JP2002506616A

JP2002506616A - β−グルコシダーゼの増強された産生のための遺伝子構築物および遺伝子改変された微生物

Info

Publication number: JP2002506616A
Application number: JP2000535729A
Authority: JP
Inventors: セレッサシー．ホワイト，; クリストファーディー．ヒンドル，
Original assignee: アイオゲン・コーポレイション
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 2002-03-05
Anticipated expiration: 2019-03-09
Also published as: BR9908648B1; EP1070117B1; EP1070117A1; CN1310756A; DE69925265D1; AU756402B2; MX223252B; CN1268737C; DE69925265T2; ES2241263T3; AU2707299A; NZ506792A; US6939704B1; WO1999046362A1; JP4026108B2; US6015703A; BR9908648A

Abstract

(57)【要約】本発明は、セルロース転換プロセスにおいて重要である酵素β−グルコシダーゼの産生を増強する、微生物の遺伝子改変に関する。本発明者らは、組換え微生物において発現される場合、産生されるβ−グルコシダーゼの量を非形質転換微生物と比較して劇的に増加する遺伝子構築物を発見した。この遺伝子構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領域を含む。β−グルコシダーゼのレベルの増加は、セルラーゼ酵素によるセルロースのグルコースへの加水分解の効率を有意に増加させ、それによってセルロースからの燃料エタノールの生成を増強する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（１．発明の分野）本発明は、商業的に重要な酵素である、β−グルコシダーゼの産生を増強する
ための微生物の遺伝子改変に関する。本発明はまた、遺伝子構築物を含有する微
生物によって産生されるβ−グルコシダーゼの量を劇的に増加させる、これらの
遺伝子構築物に関する。

【０００２】（２．関連分野の背景）セルロースからエタノールを産生する能力は、供給原料の莫大な量の利用可能
性、材料を燃焼または埋め立てすることを回避することの望ましさ、およびエタ
ノール燃料のきれいさのために、大きな関心を集めてきた。社会のためのこのよ
うなプロセスの利点は、ＡｔｌａｎｔｉｃＭｏｎｔｈｌｙ、１９９６年４月号
の記事に記載される。

【０００３】このようなプロセスのための天然のセルロース供給原料は、「バイオマス」と
呼ばれる。木材、農業の残渣、草本作物、および地方の固形廃棄物を含む、多く
の型のバイオマスが、エタノール産生のための供給原料と考えられてきた。これ
らの材料は、主にセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンからなる。本発
明は、セルロースからエタノールへの転換に適用され得る。

【０００４】セルロースは、β１，４結合によって連結された、単糖であるグルコースのポ
リマーである。セルロースは、酸、酵素、または微生物による分解または脱ポリ
マー化に非常に抵抗性である。一旦セルロースがグルコースに転換されると、生
じた糖は、酵母を用いてエタノールに容易に発酵される。このプロセスの困難な
チャレンジは、セルロースをグルコースに転換することである。

【０００５】セルロースをグルコースに転換するために研究された最も古い方法は、酸加水
分解に基づく（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎによる総説、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｂｒｅａ
ｋｄｏｗｎｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓ」Ｊ．Ａｐｐｌ
．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９６−３０８（１９７８））。こ
のプロセスは、濃縮されたか、または希釈された酸の使用を含み得る。濃縮され
た酸のプロセスは、高収量のグルコースを産生するが、酸の回収、必要とされる
特定化された材料の構築、およびこの系において水を最小化することの必要性が
、このプロセスの深刻に不利な点である。希釈した酸のプロセスは、化学的な回
収の必要性を克服するために低レベルの酸を使用する。しかし、最大のグルコー
ス収量はセルロースの約５５％のみであり、そして分解産物の高い程度の産生は
、酵母によるエタノールへの発酵を阻害し得る。これらの問題は、この酸加水分
解プロセスを商業化に到達させることを妨害してきた。

【０００６】酸加水分解プロセスのこれらの問題を克服するために、セルロース転換プロセ
スは、より最近になって、セルラーゼ酵素を使用する酵素的加水分解に焦点を合
わせてきた。セルロースの酵素的加水分解は、基質と水とを混合して、５％〜１
２％のセルロースのスラリーを達成すること、およびセルロース１ｇｍあたり５
〜５０国際単位（ＩＵ）のセルラーゼ酵素を添加することによって実行される。
代表的には、加水分解は３５〜６０℃、ｐＨ４〜６にて１２〜１５０時間行われ
る。

【０００７】多くの微生物がセルロースを加水分解する酵素を作り、これらの微生物には、
木材腐朽真菌であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、堆肥の細菌であるＴｈｅｒｍｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ；Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；ならびに真菌Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓおよびＦｕｓａｒｉｕｍが含まれる。これらの微生物によって作られる酵素は
、セルロースからグルコースへの転換に有用な３つの型の作用を有するタンパク
質：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、およびβ
−グルコシダーゼの混合物である。ＥＧ酵素およびＣＢＨ酵素は、集合的に、「
セルラーゼ」と呼ばれる。

【０００８】ＥＧ酵素は、ランダムな位置においてセルロースポリマーを切断し、ＣＢＨ酵
素による攻撃にポリマーを曝露する。１つの例として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
株は、少なくとも４つの別個のＥＧ酵素（ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩ、およ
びＥＧＶとして知られる）を産生する。

【０００９】ＣＢＨ酵素は、セルロースポリマーの末端からセロビオースの分子を、連続し
て遊離させる。セロビオースは、グルロースの水溶性のβ−１，４−結合ダイマ
ーである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって作られる２つの主要なＣＢＨ酵素（
ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ）が存在する。

【００１０】 β−グルコシダーゼ酵素は、セロビオースをグルコースに加水分解する。Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａは、１種類のβ−グルコシダーゼ酵素を作る。

【００１１】 β−グルコシダーゼによって触媒されるセルロース加水分解の最終段階は重要
である。なぜなら、グルコースは、種々の酵母によって容易にエタノールに発酵
され、一方セロビオースは発酵されないからである。加水分解の最後に残存して
いるいかなるセロビオースも、エタノールの収量の損失を示す。より重要なこと
に、セロビオースは、ＣＢＨ酵素およびＥＧ酵素の極度に強力なインヒビターで
ある。セロビオースは、わずか３．３ｇ／Ｌの濃度で、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ＣＢＨ酵素およびＥＧ酵素の加水分解の速度を５０％減少させる。加水分解の
速度の減少は、より高いレベルのセルラーゼ酵素の添加を必要とする。これは逆
に、プロセス全体の経済性に悪影響を与える。従って、加水分解の間のセロビオ
ースの蓄積は、エタノール産生のために極度に望ましくない。

【００１２】セロビオースの蓄積は、酵素的加水分解において主要な問題であった。なぜな
ら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよび他のセルラーゼ産生微生物は、非常に少量し
かβ−グルコシダーゼを作らないからである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによって
作られた全タンパク質の１％未満が、β−グルコシダーゼである。β−グルコシ
ダーゼのこの少ない量は、セロビオースのグルコースへの加水分解能力の不足、
および加水分解の間の１０〜２０ｇ／Ｌのセロビオースの蓄積を生じる。高いレ
ベルのセロビオースは、適切な量のβ−グルコシダーゼが存在する場合よりも、
必要とされるセルラーゼの量を１０倍増加させる。

【００１３】セルラーゼ酵素におけるβ−グルコシダーゼの不足を克服するために、いくつ
かのアプローチが提案されている。

【００１４】１つのアプローチは、ほとんどセルラーゼを産生しない微生物を使用してβ−
グルコシダーゼを産生すること、および加水分解を増強させるためのセルラーゼ
酵素に外部からこのβ−グルコシダーゼを添加することであった。最も成功した
このようなβ−グルコシダーゼ産生微生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇ
ｅｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐｈｏｅｎｉｃｉｓであった。これらの微
生物由来のβ−グルコシダーゼは、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋから、Ｎｏｖｏｚ
ｙｍ１８８として市販されている。しかし、商業的なバイオマスのために必要
とされる量は、エタノール操作をするにはあまりにも高価である。

【００１５】 β−グルコシダーゼの不足を克服するための第２のアプローチは、酵母による
グルコースの発酵と同時にセルロース加水分解を実行すること、いわゆる、同時
糖化および発酵（ＳＳＦ）プロセスである。ＳＳＦシステムにおいて、グルコー
スの発酵は、それを溶液から取り除く。グルコースは、β−グルコシダーゼの強
力なインヒビターであり、ゆえにＳＳＦは、β−グルコシダーゼの効率を増大す
る試みである。しかし、ＳＳＦシステムは、まだ商業的に実行可能ではない。な
ぜなら、酵母にとっての操作温度である２８℃は、セルラーゼによって要求され
る５０℃の条件にとって低すぎる；妥協の温度である３７℃における操作は、効
率が悪く、微生物汚染する傾向がある。

【００１６】 β−グルコシダーゼの不足を克服するための第３のアプローチは、酵素を過剰
発現させるように遺伝子操作し、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａによるその産生
を増大させることである。このアプローチは、Ｂａｒｎｅｔｔ、Ｂｅｒｋａ、お
よびＦｏｗｌｅｒ、「ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅＧｅｎｅＥｎｃｏｄｉｎｇａｎＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅ
ｓｅｉ：ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒＩｍｐｒｏｖｅｄＲａｔｅｓｏｆＳ
ａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｉｃＳｕｂｓｔｒ
ａｔｅｓ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、１９９１年６月、５６２
〜５６７頁（本明細書中では、「Ｂａｒｎｅｔｔら」と呼ぶ）において；および
、Ｆｏｗｌｅｒ、Ｂａｒｎｅｔｔ、およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ、ＷＯ９２／１０
５８１、「ＩｍｐｒｏｖｅｄＳａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅ
ｌｌｕｌｏｓｅｂｙＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｏｆＴｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ」（本明細書中では、「Ｆｏｗｌｅｒら」と呼ぶ）で
とられた。

【００１７】ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらの両方は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ株Ｐ４０への複数コピーのβ−グルコシダーゼ遺伝子の挿入を記載
する。両方のグループは、プラスミドｐＳＡＳβ−ｇｌｕを構築し、このプラス
ミドは、ゲノムＴ．ｒｅｅｓｅｉ β−グルコシダーゼ遺伝子およびａｍｄＳ選
択マーカーを含む形質転換ベクターである。このａｍｄＳ遺伝子は、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ由来であり、そして形質転換細胞がアセトアミ
ドを唯一の窒素源として増殖することを可能にする酵素アセトアミダーゼをコー
ドする。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉは、ａｍｄＳ遺伝子の機能的な等価物を含まず、従っ
て窒素源としてアセトアミドを利用できない。形質転換細胞は、１０〜１５コピ
ーのβ−グルコシダーゼ遺伝子を含み、そして非形質転換細胞よりも５．５倍よ
り多いβ−グルコシダーゼを産生した。

【００１８】ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらによって得られたβ−グルコシダーゼ
の産生の増強は、セルロース加水分解のためにβ−グルコシダーゼの不足を軽減
するのに充分ではない。例えば、天然のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株によって作ら
れるβ−グルコシダーゼの量は、セルロース加水分解の必要量に到達するには少
なくとも１０倍増大させなくてはならない。

【００１９】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおいてタンパク質を過剰発現させる場合、１つのス
トラテジーは、目的の遺伝子をｃｂｈ１プロモーターまたはｃｂｈ１分泌シグナ
ルに直接連結することである。ＣＢＨ１は、セルラーゼ誘導条件下で、Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａによって産生される最も豊富なタンパク質であるので、ｃｂｈ１
プロモーターおよび分泌シグナルは、遺伝子構築物中のそれらの後に配置された
遺伝子によってコードされるタンパク質の転写および分泌を方向付けることにお
いて、非常に効果的であると考えられる。このようなストラテジーは、Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａおよび他の微生物由来のタンパク質を過剰発現するために首尾よ
く使用されてきた（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ、Ｈａｙｅｓ、Ｈａｒｍａ
ｎ、およびＰｅｎｔｔｉｌａ、１９９６、「ＩｍｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｅｎｄｏｃｈｉ
ｔｉｎａｓｅｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２（６）
：２１４５〜２１５１；Ｊｏｕｔｓｊｏｕｋｉ、ＴｏｒｋｋｅｌｉおよびＮｅｖ
ａｌａｉｎｅｎ、１９９３、「ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｗｉｔｈｔｈｅＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓｒ
ｅｓｉｎａｅｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅＰ（ｇａｍＰ）ｇｅｎｅ：ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎｏｆａｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓ
ｅｂｙＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．
２４：２２３〜２２８；Ｋａｒｈｕｎｅｎ、Ｍａｎｔｙｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎ
ｅｎ、およびＳｕｏｍｉｎｅｎ、１９９３、「Ｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ｏｎｅ−ｓｔｅｐｇｅｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｉｎＴｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ１．ＥｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅＩｏｖｅｒｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：５１５〜５２２）
。

【００２０】顕著な量の研究の努力にも関わらず、高レベルのβ−グルコシダーゼを充分に
産生するための手段は存在しなかった。このようなプロセスは、セルロース由来
の燃料アルコールの産生において前にある大きな工程である。

【００２１】（発明の要旨）本発明者らは、現在達成可能なレベルよりもずっと高いレベルでβ−グルコシ
ダーゼ酵素の産生を可能にする発見をした。高レベルのβ−グルコシダーゼは、
セルロースのグルコースへの酵素的加水分解の効率を改善する。得られた、酵素
の必要量の減少、セルロース転換の増加、加水分解時間の減少、またはこれらの
利点の組み合わせは、セルロースをエタノールに転換するプロセス全体の費用を
低減させる。

【００２２】本発明者らは、遺伝子構築物が発現される組換え微生物によるβ−グルコシダ
ーゼの産性を顕著に増加させる、その遺伝子構築物を発見した。この課題を達成
する遺伝子構築物は、成熟β−グルコシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列およ
びキシラナーゼ分泌シグナルを含む。

【００２３】本発明者らが認識する限り、以前に、キシラナーゼ分泌シグナルを成熟β−グ
ルコシダーゼ酵素に連結することがβ−グルコシダーゼの産生を増大させたとい
う報告は存在しなかった。さらに、本発明者らは、任意の非キシラナーゼ成熟タ
ンパク質にキシラナーゼ分泌シグナルを連結することが、そのタンパク質の産生
を増大させるという以前の報告を認識していない。本発明者らは、この驚くべき
かつ報告されていない結果を発見した。キシラナーゼ分泌シグナルの使用が、ｃ
ｂｈ１分泌シグナルの使用よりも、高いレベルのβ−グルコシダーゼを生じるこ
とは、さらに驚くべきことであった。キシラナーゼは、ＣＢＨ１よりもＴｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａによって産生される全タンパク質のずっと少ない割合を含むので
（それぞれ、５％および６０％）、ｃｂｈ１分泌シグナルがより効果的であるこ
とが予想される。キシラナーゼ分泌シグナルを成熟β−グルコシダーゼ酵素に連
結することがβ−グルコシダーゼ産生を増大させる理由は分からないが、β−グ
ルコシダーゼとキシラナーゼ分泌シグナルとの間の長さの類似性、または組換え
β−グルコシダーゼが細胞外への分泌について競合するに違いないキシラナーゼ
のより低い豊富さに関連があるのかもしれない。しかし、本発明の実施は、これ
らまたはいずれの他の特定の理由によっても限定されない。

【００２４】本発明は、各々が組み換え手段によってβ−グルコシダーゼの発現の増強を開
示した、ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらによって自明ではない。Ｂａｒ
ｎｅｔｔらおよびＦｏｗｌｅｒらの遺伝子構築物は、β−グルコシダーゼプロモ
ーター、コード領域および分泌シグナルを含む。ＢａｒｎｅｔｔらおよびＦｏｗ
ｌｅｒらによって使用された方法は、本発明者らによって教示される方法と同程
度には有効でなく、そして本発明の遺伝子構築物を予測しない。

【００２５】本発明の１つの局面において、β−グルコシダーゼ産生のために遺伝子改変さ
れた微生物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｃｒｏｂｅ）は
、形質転換していない微生物においては存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を
含む。この形質転換していない微生物から遺伝子改変された微生物は誘導され、
このβ−グルコシダーゼ構築物はプロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、お
よび成熟β−グルコシダーゼコード領域を有し、ここでこの遺伝子改変された微
生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、
Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択
され、そしてこの遺伝子改変された微生物は、この形質転換していない微生物に
対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。

【００２６】別の局面において、本発明は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、お
よび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含むβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物
を含み、ここでこのβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅ
ｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、お
よびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される、形質転換されていない
微生物宿主中に導入され、そして発現される場合、この形質転換していない微生
物宿主に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じ
る。

【００２７】本発明のなお別の局面において、β−グルコシダーゼを産生するために遺伝子
改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物は、形質転換していないＴｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ微生物中には存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を含み、このβ−
グルコシダーゼ構築物は、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成
熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここで、この遺伝子改変されたＴｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａは、この形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物に
対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。

【００２８】さらに別の局面において、本発明は、β−グルコシダーゼを産生するために遺
伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ微生物を含み、この微生
物は、形質転換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ微生物中には
存在しないβ−グルコシダーゼ構築物を含み、このβ−グルコシダーゼ構築物は
、プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコ
ード領域を含み、ここで、この遺伝子改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅ
ｅｓｅｉ微生物は、この形質転換していない微生物に対して、少なくとも約１０
倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。

【００２９】本発明のさらに別の局面において、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、プロ
モーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコード領
域を含み、ここで、このβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ微生物中に導入され、そして発現される場合、形質転換していないＴｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ微生物に対して、少なくとも約１０倍のβ−グルコシダーゼの
産生の増加を生じる。

【００３０】本発明のなおさらに別の局面において、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、
プロモーター、キシラナーゼ分泌シグナル、および成熟β−グルコシダーゼコー
ド領域を含み、ここで、このβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ微生物中に導入され、そして発現される場合、形質転
換していないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ微生物に対して、少なくと
も約１０倍のβ−グルコシダーゼの産生の増加を生じる。

【００３１】以下の好適な実施態様の詳細な説明および付随する図面を考慮すると、本発明
の他の局面はより良好に理解され、そしてその利点はより明白である。

【００３２】（好適な実施態様の詳細な説明）本発明の好適な実施態様を、最初に以下の用語を規定することにより記載する
。

【００３３】 β−グルコシダーゼは、グルコースダイマーであるセロビオースをグルコース
に加水分解する酵素である。β−グルコシダーゼを作る多くの微生物が存在し、
そしてこれらの酵素の、構造（分子量、三次元配向、アミノ酸組成、および活性
部位）および触媒活性（セロビオース加水分解の速度および動力学、および他の
基質に対して作用する能力）を含む性質は変化する。しかし、すべての場合で、
β−グルコシダーゼ酵素は、セロビオースをグルコースに加水分解し得る。これ
はまた、活性酵素がβ−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチドを含まない場合、
成熟β−グルコシダーゼ酵素と称され得る。

【００３４】本発明を実施するために好適なβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａにより作られるβ−グルコシダーゼである。このβ−グルコシダーゼ酵素は、
７４，０００の分子量（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
場合）であり、そして８．３の等電点（非変性等電点ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定した場合）を有する。

【００３５】 β−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼ酵素の産生をコードするＤ
ＮＡの領域である。β−グルコシダーゼを産生するすべての微生物は、少なくと
も１つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を保有する。天然のβ−グルコシダーゼ遺伝
子は、β−グルコシダーゼプロモーター、分泌シグナル、コード領域および転写
ターミネーターを含む。β−グルコシダーゼを産生しない微生物は、一般に、活
性なまたは機能的なβ−グルコルシダーゼ遺伝子を含まない。

【００３６】 β−グルコシダーゼ分泌シグナルは、β−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列である。

【００３７】 β−グルコシダーゼ分泌シグナルペプチドは、コードされたβ−グルコシダー
ゼ酵素のアミノ末端に存在するペプチド配列であって、微生物細胞からの成熟β
−グルコシダーゼ酵素の搬出の間に次に除去される。この分泌シグナルは、プロ
ペプチド、プレペプチドまたはその両者を含み得る。

【００３８】成熟β−グルコシダーゼコード領域は、細胞外培養濾液から単離された場合、
機能的β−グルコシダーゼ酵素をコードするために必要であるＤＮＡ配列を含む
が、β−グルコシダーゼ分泌シグナルは含まない。

【００３９】キシラナーゼは、キシランをキシロースに加水分解もする酵素である。キシラ
ナーゼを作る多くの微生物が存在し、そしてこれら酵素の、構造（分子量、三次
元配向、アミノ酸組成、および活性部位）および触媒活性（キシラン加水分解の
速度および動力学、および他の基質に対して作用する能力）を含む性質は変化す
る。しかし、すべての場合で、キシラナーゼ酵素は、キシランをキシロースに加
水分解し得る。これはまた、活性酵素がキシラナーゼ分泌シグナルペプチドを含
まない場合、成熟キシラナーゼ酵素と称され得る。

【００４０】いくつかの最も重要な市販のキシラナーゼは、ファミリー１１キシラナーゼと
して分類される。キシラナーゼ酵素は、それが、必須の触媒残基として供される
２つのグルタミン酸残基を含む、ファミリー１１に共通のアミノ酸を所有する場
合、ファミリー１１に分類される。これらの残基は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩの番号付けによりアミノ酸８６および１７７であ
る。ファミリー１１キシラナーゼに共通のアミノ酸は、Ｗａｋａｒｃｈｕｃｋら
、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ３：４６７−４７５（１９９４）に記載さ
れている。

【００４１】キシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼ酵素の産生をコードするＤＮＡの領域で
ある。キシラナーゼを産生するすべての微生物は、少なくとも１つのキシラナー
ゼ遺伝子を保有する。天然のキシラナーゼ遺伝子は、キシラナーゼプロモーター
、分泌シグナル、コード領域および転写ターミネーターを含む。キシラナーゼを
産生しない微生物は、一般に、活性なまたは機能的なキシラナーゼ遺伝子を含ま
ない。

【００４２】キシラナーゼ分泌シグナルは、キシラナーゼ分泌シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列である。

【００４３】キシラナーゼ分泌シグナルペプチドは、コードされたキシラナーゼ酵素のアミ
ノ末端に存在するペプチド配列であって、微生物細胞からの成熟キシラナーゼ酵
素の搬出の間に次に除去される。この分泌シグナルは、プロペプチド、プレペプ
チドまたはその両者を含み得る。

【００４４】セルラーゼは、セルロースを、セロテトラオース、セロトリオースおよびセロ
ビオースを含む、グルコースの短いβ１,４連結オリゴマーに加水分解する酵素である。しばしばセロビオヒドロラーゼまたはエンドグルカナーゼとして分類さ
れる、１つ以上のセルラーゼ酵素を作る多くの微生物が存在する。これらの酵素
の、構造（分子量、三次元配向、アミノ酸組成、および活性部位）および触媒活
性（キシラン加水分解の速度および動力学、および他の基質に対して作用する能
力）を含む性質は変化する。しかし、すべての場合で、セルラーゼ酵素は、セル
ロースを、セロテトラオース、セロトリオースおよびセロビオースを含む、グル
コースの短いβ１,４連結オリゴマーに加水分解し得る。

【００４５】 β−グルコシダーゼ遺伝子構築物は、β−グルコシダーゼを産生するために必
要なエレメントを含む遺伝子をいう。これらは以下を含む。

【００４６】ａ．成熟β−グルコシダーゼコード領域好適な実施態様では、成熟β−グルコシダーゼコード領域は、Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を含む。Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａｒｅｅｓｅｉからの成熟β−グルコシダーゼコード領域のＤＮＡ配列は
、Ｂａｒｎｅｔｔらの図１に見出され得る。

【００４７】当業者は、天然の構造領域が、その機能を変化させることなく、１つ以上の核
酸の置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを知っている。
本発明の実施は、このような成熟β−グルコシダーゼコード領域に対する改変を
含むが、これらに束縛されない。

【００４８】ｂ．キシラナーゼ分泌シグナル好適な実施態様では、キシラナーゼ分泌シグナルは、ファミリー１１のキシラ
ナーゼ遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルを含む。

【００４９】より好適な実施態様では、このファミリー１１キシラナーゼ遺伝子は、Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａｘｙｌａｎａｓｅ遺伝子である。

【００５０】なおより好適な実施態様では、このキシラナーゼ分泌シグナルは、Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩ（ｘｌｎ１）遺伝子またはキシラナーゼＩＩ（ｘｌ
ｎ２）遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルを含む。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｘ
ｌｎ１およびｘｌｎ２分泌シグナルのＤＮＡ配列は、Ｔｏｒｒｏｎｅｎ、Ｍａｃ
ｈ、Ｍｅｓｓｎｅｒ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｋａｌｋｋｉｎｅｎ、Ｈａｒｋｋｉお
よびＫｕｂｉｃｅｋ、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉからの２つの主
用なキシラナーゼ：酵素および遺伝子の両方の特徴付け」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ１０：１４６１−１４６５、１９９２の図３および２にそれぞれ見出
され得る（公開された、図の説明文における遺伝子同定を逆にする）。

【００５１】当業者は、天然の分泌シグナルが、その機能を変化させることなく、１つ以上
の核酸の置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを知ってい
る。本発明の実施は、このようなキシラナーゼ分泌シグナルに対する改変を含み
、そしてこれらに束縛されない。

【００５２】ｃ．プロモーター本発明の実施は、遺伝子構築物中のプロモーターの選択により束縛されない。
しかし、好適なプロモーターは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｃｂｈ１、ｃｂｈ２
、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、ｅｇ５、ｘｌｎ１およびｘｌｎ２プロモーターであ
る。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｃｂｈ１のＤＮＡ配列は、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋに登録番号Ｄ８６２３５の下に寄託されている。

【００５３】当業者は、天然のプロモーターが、その機能を変化させることなく、１つ以上
のヌクレオチドの置き換え、置換、付加、または除去により改変され得ることを
知っている。本発明の実施は、このようなプロモーターに対する改変を含み、そ
してこれらに束縛されない。

【００５４】ｄ．キシラナーゼ分泌シグナルと成熟β−グルコシダーゼコード領域との間の
さらなる配列実施例５、６および７に記載される遺伝子構築物は、図１−３に示されるよう
に、ＤＮＡ配列の９つのさらなる塩基対を含む：最初の３つは、Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａｒｅｅｓｅｉキシラナーゼＩＩ遺伝子の分泌シグナル後のグルタミン
残基をコードし、そして残りの６つは、このキシラナーゼ分泌シグナルを、成熟
β−グルコシダーゼコード領域に結合するために用いられた特有の制限部位の挿
入および／または改変から得られる。これらのＤＮＡ配列は、キシラナーゼ分泌
シグナルペプチドと成熟β−グルコシダーゼ酵素との間のさらなるアミノ酸の存
在を生じる。これらのＤＮＡ配列は、これは天然または合成であり得るが、この
構築物によりコードされるキシラナーゼ分泌シグナルに対応する成熟キシラナー
ゼタンパク質の１つ以上のアミノ酸をコードし得るか、またはこのキシラナーゼ
分泌シグナルペプチドおよび成熟β−グルコシダーゼ酵素を連結するために必要
な制限酵素部位の付加から得られ得る。本発明の実施は、このキシラナーゼ分泌
シグナルと成熟β−グルコシダーゼコード領域との間のさらなるＤＮＡ配列の存
在を包含するが、その存在により束縛されない。

【００５５】ｅ．他のエレメントこの遺伝子構築物は、成熟β−グルコシダーゼコード領域のすぐ下流に転写タ
ーミネーターを含む。本発明の実施は、転写ターミネーターの選択により束縛さ
れず、そして任意の公知のコード領域のストップコドンの下流に（すなわち、３
’末端において）ＲＮＡポリメラーゼによる転写の終結を指向するに十分な多量
のＤＮＡを含み得る。実施例５〜７に記載の構築物中の成熟β−グルコシダーゼ
コード領域の下流に存在する転写ターミネーターは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｃｂｈ２遺伝子のストップコドンの３’側に１．９ｋｂのＤＮＡを含む。

【００５６】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｃｂｈ２転写ターミネーターの最初
の５５３塩基対のＤＮＡ配列は、ＴＡＡストップコドンのすぐ下流（または３’
）に位置し、Ｃｈｅｎ、ＧｒｉｔｚａｌｉおよびＳｔａｆｆｏｒｄ、「Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉからのセロビオヒドロラーゼＩＩのヌクレオチド
配列および推定一次構造」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７４−２７
８、１９８７の図２に見出され得る。

【００５７】遺伝子構築物は、同一プラスミドベクター上の、この遺伝子構築物の上流また
は下流（すなわち、この構築物の５’または３’末端）に存在し得るか、または
別のプラスミドベクター上のこの構築物と同時形質転換され得る、選択マーカー
を含む。選択マーカーの選択は、当業者に周知であり、そして形質転換細胞に、
この微生物によって通常代謝されない代謝物を利用する能力を付与するか（例え
ば、アセトアミダーゼをコードし、そして唯一の窒素源としてアセトアミド上で
生育する能力を付与するＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｍｄＳ遺伝子）、または抗生
物質耐性を付与する（例えば、ハイグロマイシン−ｂ−ホスホトランスフェラー
ゼをコードし、そしてハイグロマイシンに対する耐性を付与するＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉｈｐｈ遺伝子）遺伝子（合成または天然）を含む。もし宿
主株が、選択されたマーカーに対する機能的遺伝子を欠くならば、この遺伝子が
マーカーとして用いられ得る。このようなマーカーの例は、ｔｒｐ、ｐｙｒ４、
ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｌｅｕなどを含む。従って、対応する宿主株は、選択され
たマーカー、すなわち、ｔｒｐ、ｐｙｒ、ａｒｇ、ｌｅｕなどに対応する機能的
遺伝子を欠如しなければならない。実施例５〜７に記載の遺伝子構築物中で用い
られる選択マーカーは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａホスホグリセレートキナーゼ（
ｐｇｋ）プロモーターから発現されるＥ．ｃｏｌｉｈｐｈ遺伝子である。

【００５８】Ｅ．ｃｏｌｉｈｐｈ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ
、「プラスミドがコードするハイグロマイシンＢ耐性：ハイグロマシインＢホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子の配列、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるその発現
」Ｇｅｎｅ２５：１７９−１８８、１９８３の図４に見出され得；Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｐｇｋプロモーターのＤＮＡ配列は、Ｖａｎｈ
ａｎｅｎ、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ｉｌｍｅｎ、ＫｎｏｗｌｅｓおよびＰｅｎｔｔ
ｉｌａ、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉの３−ホスホグリセレートキ
ナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｋ１）のプロモーター構造および発現」Ｇｅ
ｎｅ１０６：１２９−１３３、１９９１の図２に見出され得る。

【００５９】本発明の１つの好適な実施態様は、これまで記載されたβ−グルコシダーゼ遺
伝子構築物を含む。本発明の実施は、この構築物を作る方法により束縛されず、
これは、アルカリ溶解によるＥ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの単離、プラ
スミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼを用いた消化、アガロースゲル電気泳動
によるＤＮＡフラグメントの分離および単離、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたＤ
ＮＡフラグメントの連結、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡフラグメントの末
端における特有の制限部位の挿入またはオリゴヌクレオチドリンカーの付加、な
らびにＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントを用いたＤＮＡフラグメントの平滑化のような標準的な分
子生物学の技法を含み得るが、これらに限定されない。

【００６０】実施例１〜７は、このような遺伝子構築物を作製する手順を記載する。

【００６１】本発明の別の好適な実施態様では、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物を微生物
宿主中に導入し、そして発現して、遺伝子改変された微生物を生成する。得られ
る遺伝子改変された微生物は、非形質転換微生物宿主に対して増加したレベルの
β−グルコシダーゼを生成する。この遺伝子改変された微生物は、好ましくは、
非形質転換微生物宿主に対して少なくとも約１０倍、より好ましくは、非形質転
換微生物宿主に対して少なくとも約４０倍、そして最も好ましくは、非形質転換
微生物宿主に対して少なくとも約１２０倍の増加したレベルのβ−グルコシダー
ゼを産生する。

【００６２】本発明は、当業者によく知られた微生物宿主中にβ−グルコシダーゼ遺伝子構
築物を導入する任意の方法を包含し、これには、細菌細胞の塩化カルシウム処理
または細胞膜を弱める真菌プロトプラスト，細胞膜の融合を可能にするポリエチ
レングリコールの添加、エレクトロポーレーションによる細胞膜の脱極性化、ま
たは微粒子銃を用いたマイクロプロジェクタイルボンバードメントによる細胞壁
および膜を通るＤＮＡの発射が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６３】実施例８は、粒子銃を用いて、β−グルコシダーゼ遺伝子構築物をＴｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ胞子中に導入する手順を記載する。

【００６４】非形質転換微生物宿主に対してβ−グルコシダーゼ産生の１０倍増強は、この
株の天然の変動性を十分超える有意な増強を反映し、そして商業的に重要である
。この方法によるβ−グルコシダーゼの増加の程度は１２６倍程高く、そして１
０００倍以上に達し得た。β−グルコシダーゼ産生の増加の程度の測定は、実施
例１１に記載のように、培養の増殖およびβ−グルコシダーゼ活性の測定による
。本発明の遺伝子構築物は、約１０倍より大きい任意のレベルの増加を産生する
と考えられる。酵素混合物のβ−グルコシダーゼの比活性（ＩＵ／ｍｇタンパク
質）は、酵素混合物中のセルラーゼおよびその他のタンパク質の量を低下するこ
とにより増加し得ることが当業者に理解される。これは、酵素混合物の物理的お
よび機械的分離によるか、または組換え手段によるセルラーゼまたはその他の遺
伝子の欠失によってなされ得る。このような方法は、微生物によるβ−グルコシ
ダーゼの実際の産生に影響がほとんどないかまたは全くない。しかし、これらの
手順は、必要に応じて、本発明の実施に含まれ得る。

【００６５】好適な実施態様では、微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏ
ｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＣｅｌｌｕｌｏ
ｍｏｎａｓの種のメンバーである。これらの種は十分に適している。なぜなら、
これらは、β−グルコシダーゼに加えてセルラーゼを産生するからである。さら
に、以下のセルラーゼ産生株中へのＤＮＡ構築物の導入のための方法が公開され
ている：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａについて（Ｌｏｒｉｔｏ、Ｈａｙｅｓ、ＤｉＰ
ｉｅｔｒｏおよびＨａｒｍａｎ、１９９３、「プラスミドおよびゲノムＤＮＡを
用いるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍおよびＧｌｉｏｃｌａｄｉ
ｕｍｖｉｒｅｎｓの微粒子銃形質転換」Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４
９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ、ＶａｎＭｏｎｔａｇｕおよびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅ
ｓｔｒｅｌｌａ、１９９０、「高電圧電気パルスによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｈａｒｚｉａｎｕｍの形質転換」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１
７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ、Ｒａｔｔｏ、Ｓａｌｍｉｎｅ
ｎおよびＫｎｏｗｌｅｓ、１９８７、「セルロース溶解性真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａｒｅｅｓｅｉのための汎用形質転換系」、Ｇｅｎｅ６：１５５−１６
４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓについて（Ｙｅｌｔｏｎ、ＨａｍｅｒおよびＴｉ
ｍｂｅｒｌａｋｅ、１９８４、「ｔｒｐＣプラスミドを用いるＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４）、Ｆｕｓａｒｉｕｍについて（Ｂａｊ
ａｒ、ＰｏｄｉｌａおよびＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、１９９１、「リン酸化トラ
ンス作用性因子を経由する植物シグナルによって誘導可能な真菌クチナーゼプロ
モーターの同定」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８
２０２−８２１２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓについて（Ｈｏｐｗｏｏｄら、
１９８５、「ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ」ＴｈｅＪｏｈｎ
ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｋ、ＵＫ）およびＢａｃｉ
ｌｌｕｓについて（Ｂｒｉｇｉｄｉ、ＤｅＲｏｓｓｉ、Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ、Ｒ
ｉｃｃａｒｄｉおよびＭａｔｔｅｕｚｚｉ、１９９０、「エレクトロポーレーシ
ョンによるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのインタクト細胞の遺伝子形質
転換」、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８）。

【００６６】これらの公開された形質転換方法において使用された遺伝子構築物は、実施例
５〜７に記載されるものと、それらが、タンパク質コード領域（これは、選択マ
ーカーをコードし得る）に連結されたプロモーターおよび転写ターミネーターを
含むという点において類似する。殆どの場合、遺伝子構築物は、選択マーカー遺
伝子に連結される。

【００６７】Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａまたはＣｅｌｌｕｌｏｍ
ｏｎａｓの形質転換のための公開された方法は存在しないが、他の糸状菌または
細菌のための形質転換方法が、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏ
ｒａまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓの株について、それについての形質転換方
法が公開されたこれらの種の類似の形態および生理によって、最適化され得ると
考えられる。さらに、エレクトロポレーションおよび粒子ボンバートメントのよ
うな形質転換方法を使用して、ＤＮＡを多くの異なる細胞型（哺乳動物細胞およ
び植物細胞、細菌、酵母および真菌の細胞を含む）へと導入している。

【００６８】好ましい実施態様において、その遺伝子改変された微生物が由来するキシラナ
ーゼ分泌シグナルは、その微生物宿主にとってネイティブである（すなわち、キ
シラナーゼ分泌シグナルの供給源は、その遺伝子改変された微生物が由来する微
生物宿主と同じ型の微生物宿主である）。

【００６９】より好ましい実施態様において、その微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
である。

【００７０】より好ましい実施態様において、その微生物宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉである。

【００７１】（実施例）実施例１は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉの株ＲｕｔＣ３０，Ｍ２
Ｃ３８，ＢＴＲ４８からのゲノムＤＮＡの単離、およびそれらの株の遺伝子改変
された誘導体を記載する。実施例２〜７は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓ
ｅｉの株Ｍ２Ｃ３８からの、ゲノムＤＮＡライブラリーの構築、種々の遺伝子の
クローニング、およびいくつかの遺伝子構築物を記載する。実施例９および１１
〜１５は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉの株Ｍ２Ｃ３８、ＢＴＲ４８
、およびＲｕｔＣ３０におけるβ−グルコシダーゼ遺伝子構築物の形質転換およ
び発現を記載する。

【００７２】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉの株Ｍ２Ｃ３８およびＢＴＲ４８は、
ＩｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有の株であり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａｒｅｅｓｅｉＲｕｔＣ３０に由来した（ＡＴＣＣ５６７６５，Ｍｏ
ｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔａｎｄＥｖｅｌｅｉｇｈ，１９７９，「Ｓｅｌｅｃｔ
ｉｖｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｙｉｅｌｄｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｓｅｍｕｔａｎｔｓｏｆＴ．ｒｅｅｓｅｉ」、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｅｒ．１８１：２８９−３０１）。次いで、この株は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａｒｅｅｓｅｉＱｍ６Ａに由来した（ＡＴＣＣ１３６３１Ｍａｎｄｅ
ｌｓａｎｄＲｅｅｓｅ，１９５７「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕ
ｌａｓｅｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅａｓｉｎｆｌｕｅ
ｎｃｅｄｂｙｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｍｅｔａｌｓ」、Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３：２６９−２７８）。

【００７３】実施例１およびその後の実施例において、制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ
ーゼ１のクレノウフラグメントを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍまたはＰｈａｒ
ｍａｃｉａから購入し、そしてそれら製造業者の推奨どおりに使用した。プルー
フリーディング活性を有するＰｗｏポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）をすべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、その製造
業者のプロトコルに従って使用した。ハイグロマイシンＢを、ＣａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍから購入した。

【００７４】（実施例１：ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉゲノムＤＮＡの単離）ゲノムＤＮＡを単離するために、５０ｍｌのＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅ
Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に、無菌の播種ループを伴うＰｏｔａｔｏＤｅｘ
ｔｒｏｓｅＡｇａｒプレートから収集したＴ．ｒｅｅｓｅｉの胞子を播種した
。この培養物を、２００ｒｐｍで、２〜３日間２８℃で振盪した。菌糸を、無菌
のＧＦＡ微小ガラスファイバーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上で濾過し、そし
て冷脱イオン水を用いて洗浄した。真菌のケーキ（ｃａｋｅ）を、液体窒素中で
凍結させ、そして予め冷やした乳鉢および乳棒を用いて粉末へと粉砕し；粉末化
したバイオマスの０．５ｇを、５ｍｌの１００ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７．５および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に再懸濁し
た。その溶解物を遠心分離して（５０００ｇ、２０分、４℃）、細胞砕片をペレ
ット化した。その上清を、緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ８．０）で飽和した１容量のフェノールで抽出し、続いて可溶性タンパク質
を除くために１容量の緩衝液で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール（２５：２４：１）を用いて抽出した。ＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ
の酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２．５容量の冷９５％エタノールを添加す
ることによって、その溶液から沈降させた。少なくとも１時間、−２０℃でイン
キュベートした後、そのＤＮＡを、遠心分離（５０００ｇ、２０分、４℃）によ
ってペレット化し、１０ｍｌの７０％エタノールでリンスし、風乾し、そして１
ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁した。Ｒ
ＮＡを、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにまで添加したリボヌクレアーゼＡ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の添加および３７℃での１時間のインキュ
ベーションによって消化する。１容量の緩衝液飽和フェノールおよび１容量の緩
衝液飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）
での連続的な抽出を用いて、そのＤＮＡ溶液から、リボヌクレアーゼを除去する
。そのＤＮＡを再び、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２．
５容量の冷９５％エタノールを用いて沈降させ、遠心分離によってペレット化し
、７０％エタノールを用いてリンスし、風乾し、そして５０μｌの１０ｍＭＴ
ｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０に再懸濁する。ＤＮＡの濃度を、２６
０ｎｍでその溶液の吸光度を測定することによって決定した（ｐ．Ｃ１、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ１９
８９、本明細書以後Ｓａｍｂｒｏｏｋらと称する）。

【００７５】（実施例２：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉゲノムライブラリーの構築）２つのプラスミドライブラリーおよび１つのファージライブラリーを、Ｔ．ｒ
ｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８から単離したゲノムＤＮＡを用いて構築した。これらの
プラスミドライブラリーを、ベクターｐＵＣ１１９中に構築した（Ｖｉｅｒａ
ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒ
ａｎｄｅｄｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ」、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１
５３：３，１９８７）。これは、以下のとおりである：１０μｇのゲノムＤＮ
Ａを、２０時間、３７℃で、１００μｌ容量の２ユニット／μｇのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩの制限酵素中で、消化した。消化したＤＮＡを
、０．０４ＭＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ中で流した０．７５％のアガ
ロースゲル上で分画し、そしてエチジウムブロミドで染色した。目的の遺伝子の
大きさに対応するゲルスライス（公開された情報およびサザンブロットに基づく
）を切り出し、そして電気溶出に供して、そのＤＮＡフラグメントを回収した（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、６．２８−６．２９頁）。これらの富化されたＤＮＡ画分
を、遺伝子ライブラリーを作製するために、４℃で１６時間、ベクター：インサ
ートＤＮＡのモル比が２：１での２０〜５０μｇ／ｍｌＤＮＡ、１ｍＭＡＴ
Ｐおよび５ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼを総容量１０〜１５μｌで含む連結反
応においてｐＵＣ１１９へと連結した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ｈ
Ｂ１０１を連結反応物を用いて、ＣｅｌｌＰｏｒａｔｏｒＳｙｓｔｅｍ（Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、エレクトロポレ
ートし、そして形質転換体を、７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上
で選択した。

【００７６】ファージライブラリーを、λベクターλＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉ
ｎｃ．）中に構築した。これは以下のとおりであった：ゲノムＤＮＡ（３μｇ）
を、２ユニット／μｇ、１ユニット／μｇ、０．５ユニット／μｇおよび０．２
ユニット／μｇのＢａｍＨＩを用いて、１時間３７℃にて消化して、大きさが９
〜２３ｋＢのフラグメントを生成した。各消化物からのＤＮＡを、１容量のＴｒ
ｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）
を用いた抽出、続いて１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２５０
μｌの９５％エタノール（−２０℃）での沈降によって、精製した。この消化し
たＤＮＡを、微小遠心分離によってペレット化し、０．５ｍｌの冷７０％エタノ
ールを用いてリンスし、風乾し、そして１０μｌの無菌の脱イオン水中に再懸濁
した。大きさが９〜２３ｋＢのＤＮＡフラグメントの富化は、アガロースゲル電
気泳動によって確認した（０．０４ＭのＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ中の
０．８％アガロース）。消化したＤＮＡ（０．４μｇ）を、４℃で一晩、５μｌ
の総容量中に２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼおよび１ｍＭＡＴＰを含有す
る反応液中において、ＢａｍＨＩを用いて予備消化した１μｇのλＤＡＳＨのア
ーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。連結混合物を、ＧｉｇａＰａｃｋ（
登録商標）ＩＩＧｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製
造業者のプロトコルに従って用いてファージ粒子へとパッケージングした。その
ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＡ（Ｐ２）を用いて
力価決定し、そして３×１０⁵の独立クローンを含むことが見出された。

【００７７】（実施例３：ｐＵＣ１１９ライブラリーからのセロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂ
ｈ１）遺伝子、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ｃｂｈ２）遺伝子、およびβ−グル
コシダーゼ（ｂｇｌ１）遺伝子のＴ．ｒｅｅｓｅｉＭ２Ｃ３８クローンの単離
）組換えｐＵＣ１１９−ＨｉｎｄＩＩＩライブラリー、組換えｐＵＣ１１９−
ＢａｍＨＩライブラリーまたは組換えｐＵＣ１１９−ＥｃｏＲＩライブラリー由
来のｃｂｈ１，ｃｂｈ２またはｂｇｌ１のクローンを有するＥ．ｃｏｌｉＨＢ
１０１形質転換体を、コロニーリフトハイブリダイゼーションによって同定した
。１〜３×１０⁴コロニーを、ＨｙＢｏｎｄ^TMナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ転写し；そのメンブレンをコロニー側を上にして、０．５ＭＮａＯ
Ｈ，１ＭＮａＣｌで５分間飽和したブロット紙（ＶＷＲ２３８）上に配置し
て、細菌細胞を溶解し、そしてそのＤＮＡを変性させ；次いで、そのメンブレン
をコロニー側を上にして、１．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ＭＮａＣｌで
５分間飽和したブロット紙（ＶＷＲ２３８）上にそれらを配置することにより
中和し；そのメンブレンを、３０分間風乾させて、次いでそのＤＮＡを、８０℃
で２時間ベーキングすることによりそのメンブレンに、固定した。

【００７８】 ³²Ｐ標識したプローブを、総容量２０μｌ中に、１０〜５０ｎｇの標的ＤＮＡ
、各々０．２ｍＭのｄ（ＧＣＴ）ＴＰ、０．５μＭのｄＡＴＰ、２０〜４０μＣ
ｉのα−³²Ｐ−ｄＡＴＰ、１０ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマーおよび
０．５ユニットのＴａｑポリメラーゼを含む標識反応液中における、それぞれ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩのフラグメントの富化されたプー
ルからのｂｇｌ１、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２のコード領域の短い（０．７〜１．
５ｋＢ）のフラグメントのＰＣＲ増幅によって、調製した。この反応を、６〜７
サイクルの増幅に供した（９５℃、２分；５６℃、１．５分；７０℃、５分）
。増幅した³²Ｐ標識ＤＮＡを、０．５ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸お
よび０．５ｍｇの酵母ｔＲＮＡを添加することによって沈降させた。このＤＮＡ
を、微小遠心分離によってペレット化し、１ｍｌ７０％エタノールで２回洗浄
し、風乾し、そして１ＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁
した。

【００７９】組換えｐＵＣ１１９プラスミドが固定されたナイロンメンブレンを、熱シール
したバッグ中で１時間、６０〜６５℃にて、１００ μｇ／ｍｌの変性させ剪断
したサケ精子ＤＮＡを有する１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．５中で予備ハイブリダイズした。ハイブリダ
イゼーションを、熱シールしたバッグ中にて、５０μｇ／ｍｌのみの変性させ、
剪断したサケ精子ＤＮＡおよび５×１０⁶〜５×１０⁷ｃｐｍの変性したｂｇｌ１
プローブ、ｃｂｈ１プローブまたはｃｂｈ２プローブを有する同じ緩衝液中で１
６〜２０時間、６０〜６５℃にて、実施した。メンブレンを、１ＭＮａＣｌ、
０．５％ＳＤＳを用いて、６０℃にて１５分間、１回洗浄し、０．３ＭＮａ
ＣＬ、０．５％ＳＤＳを用いてそれぞれ６０℃にて１５分間、２回洗浄し、そ
して０．０３ＭＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳを用いて５５℃にて１５分間、１
回洗浄した。メンブレンを、再度、熱シールしたバッグ中におき、そしてＫｏｄ
ａｋＲＰＸ線フィルムに１６〜４８時間、−７０℃にて曝露した。Ｘ線フィ
ルムを、製造者のプロトコルに従って現像した。強力なシグナルまたは弱いシグ
ナルを与えるコロニーを拾い、そして７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した
２×ＹＴ培地中で培養した。プラスミドＤＮＡを、これらの培養物から、アルカ
リ溶解方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１．２５−１．２８頁）を用いて単離し、そ
して制限消化、サザンハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８
−９．４４頁）およびＰＣＲ分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１４．１８−１４．１
９頁）により分析した。

【００８０】ｂｇｌ１遺伝子を有するクローンを、公開されたｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔ
ｔら）のｂｐ４６２−１４０３を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて調整された１．０ｋｂのｂｇｌ１プローブを用いる、ｐＵ
Ｃ１１９−ＨｉｎｄＩＩＩライブラリー（実施例２）のコロニーリフトハイブ
リダイゼーションによって同定した。ｂｇｌ１クローンであるｐＪＥＮ２００
を、単離した。これは、プロモーター、構造遺伝子および終結配列に対応する６
．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含んでいた。ｃｂｈ１遺伝子を有
するクローンを、公開されたｃｂｈ１配列（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓｃｈｗｅｉ
ｋａｒｔ，Ｌａｄｎｅｒ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｋｗｏｋ，ＭｙａｍｂｏおよびＩｎ
ｎｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆｅｘｏ−ｃｅｌｌｏｂ
ｉｏｈｙｄｒｏｌｙａｓｅ１ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａｒｅｅｓｅｉｓｔｒａｉｎＬ２７」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ１：６９１−６９６，１９８３本明細書以後、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒらと称
する。）のｂｐ５９７−１３６１を増幅するように設計されたオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いて調製した０．７ｋｂのｃｂｈ１プローブを用いる、ｐＵ
Ｃ１１９−ＢａｍＨＩライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションに
よって同定した。ｃｂｈ１クローンであるｐＣＯＲ１３２を、単離した。これは
、プロモーター（４．７ｋｂ）および１ｋｂのｃｂｈ１構造遺伝子に対応する５
．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを含んでいた。これから、ｃｂｈ１プロモー
ター（２．１ｋｂ）およびｃｂｈ１コード領域の５’末端（０．４ｋｂ）を含む
２．５ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＵＣ１１９中にサブクローニング
して、ｐＣＢ１５２を生成した。ｃｂｈ２遺伝子を有するクローンを、公開され
たｃｂｈ２配列（Ｃｈｅｎ，ＧｒｉｔｚａｌｉおよびＳｔａｆｆｏｒｄ、「Ｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄｐｒｉｍａｒ
ｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＩＩ
ｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ５：２７４−２７８、１９８７、本明細書以後、Ｃｈｅｎらと称す
る）のｂｐ５８０−２１１４を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて調製した１．５ｋｂｃｂｈ２のプローブを用いる、ｐＵＣ
１１９−ＥｃｏＲＩライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーションによ
って、同定した。ｃｂｈ２クローンであるｐＺＵＫ６００を単離した。これは、
プロモーター（６００ｂｐ）、構造遺伝子（２．３ｋｂ）およびターミネータ−
（１．９ｋｂｐ）に対応する４．８ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを含んでいた
。

【００８１】（実施例４：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＭ２Ｃ３８ｃｂｈ１のターミネーター、キ
シラナーゼＩＩ（ｘｌｎ２）遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター
（ｐｇｋｐ）のクローニング）ジゴキシゲン−１１−ｄＵＴＰ標識プローブを、ＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇ
ａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
）を用いたランダムプライム標識により、そして製造者のプロトコルに従ってｃ
ｂｈ１遺伝子、ｘｌｎ２遺伝子およびｐｇｋ遺伝子のＰＣＲ増幅したコード領域
から調製した。ｃｂｈ１遺伝子、ｘｌｎ２遺伝子およびｐｇｋ遺伝子を含むゲノ
ムクローンを、λＤＡＳＨライブラリーのプラークリフトハイブリダイゼーショ
ンによって同定した。目的の各遺伝子について、１×１０⁴のクローンをＮｙｔｒａｎ（登録商標）（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｌｌ）ナイロン
メンブレンに転写した。このファージ粒子を溶解し、そしてそのファージＤＮＡ
を、そのメンブレンをプラーク側を上にして、０．５ＭＮａＯＨ、１ＭＮ
ａＣｌで飽和させたブロット紙（ＶＷＲ２３８）上に５分間置くことによって変
性させ；次いで、そのメンブレンを、プラーク側を上にしてそのメンブレンを１
．５ＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５および１ＭＮａＣｌで５分間飽和させたブロ
ット紙（ＶＷＲ２３８）上に置くことによって、中和し；そのメンブレンを、３
０分間風乾させ、次いで、ＤＮＡを、８０℃で２時間ベーキングすることによっ
てそのメンブレンに固定させた。このメンブレンを、熱シールしたバッグ中で、
６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変
性させ、剪断したサケ精子ＤＮＡの溶液中において、６５℃にて２時間予備ハイ
ブリダイズした。次いで、このメンブレンを、熱シールしたバッグ中で、５０μ
ｇ／ｍｌの変性させ、剪断したサケ精子ＤＮＡおよび０．５μｇのジゴキシゲン
−ｄＵＴＰ標識したプローブを含む同じ緩衝液中において、６５℃にて一晩ハイ
ブリダイズさせた。このメンブレンを、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で室
温にて１５分間、２回洗浄し、そして０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で
６５℃にて１５分間、２回洗浄し、そして２×ＳＳＰＥ中で５分間、１回洗浄し
た。陽性にハイブリダイズしたクローンを、抗ジゴキシゲニン／アルカリホスフ
ァターゼ抗体結合体、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートお
よび４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ）を用いた反応により製造者のプロトコルに従って、同定した。陽性
にハイブリダイズしたクローンを、ジゴキシゲン−ｄＵＴＰ標識プローブを用い
た２回のスクリーニングによってさらに精製した。個々のクローンを単離し、そ
してファージＤＮＡを、ＣｓＣｌ勾配工程を、１容量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および１容量のクロロホルム：イ
ソアミルアルコール（２４：１）を用いた抽出に置き換えたことを除いて、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら（１９８９）２．１１８−２．１２１頁に記載されるように精製
した。このＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよびｐＨ５．２、なら
びに２．５容量の冷９５％エタノールを用いて沈降させた。沈降したファージＤ
ＮＡを，０．５ｍｌの冷７０％エタノールを用いて洗浄し、風乾させ、そして５
０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０中に再懸濁した。
目的の遺伝子を含む制限フラグメントを、精製したファージＤＮＡの制限消化、
およびλＤＡＳＨライブラリーをスクリーニングするために使用したのと同じジ
ゴキシゲン−ｄＵＴＰ標識したプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼ
ーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８−９．４４頁）によって同定した。こ
のメンブレンをハイブリダイズさせ、そして陽性にハイブリダイズするフラグメ
ントを、プラークリフトについて使用したのと同じ方法によって可視化した。一
旦各λＤＡＳＨクローンからの所望の制限フラグメントが同定されると、その制
限消化を繰り返し、そのフラグメントを、ＴＡＥ中にて０．８％のアガロースゲ
ル上で分離し、そして所望のバンドを切り出した。このＤＮＡを、ゲルスライス
から、ＳｅｐｈａｇｌａｓＢａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を、製造者のプロトコルに従って用いて溶出した。ｃｂｈ１遺伝子を有するクロ
ーンを、公開されたｃｂｈ１配列（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら）のｂｐ４５−２２
２０を含むｃｂｈ１プローブを用いたλＤＡＳＨライブラリーのコロニーリフト
ハイブリダイゼーション（実施例２）によって同定した。ｃｂｈ１コード領域（
０．５ｋｂ）およびｃｂｈ１ターミネーター（１．３ｋｂ）の３’末端を含む１
．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを、λＤＡＳＨｃｂｈ１クローンから精
製したファージＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントを、Ｅ．
ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ部位にサブクローニング
して、プラスミドｐＣＢ１Ｔａを作製した。ｘｌｎ２遺伝子を有するクローンを
、公開されたｘｌｎ２配列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎ，Ｐａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｆ
ａｇｅｒｓｔｒｏｍ，ＳｕｏｍｉｎｅｎおよびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ、「Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎｏｆｔｈｅＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｅｎｄｏｘｙ
ｌａｎａｓｅＩＩ（ｐＩ９）ｇｅｎｅｘｌｎ２」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．２４１：４９７−５０３、１９９３、本明細書中で以後Ｓａａｒｅｌ
ａｉｎｅｎらと称する）のｂｐ１００−７８３を含むｘｌｎ２プローブを用
いたλＤＡＳＨライブラリーのコロニーリフトハイブリダイゼーション（実施例
２）によって同定した。ｘｌｎ２遺伝子のプロモーター（２．３ｋｂ）、コード
領域（０．８ｋｂ）およびターミネータ−（２．６ｋｂ）を含む５．７ｋｂ
ＫｐｎＩフラグメントを、λＤＡＳＨｘｌｎ２クローンから精製したファージ
ＤＮＡの制限消化によって単離した。このフラグメントを、ｐＵＣ１１９のＫｐ
ｎＩ部位へサブクローニングして、プラスミドｐＸＹＮ２Ｋ−２を生成した。ｐ
ｇｋ遺伝子を有するクローンを、公開されたｐｇｋ配列（Ｖａｎｈａｎｅｎ，Ｐ
ｅｎｔｔｉｌａ，ＬｅｈｔｏｖａａｒａおよびＫｎｏｗｌｅｓ、「Ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ３−ｐｈ
ｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ（ｐｇｋ）ｆｒｏｍ
ｔｈｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒ
ｅｅｓｅｉ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１８１−１８６，１９８９）のｂ
ｐ４−１５８６を含むｐｇｋ１プローブを用いた、λＤＡＳＨライブラリーの
コロニーリフトハイブリダイゼーション（実施例２）によって同定した。ｐｇｋ
遺伝子のプロモーター（２．９ｋｂ）、コード領域（１．６ｋｂ）およびターミ
ネータ−（０．５ｋｂ）を含む５．０ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、λＤ
ＡＳＨｐｇｋクローンから精製したファージＤＮＡの制限消化によって単離し
た。このフラグメントを、ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし
て、プラスミドｐＧＫ５．０を作製した。

【００８２】（実施例５：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶの構築）本実施例は、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセロビオヒドロラーゼＩプロモーターお
よび分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含有するベクター
の構築を記載する。

【００８３】 β−グルコシダーゼ分泌シグナルを含まないｂｇｌ１コード領域（ｂｐ４７４
−２６７９）を含むＤＮＡフラグメントを、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、コー
ドされたβ−グルコシダーゼのＶａｌ３２の５’側のＳｐｈ１部位またはｂｇｌ
１停止コドンの３’側のＫｐｎＩ部位のいずれかを含む、公開されたｂｇｌ１配
列に相同なプライマーを用いて、ｐＪＥＮ２００鋳型からＰＣＲによって増幅し
た。この増幅されたフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｓｐｈ
ＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＣＢ２１９Ｎに挿入し、ｐＢｇｓｔｒｆを生成し
た。ｐＣＢ２１９Ｎを作製するために、ｃｂｈ２ターミネーターフラグメントを
、５’末端でＫｐｎＩ部位を含む、公開されたｃｂｈ２遺伝子３’非翻訳領域（
Ｃｈｅｎら、１９８７）のｂｐ２２２６−２２４２に相同なプライマー、および
ｐＵＣ順方向プライマー（カタログ番号１２２４、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）（ｐＺＵＫ６００におけるｃｂｈ２の３’末端でＥｃｏＲＩ部位
の下流にアニールする）を用いて、ｐＺＵＫ６００鋳型から増幅した。このフラ
グメントを、操作されたＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位で消化し、ｐＵＣ１１９
の対応する部位に挿入し、ｐＣＢ２１９を生成した。ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダ
プター（カタログ番号３５３１０−０１０、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を、ｐＣＢ２
１９の特有のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＣＢ２１９Ｎを生成した。ｃｂｈ１プ
ロモーターおよび分泌シグナルを含有するフラグメントを、コードされたＣＢＨ
１のＳｅｒ１９の３’側のＳｐｈＩ部位を含むｃｂｈ１特異的プライマー（公開
されたｃｂｈ１配列のｂｐ２４９−２８４、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、１９８３）
、およびｐＵＣ順方向プライマー（カタログ番号１２２４、ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ）（ｐＣＢ１５２におけるｃｂｈ１の５’末端でＥｃｏＲ
Ｉ部位の上流にアニールする）を用いて、ｐＣＢ１５２から増幅した。ｃｂｈ１
プロモーター＋分泌シグナルＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで消化し
、そしてｐＢＲ３２２Ｌ（ＳｐｈＩ部位とＳａｌＩ部位との間の領域が、Ｓｐｈ
Ｉ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩリンカーで置換されたｐＢＲ３２２の誘導体）において
対応する部位に挿入し、ｐＢＲ３２２ＬＣＳを生成した。発現カセットを作製す
るために、ｂｇｌ１コード領域およびｃｂｈ２ターミネーターを、ｐＢｇｓｔｒ
ｆから４．１ｋｂのＳｐｈＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして単離し、ＳｐｈＩお
よびＮｏｔＩで消化したｐＢＲ３２２ＬＣＳに挿入した。ｃｂｈ１分泌シグナル
および成熟β−グルコシダーゼの接合点で正確な読み枠を維持するために、得ら
れたプラスミドｐＣＢＧｓｔｒｆを、特有のＳｐｈＩ部位で線状化し、そしてＳ
ｐｈＩ部位を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。次いで、得られたプラ
スミドｐＣＢＧ１を、ｃｂｈ２ターミネーターの３’末端で特有のＮｏｔＩ部位
を、ＸｈｏＩリンカー（カタログ番号１０７３、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓ）の付加により特有のＸｈｏＩ部位へ変換することによりさらに改変
した。最終プラスミドｐＣＢＧ１−ｘｈｏは、発現カセットプラスミドである。

【００８４】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉについての選択マーカーとして使用されるＥ．ｃｏｌｉヒグ
ロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を、プラスミドｐＶＵ１
００５（ＶａｎｄｅｎＥｌｚｅｎ、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、ＬｅｅおよびＢｅｄ
ｂｒｏｏｋ、「Ａｃｈｉｍａｅｒｉｃｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅｇｅｎｅａｓａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｉｎ
ｐｌａｎｔｃｅｌｌｓ」、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：２９９−３０
２、１９８９）からＰｗｏポリメラーゼで増幅した。プライマーを、それぞれｈ
ｐｈコード領域（公開されたｈｐｈ配列のｂｐ２１１−１２３６、Ｇｒｉｔｚお
よびＤａｖｉｅｓ、「Ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
ｂｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｙｇｒｏ
ｍｙｃｉｎＢｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅａｎｄ
ｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａ
ｎｄＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｇｅｎｅ２５
：１７９−１８８，１９８３）の５’末端および３’末端にＳｐｈＩ部位および
ＫｐｎＩ部位を導入するように設計した。ＰＣＲ産物をＳｐｈＩおよびＫｐｎＩ
で消化し、そしてｐＵＣ１１９のポリリンカー領域における対応する部位に挿入
した。得られたプラスミドｐＨＰＴ１００を、選択カセットの構築のための出発
プラスミドとして使用した。２つの新規なリンカー領域を、プロモーターおよび
ターミネーターフラグメントのクローニングを容易にするために、このプラスミ
ドに導入した。ｐＨＰＴ１００に残存するｐＵＣ１１９ポリリンカーのＫｐｎＩ
部位とＳａｃＩ部位との間に挿入したＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｃＩリンカーと
同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＳｐｈＩリンカーを、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位とＳｐｈＩ部位との間に挿入した。この構築物を、ｐＨＰＴ１０２と
称した。ｐｇｋプロモーターを増幅するために使用されるプライマー（Ｖａｎｈ
ａｎｅｎ、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ、Ｉｌｍｅｎ、ＫｎｏｗｌｅｓおよびＰｅｎｔｔ
ｉｌａ、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｏｆｔｈｅ３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ
ｇｅｎｅ（ｐｇｋ１）ｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ」、Ｇｅ
ｎｅ１０６：１２９−１３３、１９９１）を、それぞれ、プロモーターの−９
７０位および＋１位にＸｈｏＩ部位およびＳｐｈＩ部位を導入するように設計し
た。続いて、これらの部位を、ｐｇｋプロモーターをｐＨＰＴ１０２のＸｈｏＩ
部位およびＳｐｈＩ部位に挿入してｐＨＰＴ１１５を生成するために使用した。
１．３ｋｂのｃｂｈ１ターミネーターフラグメントを、ｂｐ１８７７−１８８２
でＫｐｎＩ部位を含有するｃｂｈ１の３’非翻訳領域（公開されたｃｂｈ１配列
のｂｐ１８６４−１８９９）にアニールするプライマー、およびｐＵＣ逆方向プ
ライマー（カタログ番号１８４３２−０１３、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｐＣＢ１
Ｔａにおけるｃｂｈ１の３’末端でＥｃｏＲＩ部位の下流にアニールする）を使
用して、ｐＣＢ１ＴａからＰｗｏポリメラーゼによって増幅した。ｃｂｈ１ター
ミネーターＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化し、そしてｐＨＰＴ１１５の特有のＫｐ
ｎＩ部位に挿入し、選択カセットプラスミドｐＨＰＴ１３６を生成した。

【００８５】形質転換ベクターを作製するために、ｐＣＢＧ１−Ｘｈｏからの発現カセット
を５．６ｋｂのＸｂａＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、そしてｐＨＰＴ
１３６の選択カセットの上流の特有のＸｂａＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入
した。最終形質転換ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶ（図１に示す）を、以下、実施例
９に記載するように、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって、Ｔ
．ｒｅｅｓｅｉＭ２Ｃ３８に環状プラスミドとして導入した。

【００８６】（実施例６：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＸＢＧ１−ＴＶの構築）本実施例は、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩＩプロモーターおよび分
泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含有するベクターの構築
を記載する。

【００８７】 β−グルコシダーゼコード領域（ｂｐ４７４−２６８０）を、Ｐｗｏポリメラ
ーゼを用いて、公開されたｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔｔら）におけるｂｐ４７
４のすぐ上流にＸｂａＩ部位を、およびｂｐ２６８０のすぐ下流にＫｐｎＩ部位
を挿入するためのプライマーを用いて、ゲノムｂｇｌ１クローンｐＪＥＮ２００
から増幅した。平滑末端化したＰＣＲ産物を、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位に挿
入し、ｐＢＧｍ．ｓと称されるプラスミドを生成した。ＸｂａＩ部位を、Ｖａｌ
３２で成熟β−グルコシダーゼの開始のすぐ上流にあるように操作したので、ク
ローニングされたフラグメントは、β−グルコシダーゼ分泌シグナルを含まなか
った。プラスミドｐＣＢｍ．ｓを、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして分
泌シグナルを含まないｂｇｌ１コード領域を含む２．２ｋｂフラグメントを単離
し、そしてプラスミドｐＣＢ２１９Ｎ（上記、実施例５に記載）におけるｃｂｈ
２ターミネーターの上流のＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位に挿入し、プラスミ
ドｐＢＧ２Ｘを生成した。ｘｌｎ２遺伝子のプロモーターおよび分泌シグナルを
含む２．３ｋｂフラグメント（ｂｐ−２１５０から＋９９、ここで＋１は、ＡＴ
Ｇ開始コドンを示す）を、Ｐｗｏポリメラーゼを用いて、公開されたｘｌｎ２配
列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）のｂｐ１０３のすぐ下流のＮｈｅＩ部位を含む
ｘｌｎ２特異的プライマー、およびｐＵＣ逆方向プライマー（カタログ番号１８
４３２−０１３、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｘｌｎ２遺伝子の５’末端でＫｐｎＩ
部位の上流にアニールする）を用いて、ゲノムｘｌｎ２サブクローンｐＸＹＮ２
Ｋ−２から増幅した。このｘｌｎ２ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ（これをｐＸＹ
Ｎ２Ｋ−２からのｐＵＣ１１９ポリリンカーの一部として増幅する）およびＮｈ
ｅＩで消化し、そしてプラスミドｐＢＲ３２２Ｌ（上記実施例５に記載）に挿入
し、ｐＢＲ３２２ＬＸＮを生成した。次いで、ｐＢＲ３２２ＬＸＮのＥｃｏＲＩ
部位を、クレノウで平滑化し、そしてＳｐｅＩリンカー（カタログ番号１０８６
、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を付加し、ｐＢＲ３２２ＳｐＸＮ
を生成した。ｐＢＧ２Ｘプラスミドを、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断し、そし
て４．２ｋｂフラグメント（ｂｇｌ１コード領域、続いてｃｂｈ２ターミネータ
ーを含む）を単離した。このフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切断し
たプラスミドｐＢＲ３２２ＳｐＸＮに挿入した（ＮｈｅＩおよびＸｂａＩは、適
合性の突出部を有する）。このクローニングは、成熟β−グルコシダーゼに直接
的にキシラーゼ分泌シグナルの融合を生じ、完全発現カセットｐＸＢＧ−２を作
製した。

【００８８】上記実施例５に記載の選択カセットプラスミドｐＨＰＴ１３６におけるｃｂｈ
１ターミネーターを、ｘｌｎ２転写ターミネーターを含む２．６ｋｂのＫｐｎＩ
フラグメントと置換した。ｘｌｎ２ターミネーターを、Ｐｗｏポリメラーゼを用
いて、公開されたｘｌｎ２配列（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）のｂｐ７８０のす
ぐ下流にＫｐｎＩ部位を導入するプライマー、およびｐＵＣ順方向プライマー（
カタログ番号１８４３１−０１５、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ｐＸＹＮ２Ｋ−２に
おけるｘｌｎ２遺伝子の３’末端の下流にアニールする）を用いて、ゲノムサブ
クローンｐＸＹＮ２Ｋ−２から増幅した。ｘｌｎ２ターミネーターＰＣＲ産物を
ＫｐｎＩで消化し、そしてｐＵＣ１１９中のｐｇｋ促進ｈｐｋ遺伝子を含有する
ｐＨＰＴ１３６由来の５．１ｋｂのＫｐｎＩフラグメントに連結して選択カセッ
トプラスミドｐＨＰＴ１３６Ｘを生成した。

【００８９】形質転換ベクターの構築は、選択カセット由来のｐｇｋプロモーターのすぐ上
流への発現カセットの挿入を包含した。発現カセットプラスミドｐＸＢＧ２をＮ
ｏｔＩで消化し、そして末端をクレノウを用いて平滑化し、次いでＳｐｅＩで消
化した。選択カセットｐＨＰＴ１３６Ｘを、ＸｈｏＩでの消化、次いで、反応物
を充填して平滑末端を作出し、次いでＸｂａＩで消化することにより、同様な様
式で調製した。これらの２つのフラグメントの平滑−粘着連結を行い、ｐＸＢＧ
２由来の６．５ｋｂのＳｐｅＩ／平滑化ＮｏｔＩフラグメントをｐＨＰＴ１３６
ＸのＸｂａＩ／平滑化ＸｈｏＩフラグメントに連結した（ＳｐｅＩおよびＸｂａ
Ｉは、適合性の突出部を有する）。最終的な形質転換ベクターｐＸＢＧ−ＴＶ（
図２に示す）を、以下、実施例９に記載するように、マイクロプロジェクタイル
ボンバードメントによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＭ２Ｃ３８の形質転換の前に、
その特有のＮｏｔＩで線状化した。

【００９０】（実施例７：β−グルコシダーゼ過剰発現ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）
−ＴＶの構築）本実施例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセロバイオヒドロラーゼ１プロモーター
、キシラナーゼＩＩ分泌シグナルおよび成熟β−グルコシダーゼコード領域を含
有するベクターの構築を記載する。

【００９１】本実施例は、ｂｇｌ発現におけるｃｍｈ１プロモーターおよびｘｌｎ２分泌シ
グナルの組み合わせ効果を試験するために実施した。ｃｂｈ１プロモーターのｂ
ｐ−１３９９から−２０４を含む１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、
ｂｐ−１３９３から−１３８８に特有のＸｂａＩ部位を挿入するために、ｃｂｈ
１プロモーター含有プラスミドｐＢＲ３２２ＬＣＳ（実施例５）を鋳型として用
いてＰＣＲにより増幅した。この改変されたｃｂｈ１プロモーターフラグメント
を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＸＢＧ１（実施例６）においてｘｌｎ２
プロモーターのｂｐ−１４００〜−１２１を置換して、新規な発現カセットプラ
スミドｐＣ／ＸＢＧ１を生成するために使用した。ｐＣ／ＸＢＧ１からの６．４
ｋｂ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化し、続いてＮｏｔＩ部位をクレノウフラグ
メントで平滑化し、続いてＳｐｅＩで消化することによって単離した。次いで、
このフラグメントを、ｐＨＰＴ１３６Ｘにおいてｈｐｈ選択カセットの上流に平
滑／粘着連結により挿入した。このプラスミドは、ＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩ
部位でクレノウで平滑化し、そしてＸｂａＩで消化しておいたものである。最終
的な形質転換ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶ（受託番号２０９６１３
、寄託日１９９８年２月３日、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２
３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ、Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ２０８５
２ＵＳＡ）（図３に示す）を、以下、実施例９に記載するように、マイクロプ
ロジェクタイルボンバードメントによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＭ２Ｃ３８の形
質転換の前に、ｃｂｈ１プロモーターの５’末端およびｘｌｎ２ターミネーター
の３’末端の特有のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位で線状化した。

【００９２】（実施例８：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離され
たゲノムＤＮＡのサザンブロット）実施例１に記載のように、各株からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロット
のために、１μｇのＤＮＡを、少なくとも２時間、３７℃で３〜１０ユニットの
制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして消化産物を０．０４ＭＴｒｉｓ酢酸、
１ｍＭＥＤＴＡ中で０．８％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡを、キャピ
ラリー転移によりナイロン膜（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）上に
転写した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８〜９．４４頁）。図４および５におい
て、レーン２、４、６、８、１０、および１２は、消化されたＭ２Ｃ３８ＤＮ
Ａを含み、そしてレーン３、５、７、９、１１、および１３は、消化されたＲｕ
ｔＣ３０のＤＮＡを含む。使用した制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨＩ（レ
ーン２および３）、ＥｃｏＲＩ（レーン４および５）、ＸｂａＩ（レーン６およ
び７）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン８および９）、ＳｓｔＩ（レーン１０および１
１）およびＫｐｎＩ（レーン１２および１３）であった。両図において、レーン
１は、λＨｉｎｄＩＩＩ分子サイズ標準（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１
５６１２−０１３）を含み、そしてレーン１４は、プローブを作製するために使
用した１ｎｇの未標識フラグメントを含む。サザンブロットを、ＤＩＧＬａｂ
ｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ）を用いて調製されたジゴキシゲン−１１−ｄＵＴＰ標識ランダ
ムプライムプローブとハイブリダイズさせた。図４において使用したプローブに
ついての鋳型は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉｘｌｎ２プロモーターおよび分泌シグナル
（Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）を含む２．３ｋｂフラグメントであった。図５に
おいて使用したプローブについての鋳型は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉｂｇｌ２成熟コ
ード領域（Ｂａｒｎｅｔｔら）のｂｐ５７４−２６７９を含む２．１ｋｂフラグ
メントであった。ポストハイブリダイゼーション洗浄後、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ複合
体を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とのインキュベーション、続いて５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドイルホスフェートおよび４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライ
ド（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）によって可視化した。

【００９３】（実施例９：マイクロプロジェクタイルボンバードメントによるＴ．ｒｅｅｓ
ｅｉＲｕｔＣ３０、Ｍ２Ｃ３８、およびＢＴＲ４８の形質転換）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０、Ｍ２Ｃ３８、およびＢＴＲ４８の胞子を形
質転換するために、バイオリスティックＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステム（Ｂｉ
ｏＲａｄ；Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓａｎｄＣｏｍｐａ
ｎｙ）を使用し、そして全ての手順を、製造業者により推奨されるように実施し
た。Ｍ−１０タングステン粒子（０．７μｍの直径中央値）をマイクロキャリア
として使用した。以下のパラメーターを、形質転換の至適化において使用した：
破裂圧１１００ｐｓｉ、ヘリウム圧２９ｍｍＨｇ、ギャップ距離０．９５ｃｍ、
マイクロキャリア移動距離１６ｍｍ、および標的距離９ｃｍ。ポテトデキストロ
ール寒天培地（ＰＤＡ）上に１×１０⁶胞子を有するプレートを調製した。ボンバードメントプレートを、２８℃でインキュベートした。ボンバードメント４時
間後、胞子を、８０ユニット／ｍｌのＨｙｇＢを補充した選択的ＰＤＡ培地の重
層により、一次選択に供する。ボンバードメントプレートを２８℃でインキュベ
ートする。形質転換体を、３〜６日増殖後に観察し得る；しかし、胞子形成を達
成するためには、さらなるインキュベーションが必要である。

【００９４】胞子形成が生じた後、二次選択プロセスを実施して、個々の形質転換体を単離
する。胞子を、接種ループを用いてプレートから採集し、そして滅菌水中に再懸
濁する。次いで、この懸濁液を、ガラス製マイクロファイバーで栓をした滅菌注
射器で濾過する。これは、望ましくない菌糸を保持する一方で、胞子を通過させ
る。この懸濁液中の胞子の濃度の決定が必要であり、そして続く希釈液を、０．
７５％Ｏｘｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ）およびＨｙｇＢ（４０ユニット／ｍＬ）を補
充したＰＤＡプレート上にプレートして、１プレート当たり２０〜５０の胞子を
得る。Ｏｘｇａｌｌはコロニー制限因子（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｒ）として作用し
、それにより、これらの二次選択プレート上での個々のコロニーの単離を可能に
する。単離されたコロニーは、２〜３日後に観察され得る。

【００９５】（実施例１０：Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０、ＲＣ３００、ＲＣ−３０２
、Ｍ２Ｃ３８、ＲＭ４−３００、Ｒ４−３０１、ＲＭ４−３０２、ＢＴＲ４８、
およびＲＢ４−３０１から単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析）実施例１に記載のように、各株からゲノムＤＮＡを単離した。サザンブロット
のために、１μｇのＤＮＡを、少なくとも２時間、３７℃で３〜１０ユニットの
Ｋｐｎ１またはＸｂａ１で消化し、そして消化産物を０．０４ＭＴｒｉｓ酢酸
、１ｍＭＥＤＴＡ中で０．８％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡを、キャ
ピラリー転移によりナイロン膜（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）上
に転写した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．３８〜９．４４頁）。サザンブロットを
、ＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて調製したジゴキシゲン−１１−ｄＵ
ＴＰ標識ランダムプライムプローブとハイブリダイズさせた。鋳型は、公開され
たｂｇｌ１配列（Ｂａｒｎｅｔｔら）のｂｐ１２１５−２４６４を含む１．３ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントであった。ポストハイブリダイゼーシ
ョン洗浄後、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ複合体を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファタ
ーゼ結合体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）とのインキュベーショ
ン、続いて化学発光試薬ＣＳＰＤ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
との反応、およびＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）への曝露によって可視化した。結
果を表１に要約する。

【００９６】

【表１】（実施例１１：液体培養におけるβ−グルコシダーゼの産生）本実施例は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株により産生された酵素β−グルコシダ
ーゼの量を決定するために使用した方法を記載する。

【００９７】各培養物の増殖のためにＰＤＡプレートにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの個々のコ
ロニーを移す。胞子形成は、培養物がβ−グルコシダーゼおよびセルラーゼを産
生する能力を試験することにおいて使用される振盪フラスコの均一な接種に必要
である。培養培地は、以下で構成される：

【００９８】

【化１】 ^*微量元素溶液は、５ｇ／ｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＳＯ₄・
Ｈ₂Ｏ；１．４ｇ／ｌのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₄Ｏを含む。^** ５ｇ／ｌのグルコースプラス１０ｇ／ｌのＳｏｌｋａフロック（ｃｂｈ１
または他のセルラーゼプロモーターを用いる場合）、１０ｇ／ｌのキシラン（ｘ
ｌｎ２プロモーターを用いる場合）、またはβ−グルコシダーゼの発現を指示す
るプロモーターに適切な他の炭素供給源。この炭素供給源は、ｐＨ２〜７で水溶
液として別々に滅菌され得、そして残りの培地に添加され得る。

【００９９】１リットルのフラスコあたりの液体容量は、１５０ｍＬであり、最初のｐＨは
、５．５であり、そしてそれぞれのフラスコを、接種前に１２１℃で３０分間、
蒸気オートクレーブにより滅菌する。

【０１００】非形質転換（すなわち、ネイティブ）細胞および形質転換細胞の両方について
、芽胞を、実施例９に記載のようにＰＤＡプレートから単離し、そして１〜２×
１０⁶個の芽胞を使用してそれぞれのフラスコに接種する。このフラスコを６日間、２８℃の温度で２００ｒｐｍで振盪する。分泌タンパク質を含む濾過物を、
ＧＦ／Ａガラス微小繊維フィルター（ｇｌａｓｓｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅｆ
ｉｌｔｅｒｓ）（Ｗｈａｔｍａｎ）を通した濾過により収集した。このタンパク
質濃度は、標準としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセルラーゼを用いるＢｉｏ−Ｒ
ａｄタンパク質アッセイ（カタログ番号５００−０００１）を用いて決定する。
β−グルコシダーゼ活性は、実施例１６に記載のように決定する。

【０１０１】形質転換体を、培養濾過物のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）により分割された
培養濾過物のβ−グルコシダーゼ活性のＩＵ／ｍｌにより決定する場合、非形質
転換宿主株よりも少なくとも１０倍多くβ−グルコシダーゼ（ＩＵ／ｍｇ）を産
生する能力についてスクリーニングした。

【０１０２】（実施例１２：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株
ＲｕｔＣ３０、ＲＣ−３００およびＲＣ−３０２によるβ−グルコシダーゼの産
生）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａにおけるタンパク質過剰発現のためのｃｂｈ１プロモ
ーターおよび分泌シグナルを用いる以前の成功に基づき、成熟β−グルコシダー
ゼコード領域を、図１に示されそして実施例５に記載される遺伝子構築物（ｐＣ
ＢＧ１−ＴＶ）におけるｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルの下流におい
た。このベクターを、微粒子銃（実施例９）によりＴ．ｒｅｅｓｅｉＲｕｔＣ
３０に導入し、得られた形質転換体ＲＣ−３００は、親株よりも７倍多くβ−グ
ルコシダーゼ活性を生じた（表２）。この７倍の増加は、形質転換ベクターの１
つのコピーの宿主染色体への組み込みから生じた（実施例１０、表１）。β−グ
ルコシダーゼがｃｂｈ１プロモーターおよび分泌シグナルを用いて発現される構
築物の１つのコピーから得られたβ−グルコシダーゼ活性における、より大きい
増加は、この戦略がＢａｒｎｅｔｔら、およびＦｏｗｌｅｒらにより用いられた
戦略よりも良好であることを示唆する。彼らの戦略は、構築物（ここでβ−グル
コシダーゼは、それ自身のプロモーターおよび分泌シグナルから発現される）の
１０〜１５コピーからのβ−グルコシダーゼ活性においてわずか５倍の増加しか
生じなかった。しかし、β−グルコシダーゼ活性において得られた７倍の増加は
、セルロース加水分解ためのβ−グルコシダーゼの不足を解消するにはまだ十分
ではなかった。

【０１０３】形質転換されていないＴ．ｒｅｅｓｅｉのＲｕｔＣ３０株を、Ｔ．ｒｅｅｓｅ
ｉキシラナーゼＩＩ分泌シグナルに連結した成熟Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのβ−グルコ
シダーゼ酵素をコードするベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｖｂａ１）−ＴＶ由来の遺伝
子構築物を用いて、微粒子銃により形質転換した（実施例９）。

【０１０４】非形質転換株ＲｕｔＣ３０および得られたこの宿主由来の形質転換株（ＲＣ−
３０２）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として１０ｇ／ＬのＳｏｌ
ｋａフロックおよび５ｇ／Ｌのグルコースを用いて培養した。結果を表２に示
す。

【０１０５】非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１４ＩＵのβ−グルコシダー
ゼを産生した。

【０１０６】ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換
体ＲＣ−３０２は、１９ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。これは、
非形質転換株より約１３６倍の改善を示し、このことはセルロースからエタノー
ルへのプロセスのために非常に重要である。

【０１０７】ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換
体ＲＣ−３０２は、ＣＢＨ１プロモーターおよびＣＢＨ１分泌シグナルを有する
最良のＲｕｔＣ３０形質転換株よりも約１９倍多いβ−グルコシダーゼ活性を産
生した。

【０１０８】

【表２】（実施例１３：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、Ｍ２Ｃ３８株および
ＲＭ４−３０２株によるβ−グルコシダーゼの産生）ｐＣＢＧ１−ＴＶベクター（β−グルコシダーゼがＣＢＨ１プロモーターおよ
び分泌シグナルから発現される）（図１および実施例５）を、微粒子銃によりＴ
．ｒｅｅｓｅｉのＭ２Ｃ３８に導入した（実施例９）。得られた形質転換体ＲＭ
４−３００は、親株よりも約７〜１２倍多くβ−グルコシダーゼ活性を産生した
（表３）。

【０１０９】非形質転換体のＴ．ｒｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８を、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉキシラナ
ーゼＩＩ分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼ酵
素をコードするベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶ由来の遺伝子構築物を
用いて、微粒子銃により形質転換した（実施例９）。

【０１１０】非形質転換株Ｍ２Ｃ３８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＭ４−３０２）
を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として１０ｇ／ＬのＳｏｌｋａフロ
ックおよび５ｇ／Ｌのグルコースを用いて培養した。結果を、表３に示す。

【０１１１】非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．３５ＩＵのβ−グルコシダー
ゼを産生した。

【０１１２】ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換
体ＲＭ４−３０２は、１４．１ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシダーゼを産生した。こ
れは、非形質転換株より約４０倍の改善を示し、このことはセルロースからエタ
ノールへのプロセスのために非常に重要である。

【０１１３】ＣＢＨ１プロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグナルを有する形質転換
体ＲＭ４−３０２は、ＣＢＨ１プロモーターおよびＣＢＨ１分泌シグナルを有す
る形質転換体よりも約３倍多いβ−グルコシダーゼ活性を産生した。これは、Ｃ
ＢＨ１プロモーターおよび分泌シグナルが、加水分解におけるセロビオース産生
を完全に抑制するためのβ−グルコシダーゼの十分な産生を導かなかったので、
重大な差異である。

【０１１４】

【表３】（実施例１４：キシラン炭素供給源を用いる、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＭ２Ｃ３８
株およびＲＭ４−３０１株によるβ−グルコシダーゼの産生）非形質転換Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株Ｍ２Ｃ３８を、キシラナーゼプロモーターおよ
び分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼをコード
するベクターｐＸＢＧ１−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形
質転換した（実施例９）。

【０１１５】非形質転換株Ｍ２Ｃ３８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＭ４−３０１）
を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として５ｇ／Ｌのグルコースおよび
１０ｇ／Ｌのキシランを用いて培養した。結果を、表４に示す。

【０１１６】非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１６ＩＵのβ−グルコシダー
ゼを産生した。キシラナーゼＩＩプロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグ
ナルを有する形質転換体ＲＭ４−３０１は、２０．４ＩＵ／ｍｇのβ−グルコシ
ダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約１２７倍の改善を示し、このこ
とは、セルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。

【０１１７】

【表４】（実施例１５：Ｓｏｌｋａフロック炭素供給源を用いる、ＢＴＲ−４８株およ
びＲＢ４８−３０１株によるβ−グルコシダーゼの産生）非形質転換Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＢＴＲ４８を、キシラナーゼプロモーターおよ
び分泌シグナルに連結したＴ．ｒｅｅｓｅｉの成熟β−グルコシダーゼをコード
するベクターｐＸＢＧ１−ＴＶ由来の遺伝子構築物を用いて、微粒子銃により形
質転換した。

【０１１８】非形質転換株ＢＴＲ−４８およびこの宿主由来の形質転換株（ＲＢ４８−３０
１）を、実施例１１の手順を用いて、炭素供給源として５ｇ／Ｌのグルコースお
よび１０ｇ／ＬのＳｏｌｋａフロックを用いて培養した。結果を、表５に示す。

【０１１９】非形質転換株は、タンパク質１ｍｇあたり、０．１６ＩＵのβ−グルコシダー
ゼを産生した。キシラナーゼＩＩプロモーターおよびキシラナーゼＩＩ分泌シグ
ナルを有する形質転換体ＲＢ４８−３０１は、約２１．９ＩＵ／ｍｇのβ−グル
コシダーゼを産生した。これは、非形質転換株より約１３６倍の改善を示し、こ
のことは、セルロースからエタノールへのプロセスのために非常に重要である。

【０１２０】

【表５】（実施例１６：酵素混合物のβ−グルコシダーゼ活性の測定）酵素のβ−グルコシダーゼ活性を、以下のようにＧｈｏｓｅ、「Ｍｅａｓｕｒ
ｅｍｅｎｔｏｆＣｅｌｌｕｌａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｐｕｒｅ
ａｎｄＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７〜２６８（１９８７）の手順を用い
て測定する。酵素のサンプルを、０．５ｍｌの容量に、５０ｍＭのクエン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ４，８中で、いくつかの濃度に希釈する。希釈の都合のよい
範囲は、サンプルの推定した活性の３〜２４倍である。例えば、１０ｕｎｉｔ／
ｍｌのサンプルは、１：３０〜１：２４０に希釈するべきである。用いる希釈に
かかわらず、クエン酸緩衝液の０．５ｍｌサンプルを、それぞれの酵素の試験管
に添加する。基質を１５ｍＭ（５．１３ｇ／Ｌ）のセロビオースとして調製する
。希釈酵素の保存液および基質を別々に５分間、５０℃に事前加熱し、次いで、
基質の０．５ｍｌのアリコートを酵素の各試験管に添加する。これらの試験管を
５０℃で３０分間インキュベートする。この反応を、５分間、沸騰水浴に各試験
管を浸すことにより終止させる。次いで、この試験管をボルテックス混合し、そ
して酵素のそれぞれのサンプルにより産生された糖の量を、ＹＳＩグルコースア
ナライザーで測定し、酵素からの小さいバックグラウンドを考慮に入れる。

【０１２１】 β−グルコシダーゼ活性の単位を１分あたり産生されたグルコースのマイクロ
モル数で規定する。この活性を、０．１５〜１．５ｍｇ／ｍｌのグルコースを産
生するそれぞれの希釈液からの平均値を用いて、式１に基いて計算する。

【０１２２】Ａ＝Ｃ^*Ｇ^*Ｄ（１）ここでＡ＝活性、β−グルコシダーゼｕｎｉｔ／ｍｌ（またはマイクロモルグルコース／ｍｌ／分）Ｃ＝１６．７マイクロモル／ｍｇ／分Ｇ＝産生グルコース、ｍｇ／ｍｌＤ＝酵素希釈（次元なし）（実施例１７：セルロース加水分解）この実験の目的は、セルロースの加水分解増強における、形質転換されたＴｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａにより産生されたβ−グルコシダーゼの有効性を実証するこ
とであった。

【０１２３】この研究のためにもちいた酵素は、Ｉｏｇｅｎセルラーゼ（ＩｏｇｅｎＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販のセルラーゼ酵素）、および実施例１１に記載の手
順を用いて（その実施例に挙げた培地濃度レベルの２倍で）３０リットルの発酵
容器中で増殖したＲＭ４−３０２の産物であった。酵素濃度を、Ａｍｉｃｏｎ
１０，０００ＭＷＣＯ膜を通過する限外濾過により増加させ、そしてＩｏｇｅｎ
セルラーゼと同じセルラーゼ活性に対して基準化した。これらの２つの酵素の
活性を表６に示す。

【０１２４】

【表６】この研究に用いるセルロースは、前処理したカラスムギの外皮であり、Ｆｏｏ
ｄｙら（ＩｍｐｒｏｖｅｄＰｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔＰｒｏｃｅｓｓｆｏ
ｒＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｅｔｏＦｕｅｌＥｔ
ｈａｎｏｌ，１９９７年６月９日出願の米国特許出願、実施例６）の手順に従っ
て調製した。

【０１２５】０．５グラムの前処理カラスムギ外皮セルロースのサンプルを、４９．５グラ
ムの０．０５モラーのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８とともに、２５ｍ
ｌフラスコに添加した。

【０１２６】この酵素をセルロース１グラムあたり１０ＦＰＵに対応する量でフラスコに添
加した。得られたβ−グルコシダーゼ用量を表６に列挙する。

【０１２７】両方の場合において、このフラスコを２５０ＲＰＭで振盪し、そして２４時間
５０℃で維持した。この時、サンプルを採取し、不溶性セルロースを濾過除去し
、そして標準的なＤｉｏｎｅｘパルス電流測定ＨＰＬＣ炭水化物分析方法を用い
てグルコース濃度およびセロビオース濃度について分析した。この結果を表７に
列挙する。

【０１２８】ＩｏｇｅｎＣｅｌｌｕｌａｓｅ（従来のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのセルラー
ゼ）は、セルロースのわずか４５％しかグルコースに転換しなかった。これは、
エタノールプロセスには受容できない低さである。セロビオースのこの蓄積は、
有意であり、セルロースの１３％を示した。

【０１２９】増強されたβ−グルコシダーゼを伴うセルラーゼは、より良好に実施した。こ
のセルロースのグルコースへの転換は、８４％に達した。この優れた能力の理由
は、β−グルコシダーゼの豊富さによって、セロビオース蓄積が、無視できたこ
とであった。

【０１３０】

【表７】（実施例１８：ＲｕｔＣ３０株およびＭ２Ｃ３８株におけるＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａｒｅｓｓｅｉのｘｌｎ２およびｂｇｌ１遺伝子の比較）サザンブロット分析を、成熟β−グルコシダーゼおよびキシラナーゼ分泌シグ
ナルをコードする領域の内側および外側の両方を切断する６つの異なる制限酵素
で消化したＭ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０のＤＮＡに対して実施し（実施例８）
、２つの株の間に多型性が存在するか否かを決定した。図４および５に示すよう
に、同一のバンドが成熟β−グルコシダーゼ酵素およびキシラナーゼＩＩプロモ
ータープラス分泌シグナルをコードするＭ２Ｃ３８フラグメントから調製した標
識プローブとハイブリダイズすることが見出され、このことは、２つの株の間の
これらの領域に多型性がなく、そして高い程度のＤＮＡ配列相同性があることを
示す。

【０１３１】実施例５〜７に記載される遺伝子構築物を作製するために必要なＭ２Ｃ３８
ＤＮＡ配列を同定およびクローニングするために使用されるプローブおよびプラ
イマーは、以下を含むいくつかの異なるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ
株由来の種々の遺伝子の公開されたＤＮＡ配列に基づいた：ＱＭ９４１４（ｐｇ
ｋ、Ｖａｎｈａｎｅｎら、１９８９、およびｃｂｈ２、Ｃｈｅｎら）、ＱＭ９４
１４誘導体ＶＴＴ−Ｄ７９１２５（ｘｌｎ２、Ｓａａｒｅｌａｉｎｅｎら）およ
びＬ２７（ｃｂｈ１、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら）、およびＲＬ−Ｐ３７株誘導体Ｐ
４０株（ｂｇｌ１、Ｂａｒｎｅｔｔら）。Ｍ２Ｃ３８と同様に、これらの株のす
べては、ＱＭ６ａ株に由来する（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｒｅｙおよび
Ｄｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎ、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉ
ｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｋａ
ｒｙｏｔｙｐｅｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ：ｍａｐｐｉｎ
ｇｏｆｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｓｅａｎｄｘｙｌａｎａｓｅｇｅｎｅ
ｓ」ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６：２１６７〜２１７４
、１９９２）。

【０１３２】ＲｕｔＣ３０は、Ｍ２Ｃ３８のＱＭ６ａ由来前駆体であるので、本発明者らは
、実施例５〜７において記載されるβ−グルコシダーゼ発現ベクターを作製する
ために使用される遺伝子配列の単離のための、実施例２〜４に記載の記載される
方法が、Ｍ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０の両方由来の同じ遺伝子配列の単離に等
しく良好に機能することを確信している。上記の株系統およびサザンブロットデ
ータに基づいて、本発明者らはまた、ＲｕｔＣ３０ＤＮＡから調製された遺伝
子構築物が、成熟β−グルコシダーゼ酵素およびキシラナーゼＩＩ分泌シグナル
をコードする、Ｍ２Ｃ３８ＤＮＡから調製されたものと同一のＤＮＡセグメン
トを含むという、高程度の確信を有する。Ｍ２Ｃ３８ＤＮＡから調製された構
築物（実施例５〜７）は、Ｍ２Ｃ３８およびＲｕｔＣ３０の両方において増強さ
れたβ−グルコシダーゼ発現を生じるので（実施例１２〜１４）、本発明者らは
また、ＲｕｔＣ３０ＤＮＡから作製される遺伝子構築物が、ＲｕｔＣ３０およ
びＭ２Ｃ３８の両方におけるβ−グルコシダーゼ活性の類似のレベルの増強を生
じることを確信している。

【０１３３】本発明は、現在のところ好ましい実施態様であると考えられる実施態様に関し
て記載しているが、本発明は、開示された実施態様に限定されないことが理解さ
れるべきである。対照的に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲
内に含まれる種々の改変および等価のアレンジを包含することが意図される。以
下の特許請求の範囲は、そのような改変および等価な表現および機能のすべてを
含むように最も広い解釈であるとみなされるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ベクターｐＣＢＧ１−ＴＶの制限地図、およびＣＢＨ１分泌シグナル
／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。

【図２】図２は、ベクターｐＸＢＧ１−ＴＶの制限地図、およびキシラナーゼＩＩ分泌
シグナル／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。

【図３】図３は、ベクターｐＣ／ＸＢＧ（Ｘｂａ１）−ＴＶの制限地図、およびキシラ
ナーゼＩＩ分泌シグナル／成熟β−グルコシダーゼ連結のアミノ酸配列である。

【図４】図４は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離され、そ
してＭ２Ｃ３８キシラナーゼプロモーターおよび分泌シグナルを含む標識したＤ
ＮＡフラグメントを用いてプローブした、ゲノムＤＮＡのサザンブロットである
。

【図５】図５は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ株ＲｕｔＣ３０およびＭ２Ｃ３８から単離され、そ
してＭ２Ｃ３８成熟β−グルコシダーゼコード領域を含む標識したＤＮＡフラグ
メントを用いてプローブした、ゲノムＤＮＡのサザンブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:885）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA02 CA03 CA04 DA11 EA04 FA02 FA18 GA12 HA01 4B050 CC03 DD03 LL03 LL05 4B065 AA15X AA50X AA58X AA58Y AA60X AA60Y AA65X AA65Y AA70X AA70Y AB01 AC14 BA02 BA04 BA22 CA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子構築物であって：ファミリー１１キシラナーゼ遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルと作動可能に
連結した、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２プロモー
ター、ｅｇ１プロモーター、ｅｇ２プロモーター、ｅｇ３プロモーター、ｅｇ５
プロモーター、ｘｌｎ１プロモーター、およびｘｌｎ２プロモーターからなる群
から選択される、プロモーター、ならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、およ
びＦｕｓａｒｉｕｍのβ−グルコシダーゼ遺伝子からなる群から選択されるβ−
グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域、を含む、遺伝子構築物。
【請求項２】前記ファミリー１１キシラナーゼ遺伝子がＴｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａキシラナーゼ遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼ遺伝子が、Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩ遺伝子またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナ
ーゼＩＩ遺伝子を含む、請求項２に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を含
む、請求項３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子が
、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｂｇｌ１遺伝子を含む、請求項４に記載の遺伝子構
築物。
【請求項６】遺伝子改変された微生物であって：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｍｏｎａｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される
微生物、ならびに該微生物に導入された請求項１に記載の遺伝子構築物、を含み、該微生物と比較して増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、
遺伝子改変された微生物。
【請求項７】前記微生物がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物である、請求項
６に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項８】前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａｒｅｅｓｅｉ微生物である、請求項７に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項９】前記遺伝子改変された微生物が、少なくとも約１０倍の増加
したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、請求項６に記載の遺伝子改変され
た微生物。
【請求項１０】前記遺伝子改変された微生物が、少なくとも約４０倍の増
加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、請求項６に記載の遺伝子改変さ
れた微生物。
【請求項１１】前記遺伝子改変された微生物が、少なくとも約１２０倍の
増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する、請求項６に記載の遺伝子改変
された微生物。
【請求項１２】前記キシラナーゼ分泌シグナルが、前記遺伝子改変された
微生物が由来する前記微生物に対してネイティブである、請求項６に記載の遺伝
子改変された微生物。
【請求項１３】前記キシラナーゼ分泌シグナルが、ファミリー１１キシラ
ナーゼ遺伝子のキシラナーゼ分泌シグナルを含む、請求項６に記載の遺伝子改変
された微生物。
【請求項１４】前記ファミリー１１キシラナーゼ遺伝子がＴｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａキシラナーゼ遺伝子を含む、請求項１３に記載の遺伝子改変された微生
物。
【請求項１５】前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼ遺伝子が、Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラナーゼＩ遺伝子またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａキシラ
ナーゼＩＩ遺伝子を含む、請求項１４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項１６】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａｂｇｌ１遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を含み、ここ
で前記プロモーターは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのｃｂｈ１プロモーター、ｃｂ
ｈ２プロモーター、ｅｇ１プロモーター、ｅｇ２プロモーター、ｅｇ３プロモー
ター、ｅｇ５プロモーター、ｘｌｎ１プロモーター、およびｘｌｎ２プロモータ
ーからなる群から選択される、請求項１４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項１７】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項６に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項１８】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項７に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項１９】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項８に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２０】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項９に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２１】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１０に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２２】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１１に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２３】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１２に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２４】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１３に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２５】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１４に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２６】前記成熟β−グルコシダーゼコード領域が、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ β−グルコシダーゼ遺伝子の成熟β−グルコシダーゼコード領域を
含む、請求項１５に記載の遺伝子改変された微生物。
【請求項２７】 β−グルコシダーゼを産生するための方法であって、以下
の工程：請求項１に記載の遺伝子構築物で微生物を形質転換し、遺伝子改変された微生
物を作製する工程；および該遺伝子改変された微生物を使用して、形質転換される前の該微生物と比較し
て増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する工程、を包含する、方法。
【請求項２８】前記形質転換する工程が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕ
ｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、およびＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される微生物を形質転換し、遺伝子改変
された微生物を作製する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記使用する工程が、前記遺伝子改変された微生物を使用
して、少なくとも約１０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する工
程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記使用する工程が、前記遺伝子改変された微生物を使用
して、少なくとも約４０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する工
程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】前記使用する工程が、前記遺伝子改変された微生物を使用
して、少なくとも約１２０倍の増加したレベルのβ−グルコシダーゼを産生する
工程を包含する、請求項２７に記載の方法。