JP2002517085A - 磁性金属酸化物ナノ粒子の核生成および成長ならびにその使用 - Google Patents

磁性金属酸化物ナノ粒子の核生成および成長ならびにその使用

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Abstract

(57)【要約】 磁性金属酸化物でコーティングしたナノ粒子を調製するための方法であって、以下のa)〜g)の工程を含んでなる方法：a)可溶性のポリマー金属キレート化剤を含む水溶液を１種以上の可溶性金属塩と接触させて金属イオンを生成させる工程であって、この場合該金属イオンのうち少なくとも１種は磁性酸化物を形成できるものであり、該金属イオンが前記キレート化剤の結合能を実質的に上回らない量で存在する、該工程；b)前記金属イオンが磁性酸化物の形成に必要な酸化状態で存在するようにする工程；c)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程；d)追加量の前記金属塩を溶液に添加する工程；e)該追加の金属イオンが磁性酸化物の形成に必要な酸化状態で存在するようにする工程；f)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程；g)工程d)〜f)の操作を、磁性金属酸化物でコーティングした単分散ナノ粒子を得るのに必要な回数連続的に繰り返す工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】磁性金属酸化物ナノ粒子の核生成と成長ならびにその使用 発明の技術分野 本発明は、金属キレート化剤であるポリマーからできている核を作製しその核
の上に磁性金属酸化物のコーティングを成長させて磁性ナノ粒子を調製するため
の方法、それから得られた中空磁性ナノ粒子、ならびにその粒子の各種の使用法
に関する。
【０００２】発明の背景 磁性ナノ粒子は、比較的大きい表面積と磁気的性質を有するので、広い範囲に
応用できる可能性がある。そのような応用の典型的な例としては磁気記憶装置、
磁気シーリング、Ｘ線増感、変圧器の製造、インダクター、オーディオおよびビ
デオ用のヘッド、ならびに各種の生体医学的用途(MRI用造影剤、細胞標識、細胞
分離、診断、ドラッグデリバリー、温熱療法、オリゴヌクレオチドおよびペプチ
ドの合成、好ましくない分子の解毒、固定化酵素、クロマトグラフィーなど)が
ある。
【０００３】 近年、磁気的性質を有するナノ粒子を合成しようとする努力が広く行われてき
た。磁性ナノ粒子の調製は非常に複雑であり、それは粒子の大きさの分布が狭く
、実質的に均一な粒子の集団を得ること、溶液中での凝集過程を最小限に減らす
ような条件を確保すること等が重要であるためであるが、これらの要因は磁性ナ
ノ粒子の作製に関わる多くの要因のうちのたった２つの要因にすぎない。一般的
には既存の方法は３つの主要なカテゴリーに分けられる。
【０００４】 第1の方法は適切なマトリクス中への磁性材料のマイクロカプセル化に基づい
たものである。例えば、Margelら, J. Immunol. Methods 28, 341(1979)は強磁
性流体粒子および適切な界面活性剤の存在下での適切なモノマーの不均一重合に
ついて述べている。この方法によって、通常はポリマーナノ粒子中に磁性流体粒
子を埋め込んで構成し、凝集を防ぐために界面活性剤でコートされた磁性粒子が
形成される。
【０００５】 第2の方法は、直接的に磁性酸化物を沈殿させることに基づくものであり、例
えばWO 88/06632で述べられているように、磁性酸化物、例えば磁鉄鉱(Fe３O４)
および/またはマグヘマイト(γFe２O３)を、鉄(II)塩および鉄(III)塩と接触さ
せ、その後、種々の表面処理を施すことにより沈殿させる。これらの方法によっ
て、典型的には、大きさの分布が狭い、安定な粒子が低収率で得られる。
【０００６】 第3の方法は、磁性コーティングの形成に基づくものであり、すなわち、成形
済の粒子の表面への酸化鉄またはフェライトのコーティングの形成を要する。M.
Abe, Proceedings of The Sixth International Conference on Ferrites (ICF
-6), Tokyo and Kyoto, Japan 1992, p.472-477、S. Nagahataら, Proceedings
of The Sixth International Conference on Ferrites (ICF-6), Tokyo and Kyo
to, Japan 1992, p.279-282、ならびにM. AbeおよびT. Itoh, Thin Solid Films
, 216, 155 (1992)は、表面にヒドロキシル基を有する成形済のポリアクリレー
トナノ粒子上にFe３O４または(Fe,M)３O４ [M＝Fe, Co, Niなど]の薄い磁性コー
ティングを施すことによる、大きさが約0.3μmから2−3μmまでの磁性ナノ粒子
の調製法、すなわち約0.3μmまたはそれ以上の大きさのナノ粒子を別途調製し、
次いでコーティング工程にかける調製法を発表している。
【０００７】 当業界で知られている別の方法は、成形済の粒子上に磁性コーティングを形成
させることに基づくもので、Margelら, WO 96/11054によって開示されている。
この開示によれば、約0.3μmから2−3μmまでの範囲の大きさの単分散磁性ナノ
粒子は、成形済のミクロンサイズの単分散ポリスチレン粒子(または類似の疎水
性粒子、例えばポリクロロメチルスチレン)上にフェライトまたは酸化鉄の薄い
磁性コーティングを施すことによって調製される。この工程では、磁性ナノ粒子
は、ポリビニルピロリドンなどの親水性界面活性剤でコートされたミクロンサイ
ズの成形済ポリスチレン粒子上に、鉄(II)塩および鉄(III)塩を重合させること
によって形成される。この工程は、界面活性剤-ポリスチレン粒子上に酸化鉄ア
イランドコーティングを施すものであるが、これは親水性界面活性剤によりコー
トされた、大きさが約0.3μmから2−3μmまでの範囲のポリスチレン粒子に限定
される。
【０００８】 米国特許第5,062,991号は、ゼラチン(タイプB)水溶液、FeCl２などの金属塩、
酸化剤としてNaNO３、およびアルカリ化剤として水酸化ナトリウムの存在下での
フェライトナノ粒子の調製法を開示している。米国特許第5,062,991号によれば
、ゼラチンは、核生成および形成された粒子の凝集からの防御の双方に用いられ
るが、それはすなわちゼラチンがコーティングの一部をなすことを意図している
。このようにゼラチンには核生成のための担体ビヒクルとしておよび安定化剤で
ある界面活性剤としての二元機能があるので、ゼラチンは比較的高い濃度で用い
られる。さらに、米国特許第5,062,991号は、ゼラチンタイプB(ゼラチン強度60
bloom)またはアルカリ処理ゼラチンに特定したものである。米国特許第5,062,99
1号では、その他のタイプのゼラチン、例えばタイプA、またはポリマー、例えば
デキストランおよびポリビニルピロリドンは磁性粒子の調製にはうまく用いるこ
とができなかった。米国特許第5,062,991号に示されている工程は大きさが0.1μ
mから1μmまでの範囲の粒子が得られるとされているが、この特許では直径が0.2
μm未満の粒子を満足すべき収率でかつ満足すべき大きさの分布で調製すること
を例示することはできていない。
【０００９】 従って、従来技術では大きさの分布の狭い、とりわけ大きさが0.3μm未満の、
特に0.1μm未満の磁性ナノ粒子を高収率で作製するための完全に満足のいく方法
は、これまで提供されていないことは明らかである。また、現在の当業界の方法
では、磁性コーティングをその上に施す基質材料として種々のものを用いること
はできず、さらに、従来技術で用いられる基質材料の濃度はかなり高い。これら
の非常に重要な特徴、すなわち、現在の当業界の方法に従って得ることのできる
粒子の大きさの分布、ならびにコートされるべき粒子を調製するために用いるこ
とのできる材料およびその材料の濃度範囲は、磁性粒子の応用範囲を著しく限定
している。作製された磁性ナノ粒子の大きさの分布が均一であることの重要性は
、不均一なコロイド性粒子は定義することおよび特徴づけることが困難であると
いう事実から来ている。不均一なコロイド性粒子はまた、製造時に存在する、ま
たは保存に伴って生ずる小さな非典型的な集団の検出を妨害する可能性がある。
コロイド性粒子の非典型的な副次的集団はヒトに注射する際の毒性の原因となり
うると考えられる。従って、そのような副次的集団が存在しないことを確認する
ことができれば、それは作製しうるコロイドの品質を向上させることとなる[S.
Palmacci, L. Josephson, およびE. Groman, WO 95/05669(1995)を参照せよ]。
また、大きさが0.1μm未満の磁性ナノ粒子を得ることができることは非常に重要
であるが、それはそのような大きさの粒子が特に好適ないくつかの用途があるか
らである。例えば、MRI用には約0.1μm未満の大きさの磁性粒子が好ましい[S. P
almacciら, WO 95/05669を参照せよ]。約0.1μm未満の大きさの磁性粒子の利点
を示す別の例としては、特異的細胞分離の分野がある[S. Miltenyiら, Cytometr
y 11, 231(1990); S.Miltenyi, WO 90/07380(1990)を参照せよ]。比較的高い濃
度の基質材料（その上に磁性金属酸化物を成長させる）の使用において、当業界
で現在用いられている方法によれば、これらの材料はナノ粒子に対して界面活性
剤安定剤としても働くと考えられるので、当業者であれば、このことによって最
終産物である磁性ナノ粒子の形成後に存在する過剰なポリマー基質を洗い流そう
とする際に、種々の困難が生ずることが理解されるであろう。
【００１０】 従って本発明の目的は上述の欠点を克服することである。とりわけ、本発明の
目的は、大きさが0.3μm未満の磁性ナノ粒子を、優れた収率で、その大きさの分
布が実質的に均一であるように調製する方法を提供することである。
【００１１】 本発明の別の目的は、経済的に利点があり、技術的により優れた方法を提供す
ることである。その方法は、磁性コーティングをその上に成長させるべき核の形
成のために広い範囲のポリマー基質を適用することができ、また適用するその基
質の濃度は比較的低いものでも良く、従って溶液中に存在する過剰のポリマー材
料によって生ずる困難性を排除し得ることによるものである。
【００１２】発明の要旨 本発明者らは、磁性金属酸化物をその上に成長させるのに適した核を作製し、
次いで磁性金属酸化物を簡単なやり方でそのように成長させることによって直接
的に磁性ナノ粒子を作製することができることを見出した。
【００１３】 本発明では、磁性金属酸化物によってコートされたナノ粒子の製造法は下記の
a)〜b)の工程を含んでなる： a) 可溶性ポリマー金属キレート化剤含有の水溶液を、1種以上の可溶性の金属塩
と接触させて金属イオンを生成させる工程であって、その際、その金属イオンの
少なくとも1種は磁性酸化物を形成することができ、その金属イオンの量は該キ
レート化剤の結合能を実質的に超えない量である、該工程； b)磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態で該金属イオンが存在するようにす
る工程； c)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； d)該金属塩の追加量を溶液中に添加する工程； e)磁性を有する酸化物の形成のために必要な酸化状態で該追加金属イオンが存在
するようにする工程； f)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； g)磁性金属酸化物でコートされた単分散ナノ粒子を得るために必要なだけの回数
、上記の工程d)〜f)を連続的に繰り返す工程。
【００１４】 "ナノ粒子"という用語は0.3μm未満の大きさの粒子を意味する。
【００１５】 "ポリマー金属キレート化剤"という用語は金属イオンのキレート化を意図して
いる。磁性金属酸化物をその上に成長させるべき核の形成のために用いられるポ
リマー金属キレート化剤は、金属イオンと結合しうる官能基、例えばアミノ基、
ヒドロキシル基、カルボキシラート基、-SH基、エーテル基、イミン基、リン酸
基、およびスルフィド基などを有するポリマーである。
【００１６】 本発明では好ましい磁性金属酸化物は、酸化鉄(とりわけ磁鉄鉱、マグヘマイ
ト、またはそれらの混合物)およびフェライトからなる群から選択されるもので
ある。それらの酸化鉄またはフェライトを形成するためには、可溶性金属キレー
ト化剤含有の溶液中に鉄が2種類の異なる酸化状態であるFe２＋およびFe３＋で
存在することが好ましい。2つの酸化状態は、工程a)およびb)に従って鉄(II)塩
および鉄(III)塩の混合物を添加すること、または鉄(II)塩もしくは鉄(III)塩を
添加し、必要に応じてFe２＋またはFe３＋の一部を他方の酸化状態に、好ましく
は各々酸化または場合により還元にて変換することによって、溶液中に存在する
ようにする。どちらの方法で生成させた場合も、Fe２＋とFe３＋のイオンのモル
濃度比は所望の磁性酸化物の組成のFe２＋とFe３＋イオンの比より高くならない
ようにすることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、工程a)およびd)に
おいて鉄(II)塩を溶液中に添加し、Fe３＋イオンを得るためにその一部を溶液中
に酸化剤を添加することによって酸化させる。
【００１７】 本発明の別の実施形態によれば、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成
することのできる他の金属塩が工程a)およびd)で提供される。これらの任意に用
いられる金属は典型的には遷移金属から選択される。
【００１８】 磁性金属酸化物を形成するために各種の金属イオン間の相互作用を起こさせる
には溶液のpHが7以上である必要がある。pHは、適切なバッファー溶液を工程a)
の水溶液として用いるか、または工程c)およびf)において溶液に塩基を添加する
ことによって所望の範囲に維持される。ひとたびpH値としてその7以上の範囲に
ある特定の値を選択した後は、最終産物の大きさの分布が実質的に均一となるこ
とを確保するために、そのpH値を磁性ナノ粒子の調製工程の全体にわたって維持
することが好ましい。
【００１９】 種々の成分を工程d)〜g)に従って溶液中に添加する際には以下の2つの異なる
操作様式にて行いうることは理解されるべきである。
【００２０】 1つの操作様式は段階的増加によるもので、以後段階的様式の操作と呼ぶが、
その操作様式では各成分(金属塩、酸化剤および塩基)を数回に分けて、好ましく
は毎回等量で、工程d)からg)で定めた順序で溶液に連続的に添加し、それらの工
程を磁性金属酸化物でコートされた所望のナノ粒子が得られるまで必要な回数繰
り返し、その各回の添加量は溶液中（すなわち粒子の表面上以外）での金属イオ
ンの重合を実質的に避けることのできる量とする。他方、連続した操作様式とは
、各成分(金属塩、酸化剤、および塩基)を工程d)からg)に定められた順序で、粒
子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一
な流速で、連続的に溶液中に添加するというものである。
【００２１】 第1の操作様式での各添加量、および第2の操作様式での流速は、実験によって
決定および調節される。、その実験は、溶液中の金属イオンの望ましくない重合
が時には肉眼的に見えるものであるか、または従来法の使用により同定しうるも
のであり、該重合が工程d)〜g)をより少ない添加量またはより遅い流速で行わね
ばならないことを意味するために行う。例えば、溶液が多分散性になったことを
示しうる、コールターカウンターに基づく光学的方法を適用しうる。また別に、
原子吸光などの分析方法を、溶液中の遊離の金属イオンが著しく高濃度になった
ことを測定するために用いることができる。
【００２２】 これらの操作様式では、各種成分を核の表面上への磁性金属酸化物の形成の速
度よりも遅いかまたは同等の速度で溶液中に添加するものとし、そのことによっ
て溶液中のそれらの成分が著しく高濃度へと増加して、望ましくない副反応(成
長しつつある粒子の境界の外部での金属塩の重合、および凝集プロセス)を引き
起こすことを避けられる。しかし、正確な説明がどうであろうとも、事実として
は上記の操作様式によって、大きさの分布の狭い、磁性金属酸化物でコートされ
た安定な単分散ナノ粒子が得られる。
【００２３】 工程d)からg)の繰り返しの回数は、どちらの操作様式を選択するか、および最
終のナノ粒子にどのような大きさを求めるかによって変わり、またそれらの工程
の後、上述の光学的方法を実施する。
【００２４】好ましい実施形態の詳細な説明 本発明では、磁性金属酸化物でコートされたナノ粒子の調製法は下記のa)〜b)
の工程を含んでなる： a) 可溶性ポリマー金属キレート化剤含有の水溶液を、1種以上の可溶性の金属塩
と接触させて金属イオンを生成させる工程であって、その際、その金属イオンの
うち少なくとも1種は磁性酸化物を形成することができ、その金属イオンの量は
該キレート化剤の結合能を実質的に超えない量である、該工程； b)磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態で該金属イオンが存在するようにす
る工程； c)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； d)該金属塩の追加量を溶液中に添加する工程； e)磁性を有する酸化物の形成のために必要な酸化状態で該追加金属イオンが存在
するようにする工程； f)溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； g)磁性金属酸化物でコートされた単分散ナノ粒子を得るために必要なだけの回数
、上記の工程d)〜f)の操作を連続的に繰り返す工程。
【００２５】 いかなる理論にも拘束されないが、工程a)〜c)を経て核が形成され、次にその
核の上に工程d)〜g)を経て磁性金属酸化物が成長すると考えられる。この機作は
図1に図示しているが、この図では単純化のために1つのポリマー金属キレート鎖
しか描かれていない。
【００２６】 従って本発明の1態様は、磁性金属酸化物でコートされ、その大きさが0.3μm
未満、好ましくは0.1μm未満であるナノ粒子の調製法に関する。該磁性ナノ粒子
は、ポリマー金属キレート化剤を含む核であってその上に磁性金属酸化物が成長
するものから、構成されるものである。当業者であれば、核と磁性コーティング
との重量％比が制御しうるものであることが理解されるであろう。すなわち、粒
子が小さくなればなるほど核の比率は高くなる。例えば、約0.2μm以上の粒子は
主として磁性金属酸化物コーティングからなり、核の重量％は比較的無視しうる
ものである。他方、約60〜70 nmの粒子では核の重量％は5〜20%の範囲となりう
る。
【００２７】 磁性金属酸化物をその上に成長させるべき核の形成のために用いられる、ポリ
マー金属キレート化剤は、金属イオンと結合しうる官能基、好ましくはアミノ基
、ヒドロキシル基、カルボキシラート基、-SH基、エーテル基、イミン基、リン
酸基、およびスルフィド基である基を有するポリマーである。ポリマーキレート
化剤は最も好ましくはゼラチン、ポリメチレンイミン、デキストラン、キトサン
、ポリリシン、およびポリビニルピロリドンからなる群から選択されるものであ
る。水溶液中のポリマーキレート化剤の濃度は0.01から10w/v%の間で、好ましく
は0.1から1w/v%の間で様々であり得る。
【００２８】 本発明では好ましい磁性金属酸化物は、酸化鉄(とりわけ磁鉄鉱、マグヘマイ
ト、またはそれらの混合物)およびフェライト、(Fe,M)３O４（このMは後ほど定
義する）からなる群から選択されるものである。それらの酸化鉄またはフェライ
トを形成するためには、可溶性金属キレート化剤含有の溶液中に鉄が2種類の異
なる酸化状態、Fe２＋およびFe３＋で存在することが好ましい。2つの酸化状態
はどちらも、工程a)およびb)に従って鉄(II)塩および鉄(III)塩の混合物を、好
ましくは所望の磁性酸化物の組成のFe２＋のFe３＋に対する比より高くないモル
比で添加すること、または鉄(II)塩もしくは鉄(III)塩を添加して、必要に応じ
てFe２＋またはFe３＋の一部を他方の酸化状態に、好ましくは酸化または場合に
より還元によって変換することにより、溶液中に存在できるようになる。この時
、酸化または還元された分の規模は、Fe２＋のFe３＋に対するモル比が所望の磁
性酸化物の組成の比より高くならないようにする。
【００２９】 本発明の好ましい実施形態では磁性金属酸化物コーティングは磁鉄鉱もしくは
マグヘマイト、またはそれらの混合物を含む。
【００３０】 本発明の別の好ましい実施形態では磁性コーティングを成す磁性金属酸化物は
フェライトである。フェライトコーティングを意図する場合には、工程a)および
d)で提供される金属塩は、鉄(II)塩または/および鉄(III)塩に加えて、任意に、
該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできるその他の金属塩
を含んでもよい。これらの任意の金属（Mで示す）は、典型的には遷移金属の中
から選択されるもので、最も好ましくはZn＋２、Co＋２、Mn＋２またはNi＋２の
塩であり、Fe２＋/M＋ｎのモル比（ここでM＋ｎは金属Mの陽イオンを示す）は選
択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でま
たは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好
ましい。
【００３１】 本発明の工程a)で水溶液中に添加される金属イオンの量は、溶液中に存在する
、そのイオンに対するポリマー金属キレート化剤の結合能によって決められる。
"ポリマーキレート化剤の結合能"という用語は、所定量のポリマー金属キレート
化剤に対して付着しうるある特定のイオンの最大量を意味する。このパラメータ
ーは非常に重要であるが、それは本発明者らにより、均一な単分散磁性ナノ粒子
の単一集団を高収率(ほぼ100%)で得るためには、工程a)で用いる金属塩の濃度は
金属イオンに対する上記のキレートポリマーの結合能と同等、またはそれを大き
く上回らないようにすべきであることが見出されたためであり、それによって磁
性コーティングの著しい成長が開始される前に実質的に全ての核が形成されるこ
ととなる。所定のポリマー金属キレート化剤の結合能は当業界で既知の方法によ
ってあらかじめ測定しておくこともできる。そのような方法の1つを実施例1に記
載し図2に示している。
【００３２】 本発明の好ましい磁性金属酸化物のコーティングを作製するためには、通常は
可溶性金属キレート化剤含有の溶液中に鉄が2種類の異なる酸化状態、Fe２＋お
よびFe３＋で存在することが好ましい。本発明の好ましい1実施形態においては
、工程a)で供給される金属塩は鉄(II)塩からなる。工程b)に従ってFe２＋イオン
の一部をFe３＋に変換するために、好ましくは溶液中に酸化剤を添加することに
よって酸化反応を行い、そのことによってFe２＋の一部をFe３＋に酸化するが、
その一部分は酸化の結果得られるFe２＋のFe３＋に対する比率が所望の磁性酸化
物の組成中の比率より高くないようにする。本発明の好ましい1実施形態におい
ては、溶液中のFe２＋のFe３＋に対する望ましい比率は1:2より高くてはならず
、従ってその溶液中に工程a)またはd)で添加されるFe２＋の量の2/3以下の量、
好ましくはそれ以下の量が酸化反応を受ける。酸化剤は好ましくは酸素、過酸化
水素、亜硝酸塩、または硝酸塩からなる群から選択されるものである。本発明の
好ましい酸化剤は亜硝酸塩および硝酸塩、とりわけ亜硝酸および硝酸のアルカリ
金属塩である。驚くべきことに、磁性ナノ粒子の大きさの分布が所望のとおり狭
いものを得るためには、亜硝酸(または硝酸)/ Fe２＋の望ましいモル比は好まし
くは2/3以下、好ましくは1/2未満、好ましい比は約1/5であることが、本発明者
らにより見出された。酸化剤は固形または溶液の形で、また任意に塩基性バッフ
ァー溶液の形で提供することができる。
【００３３】 バッファー溶液を工程a)でのポリマー金属キレート化剤含有の水溶液として、
または場合により、工程b)での酸化剤溶液とし、用いない場合には、工程c)およ
びf)で溶液のpH値を7以上に維持するために塩基を溶液に添加すべきである。好
ましくは、溶液のpHは7〜11の範囲、最も好ましいのはpH8〜10である。いったん
あるpH値を7またはそれ以上の範囲内にて選択した後は、最終産物の大きさの分
布を実質的に均一なものとするために、磁性ナノ粒子の調製工程全体を通じてそ
のpH値を維持することが好ましい。本発明の別の好ましい実施形態では、初期pH
値を工程c)まで維持し、第2のpH値は工程f)まで維持するが、それらの値は7以上
の範囲にあり、第2のpH値は好ましくはより高い値とする。本発明で用いること
のできる塩基は水酸化アルカリ、アンモニア、または有機塩基、好ましくはアミ
ンからなる群から選択することができる。
【００３４】 前述のとおり、本発明の工程d)〜g)は、段階的または連続的操作様式を適用す
ることにより、大きさの分布が狭い粒子が形成され副反応(例えば水溶液中での
金属塩の重合、および凝集プロセス)を避けられるように、制御されたやり方で
行われる。
【００３５】 もし工程d)〜g)が上述のような制御されたやり方で行われない場合には、その
結果凝集した粒子がかなりの部分を占め、および/または大きさの分布の広い粒
子の集団が形成されることは注目すべきである。
【００３６】 本発明の磁性金属酸化物でコートされたナノ粒子の調製法は、100℃未満の温
度範囲で行い、通常は50℃から90℃の間の温度が好ましい。典型的には約60℃の
温度が用いられる。
【００３７】 本発明の別の態様は、中空の磁性ナノ粒子の調製に関する。この態様では、そ
ういった中空磁性ナノ粒子は、ポリマー金属キレート化剤で作られた内部の核を
、不活性雰囲気中でバーンオフさせることによって該粒子から除去して得られる
。好ましい1実施形態では磁性ナノ粒子を400から1000℃の範囲、好ましくは500
から900℃の範囲の温度下におくことによって、そのバーンオフがなされる。
【００３８】 本発明の別の態様は、大きさが0.3μm未満、好ましくは0.1μm未満であって、
金属キレート化剤のポリマーからなり、磁性金属酸化物でコートされたナノ粒子
に関する。本発明のまた別の態様は、大きさが0.3μm未満、好ましくは0.1μm未
満であって、磁性金属酸化物の殻からなる中空のナノ粒子に関する。
【００３９】 本発明のまた別の態様は、本発明の磁性ナノ粒子の、種々の生物学的および医
学的用途における使用に関する。
【００４０】 本発明の好ましい1実施形態では、生物学的および医学的用途は細胞標識、細
胞分離、制御放出、診断、酵素固定、タンパク質精製、MRIおよびソノ-イメージ
ング用造影剤、ドラッグデリバリー、および重金属イオンのキレート化からなる
群から選択されるものである。
【００４１】 本発明の好ましい1実施形態では、官能基を有する分子を本発明の磁性ナノ粒
子の磁性表面に付着させて粒子上に所望の官能基のコーティングを作る。好まし
くは、その分子は、多糖類、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびω−シ
ラン Si(OR)３(CH２)ｎX(式中、Rはアルキル置換基であり、nは1から18の整数で
あり(1,18を含む)、XはNH２、CH３、CN、およびSHからなる群から選択される官
能基である)の中から選択されるポリマーを含む。該分子により供給される官能
基のうち、アミン基、またはアミン基に変換しうるその他の官能基は特に重要で
あるが、それはこれらの基へのポリアルデヒドリガンドの共有結合をさらに利用
しうるからである。本発明のまた別の好ましい実施形態においては、活性化リガ
ンド、好ましくは塩化アクリロイル、ジビニルスルホン、ジカルボニルイミダゾ
ール、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)、および
m-マレイミド安息香酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルからなる群か
ら選択されるしたものは、磁性ナノ粒子の表面上にある官能基に付着されて、該
活性化リガンドがナノ粒子の表面を生体活性化合物がさらに結合するために適し
たものとする。好ましくは、生体活性物質は、所望の生物学的または生体医学的
用途に応じてタンパク質、酵素、抗体、および薬剤の中から選択されるものであ
る。
【００４２】 上述のとおり、いくつかの用途では、例えば特異的細胞分離、ドラッグデリバ
リー、有機溶媒中での反応、などでは、凝集プロセスに対して粒子を安定化させ
るため、または所望の表面官能基を導入するために、磁性ナノ粒子の表面を改変
することが不可欠である。表面の改変は当業界で既知の方法によってなされ、そ
れは好ましくは水溶液中で行われる。Si(OR)３(CH２)ｎX(X＝CH３、NH２、SHな
ど)などのω−アルキルシラン化合物を用いた磁性粒子の改変は、P.Wikstromら,
J. of Chromatography 455, 105(1988)およびS. Brandrissら, Langmuir 9, 12
32(1993)に述べられているプロセスと同様のプロセスで水溶液中で行った。例え
ば、末端アミン基を有するω−アルキルシラン化合物と結合した粒子は極性溶媒
中に容易に懸濁しうるが、末端メチル基を有するω−アルキルシラン化合物と結
合した粒子は非極性溶媒中に容易に懸濁しうる。デキストラン、およびデキスト
ランビオチンなどのデキストラン誘導体などの多糖類による磁性ナノ粒子の表面
のコーティングは、通常は多糖類水溶液中にフェライト懸濁液を高温(例えば80
℃)で適切な時間混合し、次いでそれを室温まで冷却することによって行われる
。セルロースをコートしたナノ粒子は、室温でフェライトの懸濁液をキサントゲ
ン酸セルロースの水溶液中に混合し、次いで懸濁液の温度を約90℃に上昇させる
ことによってキサントゲン酸セルロースをセルロースに加水分解して、作製した
。キトサンでコートしたナノ粒子は、pHを>7、すなわちpH 9.5に保持したフェラ
イトでコートしたナノ粒子上に酸性キトサン水溶液を沈殿させることによって調
製した。次に多糖類でコートしたフェライトナノ粒子は、透析、ゲルろ過カラム
、磁場、または高磁場勾配(HMFG)によるなどの方法によって過剰の未結合多糖類
を洗い落としす。以後、磁気分離は溶液からのナノ粒子の分離のために永久磁石
または高磁場勾配を用いることを意味する。
【００４３】 本発明の好ましい1実施形態では、磁性ナノ粒子表面へのタンパク質、好まし
くはアルブミンなどのタンパク質、ポリリシン、およびポリリシンとグルタミン
酸のコポリマーを用いたコーティングは、金属酸化物懸濁液をタンパク質の水溶
液中に塩基性pH、例えばpH 9.5で適切な時間混合することによって行われる。ア
ルブミンでコートした磁性ナノ粒子は次いで前述のやり方で未結合のアルブミン
を洗い落とした。ゼラチンでコートしたナノ粒子は高温(約60℃)でフェライト懸
濁液をゼラチンの水溶液中に適切な時間混合することによって調製した。次いで
温度を室温まで下げ、ゼラチンでコートした粒子を前述のやり方で洗った。
【００４４】 ドラッグデリバリーおよび制御放出、MRIおよびソノ-イメージングなどの生体
医学的用途には、ポリマー金属キレート化剤および上述の磁性ナノ粒子上に機能
性コーティングを形成するために用いられるポリマーは、例えばゼラチンまたは
キトサンのようなキレートポリマーなどの、生体適合性があり、無毒で生物分解
性の物質から選択される。
【００４５】 生体活性のあるコンジュゲートされた粒子の調製のための活性化磁性ナノ粒子
は、機能性にコートした粒子をカルボニルジイミダゾール、塩化アクリロイル、
ジビニルスルホン[DVS]、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスク
シナート)[スルホ−EGS]およびm−マレイミド安息香酸N−ヒドロキシスルホスク
シンイミドエステル[スルホ−MBS]などの特異的活性化リガンドと相互作用させ
ることによって、調製した。次いでナノ粒子の機能性コーティングの残存官能基
をブロックした。続いて、例えばタンパク質、酵素、抗体、薬剤などの生体活性
剤を、磁性ナノ粒子の機能性コーティングに付着している活性化リガンドと共有
結合させた。次に活性化リガンドの残存活性基をブロックまたは加水分解した。
次いで生体活性を有する磁性コンジュゲート化ナノ粒子を異なる生体医学的用途
に用いた。
【００４６】 本発明の別の態様は、磁性ナノ粒子内への活性物質のマイクロカプセル化に関
する。このマイクロカプセル化は、例えば薬剤、または蛍光色素などの活性物質
をそれ自体または適切なリガンドに結合された形のいずれかで工程a)の水溶液中
に添加することによってなされ、磁性金属酸化物コーティングが活性物質を囲い
込んだマイクロカプセル化された磁性ナノ粒子が作製される。
【００４７】 さらに好ましい1実施形態においては、空気などの気体で満たされた本発明の
中空磁性ナノ粒子は、アルブミンまたはSpan 60およびTween 80から調製した中
空ナノ粒子[M.A. WheatleyおよびS. Singhal, Reactive Polymers 25, 157(1995
)を参照せよ]、ならびにフェライトでコートした有孔シリカナノ粒子[M. Zhang,
Y. KitamotoおよびM. Abe, J. Phys IV France 7, C1-669(1997)を参照せよ]に
ついて既に述べられているようにソノ-イメージング超音波造影などの用途に用
いることができる。
【００４８】 上の記述および例示の全ては説明のために提示したものであり、本発明をいか
ようにも限定することを意図したものではない。本発明のプロセスには多数の改
変を行うことができる。例えば、異なるキレートポリマーを用いることができ、
異なるフェライト組成物および異なるコーティングを本発明の範囲を逸脱するこ
となく調製することができる。
【００４９】実施例 実施例1 ゼラチンの鉄イオンに対するキレート形成能 ゼラチン(ブタの皮膚から製したタイプA、300 bloom−Sigma)の鉄イオンに対
するキレート形成能をゼラチン水溶液の鉄イオンでの滴定を酸化剤、例えばNaNO ２ およびNaNO３などの存在しない条件および存在条件下で行って測定した。キレ
ート形成能はゼラチン溶液中への鉄イオンの添加の間のpHの変化を追跡すること
によって測定した。pHは鉄イオンがゼラチンによってキレート化されている限り
は顕著には変化しない。鉄イオンに対するゼラチンのキレート形成能は水溶液中
の遊離の鉄イオンが著しく多量に存在するようになればその結果水溶液のpHが急
激に低下することによって示される。
【００５０】実施例1-A 典型的な実験において、0.3%(w/v)のゼラチン含有の脱気した水溶液
(10mLを60℃で振盪)中に参照鉄溶液(5mLの蒸留水中に7 mmolのFeCl２・4H２Oを
含む)を10μLずつ段階的に添加することによってFe(II)イオンで滴定した。参照
鉄溶液の各回の添加量の各々には0.014 mmolのFe(II)イオンが含まれ、各回の添
加の間隔は約3分とした。
【００５１】実施例1-B 酸化剤NaNO３(0.0028 mmol)の添加を各回の鉄溶液の添加前に行った
ことを除いては、実験1-Aと同じことを繰り返した。
【００５２】実施例1-C NaNO３の代わりにNaNO２を用いて実験1-Bを繰り返した。
【００５３】 図2：A-Cは上記の実験条件下では30mgのゼラチン(10mL溶液中に0.3%)の鉄イオ
ンに対するキレート形成能は0.05−0.07 mmol鉄イオンの間であることを示して
いる。上記の実験条件下では、均一な磁性ナノ粒子を形成させるためには、核生
成ステップでのFe(II)塩の添加はゼラチンの鉄塩に対する結合能を著しく超えて
はならない；そうでなければ、多分散磁性ナノ粒子の形成ならびに粒子の凝集な
どの副反応が生ずる可能性がある。
【００５４】実施例2 ゼラチンを用いた磁性ナノ粒子の調製：段階的添加対単回全量添加 実施例2-A：段階的添加 典型的な1実験では、0.1%(w/v)ゼラチン含有の脱気した水溶液10mLを60℃で振
盪した。FeCl２・4H２O(0.07 mmol)およびNaNO２(0.014 mmol)含有の固形サンプ
ルを連続的にゼラチン溶液に添加した(NaNO２は鉄塩の溶解直後に添加した)。次
いでその溶液のpHを、ゼラチン溶液中にNaOH溶液(0.3 M)を添加することによっ
て9.5へと上昇させた。磁性酸化物の形成反応は約5分間継続させた。その後、前
述の方法(FeCl２・4H２O、NaNO２、およびpH9.5へのNaOHの連続的に添加)を2回
反復した。
【００５５】実施例2-B：単回全量添加 FeCl２・4H２O、NaNO２、およびNaOHの3回の連続的に添加の代わりにこれらの
試薬(0.21 mmol FeCl２・4H２O、0.04 mmol NaNO２、および0.3M NaOHでpH 9.5
とし、反応時間 15分、実施例2-Aのとおり)を単回全量添加して、実施例2-Aを
繰り返した。
【００５６】 表1および図3と4は実験2-Aと2-Bの主な相異点を要約し示したものである。
【００５７】
【表１】表1：ゼラチン溶液中へのFeCl２・4H２OおよびNaNO２の単回添加および段階的添
加によって形成された磁性酸化物の比較。 実施例2は、重合剤をゼラチン溶液中に同様の濃度で段階的添加と単回全量添
加によって形成した磁性酸化物の主な相異点を示している。段階的添加すること
によって形成した磁性酸化物ナノ粒子は大きさの分布の範囲の狭い単分散された
ものであった。湿潤状態では平均粒子径はコールターカウンターによる測定では
92nmであり(図3A)、乾燥状態では平均粒子径はSEM測定で約15nmである(図4)。添
加された鉄塩のほぼ100%が磁性コーティングに用いられた(水溶液中には粒子の
部分を除いてはわずかの量の鉄塩しか認められなかった)。その磁性ナノ粒子は
非常によく分散されており数ヶ月間を経ても沈殿しなかった。他方、単回全量添
加によって形成した磁性粒子はその大きさの分布幅が広く、凝集した粒子を高い
比率で含んでいた。また、その懸濁液は不安定で短期間のうちに大多数の粒子が
沈殿し、超音波処理後ですら粒子は懸濁性が悪く非常に速やかに凝集し沈殿した
。
【００５８】実施例3 表2に示すとおり、酸化剤としてNaNO２の代わりにNaNO３を用い、0.1%(w/v)ゼ
ラチンの代わりに0.3%(w/v)を用いて、実施例2を繰り返した。
【００５９】
【表２】表2：FeCl２・4H２OおよびNaNO３のゼラチン溶液中への添加を段階的に行ったと
きと単回全量添加したときに形成された磁性酸化物の比較。 この実験(表2および図5を参照せよ)では、実施例2で述べたものと同様の挙動
であったが、それはすなわち、重合剤のゼラチン溶液中への段階的添加によって
形成された磁性ナノ粒子の方が、重合剤の同様の濃度のものを単回全量投与した
場合より著しく優れたものであった。
【００６０】 段階的に添加することによって調製した磁性ナノ粒子は大きさの分布の範囲の
狭い単分散されたものであり、平均粒子径は65nmであった(これは表1に示す0.1%
ゼラチンの存在下で形成させたもの(92nm)より小さかった)。添加された鉄塩の
ほぼ100%が磁性コーティングに用いられた。その磁性ナノ粒子は非常によく分散
されており数ヶ月間を経ても沈殿しなかった。他方、単回全量添加によって形成
した磁性粒子の懸濁液は不安定で、その大きさの分布幅が広く、凝集した粒子を
高い比率で含んでいた。
【００６１】実施例4 ゼラチンの代わりにポリエチレンイミンを使用 ゼラチンの代わりに平均分子量50,000のポリエチレンイミンを用いて実施例3
を繰り返した。ナノ粒子の平均粒子径が異なったこと、例えば段階的添加で形成
させた粒子では190±40nmで、単回全量添加では380±300nmであったことを除い
ては、段階的添加と単回全量添加との間には前述のものと同様な相異が認められ
た。
【００６２】実施例5 実施例3で述べたものと同様の実験を、液状のものの代わりに固体のFeCl２・4
H２OおよびNaNO３サンプルを用いて行った。この実験用としてFeCl２・4H２O(2.
1g/5mL 0.1N HCl)およびNaNO３(0.5g/5mL H２O)を含有する参照水溶液を調製し
、下記のやり方で用いた：0.3%(w/v)ゼラチン含有の脱気した水溶液10mLを60℃
で振盪した。FeCl２・4H２OおよびNaNO３を含有するサンプルを連続的にゼラチ
ン溶液中に添加した(NaNO３は鉄塩の添加の1分後に添加した)。溶液のpHはNaOH(
1.0N)の添加によって9.5に上げた。反応は段階的に(各段階では同量を使用)、ま
たは単回で、表3に従って行った。段階的添加と単回添加の双方ともに合計の反
応時間は15分とした。
【００６３】
【表３】表3：FeCl２・4H２OおよびNaNO３水溶液のゼラチン溶液中への添加を段階的に行
ったときと単回全量添加したときに形成された磁性酸化物の比較。 実施例3で述べた段階的添加(表3-A)と単回全量添加(表3-B & C)との間の相異
と同様なものが認められた。例えば図6は、表3-Bで詳細を示した単回全量投与に
よって形成された凝集した粒子を示している典型的なSEM像である。
【００６４】実施例6 pHの影響 pH9.5の代わりにpH7.0およびpH11.0を用いて実施例5を繰り返した。同様な結
果が観察された。
【００６５】実施例7 温度の影響 60℃の代わりに50℃および90℃を用いて実施例5を繰り返した。同様な結果が
観察された。
【００６６】実施例8 金属フェライトの調製 Fe(II)塩の代わりに、Fe(II)塩とMn(II)、Co(II)、Ni(II)およびZn(II)からな
る群から選択されたもう1種の別の金属イオンとの混合物を用いて実施例5を繰り
返した。Fe(II)/M(II)のモル比は2/1に維持し、M(II)タイプの金属塩の大部分は
硝酸塩型であった。コールターカウンターでの測定では段階的添加によって形成
した粒子は大きさの分布が狭くその大きさは金属イオンのタイプによって異なり
、約50nmから150nmの範囲であった。他方、単回全量添加によって形成したフェ
ライト粒子はその大きさの分布が広く、著しい量の凝集粒子を含んでいた。
【００６７】実施例9 NO３ −/ Fe２＋のモル比の変更 NO３ −/ Fe２＋のモル比を1:20；1:5；1:2および1:1として実施例5-A(段階的
添加)を繰り返した。モル比1:1を用いて形成させた磁性粒子は大きさの分布が広
く凝集した粒子を著しい割合で含んでいた。他方、その他のモル比で調製された
磁性ナノ粒子は大きさの分布が狭くそれぞれ類似の直径(約65nm)を持ち、実施例
5-Aで調製した磁性ナノ粒子と類似の挙動を示した。
【００６８】実施例10 蛍光磁性ナノ粒子の調製 ゼラチン溶液の代わりに2mgのローダミンBイソチオシアネート含有の同様な溶
液を用いて実施例5-Aを繰り返した。過剰な蛍光試薬は透析で除去した。類似の
特性を持つ蛍光磁性ナノ粒子が形成された。蛍光ナノ粒子は所望の蛍光分子を実
施例23に従って粒子の表面に結合させることによっても調製される。
【００６９】実施例11 NaOHの代わりにNH４OHおよび(CH３)３NOHを使用 NaOHの代わりにNH４OHおよび(CH３)３NOHを用いて実施例5を繰り返した。同様
な結果が得られた。
【００７０】実施例12 アドリアマイシンなどの薬剤の磁性ナノ粒子中へのマイクロカプセル化 ゼラチン溶液の代わりに10mgのアドリアマイシン含有の同様な溶液を用いて実
施例5-Aを繰り返した。過剰のアドリアマイシンは磁場または透析によって除去
した。これによってアドリアマイシン含有の磁性ナノ粒子が形成された。また、
アドリアマイシンを適切なポリマー、例えば末端に塩化アシル基を有するポリエ
チレングリコールなどと共有結合で結合させて前述のマイクロカプセル化法を繰
り返すこともできる。
【００７１】実施例13 鉄塩溶液および酸化剤溶液の代わりに双方の試薬を含有する単一の溶液を用いる
こと 鉄塩溶液および酸化剤溶液の代わりに双方の試薬を含有する単一の溶液(双方
の濃度は維持したまま)を用いて実施例5を繰り返した。同様の結果が得られた。
【００７２】実施例14 Fe２＋および酸化剤の溶液の代わりにFe２＋とFe３＋の塩の混合物を含有する単
一の溶液を用いること Fe２＋塩および酸化剤の溶液の代わりにFe２＋とFe３＋の塩の混合物を含有す
る溶液を用いて実施例13を繰り返した。それらの量は：[Fe３＋]＝[NaNO３]、[F
e２＋]＝[Fe２＋]−[NaNO３]、式の右辺の量は実施例5で定義されたとおりとし
た。 同様な結果が得られた。
【００７３】実施例15 重合剤の連続的添加 重合剤の添加を段階的に行う方法の代わりに、次の条件で連続的に添加する方
法を用いて実施例5を繰り返した；鉄塩溶液を2.1μL/minの流速で100μL、酸化
剤溶液を0.8μL/minの流速で36μL、およびNaOH溶液を7.5μL/minの流速で365μ
L。酸化剤溶液および塩基溶液は鉄塩溶液の添加のそれぞれ約30秒後および60秒
後に添加した。反応時間の合計は約50分であった。同様な結果が得られた。
【００７４】 重合剤を約3倍の速さで添加しても同様の結果が得られたため、この方法では
コーティングプロセスは約16分で完了する。
【００７５】実施例16 磁性ナノ粒子の核生成と成長 この実験では、磁性粒子の核生成と成長が実施例5で述べたものと同様のやり
方で、表4に従って行われた。
【００７６】
【表４】表4：磁性ナノ粒子の核生成と成長 実験A-Cは核生成の大きさはキレートポリマーによって決定することを示して
いる。粒子の平均の大きさはこれらの全実験で65nmであったが実験Cの粒子の濃
度はAおよびBの濃度より著しく高かった。また、実験AおよびBでは鉄(II)濃度は
核の全てを形成するためには十分ではなく、懸濁液の色調は水に可溶性の鉄(II)
-ゼラチン(これはまだ核生成ステップに至っていないものである)のために黄褐
色であった。実験Cでは鉄(II)の濃度はより高く、核の全てではないかもしれな
いが大多数の形成を完了するためには十分なものである。実験CおよびDは磁性ナ
ノ粒子の成長、すなわち湿潤状態では約65nmから約90nm(表4)まで、乾燥状態で
は約10nmから約25nmまでの成長を示している(図7)。
【００７７】実施例17 中空磁性ナノ粒子の調製 中空磁性ナノ粒子は、実施例5の説明と同様の方法で調製された磁性粒子の有
機物のコアを表5に従ってバーンオフすることによって調製した。この実験はTGA
(Mettler TC11 TA プロセッサーの熱重量分析装置)を用いて不活性雰囲気下で行
った。各実験で10mgのナノ粒子を110℃で15分間保持して水分を除去し、次いで
温度を900℃まで上昇させ(10°/min)約30分かけてゼラチンのコアをバーンオフ
した。
【００７８】
【表５】表5：磁性ナノ粒子の有機物のコアのバーンオフ * NaNO３の代わりにNaNO２を用いた。
【００７９】 表5は磁性コーティングの厚さが増加するに連れて有機物コアの％が減少した
ことを示している。磁気測定結果はこれらの粒子は燃焼プロセスの前後で磁化率
が同様であることを示している。
【００８０】実施例18 キレートポリマーとしてPVPを用いた磁性ナノ粒子の調製 ゼラチンの代わりに平均分子量が160,000のポリビニルピロリドン(PVP)を表6
に従って用い、実施例5を繰り返した。同様の結論が観察された。また、粒子が
成長を続けて約160nmから約300nmに至るようにすることが可能であり、約300nm
以上では凝集プロセスを防止することが困難であることも見出された。
【００８１】
【表６】表6：FeCl２・4H２OおよびNaNO３水溶液のPVP溶液中への添加を段階的に行った
ときと単回全量添加したときに形成された磁性ナノ粒子の比較。 * SEM測定では平均粒子径が約5−6nmの大きさの、分布の狭い粒子であることが
示された。
【００８２】実施例19 キレートポリマーとして異なる分子量のデキストランを用いた磁性ナノ粒子の調
製 PVPの代わりに異なる分子量のデキストランを用いて表7に従って実施例18を繰
り返した。
【００８３】
【表７】表7：デキストランの分子量が磁性ナノ粒子に及ぼす影響 この実験は、安定な単分散粒子を得るために添加する重合剤の濃度は、キレー
トポリマーの分子量に高度に依存することを示している。例えば、類似の濃度の
下でも(実験A & B)低い分子量(41k)のデキストランの存在下で形成させた粒子は
不安定でかなりの凝集したものを含んでいたが、一方より高い分子量(580K)のデ
キストランの存在下で形成させた粒子は安定で、粒子の大きさの分布が比較的狭
い単分散なものであった。
【００８４】実施例20 磁性ナノ粒子の磁気測定 実施例5を表8に従って繰り返した。磁化率は磁力計 (VSM Oxford Instrument
Vibrating Sample Magnetometer)で測定した。これらの実験で調製した粒子の磁
気モーメント/磁場を示す磁化曲線は250°Kで記録したものであるが、それは単
一ドメイン粒子による超常磁性の挙動を示している。
【００８５】
【表８】表8：磁性ナノ粒子の磁化率 実施例21 磁性ナノ粒子の凍結乾燥 10%(w/v)マンニトール、または1%(w/v)デキストラン、または0.25%(w/v)アル
ブミンを含有する、水で洗ったナノ粒子(実施例5-A、8(段階的添加)および17-A
で調製したもの)を凍結乾燥した。凍結乾燥させた粉末は、水で(またはその他の
生理学的溶媒で)湿潤化した粉末をボルテックスすることによって容易に分散さ
せてもとの懸濁液とすることができる。
【００８６】実施例22 磁性ナノ粒子の表面の改変 磁性ナノ粒子の表面の改変は、ωの位置に官能基を有するアルキルシラン化合
物、タンパク質、および多糖類などの試薬を用いて行った。例えば、典型的な表
面改変法を下記に述べる：1. ω−アルキルシラン化合物、すなわちSi(OEt)３(CH２)３NH２を用いた磁性
ナノ粒子のコーティング。 1-A： 典型的な実験において、実施例5-A、8、17、および22で調製した磁性ナノ
粒子(粒子は60℃でpH9.5とした)5mL中に0.1mLの両親媒性のSi(OEt)３(CH２)３NH ２ を添加した。懸濁液を約12時間振盪した。その後、第1アミン誘導体化粒子を
磁場をかけるかまたは透析によって水でよく洗った。洗浄済のコーティングされ
た磁性ナノ粒子を凍結乾燥、または室温もしくは4℃で水溶液中で保存した。
【００８７】 他のω−アルキルシラン化合物、例えばSi(OEt)３(CH２)３X(式中、XはCH３、
SH、およびエポキシドである)を用いて同様の操作を行った。親水性ω−基、例
えば第1アミンでコーティングされた磁性ナノ粒子は極性溶媒(例えば水)中に容
易に分散するが、非極性溶媒(例えばトルエン)中では凝集体を形成した。他方、
疎水性ω−基、例えばCH３でコーティングされたナノ粒子は非極性溶媒中では容
易に分散したが、極性溶媒中では凝集体を形成した。
【００８８】 ω−アルデヒド基を含有する磁性ナノ粒子は、上述の説明に従って調製したω
−第1アミン誘導体化粒子を1%(w/v)グルタールアルデヒドと室温(またはそれよ
り高温)で約3時間反応させることによって作製した。ω−アルデヒド誘導体化粒
子を磁場をかけるかまたは透析によって水でよく洗い、前述のとおり保存した。
【００８９】1-B： 典型的な実験では、1-Aに記載の磁性ナノ粒子5mLを酢酸バッファー0.1M, p
H5.5に対して透析した。次いで懸濁液を約12時間60℃でω−アルキルシラン化合
物、すなわちSi(OEt)３(CH２)３NH２とともに振盪した。誘導体化粒子の洗浄お
よびグルタールアルデヒドによる誘導体化は前述(1-A)の方法に従って行った。
【００９０】1-C： 典型的な実験では、磁性粒子の5mLを、5mLのグリセロールで希釈した。次
いで0.1mLの両親媒性Si(OEt)３(CH２)３NH２をグリセロール/水懸濁液中に添加
した。その懸濁液を60℃で約3時間攪拌した。その後、グリセロール懸濁液から
全ての水と未結合の両親媒性物質が蒸発するまで温度を約150℃に上げた。誘導
体化粒子の洗浄およびグルタールアルデヒドによる誘導体化は前述(1-A)の方法
に従って行った。
【００９１】2. タンパク質を用いた磁性ナノ粒子のコーティング BSAでのコーティング。 典型的な実験では、実施例5-A、8、17、および22(60
℃でpH9.5)に従って調製された磁性ナノ粒子5mLを、60℃(または室温)の1-4%(w/
v)ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液5mL中に添加した。次いでその懸濁液を60℃で
(または室温で)4時間、次いで室温で12時間振盪した。次いでBSAコーティングさ
れた粒子を磁場をかけるかまたは透析によって水でよく洗った。洗浄済のコーテ
ィング磁性ナノ粒子を凍結乾燥するかまたは水溶液中で4℃で保存した。
【００９２】 他のタンパク質、ペプチド、およびポリアミン、例えばヒト血清アルブミン、
ゼラチン、カゼイン、ポリリジン、リジンとグルタミン酸の共重合体、およびポ
リエチレンイミンなどを用いて同様の操作を行った。
【００９３】3. 多糖類を用いた磁性ナノ粒子のコーティング 3-A： デキストランを用いた磁性ナノ粒子のコーティング。
【００９４】 典型的な実験において、実施例5-A、8、17、および22(60℃でpH9.5)に従って
調製された磁性ナノ粒子5mLを、80℃の1%(w/v)デキストラン(分子量41,000)水溶
液5mL中に添加した。次いでその懸濁液を80℃で4時間、次いで室温で12時間振盪
した。デキストランがコーティングされた粒子を磁場をかけるかまたは透析によ
って水でよく洗った。洗浄済のコーティング磁性ナノ粒子を凍結乾燥するかまた
は水溶液中で室温もしくは4℃にて保存した。デキストランのコーティングを80
℃の代わりに室温で同様なプロセスで行った。同様なデキストランコーティング
含量が得られた。
【００９５】 多糖類の別の誘導体、例えばデキストラン-ビオチン、カルボキシメチルセル
ロース、およびデンプンなどを用いて同様のプロセスで磁性ナノ粒子のコーティ
ングを行った。
【００９６】3-B： セルロースを用いた磁性ナノ粒子のコーティング3-B-I： 典型的な実験において、実施例5-A、8、および22(粒子はpH9.5で室温ま
で冷却した)に従って調製された磁性ナノ粒子5mL中に、1%(w/v)キサントゲン酸
セルロース水溶液を添加した。次いでその懸濁液を4時間振盪し、次いで約80℃
に加熱しさらに4時間、キサントゲン酸基を加水分解するために振盪した。次い
でセルロースコーティング粒子に磁場をかけて遊離のセルロースを水でよく洗っ
た。洗浄済のコーティング磁性ナノ粒子を凍結乾燥するかまたは水溶液中で室温
もしくは4℃で保存した。
【００９７】3-B-II： 典型的な実験において、実施例5-A、8、および22(粒子はpH9.5で室温ま
で冷却した)に従って調製された磁性ナノ粒子5mL中に、1mLの1%(w/v)キサントゲ
ン酸セルロース水溶液を添加した。次いでそのキサントゲン酸セルロースをコー
ティングした磁性ナノ粒子を室温でpH9.5の水溶液で磁場をかけて洗った。次い
で懸濁液を約80℃に加熱し3-B-Iに述べたとおり処理した。
【００９８】3-C： キトサンを用いた磁性ナノ粒子のコーティング 典型的な実験において、実施例5-A、8、17、および22(粒子はpH9.5で室温まで
冷却した)に従って調製された磁性ナノ粒子5mL中に、1mLの0.1−1%(w/v)キトサ
ン水溶液pH3.0を滴下して添加した。キトサンは選択的にナノ粒子上に沈殿した
。次いでキトサンコーティング粒子に磁場をかけて水でよく洗って遊離のキトサ
ンを除去した。洗浄済のコーティングされた磁性ナノ粒子を凍結乾燥するかまた
は水溶液中で室温もしくは4℃で保存した。
【００９９】4. チオール試薬を用いた磁性ナノ粒子の誘導体化 デキストランの代わりにジメルカプトコハク酸を用いて実施例3-Aを繰り返し
た。
【０１００】実施例23 アミノリガンド(すなわちタンパク質および薬剤)の改変磁性ナノ粒子への結合 1. アミンがコーティングされたナノ粒子への結合。 通常は、アミンがコーティングされた磁性ナノ粒子を水溶液中で室温で(また
はその他の所望の温度で)最適pH条件下にて適切な活性化剤、すなわちスルホ-EG
S, pH7-8.0、塩化アクリロイル, pH8.5、およびDVS, pH9-9.5とともに2-3時間振
盪した。次いで未結合の活性化剤をそのときに用いていた水溶液で、およびその
後にPBS(食塩加リン酸緩衝液, 0.01M, pH7.4)、またはその他の望ましい生理学
的溶液を用いて2-3回磁気分離サイクルを行うことによって除去した。残存する
アミン基は、酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて上述の操作(た
だし活性化剤の代わりに0.2%酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルをPBS溶
液中に含むものを用いる)を繰り返すことによってブロックした[Y. Dolitzky, S
. Sturchak, B. Nizan, Ben-Ami Sela, およびS. Margel, Analytical Biochemi
stry, 220, 257 (1994)を参照せよ]。次いで活性化された磁性ナノ粒子を、PBS(
またはその他の生理学的溶液)中で室温(または他の所望の温度)で2-3時間所望の
タンパク質と振盪し、次いでさらに2-3時間、ブロッキング剤(例えばグリシン、
エタノールアミン,pH7など)と振盪することによってアミノリガンド(すなわちタ
ンパク質)と結合させた。未結合のタンパク質はPBS(またはその他の生理学的溶
液)中で2-3回磁気分離サイクルを行うことによって除去した。次いでそのコンジ
ュゲートさせたナノ粒子をPBS(または水、またはその他の生理学的溶液)中で4℃
にて保持した。
【０１０１】 磁性陽イオンおよび陰イオン交換樹脂は、タンパク質の代わりにポリエチレン
イミン、(ジエチルアミノ)エチルアミン[DEAE]、およびアミノプロピオン酸など
のリガンドを用いて同様に形成した。
【０１０２】 典型的な実験において、PBS(pH 7.5)中の約65nmの直径のアミンをコーティン
グした磁性ナノ粒子1mgを0.1mgの活性化剤スルホ-EGSと室温で4時間振盪した。
未結合の活性化剤をPBS中での磁気分離で除去した。次いで残存アミン基を酢酸N
-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用い、前述の操作(活性化剤の代わりに0.
2%酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(PBS溶液中)を用いる)を繰り返すこ
とによってブロックした。活性化された誘導体化磁性ナノ粒子を5mLのPBS中で1m
gのトリプシンと室温で4時間振盪した。粒子上の残存活性化基は、その振盪済の
コンジュゲートさせたナノ粒子に5mgのグリシンを添加することによってブロッ
クした。さらに2時間後、未結合のトリプシンおよびグリシンをPBS中で磁気分離
によって除去した。次いでそのトリプシンをコンジュゲートさせた粒子をPBS(ま
たは水、または他の生理学的溶液)中で4℃で保持した。
【０１０３】 同様の操作法を用いて、下記のタンパク質も異なるアミン誘導体化磁性ナノ粒
子に共有結合で結合させた：アドリアマイシン(adriamycicine)、ヤギ抗ウサギI
gG(G RIgG)、ヤギ抗マウスIg(G MIg)、ヤギIgG、プロテインA、BSA、およびリゾ
チーム。
【０１０４】2. チオールがコーティングされたナノ粒子への結合。 活性化基(例えばスルホ-EGS)の代わりに他の適切な活性化剤(例えばスルホ-MB
S)を用い、活性化時のpHを7−8から6.5−8.0として上記(1)の操作を繰り返した
。
【０１０５】3. アルデヒドコーティングナノ粒子への結合。 通常、アルデヒドコーティング磁性ナノ粒子をPBS(またはその他の生理学的溶
液)中で所望のタンパク質と室温(または他の所望の温度)で2-3時間振盪した。未
結合のタンパク質をPBS中で2-3回の磁気分離サイクルによって除去した。残存ア
ルデヒド基を生理学的pHで例えばBSA、ヒドロキシルアミン、またはエタノール
アミンなどのアミノリガンドを用いてブロックした。次いでタンパク質をコンジ
ュゲートさせた粒子を凍結乾燥またはPBS(または水、または他の生理学的溶液)
中で4℃で保持した。
【０１０６】 磁性陽イオンおよび陰イオン交換樹脂を、タンパク質の代わりにリガンドにポ
リエチレンイミン、(ジエチルアミノ)エチルアミン[DEAE]、およびアミノプロピ
オン酸などを用いて同様に形成した。単一の第1アミン基含有のリガンドに対し
てシッフ塩基結合をさらにNaBH４、またはNaCNBH４を用いて還元して一重結合と
した。この操作は通常はエタノール懸濁液または水溶液中で4℃または塩基性pH(
9から11の間)で行った[A. Lazar, L. Silverstein, S. MargelおよびA. Mizrahi
, Develop. Biol. Standard., 60, 457(1985) を参照せよ]。
【０１０７】 典型的な実験において、約65nmの直径のアルデヒドコーティング磁性ナノ粒子
(PBS中)1mgを、1mgのトリプシンと5mLのPBS中で室温で4時間振盪した。未結合の
トリプシンをPBS中での3回の磁気分離サイクルで除去した。次いでコンジュゲー
トさせたナノ粒子をBSA(1%)とPBS中で室温で4時間振盪することによって粒子上
の残存アルデヒド基をブロックした。未結合のBSAはPBS中での3回の磁気分離サ
イクルによって除去した。次いでそのトリプシンをコンジュゲートさせた粒子を
PBS(または水、または他の生理学的溶液)中で4℃で保持した。
【０１０８】 同様の操作法を用いて、下記のタンパク質も、異なるアルデヒド誘導体化磁性
ナノ粒子に共有結合で結合させた：ヤギ抗ウサギIgG(G RIgG)、ヤギ抗マウスIg(
G MIg)、ヤギIgG、プロテインA、BSA、およびリゾチーム。
【０１０９】4. ヒドロキシルコーティングナノ粒子への結合 デキストランコーティングナノ粒子(65nm)を凍結乾燥したもの10mgを、10mLの
アセトン中に分散させた。次いで1mgのカルボニルジイミダゾールをその分散さ
せた粒子に添加した。その懸濁液を室温で30分間振盪した。次いでその活性化粒
子に磁場をかけることによって未結合活性化剤を洗って除いた。乾燥させた活性
化粒子を室温で1mgのトリプシン含有の5mLPBS中に添加した。その懸濁液を約12
時間振盪し、次いで残存活性化剤をpH8.5(0.1M 重炭酸溶液)で室温で4時間加水
分解することによってブロックした。
【０１１０】実施例24 タンパク質をコンジュゲートさせた磁性ナノ粒子の生物学的応用 1. 生物触媒作用：ゼラチンゲルに対するタンパク分解作用 PBS中のゼラチン懸濁液(5% w/v)を60℃で20分間加熱した。得られた澄明なゼ
ラチン溶液をプラスチック皿に注ぎ(直径5mm、1mL/皿)、次いで室温でゲル化さ
せた。各皿のゲルの重量を正確に測定した。
【０１１１】 トリプシンをコンジュゲートさせた直径約65nmの磁性ナノ粒子20mgを含有する
PBS懸濁液1mLをゲルの表面にアプライした。この実験条件に対するゼラチンゲル
の安定性を示すために、エタノールアミンをコンジュゲートさせたナノ粒子(対
照)20mgを含有するPBSの1mLも同様のゲルの表面に添加し実験時に同時にインキ
ュベートした。
【０１１２】 サンプルを25℃で約48時間インキュベートした。インキュベート後、トリプシ
ンをコンジュゲートさせた粒子で処理したゼラチンゲルは完全に可溶化した。こ
の効果はおそらく固定化したトリプシンによるゼラチンの酵素的分解によるもの
であろう[S. MargelとI. Burdygin, WO 98/02189を参照せよ]。他方、対照のナ
ノ粒子とインキュベートしたゼラチンゲルには変化はなかった。可溶化したゼラ
チン溶液からトリプシンをコンジュゲートしたナノ粒子を取り出し、磁場をかけ
てPBSで洗った。この方法を新しいゼラチンゲルに対して2回行った。同様の結果
が得られた。
【０１１３】2. 制御放出 アドリアマイシンなどの薬剤をPBS中に5%含有するゼラチン懸濁液(5% w/v)を6
0℃で20分間加熱した。得られた澄明なゼラチン溶液をプラスチック皿に注ぎ(直
径5mm、1mL/皿)、室温でゲル化させた。各皿のゲルの重量を正確に測定した。ト
リプシンをコンジュゲートさせた磁性ナノ粒子を実施例24-1に述べた方法と同様
にゼラチンゲル上にアプライした。ゼラチンの分解の過程でアドリアマイシンは
徐々に放出された。
【０１１４】3. タンパク質精製 ヤギIgGをコンジュゲートさせた直径約65nmの磁性ナノ粒子10mgを含有するPBS
懸濁液1mLを5mLのウサギ抗血清中に添加した。室温で約10分間振盪した後、その
粒子を磁場をかけてPBSで3回洗った。次いで、吸着された抗体(ウサギ抗ヤギIgG
)を粒子から0.2M グリシン-HClバッファー溶液pH 2.4で溶出させ、NaOHで中和し
、PBSに対して透析した。溶出された抗体の純度の高さはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で示した。グリシン-HClバッファーでの処理後、磁性コンジュゲート
ナノ粒子を磁場をかけてPBSで洗い、アジ化ナトリウム(0.05%)の存在下で次の使
用まで4℃で保存した。
【０１１５】4. 診断薬：ヒト血清中のα １ -アンチトリプシンの測定 実施例25-1に述べたとおり調製されたトリプシンをコンジュゲートさせたナノ
粒子の活性は基質α-N-ベンゾイル-DL-アルギニン p-ニトロアニリド(BAPNA)で
調べた。コンジュゲートされたトリプシンをTrisバッファー(pH 8)中でBAPNAと
反応させてBAPNAからp-ニトロアニリドを放出させ、その400nmにおける吸光度を
測定した。
【０１１６】 ヒト血清中のα１-アンチトリプシンの測定は、Trisバッファー中のコンジュ
ゲートされたトリプシンによるBAPNAの加水分解に対する血清中のアンチトリプ
シンの阻害効果に基づいたものである。反応の停止は酢酸の添加によって行い、
吸光度を400nmで測定する。この波長では遊離したp-ニトロアニリドのモル吸光
度は10,500である。簡潔に記せば、アッセイの前に、各供試血清をTrisバッファ
ーで1000倍に希釈した。希釈した血清の2mLを、トリプシンをコンジュゲートさ
れたナノ粒子10mgをTrisバッファー中に含有する懸濁液1mLと共に37℃で30分間
インキュベートした。5mLのBAPNA溶液(100mgのBAPNAを2.3mLのジメチルスルホキ
シド中に溶解し、次いでこのストック溶液の1mLを100mLのTrisバッファー,pH 8.
0で希釈して調製した)を血清−トリプシン-コンジュゲートナノ粒子懸濁液に添
加し37℃で30分置いた。反応は1mLの氷酢酸の添加で停止させた。コンジュゲー
トしたトリプシンとBAPNAの間の相互作用の程度は400nmの吸光度で測定した。対
照の実験は4%ヒト血清アルブミン(HSA)を用いて同じ操作法を用いて行った。α
１-アンチトリプシンの正確な量は既知量のα１-アンチトリプシンから得られた
標準曲線と比較することによって決定した。この方法で得られた結果は放射免疫
拡散法[J. TravisとD. Johnson, Methods Enzymol. 80, 754 (1981)を参照せよ]
(この方法はヒト血清中のα1-アンチトリプシンの測定に一般的に臨床で用いら
れているものである)によって得られた結果とよく一致していた。
【０１１７】5. (A) 細胞標識：ヒト赤血球細胞の特異的細胞標識 新鮮なヒト赤血球(HRBC)をウサギ抗-HRBC抗体(10６HRBCに0.8g ウサギ抗-HRBC
)と4℃で50分間振盪した。感作細胞を分離し、PBSとともに遠心して4回洗った。
洗浄済の感作細胞を、実施例24に述べたとおりに調製したG RIgG磁性コンジュゲ
ートナノ粒子(5mg, 65nm)と4℃で1時間振盪した。その標識細胞を磁場をかけてP
BSで洗って過剰のナノ粒子を除去した。対照実験は感作ウサギ抗-HRBCの代わり
に非感作HRBCを用いて同様に行った。SEMによる検査ではG RIgGをコンジュゲー
トしたナノ粒子によるRBCの特異的標識が示された。他方、対照の細胞は全く標
識されていなかった。
【０１１８】 (B) 表面に免疫グロブリンを有しているマウス脾細胞(B細胞)の特異的標識 実施例24に述べた方法で調製したG MIgをコンジュゲートした蛍光ナノ粒子(5m
g, 65nm)を、精製マウス脾細胞(10６)とともに4℃で1時間振盪した。その標識細
胞を磁場をかけてPBSで洗い過剰のナノ粒子を除去した。対照実験はマウス脾細
胞の代わりにマウス胸腺細胞を用いて同様に行った。蛍光顕微鏡での検査ではG
MIgをコンジュゲートさせたナノ粒子でのマウス脾細胞の特異的標識が示された
。他方、対照の細胞は全く標識されていなかった。
【０１１９】6. 細胞分離：七面鳥RBCのヒトRBCからの分離 10６個のヒトRBCと10６個の七面鳥RBCを含有する混合物を5-Aに記載の標識操
作を用いて磁性ナノ粒子で処理した。この細胞の混合物のPBS懸濁液5mLを入れた
バイアルの外壁に磁石を付着させた。壁面に引きつけられなかった細胞を単離し
た。引きつけられた細胞をPBS中に再懸濁し磁気分離をさらに2回繰り返した。光
学顕微鏡での検査では七面鳥RBCからヒトRBCの99-100%の分離効率が示された。
【０１２０】7. 重金属イオンのキレート化 実施例23に記載のとおり調製したキトサンまたはポリエチレンイミンをコーテ
ィングした磁性ナノ粒子(65nm)15mgを、15mgのCdCl２またはCuCl２含有の水溶液
100mLと共に室温で1時間振盪した。次いで粒子を磁場をかけることによって水溶
液から除去した。残存水溶液についての原子吸光測定では90-100%の金属イオン
が水から除去されていることが示された。
【０１２１】実施例25 MRI用造影剤 2T(テスラ)のWhole Body MRI System(2T prestige, Elscint Ltd.)を用いて室
温で緩和時間(T1 & T2)を測定した。T1は反転回復(IR)パルスシーケンスによっ
て得られた10個のデータポイントから測定した。T2はスピンエコーCarr-Purcell
-Meiboom-Gill(CPMG)シーケンスによって測定した。8個のエコータイム(TE)を用
いた：24, 48, 72, 104, 124, 148, 172, 204 msec(ミリ秒)。繰り返し時間(TR)
は5000 msecとした。
【０１２２】in vitro 研究： 実施例5-Aに従って調製した5%デキストロース水性懸濁液中の磁性ナノ粒子(0.
05 mM 鉄)の緩和度(relaxivity)測定(R1 & R2)では、R1およびR2はそれぞれ17.4
および240 mM−１sec−１であった。実施例5-Aに従って調製され、実施例23に従
ってデキストランでコーティングされた磁性ナノ粒子についての同様な測定では
、R1およびR2はそれぞれ16.2および202 mM−１sec−１であった。
【０１２３】in vivo測定： ウサギの肝臓について、2テスラでSEシーケンスをTR/TE＝500/96 msで用いてM
RIを行った。形成された磁性デキストロース水性懸濁液の静脈内注射の投与量は
10-15μmol Fe/kgとした。図8Aは粒子注射前の肝臓の強度を示し、図8Bは粒子注
射25分後の肝臓の強度を示している。肝臓の磁性物注射後(Ipost)と注射前(Ipre
)の強度比：(Ipost/Ipre)は0.47であり、これらのナノ粒子がMRI用の造影剤とし
て高い効率を有することを示している。
【０１２４】実施例26 ドラッグデリバリーおよび制御放出 実施例5-Aの磁性ナノ粒子の代わりに実施例12の磁性ナノ粒子(カプセル化され
た薬剤、例えばアドリアマイシン、を含有するナノ粒子)を用いて、実施例25のi
n vivoの部分を繰り返した。肝臓内でのその薬剤の制御放出は磁性ナノ粒子の生
物分解性によるものである。
【図面の簡単な説明】
添付の図における説明は以下の通りである。
【図１】 核生成および1個の核の上での磁性金属酸化物フィルムの成長を示す図である
。
【図２】 Fe２＋イオンによるゼラチンの滴定曲線である：(A)酸化剤不含；(B)酸化剤と
してNaNO３存在下；(C)酸化剤としてNaNO２存在下。
【図３】 FeCl２・4H２O(0.21 mmol)、NaNO２(0.04 mmol)、およびNaOH(pH9.5)の0.1%(w
/v)ゼラチン水溶液中への段階的添加(A)および単回量添加(B)によって形成され
た磁性粒子の粒子の大きさのヒストグラム。
【図４】 ゼラチン溶液(0.1%)中への重合化剤の段階的添加によって形成された磁性ナノ
粒子の走査型電子顕微鏡(SEM)顕微鏡写真。
【図５】 FeCl２・4H２O(0.21 mmol)、NaNO２(0.04 mmol)、およびNaOH(pH9.5)の0.3%(w
/v)ゼラチン水溶液中への段階的添加(A)および単回量添加(B)によって形成した
磁性粒子の粒子の大きさのヒストグラム。
【図６】 重合化剤FeCl２・4H２O(0.02 mmol)、NaNO２(0.004 mmol)、およびNaOH(pH9.5
)の0.3%(w/v)ゼラチン水溶液中への単回量添加によって形成された磁性ナノ粒子
のSEM顕微鏡写真。
【図７】 重合化剤FeCl２・4H２O(0.02 mmol)、NaNO３(0.004 mmol)、およびNaOH(pH9.5
)の0.3%(w/v)ゼラチン水溶液中への段階的添加による磁性ナノ粒子の成長を示す
SEM顕微鏡写真。
【図８】 磁性ナノ粒子を用いない場合(A)と用いた場合(B)のウサギ肝臓のMRI画像。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月７日（２０００．６．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５Ｕ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C076 AA65 AA95 CC50 DD29 DD37 DD39 DD41 DD49 DD56 DD63 EE16 EE25 EE27 EE37 EE38 EE41 EE42 FF21 FF61 4C085 HH07 JJ03 KB08 KB28 KB42 KB44 KB45 KB59 KB79 KB80 KB82 LL01 5E041 AB11 AB12 BC01 CA02 HB14 HB17 NN05 NN17 NN18

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 磁性金属酸化物でコーティングしたナノ粒子を調製するため
    の方法であって、以下のa)〜g)の工程を含んでなる方法： a) 可溶性のポリマー金属キレート化剤を含む水溶液を１種以上の可溶性金属
    塩と接触させて金属イオンを生成させる工程であって、この場合該金属イオンの
    うち少なくとも１種は磁性酸化物を形成できるものであり、該金属イオンが前記
    キレート化剤の結合能を実質的に上回らない量で存在する、該工程； b) 前記金属イオンが磁性酸化物の形成に必要な酸化状態で存在するようにす
    る工程； c) 溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； d) 追加量の前記金属塩を溶液に添加する工程； e) 該追加の金属イオンが磁性酸化物の形成に必要な酸化状態で存在するよう
    にする工程； f) 溶液のpHを7以上の範囲に維持する工程； g) 工程d)〜f)の操作を、磁性金属酸化物でコーティングした単分散ナノ粒子
    を得るのに必要な回数連続的に繰り返す工程。
  2. 【請求項２】 ポリマー金属キレート化剤が、アミノ基、ヒドロキシル基、
    カルボキシラート基、-SH基、エーテル基、イミン基、リン酸基、およびスルフ
    ィド基からなる群より選択される金属イオンに結合可能な官能基を有する、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ポリマー金属キレート化剤が、ゼラチン、ポリメチレンイミ
    ン、デキストラン、キトサン、ポリリシン、およびポリビニルピロリドンからな
    る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 水溶液中のポリマー金属キレート化剤の濃度が0.01〜10 w/v
    である、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 水溶液中のポリマー金属キレート化剤の濃度が0.1〜1 w/vで
    ある、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 磁性の金属酸化物が酸化鉄およびフェライトからなる群より
    選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 磁性酸化鉄が磁鉄鉱もしくはマグヘマイトまたはそれらの混
    合物である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 水溶液を鉄(II)塩と接触させてFe+2イオンを生成させ、該Fe +2 イオンの一部の酸化によりFe+3イオンが溶液中に存在するようにする、請求項
    １に記載の方法。
  9. 【請求項９】 水溶液を鉄(II)塩および鉄(III)塩の混合物と接触させて、
    水溶液中にFe+2およびFe+3イオンが存在するようにする、請求項１に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 Fe+2イオンの一部の酸化が溶液中への酸化剤の添加により
    引き起こされる、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 磁性金属酸化物が酸化鉄であり、酸化されるFe+2の割合が
    2/3を超えないことによって、得られる溶液中のFe+2とFe+3のモル比が1:2を超え
    ないことを特徴とする、請求項６または１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 酸化されるFe+2の割合が1/2を超えないことを特徴とする
    、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 酸化剤が、酸素、H2O2、亜硝酸塩、または硝酸塩の中から
    選択される、請求項１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 酸化剤がNO2 -またはNO3 -である、請求項１３に記載の方法
    。
  15. 【請求項１５】 モル比 (NO2 -またはNO3 -)／Fe+2が1/2を超えないことを特
    徴とする、請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 磁性金属酸化物がフェライトであり、工程a)およびb)に遷
    移金属塩を添加することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 塩基の添加によりpHを7以上の範囲に維持する、請求項１
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 pHを８〜10の範囲内の一定値に維持する、請求項１に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 工程d)〜f)を、段階的様式の操作にて実施する、請求項１
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 工程d)〜f)を、連続した様式の操作にて実施する、請求項
    １に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ナノ粒子の大きさが0.1μm未満である、請求項１に記載の
    方法。
  22. 【請求項２２】 温度が50℃〜90℃である、請求項１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 不活性雰囲気中で内部のポリマー金属キレート化剤物質を
    バーンオフすることにより、該ポリマー物質を除去して中空の磁性ナノ粒子を生
    成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 官能基を含む分子を磁性ナノ粒子の磁性表面に付着させ、
    該粒子に所望の機能性被膜を生成させることをさらに含む、請求項１または２３
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 官能基を含む分子が、多糖類、タンパク質、ペプチド、ポ
    リアミン、およびω-シラン Si(OR)3(CH2)nX（式中、Rはアルキル置換基であり
    、nは１〜18（1および18を含む）の整数であり、XはNH2、CH3、CNおよびSHから
    なる群より選択される官能基である）からなる群より選択されるポリマーを含む
    、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ポリアルデヒドリガンドを機能性被膜のアミン基に結合さ
    せることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 活性化リガンドを生体活性剤に結合可能な官能基に付着さ
    せることをさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 活性化リガンドが、塩化アクリロイル、ジビニルスルホン
    、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジ
    ルスクシナート）、およびm-マレイミド安息香酸N-ヒドロキシスルホスクシンイ
    ミドエステルからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 生体活性剤を活性化リガンドに結合させることをさらに含
    む、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 生体活性剤がタンパク質、酵素、抗体、および薬剤からな
    る群より選択される化合物である、請求項１９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 活性物質を工程a)に記載の水溶液中に添加することを特徴
    とする磁性ナノ粒子内への活性物質のマイクロカプセル化のための、請求項１に
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】 活性物質が薬剤または蛍光色素である、請求項３１に記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 金属キレート化剤であるポリマーからなり、磁性金属酸化
    物でコーティングされた、0.3μm未満の大きさのナノ粒子。
  34. 【請求項３４】 大きさが0.1μm未満である、請求項３３に記載のナノ粒子
    。
  35. 【請求項３５】 0.3μm未満の大きさの、磁性金属酸化物の殻からなる中空
    のナノ粒子。
  36. 【請求項３６】 0.1μm未満の大きさの、請求項３５に記載の中空のナノ粒
    子。
  37. 【請求項３７】 磁性被膜上に機能性ポリマーの被膜をさらに含んでなる、
    請求項34〜37のいずれか１項に記載の磁性ナノ粒子。
  38. 【請求項３８】 機能性ポリマー被膜が、多糖類、タンパク質、ペプチド、
    ポリアミン、およびω-シラン化合物からなる群より選択されるポリマーを含ん
    でなる、請求項３７に記載の磁性ナノ粒子。
  39. 【請求項３９】 活性化リガンドと結合した、請求項３８に記載の磁性ナノ
    粒子。
  40. 【請求項４０】 活性化リガンドが、塩化アクリロイル、ジビニルスルホン
    、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジ
    ルスクシナート）、およびm-マレイミド安息香酸N-ヒドロキシスルホスクシンイ
    ミドエステルからなる群より選択される化合物によって生成される、請求項３９
    に記載の磁性ナノ粒子。
  41. 【請求項４１】 生体活性剤と結合した、請求項４０に記載の磁性ナノ粒子
    。
  42. 【請求項４２】 生体活性剤が、タンパク質、酵素、抗体、および薬剤から
    なる群より選択される化合物である、請求項４１に記載の磁性ナノ粒子。
  43. 【請求項４３】 活性物質を磁性金属酸化物被膜中に封入するものである、
    請求項３３または３４に記載の磁性ナノ粒子を含む、マイクロカプセル。
  44. 【請求項４４】 生物学的または医学的適用のための、請求項３３〜４２の
    いずれか１項に記載の磁性ナノ粒子の使用。
  45. 【請求項４５】 該生物学的または医学的用途が、細胞標識、細胞分離、制
    御放出、診断、酵素固定、タンパク質精製、ドラッグデリバリー、MRIおよびソ
    ノ-イメージング適用のための造影剤、ならびに重金属イオンのキレート化から
    なる群より選択されるものである、請求項４４に記載の磁性ナノ粒子の使用。
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