whitmore
  • adenine GATC sequences of E. coli in DNA is a DNA Adeninmechira Ichize an enzyme that acts specifically against adenine this (Dam,), a methylated by m 6 A.
  • Dam adenine this
  • methylation of adenine in the GATC sequence also recognizes the foreign matter is a non-self have been evolutionarily conserved natural immune I thought it was functioning as one of the mechanisms.
  • the vaccine-like composition described in JP-T-200-53366339 described above is composed of a pathogenic bacterium attenuated by including a mutation in DNA adenine methylase.
  • the effect is to increase the immune activity (biological defense response) against the pathogenic bacteria from which the vaccine-like composition is derived, so that it is effective only for specific infectious diseases. Yes, it does not increase the immune activity of the whole organism and exert its effects on various infectious diseases.
  • a nucleic acid containing a special nucleic acid base such as a modified nucleic acid specific to a microorganism nucleic acid, or a plasmid containing the nucleic acid is administered to induce or enhance immune activity.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and solves the conventional problems, and comprises a nucleic acid containing a special nucleic acid base or a plasmid having such a base as an active ingredient.
  • a nucleic acid containing a special nucleic acid base or a plasmid having such a base as an active ingredient When administered to mammals, the immune activity of the whole mammal can be enhanced, and it is applied to cancer immunotherapy, gene therapy, and DNA vaccines that are effective against various infectious diseases
  • the invention of this application provides a cultured cell having enhanced immune activity as a model cell for research on inducing or enhancing immune activity in vitro using the above-mentioned immune activity enhancer.
  • the invention of this application is based on the inventor of the present invention that uses the above-mentioned immune activity enhancer as a model animal for research on immune activity induced and enhanced in vivo, that is, in vivo. Another object is to provide a non-human mammal having enhanced immune activity. Disclosure of the invention
  • the invention of this application provides the following inventions (1) to (19) as means for solving the above problems. That is:
  • An immune activity enhancer for enhancing the immune activity of a mammal comprising a nucleic acid containing a special nucleobase or a derivative thereof, or a plasmid having a nucleic acid containing a special nucleobase as an active ingredient.
  • the special nucleic acid base is a modified base specific to a microorganism nucleic acid, the immunological activity enhancer according to (1) above;
  • microbial nucleic acid-specific modified bases N 6 - Mechiruaden, 5 - immunoreactivity enhancement according to (3) at least one from the group consisting of hydroxymethyl cytosine is selected - hydroxymethyl ⁇ Rashiru and 5 Agent;
  • nucleic acid containing the modified base specific to the microorganism nucleic acid is a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 4 ;
  • nucleic acid containing the microorganism nucleic acid-specific unmethylated CpG sequence or the plasmid containing the microorganism nucleic acid-specific unmethylated CpG sequence-containing nucleic acid is further contained as an active ingredient.
  • nucleic acid containing the microorganism nucleic acid-specific unmethylated CpG sequence is a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a method for producing an inflammatory cytokine characterized in that:
  • the immunological activity enhancer according to any one of the above (1), (2), (3), (4), (5), (8) and (9), together with a microorganism nucleic acid-specific non-methyl Immune activity by co-administering a nucleic acid having a modified CpG sequence or a plasmid containing a nucleic acid having an unmethylated CpG sequence specific to a microorganism nucleic acid as an active ingredient to cultured cells. Producing a proinflammatory cytokine by enhancing the production of inflammatory cytokines;
  • a microbial nucleic acid-specific non-methyl ester together with the immunological activity enhancer according to any one of (1), (2), (3), (4), (5), (8) and (9). Immunity is further enhanced by co-administration of a composition comprising a nucleic acid having a modified CpG sequence or a plasmid incorporating a nucleic acid having an unmethylated CpG sequence specific to a microorganism nucleic acid as an active ingredient to cultured cells. Cultured cells characterized by being enhanced and producing inflammatory cytokines;
  • the immunological activity enhancer of any one of (1) to (9) is administered to the mammal to enhance the immune activity of the mammal. Augmentation method;
  • the immunological activity enhancer according to any one of (1), (2), (3), (4), (5), (8) and (9), and a microorganism nucleic acid-specific non-methyl Immunological activity of a mammal by co-administering a composition comprising a nucleic acid having a modified CpG sequence or a plasmid having a nucleic acid having an unmethylated CpG sequence specific to the microorganism nucleic acid as an active ingredient to a mammal. Further enhancing the immune activity of a mammal, characterized by further enhancing
  • the immune activity enhancer according to any of (1) to (9) above is administered to a non-human mammal.
  • nucleic acid enhancer according to any one of the above (1), (2), (3), (4), (5), (8) and (9), and a microorganism nucleic acid-specific non-methyl Immune activity is further enhanced by co-administration of a composition containing a nucleic acid having a modified CpG sequence or a plasmid having a nucleic acid having an unmethylated CpG sequence specific to a microorganism nucleic acid as an active ingredient to a mammal A non-human mammal characterized in that it has been
  • the entire living body of the mammal by administering to a mammal a nucleic acid containing a special nucleobase or a plasmid having the nucleic acid as an active ingredient, the entire living body of the mammal can be obtained.
  • the present invention provides an immunoreactivity enhancer which can enhance the immunological activity of the present invention and can be applied to cancer immunotherapy, gene therapy, and DNA vaccines effective against various infectious diseases.
  • cultured cells capable of efficiently producing inflammatory site force-in using the above-mentioned immune activity enhancer, and a method for producing inflammatory cytokines using the cells.
  • a non-human mammal with enhanced immune activity is provided as an in vivo model animal for studies on immune activity induced or enhanced by the above-mentioned immune activity enhancer in vivo.
  • Figure 1 is the result of a single administration of Gm 6 ATC sequence or unmethylated CpG sequence into a mouse, is a diagram showing the measurement results of IL-6.
  • Figure 2 is the result of a single administration of Gm 6 ATC sequence or unmethylated CpG sequence into a mouse, is a diagram showing the measurement results of IL-12.
  • Figure 3 is the result of a single administration of Gm 6 ATC sequence or unmethylated CpG sequence into a mouse, is a view showing a measurement result of T F- alpha.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring IL-6 as a result of simultaneous administration of a Gn TC sequence and an unmethylated CpG sequence to mice.
  • Figure 5 is a Ru results der coadministration with Gm 6 ATC sequence and unmethylated CpG sequence into a mouse, it is a view showing a measurement result of the IL- 12.
  • Ru results der coadministration with Gm 6 ATC sequence and unmethylated CpG sequence into a mouse, it is a view showing a measurement result of TNF-alpha.
  • Figure 7 is the result of administration of a plasmid containing a Gm 6 ATC sequence to mice is a diagram showing the measurement results of IL-6 and IL- 12.
  • the mammalian immunoreactivity enhancer of the invention of this application is a nucleic acid containing a special nucleobase or a derivative thereof, or a plasmid having the nucleic acid containing the special nucleobase in an arbitrary plasmid as an active ingredient. It is characterized by containing.
  • the “special nucleic acid base” in the invention of this application means a special base as a component in a nucleic acid, such as a special base as a DNA component or a special base as an E component. Specifically, for example, it is a base other than adenine, guanine, cytosine, thymine, and peracil, such as a modified base specific to a nucleic acid of a microorganism. It distinguishes and recognizes that the immune system is non-self, and can enhance and promote immune activity.
  • More specific examples include, for example, variously modified bases such as hydroxylation and methylation, etc., such as 8-oxoguanine, 8-oxoadenine, 2-oxoadenine, 5-hydroxyperacil, 5- Horumiruurashiru, 5-formyl cytosine, 8 - two Toroguanin, thymine glycol, cytosine da recall, hypoxanthine, Okizanin, pyrimidine dimers, 0 6 - Mechirudanin and - methylthymine etc. Is mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the “plasmid” may or may not express each gene carried by the plasmid in mammalian cells, and the type of the plasmid is not particularly limited. Examples of the type include pQBI63 and pcDNA. Can be used.
  • the modified base J specific to a microorganism nucleic acid means a special base as described above, which is specifically retained in a microorganism.
  • the immune system can distinguish and recognize self (mammals) and non-self (microorganisms such as bacteria) to enhance and promote immune activity. der lever which effects can be exhibited in the present invention, although the kind is not particularly limited, N 6 - methyl adenine, exemplary 5-hydro carboxymethyl ⁇ La sill, the 5-hydroxymethyl cytosine, etc. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the base sequence containing the base to be modified with the modified base is preferably a GATC sequence, and more specifically, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a nucleic acid such as a naturally-derived DNA or RNA isolated from a microorganism such as Escherichia coli or various bacteria or viruses by a known method can be used.
  • a nucleic acid (artificial oligonucleotide) to which a modified base has been artificially added by a known method can be used (eg, Cowdery, JS, et al., J. Immunol). , 156, 4570-4575, 1996, etc.).
  • a derivative of a nucleic acid containing a special nucleobase may be used.
  • the term “derivative” refers to a compound in which the phosphoric acid and sugar moieties are modified when a chemically synthesized product is used, or a compound in which a skeleton other than the base moiety is converted.
  • Use -0-methyl R, peptide nucleic acid (PNA), etc. be able to.
  • the immunological activity enhancer of the invention of the present application includes a microbial nucleic acid-specific non-specific as its active ingredient.
  • a plasmid having a nucleic acid containing a methylated CpG sequence or a nucleic acid containing an unmethylated CpG sequence specific to a microorganism nucleic acid the immune activity of a mammal can be further enhanced.
  • the nucleic acid having an unmethylated CpG sequence is preferably, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the “microorganism” in the invention of this application is a virus or a bacterium, and particularly preferably a bacterium is Escherichia coli which has abundantly accumulated handling methods and knowledge.
  • the invention of this application relates to a method of administering each of the above-mentioned immune activity enhancers to cultured cells together with a kinetic lipid, or a known method such as a microinjection method or an electroporation method. It is also possible to provide a cultured cell capable of efficiently producing an inflammatory cytokine by enhancing the immune activity of the cell, and to use it as an experimental model cell of the immune activity in vitro. In addition, by using the cultured cells, it is possible to efficiently produce and obtain inflammatory site force-in. Then, by extracting and purifying the produced inflammatory site force-in by a known method, it can be used for various uses such as therapeutic drugs.
  • compositions containing the integrated plasmid as an active ingredient may be combined and administered simultaneously to any cultured cells.
  • cultured cells are not particularly limited.
  • tissues and cells of biological individuals specifically, plant cells, insect cells, and mammalian cells Cells or the like can be used, and any of these tissues may be used.
  • the cultured cells used are preferably derived from mammals including humans.
  • cultured cells derived from humans, monkeys, pomas, peas, bushes, sheep, mice, rats, peas, etc. can be used.
  • the invention of this application is also a method of enhancing the immune activity of a mammal individual, which can enhance the immune activity of the mammal by administering each of the immune activity enhancers exemplified above to the mammal. .
  • the immunopotentiator of the invention of this application When the immunopotentiator of the invention of this application is administered to a mammal, it can be administered in the form of a nucleic acid. However, it is preferable to administer the composition containing various pharmacological components in accordance with the administration form so as to improve the immune activity.
  • the “pharmacological component j” means, firstly, various carriers used in ordinary drug production.
  • the carrier is appropriately selected from a wide range according to the type of target disease and the administration form of the drug. It can be in the form of a unit dose that can be administered orally or by injection, especially in the case of injection, topical injection, intraperitoneal injection, selective intravenous injection, intravenous injection. Subcutaneous injection, organ perfusion liquid injection, and the like can be employed.
  • Oral liquid preparations such as suspensions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, daricols such as polyethylene dalicol, oils such as sesame oil and soybean oil, alkylparahydroxybenzoates and the like. It can be produced using preservatives, stroberies, flappers such as peppermint, and the like.
  • Powders, pills, capsules and tablets include lactose, glucose, sucrose, mannitol and other excipients, starch, sodium alginate and other disintegrants, magnesium stearate, talc and other lubricants, polyvinyl It can be formulated using a binder such as alcohol, hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester and the like, a plasticizer such as glycerin and the like. When manufacturing tablets and capsules, solid pharmaceutical carriers are used.
  • the solution for injection may be a saline solution, a glucose solution, or a saline solution and a glucose solution. It can be formulated by using a carrier comprising a mixture of liquids and various buffers. Alternatively, the preparation may be prepared in powder form, and mixed with the liquid carrier at the time of use to prepare an injection solution.
  • the dose of the immunopotentiator of the invention of this application varies depending on the body weight, symptoms, administration route, and the like of the mammal to be administered.
  • the second of the pharmacological components is a component for converting the immune activity enhancer into a form that can be introduced into cells.
  • the nucleic acid or the plasmid can be mixed with a solution to obtain a composition.
  • Such a composition can be introduced into cells by, for example, a micromouth injection method, a lipid (for example, BioPORTE (Gene Therapy Systems, USA), etc.) or a peptide reagent (for example, Chariot (Active Motif if)). , US) etc., or can be attached to gold particles and introduced into target cells by a gene gun.
  • a lipid for example, BioPORTE (Gene Therapy Systems, USA), etc.
  • a peptide reagent for example, Chariot (Active Motif if)
  • the mammalian immune system distinguishes between a mammalian methylated CpG sequence and a microorganism-specific unmethylated CpG sequence to enhance mammalian immune activity.
  • a composition comprising, as an active ingredient, a nucleic acid containing a microorganism nucleic acid-specific unmethylated CpG sequence, or a plasmid containing the microorganism nucleic acid-specific unmethylated CpG sequence, together with the above-mentioned immune activity enhancer.
  • mammal in the invention of this application can be exemplified by mammals such as monkeys, pests, pests, pigs, hidges, mice, rats, and egrets, including humans. Can be administered.
  • cancer immunotherapy and gene therapy can be performed by enhancing the immune activity of mammals. It can be expected to be applied to the development of effective DM vaccine against various infectious diseases.
  • the invention of this application relates to an immune activity induced or enhanced in vivo, that is, in vivo, by a nucleic acid containing a special nucleobase as described above, a derivative thereof, or a plasmid containing the nucleic acid. It can be provided as a model animal for research, but in this case, it is important that it be a non-human mammal excluding humans.
  • mice there are monkeys, pests, pests, bushus, hidges, mice, rats, and egrets.Abundant knowledge is accumulated, and they are used as experimental model animals in many laboratories. It is preferable to use a mouse that has been used from the viewpoint of ease of handling.
  • Such experimental animal models can contribute to the elucidation of the mechanism of special nucleic acid base such as Gm 6 ATC sequence (modified base) due to inflammation induced (immunoreactivity).
  • the phosphorothioate-stabilized oligonucleotide (0DN) shown in Table 1 was prepared according to a known method (eg, Cowdery, JS, et al., J. Immunol., 156, 4570-4575, 1996, etc.). and Gm 6 ATC sequence, the four types of sequences of unmethylated CpG sequence and methylated CpG sequences were synthesized (Sigma Genosys Japan). This synthetic 0DN was dissolved in Endotoxine free TE buffer (QIAGEN) to prepare lnmol / ⁇ and prepared.
  • QIAGEN Endotoxine free TE buffer
  • GpC-ODN1720 non CpG TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT
  • the serum was collected from the mouse heart 2 hours after administration, kept at 4 overnight, and collected by centrifugation (20000 g, 20 minutes, 4).
  • Figure 1 shows the measured value of IL-6 (pg / ml)
  • Figure 2 shows the measured value of IL-12 (pg / ml)
  • Figure 3 shows the measured value of TNF- ⁇
  • the measured value of GpC-ODN1720 was: IL-6: 28 pg / mL IL-12: 33 pg / mLTNF-Q !: 47 pg / ml, and inflammatory cytotoxicity was hardly induced.
  • Cp (H) DN1668 was administered, a very strong inflammatory cytodynamic force was induced, and the measured value was IL-6: 2.
  • lng / U IL-12 1.0 ng / mK TNF -a: It was 1.5 ng / ml.
  • GATC- the induction comparison of inflammatory 'cytokines between dA and GATC-m 6 A, GATC - m 6 A , although was slightly less than in the administration of CpG ⁇ 0DN1668, significance than GATC- dA was confirmed to be induced. That is, the measured value of GATC-m 6 A is IL-6: 39 pg / ml, IL-12: 160 pg / ml, TNF- ⁇ : 150 pg / mK The measured value of GATC-dA is IL-6: 14 pg / nK IL- 12: 48 pg / ml and TNF-Q !: 92 pg / ml.
  • methylation of adenine specifically induces inflammatory site force-in.
  • the immunity-inducing ability differs depending on the sequence before and after the unmethylated CpG sequence (Kreig,, et al., Nature, 374: 546-549, 1995, etc.).
  • 6 ATC sequence by optimizing the arrangement of the front and rear, can be expected strong immunity inducing effect in single administration of Gm 6 ATC sequence.
  • Microbial origin DM contains an unmethylated CpG sequence not only m 6 A.
  • Gm 6 ATC sequence contains plasmids (e.g., Baumgartner, I., et al. , Circulation, 97, P1114-1123, 1998, etc.).
  • the given projection simultaneously mice CpG-0DN1668 containing Gm 6 ATC sequence and unmethylated sequences, to confirm the induction effect of the inflammatory cytokines.
  • Gm 6 AT GATC-dA each dose of CpG ⁇ 0DN1668: 5 nmol of Cp (H) DN1668 mixed with equimolar Gm 6 ATC or GATC-dA and dissolved in 400 U of physiological saline This was administered to a mouse, and two hours later, the amount of the inflammatory cytokine in the serum of the mouse was measured by ELISA to confirm the amount of induction.
  • Figs. Fig. 4 shows the measured value of IL-6 (pg / ml)
  • Fig. 5 shows the measured value of IL-12 (pg / ml)
  • Fig. 6 shows the measured value of TNF- ⁇ (pg / ml).
  • one U.S. mark is "P ⁇ 0. 0.01 ”and three US marks indicate“ P ⁇ 0.005J.
  • IL-6 when CpG to 0DN1668 is administered alone, IL-6: 530 pg / iL IL-12: 730 pg / mK TNF-Q !: It was 760 pg / ml.
  • IL-6 710 pg / iK IL-12: 720 pg / ih TNF- ⁇ : 1200 pg / ml.
  • the Gm 6 ATC sequence was examined inflammatory reaction induced.
  • plasmid PQBI63 which does not perform gene expression in mammalian cells.
  • Escherichia coli DH5 Q! Having methylase activity (dai + ) and Escherichia coli SCS110 (dam-) having no methylase activity were prepared as host bacteria, and plasmid PQBI03 was added to each E. coli using a known method (for example, heat shock method or heat shock method).
  • the DNA was introduced by the electro-volatilization method and prepared and purified using Endo free plasmid mega kit (QIAGEN).
  • PQBI63 was introduced into DH5 Q! (Dam + ) and was prepared as PQBI63 / DH5 ⁇ , and PQBI63 was introduced into SCS110 (dam ⁇ ) and prepared as PQBI63 / SCS110.
  • the prepared plasmids PQBI63 / DH5 Q! And PQBI63 / SCS110 were separated by low-melting point agarose gel electrophoresis, and then purified using QIA-tipOO (QIAGEN) or Micropure-EZ (Millipore).
  • An LAL test (PYR0GENL BioWhit taker II) was performed in the same manner as in 1. (1) above, and it was confirmed that the endotoxin content was 0.006 EU / ml or less.
  • the PQBI63 / SCS110 obtained by the above (1) is collected, put into 120 l of methylase buffer (50 mM Tris-HCl, IOIDM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol (pH 7.5)), and then Using 2 ⁇ Dam methylase (New England BioLabos Inc.) At 37 overnight. At this time, a methyl group donor, S-adenosylmethionine (SAM; New England BioLabos Inc.) was added to a concentration of 80 / mg and the adenine was methylated, and pQBI63 / SAM + was added. This was designated PQBI63 / SAM-.
  • SAM S-adenosylmethionine
  • 03163/5 cliff + pipe 098163 / 5- was purified using the Endo free plasmid mega kit (QIAGEN) in the same manner as in 2. (1) above to remove endotoxin and to remove contaminants. Prevented.
  • the inventor believes that the method of administering a plasmid prepared from Escherichia coli together with a cationic lipid in gene therapy using a non-viral vector will generally be used in the future.
  • An example in which administration is performed together is shown as an example.
  • PQBI63 / DH5a and pQBI63 / SCS110 prepared in 2. (1) above, and PQBI63 / SAM + and PQBI63 / SAM- prepared in 2.
  • a complex was formed with Lipofect in (Invitrogen) and administered to mice via the tail vein. Four hours after the administration, serum was collected in the same manner as in 1.
  • an immunoactivity enhancer using a nucleic acid containing a special nucleobase or a plasmid containing a nucleic acid containing this special nucleobase and enhancement of immunoactivity using the same The method is provided, and it can be expected to be applied to elucidation of the mechanism of immunoreactivity and to development of DNA vaccines effective against cancer immunotherapy and various infectious diseases.

Abstract

哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、特殊核酸塩基を含む核酸もしくはその誘導体、または、特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として含有することを特徴とする。

Description

明細書 免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法 技術分野
この出願の発明は、免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法に関す るものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 特殊核酸塩基を含む核酸も しくはその誘導体、 または、 この特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを 用いた、免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法に関するものである。 背景技術
マウスゃラット、 ゥサギ等の哺乳動物における免疫反応は、 細菌やウィルス等 の微生物、花粉や化学物質等の異物による生体への侵入および感染を防御する重 要な生体反応の一つである。 この免疫反応のうち、 「獲得性免疫」 は、 これら異 物に対して、多様な特異的に結合し無毒化する免疫抗体の働きを主として免疫反 応を担っている。 また、 同じく免疫反応の一種である 「自然免疫」 は、 自己の細 胞と異物 （たとえば、 細菌類の構成成分） との差異を見分けて認識し、 この差異 に基づいて免疫反応が起こることが、 近年報告されている （たとえば、 Werl ing, D. , and Jungi, W. Τ· , Vet. Inununol. Imunopathol. 91 : 1-12, 2003および Poltorak, A. , et al.， Science, 282: 2085-2088, 1998等)。 このような異物の 一つとして、 細菌由来の DNAに含まれている CpGジヌクレオチド配列 (CpG配列） がある（たとえば、 He雇 i， E , et al , Nature, 408 : 740-745, 2000および Kreig, ん， et al.， Nature, 374: 546-549, 1995等)。
哺乳動物の染色体 DNAにおいて、 この CpG配列は、 統計学上で期待できる値と 比べて約 1/50から 1/60の割合という極めて少ない頻度でのみ含まれており、 ま た、 CpG配列の殆どのシトシン塩基は、 CpG配列に特異的なシトシン 5-メチラー ゼにより 5位がメチル化されている。 これに対して、 細菌類 （微生物） の染色体 DNAに含まれている CpG配列は、 統計学上で期待できる値とほぼ同等の約 1/16 の割合であり、 しかも、 CpG特異的なシトシン 5-メチラーゼを持たないため、 哺 乳動物のようにメチル化シトシンを含まない CpG配列 （非メチル化 CpG配列） で あることが報告されている （たとえば、 Bird, i P. , Trends Genet , 3: 342-347, 1987等)。 つまり、 哺乳動物の自然免疫系は、 この CpG配列のメチル化、 もしく は、 非メチル化を認識し、 炎症反応が誘起 （すなわち、 免疫活性の増強） され、 その結果、細菌類の侵入や感染から効率よく生体を防御することができる免疫反 応であると考えられる。
このような非メチル化 CpG配列による免疫活性の増強を利用して、 自然免疫を 刺激する組成物（特表 2 0 0 3— 5 2 7 3 5 2号公報)、癌免疫療法（たとえば、 Whitmore, M. , Li, S.， and Huang, L , Gene T er. , 6 : 1867-1875, 1999) や 感染症に対する効率的な DMワクチン （たとえば、 特表 2 0 0 2— 5 1 1 8 4 1 号公報、 Brunner, C , et al.， J. Immunol. 165 : 6278-6286, 2000および Koj ima, Y.， et al.， Vaccine, 20 : 2857-2865, 2002等） が報告、 提案され、 その有用性 が確認されている。
また、 細菌等をはじめとずる微生物と哺乳動物における DNA配列の違いは、 こ の CpG配列以外にも存在し、 たとえば、 N6-iethyladenine (N6-メチルアデニン、 ι6Α) が挙げられる。 たとえば、 大腸菌 DNA中の GATC配列のアデニン （A) は、 こ のアデニンに対して特異的に作用する酵素である DNAアデニンメチラ一ゼ（Dam) により、 メチル化されて m6Aとなる。 発明者らは、 非メチル化 CpG配列だけでな く、 この GATC配列におけるアデニンのメチル化 （Gm6ATC配列） もまた、 自然免 疫が進化的に保存してきた非自己である異物を認識する機構の一つとして機能 していると考えた。 また、 このような Gm6ATC配列によって、 生体において、 どの ような免疫活性 （生体防御反応） が誘起されるのかを研究し、 解明することは、 将来、大腸菌等の細菌由来のプラスミドを用いた遺伝子治療法等を確立する際に 大変重要な知見となると考えられる。
現在のところ、上記の非メチル化 CpG配列以外の特殊核酸塩基を含む配列によ る免疫活性 （生体防御反応） の誘起や促進、 増強に関する研究やその報告は、 ほ とんどなされていないのが実情である。 発明者が知る限りでは、 たとえば、 上記 の Gn TC配列を含む DMを利用した免疫活性の誘起 ·増強に関しては、 DNAアデ ニンメチラーゼ （Dam) に影響を及ぼす変異を含ませることにより、 弱毒化され たサルモネラ菌等の病原性細菌を用いてワクチン様組成物の作成し、 これを生体 に投与して免疫効果を上昇させ、病原性細菌の感染の予防や治療に活用すること が提案されている （特表 2 0 0 2— 5 3 6 3 3 9号公報を参照)。
しかしながら、上記の特表 2 0 0 2— 5 3 6 3 3 9号公報記載によるワクチン 様組成物は、 DNAアデニンメチラーゼの変異を含ませることにより弱毒化させた 病原性細菌からなるものであるため、 その効果は、 このワクチン様組成物の由来 となる病原性細菌に対しての免疫活性（生体防御反応） を上昇させるものである ため、 特定の感染症に対してのみ効果を発揮するものであり、 生体全体の免疫活 性を増強させ、種々の感染症に対しても効果を発揮することができるものではな い。 つまり、 依然として微生物核酸特異的な修飾塩基等をはじめとする特殊核酸 塩基を含む核酸、 または、 その核酸を有するプラスミド等を投与して、 免疫活性 を誘起、 増強させることは知られていない。
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであつ て、 従来の問題点を解消し、 特殊核酸塩基を含む核酸、 または、 そのような塩基 を有するプラスミドを有効成分として、 哺乳動物に投与することにより、 哺乳動 物の生体全体の免疫活性を増強させることができ、 癌免疫療法や遺伝子治療、 種々の感染症に対しても効果的な DNAワクチン等に応用することができる哺乳動 物の免疫活性増強剤およびこれを利用した免疫活性の増強方法を提供すること を課題としている。
また、 この出願の発明は、 上記の免疫活性増強剤を利用して、 in vitroにおけ る免疫活性の誘起や増強等に関する研究のモデル細胞として、免疫活性が増強さ れている培養細胞を提供することを課題としており、 さらにまた、 この出願の発 明は、 上記の免疫活性増強剤を利用して、 in vivo、 すなわち生体内で誘起、 増 強される免疫活性に関する研究のモデル動物として、免疫活性が増強されている 非ヒト哺乳動物を提供することも課題としている。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決する手段として、 以下の（1)から（19)の 発明を提供する。 すなわち：
(1) 哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、特殊核酸塩基を 含む核酸もしくはその誘導体、 または、 特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラス ミドを有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の免疫活性増強剤；
(2) 特殊核酸塩基は、 8-ォキソグァニン、 8 -ォキソアデニン、 2 -ォキソアデニン、
5 -ヒドロキシゥラシル、 5-ホルミルゥラシル、 5-ホルミルシトシン、 8-ニトログ ァニン、チミングリコール、シトシンダリコール、ヒポキサンチン、ォキザニン、 ピリミジンダイマー、 06 -メチルダァニンおよび -メチルチミンからなる群から 少なくとも 1種類が選択される上記（1)に記載の免疫活性増強剤；
(3) 特殊核酸塩基は、 微生物核酸特異的な修飾塩基である上記 (1)に記載の免疫 活性増強剤；
(4) 微生物核酸特異的な修飾塩基は、 N6 -メチルアデェン、 5 -ヒドロキシメチルゥ ラシルおよび 5 -ヒドロキシメチルシトシンからなる群から少なくとも 1種類が 選択される上記 (3)に記載の免疫活性増強剤；
(5) 微生物核酸特異的な修飾塩基を含む核酸は、配列番号4の塩基配列を有する 核酸である上記 (3)に記載の免疫活性増強剤；
(6) 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸、 または、 この微生物核 酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として さらに含有する上記 (1)から（5)のいずれかに記載の免疫活性増強剤；
(7) 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸は、配列番号 2の塩基配 列を有する核酸である上記 (6)に記載の免疫活性増強剤；
(8) 微生物が、ウィルスまたは細菌である上記 (3)から（7)のいずれかに記載の免 疫活性増強剤；
(9) 細菌が、 大腸菌である上記 (8)に記載の免疫活性増強剤；
(10) 上記 (1)から（9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与する ことによって、培養細胞の免疫活性を増強させて炎症性サイトカインを生産させ ることを特徵とする炎症性サイトカインの生産方法；
(11) 上記（1)、 （2)、 （3)、 （4)、 （5)、 （8)および (9)のいずれかに記載の免疫活性 増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫 活性をさらに増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎 症性サイト力インの生産方法；
(12) 上記 (1)から（9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与する ことによって、 免疫活性が増強され、 炎症性サイトカインが生産されることを特 徵とする培養細胞；
(13) 上記（1)、 （2)、 （3)、 （4)、 （5)、 （8)および (9)のいずれかに記載の免疫活性 増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫 活性がさらに増強され、炎症性サイトカインを生産されることを特徴とする培養 細胞；
(14) 培養細胞が、 ヒトを含む哺乳動物由来である上記（12)または（13)に記載の 培養細胞；
(15) 上記（1)から（9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を哺乳動物に投与する ことによって、哺乳動物の免疫活性を増強させることを特徴とする哺乳動物の免 疫活性の増強方法；
(16) 上記（1)、 （2)、 （3)、 （4)、 （5)、 （8)および (9)のいずれかに記載の免疫活性 増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を有するプラスミドを 有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、哺乳動 物の免疫活性をさらに増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増強 方法；
(17) 上記（1)から（9)のいずれかに記載の免疫活性増強剤を非ヒト哺乳動物に投 与することによって、免疫活性が増強されていることを特徵とする非ヒト哺乳動 物；
(18) 上記（1)、 （2)、 （3)、 （4)、 （5)、 （8)および (9)のいずれかに記載の免疫活性 増強剤とともに、微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を有するプラスミドを 有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、免疫活 性がさらに増強されていることを特徵とする非ヒ卜哺乳動物；および
(19) 非ヒト哺乳動物が、 マウスである上記 (17)または（18)に記載の非ヒト哺乳 動物。
上記のとおりの（1)から（19)のこの出願の発明によって、 特殊核酸塩基を含む 核酸、 または、 その核酸を有するプラスミドを有効成分として、 哺乳動物に投与 することにより、 哺乳動物の生体全体の免疫活性を増強させることができ、 癌免 疫療法や遺伝子治療、種々の感染症に対しても効果的な DNAワクチン等に応用す ることができる免疫活性増強剤が提供される。
また、 上記の免疫活性増強剤を利用して、 哺乳動物の生体全体の免疫活性を増 強させることができる免疫活性の増強方法が提供される。
さらに、 上記の免疫活性増強剤を利用して、 炎症性サイト力インを効率よく生 産させることができる培養細胞およびこの細胞を用いた炎症性サイトカインの 生産方法が提供される。
さらにまた、 上記の免疫活性増強剤によって、 生体内で誘起、 あるいは、 増強 される免疫活性に関する研究の in vivoにおけるモデル動物として免疫活性が増 強された非ヒト哺乳動物をも提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、マウスへの Gm6ATC配列または非メチル化 CpG配列の単独投与の結果で ある、 IL-6の測定結果を示した図である。
図 2は、マウスへの Gm6ATC配列または非メチル化 CpG配列の単独投与の結果で ある、 IL-12の測定結果を示した図である。 図 3は、マウスへの Gm6ATC配列または非メチル化 CpG配列の単独投与の結果で ある、 T F- αの測定結果を示した図である。
図 4は、マウスへの Gn TC配列と非メチル化 CpG配列との同時投与の結果であ る、 IL-6の測定結果を示した図である。
図 5は、マウスへの Gm6ATC配列と非メチル化 CpG配列との同時投与の結果であ る、 IL- 12の測定結果を示した図である。
図 6は、マウスへの Gm6ATC配列と非メチル化 CpG配列との同時投与の結果であ る、 TNF-αの測定結果を示した図である。
図 7は、 マウスへの Gm6ATC配列を含むプラスミドの投与の結果である、 IL-6 および IL- 12の測定結果を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徵をもつものであるが、以下にその実施の 形態について詳しく説明する。
この出願の発明の哺乳動物の免疫活性増強剤は、特殊核酸塩基を含む核酸もし くはその誘導体、 または、 任意のプラスミド中にこの特殊核酸塩基を含む核酸を 有しているものを有効成分として含有することを特徴としている。
この出願の発明における 「特殊核酸塩基」 とは、 DNA成分として特殊な塩基、 あるいは、 E 成分として特殊な塩基等のように、 核酸中の成分として、 特殊な 塩基を意味する。 具体的には、 たとえば、 微生物核酸特異的な修飾塩基等のよう なアデニン、 グァニン、 シトシン、 チミン、 ゥラシル以外の塩基であり、 これら 特殊な塩基を有する DNAや R 等の核酸により、哺乳動物の免疫系が非自己であ ると区別 ·認識して、 免疫活性を増強 ·促進させたりすることができるものであ る。 より具体的な例を挙げると、 たとえば、 ヒドロキシル化、 メチル化等の種々 の修飾が施された塩基等があり、 8-ォキソグァニン、 8-ォキソアデニン、 2-ォキ ソァデニン、 5-ヒドロキシゥラシル、 5-ホルミルゥラシル、 5-ホルミルシトシン、 8 -二トログァニン、 チミングリコール、 シトシンダリコール、 ヒポキサンチン、 ォキザニン、 ピリミジンダイマー、 06-メチルダァニンおよび -メチルチミン等 が挙げられる。 これらは、 単独での使用はもちろん、 これら複数を組み合わせて 使用してもよい。
また、 「プラスミド」 は、 喻乳動物の細胞中でプラスミドが保有する各遺伝子 を発現してもしなくてもよく、 その種類は特に限定されるものではないが、 たと えば、 pQBI63、 pcDNA等を使用することができる。
「微生物核酸特異的な修飾塩基 J とは、 微生物中に特異的に保有されている、 上記のような特殊な塩基のことを意味する。 この微生物核酸特異的な修飾塩基に よって、 哺乳動物の免疫系は、 自己 （哺乳動物） と非自己 （細菌類等の微生物） とを区別'認識して、 免疫活性を増強促進させることができる。 この微生物核酸 に特異的な修飾塩基は、 この出願の発明の効果を発揮することのできるものであ れば、その種類は特に限定されるものではないが、 N6-メチルアデニン、 5-ヒドロ キシメチルゥラシル、 5-ヒドロキシメチルシトシン等を例示することができ、 こ れらは、 単独、 または、 複数組み合わせて使用してもよい。
特に、 微生物核酸特異的な修飾塩基が N6-メチルアデニンである場合は、 この N6-メチルアデニンは、 「GATC配列」 を優先的に選択しアデニン （A) の N- 6位を メチル化するため、 修飾塩基の修飾対象となる塩基を含む塩基配列は GATC配列 であることが好ましく、 具体的には、 配列番号 4に示した塩基配列であることが さらに好ましい。
この微生物核酸特異的な修飾塩基は、 たとえば、 大腸菌をはじめとする各種の 細菌類やウィルス等の微生物から公知の方法によって、 単離した天然由来の DNA や RNA等の核酸を使用することができ、 また、 たとえば、 公知の方法で人工的に 修飾塩基を付加した核酸 （人工オリゴヌクレオチド） を合成、 作成したものを使 用することもできる （たとえば、 Cowdery, J. S. , et al.， J. Immunol. , 156, 4570-4575, 1996等)。
なお、 この出願の発明は、 特殊核酸塩基を含む核酸の誘導体を用いることもで きる。 この 「誘導体」 とは、 化学合成品を用いる場合にリン酸部および糖部が修 飾されているものや、 塩基部以外の骨格を変換したもの等であり、 たとえば、 ホ スホロチォエート修飾や 2' -0-メチル R 、 ペプチド核酸 (PNA) 等を使用する ことができる。
さらに、 前記のとおり、 哺乳動物には、 CpGジヌクレオチド配列 (CpG配列）を ほとんど有しておらず、有していてもこの CpG配列に特異的なシトシン 5-メチラ —ゼにより 5位がメチル化されているため、 この差異を生体の免疫系が認識し、 免疫活性を増強'誘起させることから、 この出願の発明の免疫活性増強剤は、 そ の有効成分として、微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸、または、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸を有するプラスミドをさらに 含有することにより、 哺乳動物の免疫活性をさらに増強させることができる。 具 体的には、 非メチル化 CpG配列を有する核酸は、 たとえば、 配列番号 2に示した 塩基配列であることが好ましい。
この出願の発明における 「微生物」 とは、 ウィルスや細菌類であり、 特に細菌 については、その扱い方法や知見等が豊富に蓄積されている大腸菌であることが 好ましい。
この出願の発明は、 上記に例示した各免疫活性増強剤を培養細胞に、 力チォニ ック脂質とともに投与する方法やマイクロインジェクション法、エレクトロボレ ーシヨン法等の公知の方法に従って投与して、培養細胞の免疫活性を増強させて、 炎症性サイトカインが効率よく生産することのできる培養細胞を提供すること もでき、 in vi troにおける免疫活性の実験モデル細胞として使用することができ る。 また、 この培養細胞を利用することにより、 効率よく炎症性サイト力インを 生産させ、 取得することもできる。 そして、 生産されたこの炎症性サイト力イン を公知の方法で抽出、 精製等することにより、 治療薬剤等の各種用途に使用する ことができる。
また、 免疫活性をさらに増強させるために、 上記の免疫活性増強剤とともに、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、 または、 この微生物核酸 特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミドを有効成分とし て含有する組成物を組み合わせて、 任意の培養細胞に同時投与してもよい。
なお、 「培養細胞」 は、 その種類や由来等は特に制限されるものではないが、 たとえば、 生物個体の組織や細胞、 具体的には、 植物細胞や昆虫細胞、 哺乳類細 胞等を使用することができ、 また、 これらの組織としての構成の各種のものであ つてもよい。 特に、 この出願の発明は、 哺乳動物の免疫系を増強促進させること から、 使用する培養細胞は、 ヒトを含む哺乳動物由来であることが好ましい。 た とえば、 ヒト、 サル、 ゥマ、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ラット、 ゥサギ等の 由来の培養細胞を使用することができる。
さらにまた、 この出願の発明は、 上記に例示した各免疫活性増強剤を哺乳動物 に投与することによって、 哺乳動物の免疫活性を増強させることができる、 哺乳 動物個体の免疫活性の増強方法でもある。
この出願の発明の免疫増強剤を哺乳動物に投与する際には、核酸の状態で投与 することもできるが、好ましくは投与形態にあわせて各種の薬理成分を含有させ て投与し、 免疫活性を増強させる。 この 「薬理成分 j とは、 第 1には、 通常の薬 剤製造に用いられる各種の担体を意味する。 担体は、 対象疾患の種類や薬剤の投 与形態に応じて広い範囲から適宜に選択することができるが、経口的にまたは注 射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。特に、 注射による投与 の場合には、 局所注入、 腹腔内投与、 選択的静脈内注入、 静脈注射、 皮下注射、 臓器灌流液注入等を採用することができる。
懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、 水、 シユークロース、 ソ ルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレンダリコール等のダリコール類、 ゴマ油、 大豆油等の油類、 アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、 ス トロべリー'フレーパー、 ペパーミント等のフレーパー類等を使用して製造する ことができる。
散剤、 丸剤、 カプセル剤および錠剤は、 ラクトース、 グルコース、 シユークロ ース、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、 マグ ネシゥムステアレート、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシ プロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の表面活性剤、 グ リセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤や力プセルを製造 する際には、 固体の製薬担体が用いられる。
また、 注射用の溶液は、 塩溶液、 グルコース溶液、 または塩水とグルコース溶 液の混合物、 各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。 ま た粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するよう にしてもよい。
なお、 この出願の発明の免疫増強剤の投与量は、 投与対象の哺乳動物の体重、 症状、 投与経路等によって異なることに留意する必要がある。
薬理成分の第 2は、免疫活性増強剤を細胞内に導入可能な形態とするための成 分である。 たとえば、 この免疫活性増強剤の有効成分である微生物の核酸に特異 的な修飾塩基を含む核酸、 または、 これを含むプラスミドの構造や機能を変更す ることなく、 かつ、 薬理学的に許容される溶液にこの核酸、 または、 プラスミド を混合して組成物とすることができる。 このような組成物は、 たとえば、 マイク 口インジェクション法により細胞内に導入する方法や、 脂質 （たとえば、 BioPORTE (Gene Therapy Systems社、米国）等）やペプチド性試薬（たとえば、 Chariot (Act ive Mot if 社、 米国） 等） を用いた細胞内導入法、 また、 金粒子に 付着させて遺伝子銃によって標的細胞に導入することもできる。
さらにまた、 上記のとおり、 哺乳動物の免疫系は、 哺乳動物のメチル化 CpG配 列と微生物特異的な非メチル化 CpG配列とを区別し、 哺乳動物の免疫活性を増 強'誘起することから、 上記の免疫活性増強剤とともに、 微生物核酸特異的な非 メチル化 CpG配列を含む核酸、 または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG 配列を含む核酸を有するプラスミドを有効成分として含有する組成物を組み合 わせて哺乳動物に同時投与することにより、 さらに免疫活性を増強させることが できる。
そして、 この出願の発明における 「哺乳動物」 とは、 ヒトを含むサル、 ゥマ、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ラット、 ゥサギ等の哺乳動物を例示することがで き、 免疫活性増強剤の投与対象とすることができる。
このように、 この出願の発明が提供する哺乳動物の免疫活性増強剤およびこれ を用いた免疫活性の増強方法によれば、哺乳動物の免疫活性を増強させることに より、 癌免疫療法や遺伝子治療、 種々の感染症に対する効果的な DMワクチン開 発等への応用が期待できる。 さらに、 この出願の発明は、 上記のとおりの特殊核酸塩基を含む核酸、 その誘 導体、 または、 その核酸を含むプラスミド等によって、 in vivo、 すなわち生体 内で誘起、 あるいは、 増強される免疫活性に関する研究のモデル動物として提供 することもできるが、 この場合は、 ヒトを除いた非ヒト哺乳動物であることが重 要である。 たとえば、 サル、 ゥマ、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ等が挙げることができ、 特に豊富な知見等が蓄積され、 また多くの研究室で実 験モデル動物として利用されているマウスとすることが、その扱い易さ等の観点 からも好ましい。 このような実験モデル動物によって、 たとえば、 Gm6ATC配列の ような特殊核酸塩基（修飾塩基） による炎症誘起 （免疫活性） のメカニズムの解 明に貢献することができる。
以下に、 m6Aを含有または欠損した合成核酸 （オリゴヌクレオチド） およぴこ れを含んだプラスミドを調製し、 これら各々を Balb/cマウスに投与し、 誘起さ れた炎症反応の強度について炎症性サイトカインを指標にして検討して実施例 として示し、 さらに詳しく、 この出願の発明について説明する。 もちろん、 以下 の例によってこの出願の発明が限定されることはない。 実施例
1 . GtfATC配列による炎症反応の誘導
( 1 ) Gm6ATC配列と非メチル化 CpG配列の合成
表 1に示したホスホロチォエート安定化オリゴヌクレオチド （0DN) は、 公知 の方法 （たとえば、 Cowdery, J. S. , et al. , J. Immunol. , 156， 4570-4575, 1996 等） に従い、 GATC配列と Gm6ATC配列、 非メチル化 CpG配列とメチル化 CpG配列 の 4種類の配列をそれぞれ合成した （Sigma Genosys Japan)。 この合成 0DNは、 lnmol/μ ΐとなるように Endotoxine free TE緩衝液 （QIAGEN社） に溶解して調 製した。 次いで、 Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL試験； PYR0GENT、 BioWhittaker) を行ない、 この合成 ODN溶液中のエンドトキシンの含有量が、 0. 006EU/ml以下であることを確認した。 表 1
ODN Motif Sequence (5 -3')
GpC - ODN1720 non CpG TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT
CpG-ODN1668 CpG TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT
GATC-dA non-m*A TCC ATG ATC TTC CTG ATG CT
GATC-m6A meA TCC ATG m6ATC TTC CTG ATG CT
( 2 ) Gm6ATC配列、 非メチル化 CpG配列の投与
(i) Gm6ATC配列、 非メチル化 CpG配列の単独投与
表 1に示した、 GATC-dA (GATC配列を含む配列)、 GATC-i6A (Gm6ATC配列を含む 配列)、 CPG-0DN1668 (非メチル化 CpG配列を含む配列） および GpC-0DN1720 (メ チル化 CpG配列を含む配列）をそれぞれ 10腿 ol採取し 400 1の生理食塩水に溶 解して、、 Balb/cマウス （ォス、 6週齢；三協ラボサービス） の腹腔内投与し、 その 2時間後に血清中の炎症性サイト力イン （IL-6、 IL-12および TNF- α) の濃 度を酵素結合免疫吸着検定法 （ELISA法； AN' ALYZA、 Genzyme THCHNE corp. ) で 測定した。
なお、血清は、投与 2時間後に、マウスの心臓から採血し、 4 にて一晩置き、 遠心分離処理 （20000g、 20分間、 4 ） にて回収した。
結果は、 図 1から図 3に示したとおりである。 図 1は IL- 6 における測定値 (pg/ml), 図 2は IL- 12における測定値 (pg/ml) , 図 3は TNF- αにおける測定値
(pg/ml) である。 なお、 図 1から図 3に示した結果は、 平均値士標準偏差で示 し、 図中の米印 2つは ΓΡく 0. 01」、 米印 3つは 「Pく 0. 005 (n=3 (IL- 12)、 4 (IL - 6、 TNF- Q!) ) ) J を示している。
GpC-ODN1720における測定値は、 IL-6: 28pg/mL IL-12:33pg/mLTNF- Q! :47pg/ml であり、 炎症性サイト力インはほとんど誘導することはなかった。 だが、 Cp(H)DN1668を投与した場合は、 非常に強い炎症性サイト力インが誘導され、 そ の測定値は、 IL - 6： 2. lng/ U IL-12： 1. 0ng/mK TNF- a： 1. 5ng/mlであった。 一方、 GATC- dAと GATC-m6Aとの炎症'性サイトカインの誘導比較では、 GATC - m6A は、 CpG~0DN1668の投与の場合よりも若干少なかったものの、 GATC- dAよりも有 意に誘導されることを確認した。すなわち、 GATC-m6Aの測定値は IL-6： 39pg/ml、 IL-12： 160pg/ml、 TNF- α： 150pg/mK GATC-dAの測定値は IL - 6： 14pg/nK IL-12： 48pg/ml、 TNF- Q!： 92pg/ml であった。 このことは、 アデニンのメチル化 (m6A) により、 特異的に炎症性サイト力インが誘導されることを示している。 また、 非 メチル化 CpG配列において、その前後の配列によつて免疫誘導能が異なることが 知られている (Kreig, , et al. , Nature, 374: 546-549, 1995等） ことから、 Gm6ATC配列においても、その前後の配列を最適化することにより、 Gm6ATC配列の 単独投与でも強い免疫誘導効果を期待することができる。
(ii) Gm6ATC配列と非メチル化 CpG配列との同時投与
微生物由来の DM (核酸)は、m6Aだけでなく非メチル化 CpG配列を含んでいる。 たとえば、 非ウィルスベクターによる末梢動脈疾患 （peripheral arterial disease) に対する遺伝子治療では、 Gm6ATC配列と非メチル化 CpG配列が含まれ たプラスミドを利用している（たとえば、 Baumgartner, I.， et al. , Circulat ion, 97, P1114-1123, 1998等)。
そこで、 Gm6ATC配列と非メチル化配列を含む CpG- 0DN1668を同時にマウスに投 与して、炎症性サイトカインの誘導効果を確認した。 Gm6AT GATC-dA、CpG~0DN1668 のそれぞれの投与量は、 5nmolの Cp(H)DN1668に対して、等 molの Gm6ATCまたは GATC - dAを混合し、 400 Uの生理食塩水に溶解して、 これをマウスに投与し、 2 時間後にこのマウスの血清中における炎症性サイトカインの測定を ELISA法で行 ない、 誘導量を確認した。
結果は、 図 4から図 6に示したとおりである。 図 4は IL- 6 における測定値 (pg/ml), 図 5は IL- 12における測定値 (pg/ml) , 図 6は TNF- αにおける測定値 (pg/ml)である。なお、 図 4から図 6に示した結果は、平均値士標準偏差 (n=4) で示し、図中の米印 1つは「P〈0. 05」、米印 2つは「Pく 0. 01」、米印 3つは「P〈0. 005J を示している。
すなわち、 CpG~0DN1668単独投与の場合は、 IL-6： 530pg/iL IL-12： 730pg/mK TNF- Q!： 760pg/mlであった。 また、 CpG-0DN1668と GATC- dAとの同時投与の場合 は、 IL-6： 710pg/iK IL-12： 720pg/ih TNF- α： 1200pg/mlであった。 そして、 CPG-ODN1668と Gm6ATCとの同時投与の場合は、 IL-6: 1600pg/mK IL-12: 1100pg/mL TNF- α： 2900pg/mlと、 顕著に高いサイト力イン濃度が誘導されることを確認で きた。 この濃度は、 Cp(H)DN1668単独投与おょぴ Cp(H)環 1668+GATC- dAの投与と 比較して 2 - 3倍の濃度であり、 m6Aと非メチル化 CpG配列がともに存在すると、 非常に強く炎症性サイトカインが誘導、 増強されることが確認された。
2. Gm6ATC配列を含む核酸（オリゴヌクレオチド） を組込んだプラスミドによる 炎症反応の誘導
( 1 ) プラスミドの調製
実際の遺伝子治療で使用されるプラスミドを用いて、 プラスミドに含まれる
Gm6ATC配列によって、 誘起される炎症反応を検討した。
プラスミドは、 哺乳動物の細胞内では遺伝子発現を行なわないプラスミド PQBI63を使用した。ホスト菌として、メチラーゼ活性を有する大腸菌 DH5 Q! (dai+) とメチラーゼ活性を有さない大腸菌 SCS110 (dam—)を用意し、それぞれの大腸菌に プラスミド PQBI03を公知の方法 （たとえば、 ヒートショック法やエレクトロボ レ一シヨン法等) で導入し、 Endo free plasmid mega kit (QIAGEN社） を用いて 調製 ·精製した。
なお、 PQBI63 を DH5 Q! (dam+)に導入し調製したものを PQBI63/DH5 αとし、 SCS110 (dam— )に導入し調製したものを PQBI63/SCS110とした。 調製後のプラスミ ド PQBI63/DH5 Q!および PQBI63/SCS110は、 低融点ァガロース電気泳動で分取し、 その後、 QIA-t iplOO (QIAGEN社） または Micropure-EZ (Mill ipore社） を用いて 精製し、 上記 1 . ( 1 ) と同様に LAL試験 （PYR0GENL BioWhit taker ¾) を行な い、 エンドトキシンの含有量が 0. 006EU/ml以下であることを確認した。
( 2 ) in vitroでのメチル化反応
上記 ( 1 ) により得られた PQBI63/SCS110を 採取し、 120 lのメチラ一 ゼバッファー （50mM Tris-HCl、 IOIDM EDTA, 5mM 2-メルカプ夕トエタノール （pH 7. 5)) 中に入れ、 19. 2ϋの Damメチラーゼ (New England BioLabos Inc. ) を用い て 37 にて一晩反応させた。 この時、 メチル基供与体である S -アデノシルメチ ォニン （SAM； New England BioLabos Inc. ) を 80/Λ Μとなるよう添加しアデニン をメチル化したものを pQBI63/SAM+、 添加せず mock メチル化体としたものを PQBI63/SAM-とした。 反応終了後、 03163/5崖+ぉょぴ098163/5 -を、 上記 2. ( 1 ) と同様に Endo free plasmid mega kit (QIAGEN社） を用いて精製し、 ェ ンドトキシンを除去し、 混入を防止した。
( 3 ) プラスミドの投与
発明者は、 非ウィルスベクターを用いた遺伝子治療において、 大腸菌から調製 したプラスミドをカチォニック脂質とともに投与する方法は、今後一般的に使用 されると考え、 この出願の発明おけるプラスミドの投与をカチォニック脂質とと もに投与する実施例を一例として示した。
上記 2 . ( 1 ) にて調製した pQBI63/DH5 aおよび pQBI63/SCS110、 また、 上記 2. ( 2 ) にて調製した PQBI63/SAM+および PQBI63/SAM -、 それぞれをカチォニッ ク脂質 （力チォニックリボソーム） である Lipofect in (Invitrogen社） と複合 体を形成させ、尾静脈よりマウスに投与した。投与 4時間後、上記と 1 . ( 2 ) (i) と同様に血清を採集し、 この血清中の IL- 6および IL- 12の炎症性サイトカイン の濃度 (pg/ml) を ELISA法にて測定、 定量した。
結果は、 図 7に示したとおりであり、 平均値士標準偏差で示し、 米印 1 つは 「Pく 0. 05 (n=3)」 を示している。
まず、 IL-12における測定結果は、 PQBI63/DH5 Q!によって、 420pg/mlまで誘導 されたのに対して、 PQBI63/SCS110 を投与することによって、 IL- 12 の誘導が 140pg/mlに低下した。
つぎに、 QBI63/SCS110を S-アデノシルメチォニンの存在下で Dam処理を行な い、 アデニンをメチル化した PQBI63/SAM+を投与することにより、 IL-12 は、 PQBI63/DH5 Q!と同程度の 320pg/mlに誘導された。 また、 S-アデノシルメチォ二 ンの非存在下で Dam処理を行なった PQBI63/SAM-の場合は、 PQBI63/SCS110と同 程度の 140pg/mlを誘導した。
そして、 IL-6の測定結果は、 IL-12ほど強い誘導は確認されなかったが、 その 傾向は IL-12とほぼ同様であったことを確認された。 つまり、 Gm6ATC配列によつ て炎症反応が誘導、 増強されること示すものである。
なお、 コントロールである Lipoiectinの単独投与時の IL- 12および IL-6それ ぞれの血清中濃度は、 検出限界値以下 «7. 8pg/ml) であった。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 特殊核酸塩基を含む核 酸、 または、 この特殊核酸塩基を含む核酸を有するプラスミドを用いた、 免疫活 性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法が提供され、免疫活性のメカニズム の解明や癌免疫療法や種々の感染症に対しても効果的な DNAワクチン開発等への 応用に期待することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳動物の免疫活性を増強させる免疫活性増強剤において、 特殊核酸塩基 を含む核酸もしくはその誘導体、 または、 特殊核酸塩基を含む核酸を有するブラ スミドを有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の免疫活性増強剤。
2 . 特殊核酸塩基は、 8-ォキソグァニン、 8-ォキソアデニン、 2-ォキソアデ二 ン、 5-ヒドロキシゥラシル、 5-ホルミルゥラシル、 5-ホルミルシトシン、 8-ニト ログァニン、 チミングリコール、 シトシンダリコール、 ヒポキサンチン、 ォキザ ニン、 ピリミジンダイマー、 06-メチルダァニンおよび 04 -メチルチミンからなる 群から少なくとも 1種類が選択される請求項 1に記載の免疫活性増強剤。
3. 特殊核酸塩基は、 微生物核酸特異的な修飾塩基である請求項 1に記載の免 疫活性増強剤。
4. 微生物核酸特異的な修飾塩基は、 N6-メチルアデニン、 5-ヒドロキシメチル ゥラシルおよび 5 -ヒドロキシメチルシトシンからなる群から少なくとも 1種類 が選択される請求項 3に記載の免疫活性増強剤。
5 · 微生物核酸特異的な修飾塩基を含む核酸は、 配列番号 4の塩基配列を有す る核酸である請求項 3に記載の免疫活性増強剤。
6 . 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸、 または、 微生物核酸 特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸を有するプラスミドを有効成分としてさ らに含有する請求項 1から 5のいずれかに記載の免疫活性増強剤。
7 . 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を含む核酸は、 配列番号 2の塩基 配列を有する核酸である請求項 6に記載の免疫活性増強剤。
8. 微生物が、 ウィルスまたは細菌である請求項 3から 7のいずれかに記載の 免疫活性増強剤。
9. 細菌が、 大腸菌である請求項 8に記載の免疫活性増強剤。
1 0. 請求項 1から 9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与す ることによって、培養細胞の免疫活性を増強させて炎症性サイトカインを生産さ せることを特徴とする炎症性サイトカインの生産方法。
1 1 . 請求項 1、 2、 3、 4、 5、 8および 9のいずれかに記載の免疫活性増 強剤とともに、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、 または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫 活性をさらに増強させて炎症性サイトカインを生産させることを特徴とする炎 症性サイトカインの生産方法。
1 2. 請求項 1から 9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を培養細胞に投与す ることによって、 免疫活性が増強され、 炎症性サイト力インが生産されることを 特徵とする培養細胞。
1 3. 請求項 1、 2、 3、 4、 5、 8および 9のいずれかに記載の免疫活性増 強剤とともに、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、 または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を培養細胞に同時投与することによって、免疫 活性がさらに増強され、炎症性サイトカインを生産されることを特徵とする培養 細胞。
1 4. 培養細胞が、 ヒトを含む哺乳動物由来である請求項 1 2または 1 3に記 載の培養細胞。
1 5. 請求項 1から 9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を哺乳動物に投与す ることによって、哺乳動物の免疫活性を増強させることを特徴とする哺乳動物の 免疫活性の増強方法。
1 6. 請求項 1、 2、 3、 4、 5、 8および 9のいずれかに記載の免疫活性増 強剤とともに、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、 または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、哺乳 動物の免疫活性をさらに増強させることを特徴とする哺乳動物の免疫活性の増 強方法。
1 7 . 請求項 1から 9のいずれかに記載の免疫活性増強剤を非ヒト哺乳動物に 投与することによって、免疫活性が増強されていることを特徴とする非ヒト哺乳 動物。
1 8. 請求項 1、 2、 3、 4、 5、 8および 9のいずれかに記載の免疫活性増 強剤とともに、 微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸、 または、 この微生物核酸特異的な非メチル化 CpG配列を有する核酸を組込んだプラスミド を有効成分として含有する組成物を哺乳動物に同時投与することによって、免疫 活性がさらに増強されていることを特徵とする非ヒト哺乳動物。
1 9. 非ヒト哺乳動物が、 マウスである請求項 1 7または 1 8に記載の非ヒト 哺乳動物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8962652B2 (en) 2009-10-22 2015-02-24 Gilead Sciences, Inc. Derivatives of purine or deazapurine useful for the treatment of (inter alia) viral infections

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5686814B2 (ja) 2010-09-17 2015-03-18 独立行政法人科学技術振興機構 Ｈｍｇｂタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤及びスクリーニング方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03135918A (ja) * 1989-10-23 1991-06-10 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 免疫賦活剤
JPH09323979A (ja) * 1996-06-04 1997-12-16 Meiji Milk Prod Co Ltd 核酸を用いた免疫調節組成物
JPH10506265A (ja) * 1994-07-15 1998-06-23 ザ ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫調節オリゴヌクレオチド
WO2002026757A2 (en) * 2000-09-26 2002-04-04 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
JP2003535146A (ja) * 2000-06-08 2003-11-25 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 免疫促進性オリゴデオキシヌクレオチド

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6699468B1 (en) * 1994-06-23 2004-03-02 Georgetown University Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
CA2252375C (en) * 1996-04-19 2011-12-20 Colpan, Metin Nucleic acid vaccination for parvoviral infections
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1003531B1 (en) * 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
CA2291483C (en) * 1997-06-06 2012-09-18 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
ES2284247T3 (es) * 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
US6159694A (en) * 1999-04-08 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of stat3 expression
US7098192B2 (en) * 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
EP1259264A4 (en) * 2000-02-23 2005-08-31 Univ California METHOD FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY ENDURANCE AND OTHER FORMS OF GASTROINTESTINAL DEFICIENCY
CA2407942A1 (en) * 2000-05-01 2001-11-08 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US6964950B2 (en) * 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US20050250716A1 (en) * 2001-12-07 2005-11-10 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
JP3976742B2 (ja) * 2004-02-27 2007-09-19 江守商事株式会社 インターフェロンアルファを誘導する免疫刺激オリゴヌクレオチド
AU2010254550B2 (en) * 2009-05-27 2015-10-15 Selecta Biosciences, Inc. Targeted synthetic nanocarriers with pH sensitive release of immunomodulatory agents
EP2681336A4 (en) * 2011-03-02 2014-11-19 Groove Biopharma Corp ENHANCED BIODISTRIBUTION OF OLIGOMERS

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03135918A (ja) * 1989-10-23 1991-06-10 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 免疫賦活剤
JPH10506265A (ja) * 1994-07-15 1998-06-23 ザ ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫調節オリゴヌクレオチド
JPH09323979A (ja) * 1996-06-04 1997-12-16 Meiji Milk Prod Co Ltd 核酸を用いた免疫調節組成物
JP2003535146A (ja) * 2000-06-08 2003-11-25 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 免疫促進性オリゴデオキシヌクレオチド
WO2002026757A2 (en) * 2000-09-26 2002-04-04 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUNNER C. ET AL.: "Enhanced dendritic cell maturation by TNF-alpha or cytidine-phosphate-guanosine DNA drives T cell activation in vitro and therapeutic anti-tumor immune responses in vivo", J. IMMUNOL., vol. 165, no. 11, 1 December 2000 (2000-12-01), pages 6278 - 6286, XP002983687 *
COWDERY, J. S. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 156, 1996, pages 4570 - 4575
See also references of EP1702620A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8962652B2 (en) 2009-10-22 2015-02-24 Gilead Sciences, Inc. Derivatives of purine or deazapurine useful for the treatment of (inter alia) viral infections
US9161934B2 (en) 2009-10-22 2015-10-20 Gilead Sciences, Inc. Derivatives of purine or deazapurine useful for the treatment of (inter alia) viral infections

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