ES2241263T3 - Construcciones geneticas y microbios modificados geneticamente para produccion incrementada de beta-glucosidasa. - Google Patents
Construcciones geneticas y microbios modificados geneticamente para produccion incrementada de beta-glucosidasa.Info
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Abstract
Una construcción genética que comprende: un promotor seleccionado del grupo consistente de los promotores cbh1, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2 de Trichoderma, en asociación operativa con una señal de secreción de un gen de xilanasa II de la Familia 11, y una región de codificación de beta-glucosidasa madura de un gen de beta-glucosidasa seleccionado del grupo consistente de los genes de beta-glucosidasa de Trichoderma, Aspergillus, Humicola, y Fusarium.
Description
Construcciones genéticas y microbios modificados
genéticamente para producción incrementada de
beta-glucosidasa.
Esta invención se relaciona con la modificación
genética de microbios para incrementar la producción de una enzima
comercialmente importante, la beta-glucosidasa.
Esta invención también se relaciona con construcciones genéticas
que aumentan dramáticamente la cantidad de
beta-glucosidasa producida por microbios que
contienen estas construcciones.
La posibilidad de producir etanol a partir de la
celulosa ha recibido mucha atención debido a la disponibilidad de
grandes cantidades de materia prima, el deseo de evitar quemas o
relleno de terrenos con el material, y la limpieza de los
combustibles de etanol. Las ventajas de tal proceso para la sociedad
se describen en el artículo principal del Atlantic Monthly, de abril
de 1996.
Las Fuentes celulósicas naturales para tal
proceso reciben la denominación de "biomasa". Se han
considerado muchos tipos de biomasa como materia prima para la
producción de etanol, incluyendo madera, residuos agrícolas,
cultivos herbáceos y residuos municipales sólidos. Estos materiales
consisten primariamente de celulosa, hemicelulosa y lignina. Esta
invención puede aplicarse a la conversión de celulosa en
etanol.
La celulosa es un polímero del azúcar simple
glucosa conectados por enlaces beta 1,4. La celulosa es muy
resistente a la degradación o despolimerización por ácido, enzimas
o microorganismos. Una vez que la celulosa es convertida en
glucosa, el azúcar resultante se fermenta fácilmente en etanol
usando levadura. El reto difícil del proceso es convertir la
celulosa en glucosa.
Los métodos más antiguos estudiados para
convertir la celulosa en glucosa se basan en hidrólisis ácida
(revisado por by Grethlein, "Chemical breakdown of Cellulosic
Materials", J. Appl. Chem. Biotechnol. 28:296-308
(1978). Este proceso puede involucrar el uso de ácidos diluidos o
concentrados. El proceso con ácido concentrado produce un alto
rendimiento de glucosa, pero la recuperación del ácido, los
materiales de construcción especiales requeridos, y la necesidad de
minimizar el agua son serias desventajas de este proceso. El
proceso con ácido diluido usa niveles bajos de ácido para superar la
necesidad de la recuperación química. Sin embargo, el máximo
rendimiento de glucosa es sólo de aproximadamente 55% de la
celulosa, y un alto grado de producción de productos de degradación
puede inhibir la fermentación a etanol por levaduras. Estos
problemas han impedido que el proceso de hidrólisis ácida alcance la
comercialización.
Para superar los problemas del proceso de
hidrólisis ácida, los procesos de conversión de la celulosa se han
enfocado más recientemente en la hidrólisis enzimática, usando
enzimas celulasa. La hidrólisis enzimática de la celulosa se lleva
a cabo por mezcla del sustrato y agua para obtener una masa de 5% a
12% de celulosa y añadiendo de 5 a 50 Unidades Internacionales (UI)
de enzimas celulasa por g de celulosa. Típicamente, la hidrólisis
se efectúa por 12 a 150 horas a 35-60ºC, pH
4-6.
Muchos microbios producen enzimas que hidrolizan
la celulosa, incluyendo el hongo degradador de la madera,
Trichoderma, las bacterias del compost Thermomonospora,
Bacillus, y Cellulomonas; Streptomyces; y los hongos
Humicola, Aspergillus y Fusarium. Las enzimas hechas
por estos microbios a partir de proteínas con tres tipos de
acciones útiles en la conversión de celulosa en glucosa:
endoglucanasas (EG), celobiohidrolasas (CBH), y
beta-glucosidasa. Las enzimas EG y CBH se denominan
colectivamente "celulasa".
Las enzimas EG cortan el polímero de celulosa en
localizaciones aleatorias, abriéndolo para el ataque de las enzimas
CBH. Por ejemplo, las cepas de Trichoderma producen al
menos cuatro diferentes enzimas EG, conocidas como EGI, EGII,
EGIII, y EGV.
Las enzimas CBH liberan secuencialmente moléculas
de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa
es un dímero de la glucosa enlazado por beta-1,4-,
soluble en agua. Hay dos enzimas primarias CBH producidas por los
Trichoderma, CBHI y CBHII.
Las enzimas beta-glucosidasa
hidrolizan la celobiosa en glucosa. Los Trichoderma producen
una enzima beta-glucosidasa.
Esta etapa final en la hidrólisis de la celulosa
que es catalizada por la beta-glucosidasa es
importante, porque la glucosa se fermenta fácilmente mediante una
variedad de levaduras mientras que la celobiosa no lo es. Cualquier
celobiosa que permanezca al final de la hidrólisis representa una
pérdida de rendimiento de etanol. Más importante aun, la celobiosa
es un inhibidor extremadamente potente de las enzimas CBH y EG. La
celobiosa disminuye la rata de hidrólisis de las enzimas CBH y EG
de los Trichoderma en un 50% a una concentración de sólo
3.3 g/L. El descenso en la velocidad de hidrólisis necesita la
adición de niveles más altos de enzimas celulasa, lo que impacta
adversamente la economía general del proceso. Por lo tanto, la
acumulación de celobiosa durante la hidrólisis es extremadamente
indeseable para la producción de etanol.
La acumulación de celobiosa ha sido un problema
mayor en la hidrólisis enzimática porque los Trichoderma y
los otros microbios que producen celulasa producen muy poca
beta-glucosidasa. Menos del 1% de la proteína total
hecha por los Trichoderma es bg. La baja cantidad de
beta-glucosidasa produce una reducción de la
capacidad de hidrolizar la celobiosa en glucosa, y en una
acumulación de 10 a 20 g/L de celobiosa durante la hidrólisis. Este
alto nivel de celobiosa incrementa 10 veces la cantidad de celulasa
requerida en frente a si estuviera presente una adecuada cantidad
de beta-glucosidasa.
Se han propuesto varias aproximaciones para
superar la disminución de beta-glucosidasa en
enzimas celulasa.
Una aproximación ha sido producir
beta-glucosidasa usando microbios que producen poca
celulasa, y añadir esta beta-glucosidasa
exógenamente a la enzima celulasa para reforzar la hidrólisis. Los
más exitosos de tales microbios productores de
beta-glucosidasa han sido el Aspergillus
niger y el Aspergillus phoenicis. Las
beta-glucosidasas de estos microbios están
disponibles comercialmente como Novozym 188 de Novo Nordisk. Sin
embargo, las cantidades requeridas son demasiado costosas para una
operación comercial de biomasa a etanol.
Una segunda aproximación para superar la
disminución de la beta-glucosidasa es llevar a cabo
la hidrólisis de la celulosa simultáneamente con la fermentación de
la glucosa con levadura, el así llamado proceso de sacarificación y
fermentación (SSF). En un sistema SSF, la fermentación de la
glucosa la remueve de la solución. La glucosa es un potente
inhibidor de la beta-glucosidasa, así que el SSF es
un intento por incrementar la eficiencia de la
beta-glucosidasa. Sin embargo, los sistemas SSF no
son aún comercialmente viables porque la temperatura de operación
para la levadura de 28ºC, es demasiado baja para las condiciones de
50ºC requeridas por la celulasa; la operación a una temperatura
intermedia de 37ºC es ineficiente y tiende a la contaminación
microbiana.
Una tercera aproximación para superar la
disminución de la bg es usar ingeniería genética para
sobre-expresar la enzima e incrementar su producción
por parte de la Trichoderma. Esta aproximación fue realizada
por Barnett, Berka, y Fowler, en "Cloning and Amplification of
the Gene Encoding an Extracellular b-glucosidase
from Trichoderma reesei: Evidence for Improved Rates of
Saccharification of Cellulosic Substrates", Bio/Technology,
Volume 9, June 1991, p. 562-567, de aquí en
adelante denominada "Barnett, et al".; y Fowler,
Barnett, y Shoemaker in WO92/10581, "Improved Saccharification of
Celulosa by Cloning and Amplification of the
b-glucosidase gene of Trichoderma reesei",
aquí referida como "Fowler, et al".
Tanto Barnett, et al. como Fowler, et
al. describen la inserción de múltiples copias del gen
beta-glucosidasa en la cepa P40 de Trichoderma
reesei. Ambos grupos construyeron plásmidos
pSASb-glu, un vector de transformación que contiene
el gen genómico de beta-glucosidasa del T.
reesei y el marcador seleccionable amdS. El gen amdS es del
Aspergillus nidulans y codifica para la enzima acetamidasa,
la cual permite que las células transformadas crezcan sobre
acetamida como única fuente de nitrógeno. El T. reesei no
contiene un equivalente funcional al genética amdS y por tanto es
incapaz de utilizar acetamida como fuente de nitrógeno. Las células
transformadas contenían de 10 a 15 copias del gen de
beta-glucosidasa y producían 5.5 veces más
beta-glucosidasa que las células no
transformadas.
La producción mejorada de
beta-glucosidasa obtenida según Barnett, et
al. Y Fowler, et al., no es suficiente para aliviar la
disminución de beta-glucosidasa para la hidrólisis
de la celulosa. La cantidad de beta-glucosidasa
hecha por cepas naturales de Trichoderma, por ejemplo, debe
ser incrementada al menos 10 veces para satisfacer los
requerimientos de la hidrólisis de la celulosa.
Cuando se expresan proteínas en
Trichoderma, una estrategia es enlazar el gen de interés
directamente al promotor cbh1 o a la señal de secreción cbh1. Dado
que CBH1 es la proteína más abundante producida por
Trichoderma bajo condiciones inductoras de celulasa, el
inductor cbh1 y la señal de secreción son, no obstante, muy
efectivas para dirigir la transcripción y secreción de proteínas
codificadas por un gen posicionado después de ellas en una
construcción genética. Tal estrategia ha sido utilizada
exitosamente para sobre-expresar proteínas de
Trichoderma y otros microorganismos
(Margolles-Clark, Hayes, Harman y Penttila, 1996,
"Improved Production of Trichoderma harzianum
endochitinase by expression in Trichoderma reesei", Appl.
Environ. Microbiol. 62(6): 2145-2151;
Joutsjouki, Torkkeli y Nevalainen, 1993, "Transformation of
Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase
P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by
Trichoderma reesei", Curr. Genet. 24:
223-228; Karhunen, Mantyla, Nevalainen y Suominen,
1993, "High frequency one-step gene replacement in
Trichoderma reesei 1. Endoglucanase I overproduction",
Mol. Gen. Genet. 241: 515-522).
A pesar de una significativa cantidad de esfuerzo
en investigación, no ha habido medios para producir niveles
suficientemente altos de beta-glucosidasa. Tal
proceso sería una larga etapa en la producción de alcohol
combustible a partir de celulosa.
Los inventores han hecho un descubrimiento que
posibilita la producción de enzima beta-glucosidasa
en niveles muy superiores a los disponibles actualmente. Los altos
niveles de beta-glucosidasa mejoran la eficiencia de
la hidrólisis enzimática de la celulosa en glucosa. El descenso
resultante en el requerimiento enzimático, en la conversión
incrementada de celulosa, el descenso en el tiempo de hidrólisis, o
una combinación de estas ventajas, disminuye los costos globales
del proceso de convertir celulosa en etanol.
Los inventores han descubierto construcciones
genéticas que incrementan significativamente la producción de
beta-glucosidasa por parte de microbios
recombinantes, en los cuales se expresan las construcciones. Las
construcciones genéticas que cumplen esta tarea comprenden
secuencias de ADN que codifican una enzima
beta-glucosidasa madura y una señal de secreción de
xilanasa.
Hasta donde tienen noticias los inventores, no ha
habido informes previos de que, enlazando la señal de secreción de
xilanasa con la beta-glucosidasa madura, la enzima
incremente la producción de beta-glucosidasa.
Además, los inventores no tienen noticia de informes previos de que
enlazando la señal de secreción de xilanasa con la proteína
no-xilanasa madura, se incremente la producción de
beta-glucosidasa. Los inventores han descubierto
este resultado sorprendente y no reportado. Fue además sorprendente
que el uso de la señal de secreción de xilanasa produjera más altos
niveles de beta-glucosidasa que el uso de la señal
de cbh1. Dado que la xilanasa comprende una proporción mucho más
pequeña de la proteína total producida por Trichoderma de lo
que hace CBH1 (5% y 60%, respectivamente) se esperaría que la señal
de secreción de chb1 fuera más efectiva. Las razones por las cuales
al enlazar la señal de secreción de xilanasa con la enzima
beta-glucosidasa madura se incrementa la producción
de beta-glucosidasa, no son conocidas, pero pueden
estar relacionadas con la similitud en longitud entre las señales
de secreción de la beta-glucosidasa y la xilanasa o
con la menor abundancia de xilanasa contra la cual la
beta-glucosidasa recombinante debe competir por la
secreción fuera de la célula. Sin embargo, la práctica de la
invención no está limitada por éstas ni otras razones
específicas.
La presente invención no es anticipada por
Barnett, et al. y Fowler, et al., quienes cada uno
describieron la expresión mejorada de la
beta-glucosidasa por medios recombinantes. La
construcción genética de Barnett, et al. y Fowler, et
al. comprende el promotor beta-glucosidasa, la
región codificante y la señal de secreción. Los métodos usados por
Barnett, et al. y Fowler, et al. no son tan efectivos
como los métodos revelados por los inventores y no anticipan las
construcciones genéticas de la presente invención.
En un primer aspecto, la invención provee una
construcción genética que comprende un promotor seleccionado del
grupo consistente de promotores de Trichoderma cbh1, cbh2,
eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2, en asociación operativa con una
señal de secreción de xilanasa de un gen de xilanasa de la Familia
11, y una región codificador de beta-glucosidasa
madura de un gen de beta-glucosidasa seleccionado
del grupo consistente de genes de beta-glucosidasa
de Trichoderma, Aspergillus, Humicola, y Fusarium.
En otro aspecto, la invención proporciona un
microbio genéticamente modificado que comprende un microbio
seleccionado del grupo consistente de Trichoderma, Humicola,
y Fusarium, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus,
Cellulomonas, y Aspergillus, y la construcción genética
descrita anteriormente que ha sido introducida en dicho microbio,
en donde dicho microbio modificado genéticamente produce un nivel
incrementado de beta-glucosidasa de al menos 10
veces con respecto a dicho microbio.
En aun otro aspecto de la invención, se provee un
método para producir beta-glucosidasa,
comprendiendo la transformación de un microbio con la construcción
genética de la reivindicación 1 para crear un microbio genéticamente
modificado; y usando el microbio genéticamente modificado, producir
un nivel incrementado de beta-glucosidasa de al
menos 10 veces del microbio antes de ser transformado.
Otros aspectos de la invención serán mejor
entendidos y sus ventajas serán más evidentes a la vista de la
siguientes descripción detallada de las modalidades preferidas y de
los dibujos acompañantes.
Figura 1: Transferencia de restricción del vector
pCBG1-TV y de la secuencia de aminoácidos de la
unión señal de secreción CHB1/beta-glucosidasa
madura.
Figura 2: Transferencia de restricción del vector
pXBG1-TV y de la secuencia de aminoácidos de la
unión señal de secreción xilanasa
II/beta-glucosidasa madura.
Figura 3: Transferencia de restricción del vector
pC/XBG(Xbal)-TV y de la secuencia de
aminoácidos de la unión señal de secreción xilanasa
II/beta-glucosidasa madura.
Figura 4: Transferencia Southern del ADN genómico
aislado a partir de cepas de T. reesei RutC30 y M2C38 y
sondeado con un fragmento de ADN marcado que comprende el promotor
de xilanasa M2C38 más la señal de secreción.
Figura 5: Transferencia Southern del ADN genómico
aislado a partir de cepas de T. reesei RutC30 y M2C38 y
sondeado con un fragmento de ADN marcado que comprende la región de
codificación de beta-glucosidasa madura M2C38.
Las modalidades preferidas de esta invención se
describen definiendo primero los siguientes términos.
Beta-glucosidasa es una enzima
que hidroliza el dímero de glucosa celobiosa en glucosa. Hay muchos
microbios que producen beta-glucosidasa, y las
propiedades de estas enzimas varían, incluyendo estructura (peso
molecular, orientación tridimensional, composición en aminoácidos y
sitio activo) y actividad catalítica (velocidad y cinética de la
hidrólisis de la celobiosa y la habilidad para actuar sobre otros
sustratos). Sin embargo, en todos los casos la enzima
beta-glucosidasa puede hidrolizar la celobiosa en
glucosa. También puede referirse a una enzima
beta-glucosidasa madura cuando la enzima activa no
contiene un péptido de señal de secreción de
beta-glucosidasa.
La beta-glucosidasa preferida
para practicar la invención es la beta-glucosidasa
producida por Trichoderma. Esta enzima
beta-glucosidasa tiene peso molecular de 74.000
(medido por electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS) y tiene
un punto isoeléctrico de 8.3 (medido por electroforesis de enfoque
isoeléctrico no desnaturalizante sobre gel de poliacrilamida).
El gen de beta-glucosidasa es una
región de ADN que codifica para la producción de la enzima
beta-glucosidasa. Todos los microbios que producen
beta-glucosidasa poseen al menos un gen
beta-glucosidasa. Un gen de
beta-glucosidasa natural comprende un promotor de
beta-glucosidasa, una señal de secreción, una región
de codificación y un terminador transcricpcional. Microbios que no
producen beta-glucosidasa generalmente no contienen
un gen beta-glucosidasa activo o funcional.
La señal de secreción de
beta-glucosidasa es la secuencia de ADN que codifica
el péptido de señal de secreción de la
beta-glucosidasa.
El péptido de señal de secreción de
beta-glucosidasa es la secuencia peptídico presente
en el término amino de la enzima beta-glucosidasa
codificada que se remueve subsecuentemente durante la exportación
de la enzima beta-glucosidasa madura fuera de las
células microbianas. La señal de secreción puede comprender un
pro-péptido, un pre-péptido o
ambos.
La región de codificación de la
beta-glucosidasa madura comprende la secuencia de
ADN necesaria para codificar la enzima
beta-glucosidasa funcional, según se aísla de los
filtrados de cultivo extracelulares, pero no la señal de secreción
de la beta-glucosidasa.
La xilanasa es una enzima que hidroliza el xilano
a xilosa. Hay muchos microbios que producen xilanasa y las
propiedades de estas enzimas varían, incluyendo estructura (peso
molecular, orientación tridimensional, composición en aminoácidos y
sitio activo) y actividad catalítica (velocidad y cinética de la
hidrólisis del xilano, y capacidad para actuar sobre otros
sustratos). Sin embargo, en todos los casos la enzima xilanasa
puede hidrolizar el xilano a xilosa. También puede referirse a una
enzima xilanasa madura cuando la enzima active no contiene un
péptido de señal de secreción de xilanasa.
Algunas de las xilanasas comerciales más
importantes se clasifican como xilanasas de la Familia 11,
incluyendo dos residuos de ácido glutámico que sirven como residuos
catalíticos esenciales. Estos residuos son los aminoácidos 86 y 177
según la numeración de xilanasa II para Trichoderma reesei.
Los aminoácidos comunes a la las xilanasas de la Familia 11 están
descritos en Wakarchuck, et al, Protein Science
3:467-475 (1994).
El gen de la xilanasa es una región de ADN que
codifica para la producción de la enzima xilanasa. Todos los
microbios que producen xilanasa poseen al menos un gen de xilanasa.
Un gen de xilanasa natural comprende un promotor de xilanasa, una
señal de secreción, una región de codificación y un terminador
transcricpcional. Los microbios que no producen xilanasa
generalmente no contienen un gen de xilanasa activo y
funcional.
La señal de secreción de la xilanasa es la
secuencia de ADN que codifica el péptido de señal de secreción de
la xilanasa.
El péptido de señal de secreción de xilanasa es
la secuencia peptídico en el término del aminoácido de la enzima
codificada xilanasa que se remueve subsecuentemente durante la
exportación de la enzima xilanasa madura fuera de las células
microbianas. La señal de secreción puede comprender un
pro-péptido, un pre-péptido o
ambos.
La celulasa es una enzima que hidroliza la
celulosa en oligómeros cortos unidos por 1,4- de glucosa,
incluyendo celotetraosa, celotriosa y celobiosa. Hay muchos
microbios que producen más o menos celulasa, frecuentemente
clasificados como celobiohidrolasas o endoglucanasas. Las
propiedades de estas enzimas varían, incluyendo estructura (peso
molecular, orientación tridimensional, composición en aminoácidos y
sitio activo) y actividad catalítica (velocidad y cinética de la
hidrólisis del xilano, y capacidad para actuar sobre otros
sustratos). Sin embargo, en todos los casos las enzimas celulasa
pueden hidrolizar la celulosa en oligómeros cortos unidos por 1,4-,
incluyendo celotetraosa, celotriosa y celobiosa.
La construcción genética de
beta-glucosidasa se refiere a un gen que comprende
los elementos necesarios para producir
beta-glucosidasa. Incluyen:
a. Una región de codificación de
beta-glucosidasa madura. En una modalidad
preferida, la región de codificación de
beta-glucosidasa madura de un gen
Trichoderma. La secuencia de ADN de la región de codificación
de beta-glucosidasa madura del Trichoderma
reesei puede encontrarse en la Figura 1 de Barnett, et
al. Los experimentados en la técnica advertirán que una región
estructural natural puede modificarse por reemplazo, sustitución,
adición o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin cambiar su
función. La práctica de la invención abarca y no está limitada por
tales alteraciones de la región de codificación de la
beta-glucosidasa madura.
b. Una señal de secreción de xilanasa. En una
modalidad preferida, la señal de secreción de xilanasa comprende
una señal de secreción de xilanasa de ungen de xilanasa de la
Familia 11. En una modalidad más preferida, el gen de xilanasa de
la Familia 11 es un gen de xilanasa de Trichoderma. En una
modalidad aun más preferida, la señal de secreción de xilanasa
comprende una señal de secreción de xilanasa del gen de xilanasa de
Trichoderma I (xln1) o del gen de xilanasa II (xln2). Las
secuencias de ADN de las señales de secreción de Trichoderma
xln1 y xln2 pueden encontrarse en las Figuras 3 y 2,
respectivamente, de Torronen, Mach, Messner, Gonzalez, Kalkkinen,
Harkki y Kubicek, "The two major xylanases from Trichoderma
reesei: characterization of both enzymes and genes",
Bio/Technology 10: 1461-1465, 1992 (los datos de
identificación de genes en la figura, según se publicó, están
invertidos). Los experimentados en la técnica advertirán que una
señal de secreción natural puede modificarse por reemplazo,
sustitución, adición o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin
cambiar su función. La práctica de la invención abarca y no está
limitada por tales alteraciones en la señal de secreción de la
xilanasa que puede modificarse por reemplazo, sustitución, adición
o eliminación de uno o más ácidos nucleicos sin cambiar su
función.
La práctica de la invención no está limitada por
la escogencia del promotor en la construcción genética. Sin
embargo, los promotores preferidos son los promotores de
Trichoderma cbh1, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2. La
secuencia de ADN del Trichoderma reesei cbh1 está depositada
en GenBank bajo el Número de Acceso D86235. Los experimentados en
la técnica advertirán que un promotor natural puede ser modificado
por reemplazo, sustitución, adición o eliminación de uno o más
ácidos nucleicos sin cambiar su función. La práctica de la
invención abarca y no está limitada por tales alteraciones del
promotor.
d. Secuencias adicionales entre la señal de
secreción de la xilanasa y la región de codificación de la
beta-glucosidasa madura. Las construcciones
genéticas descritas en los Ejemplos 5, 6 y 7 contienen nueve pares
adicionales de bases de la secuencia de ADN como se muestra en las
Figuras 1-3; las tres primeras codifican el residuo
glutamina después de la señal de secreción del gen de xilanasa II
de Trichoderma reesei, y las seis restantes resultan de la
inserción y/o modificación de los sitios de restricción únicos
usados para unir la señal de secreción de la xilanasa con la región
de codificación de la beta-glucosidasa madura.
Estas secuencias de ADN resultan en la presencia de aminoácidos
adicionales entre el péptido de la señal de secreción de la
xilanasa y la enzima beta-glucosidasa madura. Estas
secuencias de ADN, que pueden ser naturales o sintéticas, pueden
codificar uno o más de loas aminoácidos de la proteína xilanasa
madura correspondiente a la señal de secreción de la xilanasa
codificada por la construcción o puede resultar de la adición de
sitios de restricción en la enzima necesarios para unir el péptido
de señal de secreción de la xilanasa y la enzima
beta-glucosidasa madura. La práctica de la
invención abarca pero no es limitada por la presencia de secuencias
adicionales de ADN entre la señal de secreción de la xilanasa y la
región de codificación de la beta-glucosidasa.
La construcción genética contiene un terminador
transcripcional inmediatamente después de la región de codificación
de la beta-glucosidasa madura. La práctica de la
invención no está limitada por la escogencia del terminador
transcripcional y puede incluir tanto ADN hacia abajo (por ejemplo,
en el extremo 3') del codón de detención de cualquier región de
codificación conocida como sea suficiente para dirigir la
terminación de la transcripción por la ARNB polimerasa. El
terminador transcripcional presente hacia abajo de la región de
codificación de la beta-glucosidasa madura en las
construcciones descrito en los Ejemplos 5-7 abarca
1,9 kb de ADN 3' hasta el codón de detención del gen de
Trichoderma cbh2.
La secuencia de ADN de los primeros 553 pares de
bases del terminador transcricpcional de Trichoderma reesei
cbh2, las cuales se localizan hacia abajo (ó 3') del codón de
detención TAA, pueden encontrase en la Figura 2 de Chen, Gritzali y
Stafford, "Nucleotide Sequence and Deduced Primary Structure of
Cellobiohidrolase II from Trichoderma reesei," Bio/
Technology 5: 274-278, 1987.
La construcción genética contiene un marcador
seleccionable que puede estar presente hacia arriba o hacia abajo
de la construcción genética (esto es, en el terminal 5' ó 3' del la
construcción) sobre el mismo vector plásmido o puede ser
cotransformada con la construcción sobre un mismo vector de
plásmido. Las escogencias de marcadores seleccionables son bien
conocidas para los experimentados en la técnica e incluyen genes
(sintéticos o naturales) que confieren a las células transformadas
la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es
metabolizado por el microbio (por ejemplo, el gen A. nidulans
amdS que codifica acetamidasa y confiere la capacidad de crecer
sobre acetamida como única fuente de nitrógeno) o de resistencia a
antibióticos (por ejemplo, el gen hph codificador de
higromicina-b-fosfotransferasa de
Escherichia coli y que confiere resistencia a la
higromicina). Si la cepa huésped carece de un gen funcional para el
marcador escogido, entonces ese gen puede ser usado como marcador.
Ejemplos de tales marcadores incluyen trp, pyr4, pyrG, argB, leu, y
similares. La cepa huésped correspondiente tendrá entonces que
carecer de un gen funcional correspondiente al marcador escogido,
esto es, trp, pyr, arg, leu y similares. El marcador seleccionado
usable en las construcciones genéticas descritas en los Ejemplos
5-7 es el gen hph de E. coli expresado a
partir del promotor Trichoderma fosfoglicerato kinasa
(pgk).
La secuencia de ADN del gen hph de E. coli
puede encontrarse en la Figura 4 de Gritz y Davies,
"Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the
sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression
in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae",
Gene 25: 179-188, 1983; la secuencia de ADN del
promoter Trichoderma reesei pgk puede encontrarse en la
Figura 2 de Vanhanen, Saloheimo, Ilmen, Knowles y Penttila,
"Promoter structure and expression of the
3-phosphoglycerate kinase-encoding
gene (pgk1) of Trichoderma reesei", Gene 106:
129-133,
1991.
1991.
Una modalidad preferida de la invención comprende
la construcción genética de beta-glucosidasa
descrita hasta ahora. La práctica de nuestra invención no está
limitada por el método para preparar la construcción, el cual puede
incluir, pero no está restringido a, técnicas estándar de biología
molecular tales como aislamiento del plásmido de ADN de E.
coli por lisis alcalina, digestión del plásmido de ADN con
endonucleasas de restricción, separación y aislamiento de
fragmentos de ADN por electroforesis sobre gel de azarosa, ligazón
de fragmentos de ADN con T4 ADN ligasa, inserción de sitios de
restricción únicos en los extremos de fragmentos de ADN con T4ADN
polimerasa o fragmento de Klenow def E. coli ADN polimerasa
I.
Los Ejemplo 1-7 describen
procedimientos para hacer tales construcciones genéticas.
En otra modalidad preferida de nuestra invención,
la construcción genética beta-glucosidasa es
introducida y expresada en un huésped microbiano para crear un
microbio genéticamente modificado. El microbio genéticamente
modificado produce un nivel incrementado de
beta-glucosidasa con respecto al huésped microbiano
no transformado. El microbio genéticamente modificado produce un
nivel incrementado de beta-glucosidasa de
preferiblemente al menos 10 veces con respecto al huésped
microbiano no transformado, más preferiblemente al menos 40 veces
con respecto al huésped microbiano no transformado, y más
preferiblemente al menos 120 veces con respecto al huésped
microbiano no transformado.
Esta invención abarca cualquier método para
introducir la construcción genética de
beta-glucosidasa en el huésped microbiano, familiar
para los experimentados en la técnica, incluyendo peor no limitada
a, tratamiento con cloruro de calcio de las células bacterianas o
protoplastos fúngicos para debilitar las membranas celulares,
adición de polietilén glicol para permitir la fusión de las
membranas celulares, despolarización de membranas por
electroporación, o disparo del ADN a través de la pared y membrana
celular, vía bombardeo con microproyectiles con una pistola de
partículas. El Ejemplo 8 describe los procedimientos para
introducir la construcción genética de la
beta-glucosidasa en las esporas de
Trichoderma usando una pistola de partículas.
Un aumento de 10 veces la producción de
beta-glucosidasa con respecto al huésped microbiano
no transformado refleja una significativa mejora que está harto por
encima de la variabilidad natural de la cepa y es comercialmente
significativa. El grado de mejora de
beta-glucosidasa por este método ha sido tan alto
como 126 veces y podría alcanzar 1000 veces. La medición del grado
de mejoramiento de la producción de
beta-glucosidasa es por crecimiento del cultivo y
medición de la actividad de la beta-glucosidasa,
según se describe en el Ejemplo 11. Se cree que las construcciones
genéticas de nuestra invención cualquier nivel de mejoramiento
superior a aproximadamente 10 veces.
Se entiende por aquellos experimentados en la
técnica que la actividad específica de
beta-glucosidasa de una mezcla de enzimas en UI/mg
de proteína) puede incrementarse al disminuir la cantidad de
celulasa y otras proteínas en la mezcla de enzimas. Esto puede
lograrse mediante separaciones físicas y mecánicas de la mezcla de
enzimas o por supresión de la celulasa u otros genes por medios de
recombinación. Tales métodos tienen poco o ningún efecto sobre la
producción real de beta-glucosidasa por el
microorganismo. Estos procedimientos pueden, sin embargo, ser
incluidos opcionalmente en la práctica de nuestra invención
En una modalidad preferida, el huésped microbiano
es un miembro de las especies de Trichoderma, Humicola,
Fusarium, Aspergillus, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus,
o Cellulomonas. Estas especies son bien apropiadas, puesto
que producen celulasa además de beta-glucosidasa.
Además, se han publicado métodos para la introducción de
construcciones de ADN en cepas productoras de celulasa de
Trichoderma (Lorito, Hayes, DiPietro y Harman, 1993,
"Biolistic Transformation of Trichoderma harzianum and
Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA," Curr.
Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and
Herrera-Estrella, 1990, "Transformation of
Trichoderma harzianum by high-voltage
electric pulse", Curr. Genet. 17:169-174;
Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen y Knowles, 1987, "A
versatile transformation system for the cellulolytic fungus
Trichoderma reesei", Gene 6: 155-164),
Aspergillus (Yelton, Hamer and Timberlake, 1984,
"Transformation of Aspergillus nidulans using a trpC
plasmid", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
1470-1474), Fusarium (Bajar, Podila and
Kolattukudy, 1991, "Identification of a fungal cutinase promoter
that is inducible by a plant signal via a phosphorylated
transacting factor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8202-8212), Streptomyces (Hopwood et al.,
1985, "Genetic Manipulation of Streptomyces: a laboratory
manual," The John Innes Foundation, Norwich, UK) and
Bacillus (Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and
Matteuzzi, 1990, "Genetic transformation of intact cells of
Bacillus subtilis by electroporation", FEMS Microbiol.
Lett. 55: 135-
138).
138).
Las construcciones genéticas usados en estos
métodos de transformación publicados son similares a las descritas
en los Ejemplos 5-7 en que contienen un promotor
ligado a una región de codificación de una proteína (la cual puede
codificar un marcador seleccionable) y un terminador
transcripcional. En la mayoría de los casos, las construcciones
genéticas están ligadas a un gen marcador seleccionable.
Aunque no hay métodos publicados para la
transformación de Humicola, Thermomonospora o
Cellulomonas, se cree que los métodos de transformación para
otros hongos o bacterias filamentosos puede optimizarse para cepas
de Humicola, Thermomonospora o Cellulomonas en
virtud de las similares morfologías y fisiologías de estas especies
respecto de aquellas para las cuales se han publicado los métodos
de transformación. Además, los métodos de transformación tales como
electroporación y bombardeo de partículas han sido utilizados para
introducir ADN en muchos tipos diferentes de células, incluyendo
células de mamíferos y vegetales, bacterianas, levaduras y
fúngicas.
En una modalidad preferida, la señal de secreción
de xilanasa es nativa para el huésped microbiano a partir del cual
se genera dicho microbio modificado genéticamente (esto es, la
fuente de la señal de secreción de xilanasa es el mismo tipo de
huésped microbiano del cual se deriva dicho microbio genéticamente
modificado).
En una modalidad más preferida, el huésped
microbiano es Trichoderma.
En una modalidad más preferida, el huésped
microbiano es Trichoderma reesei.
El Ejemplo 1 describe el aislamiento del ADN
genómico a partir de cepas Trichoderma reesei RutC30, M2C38,
BTR48 y los derivados genéticamente modificados de estas cepas. Los
Ejemplos 2-7 describen la construcción de
bibliotecas genómicas de ADN, la clonación de diversos genes y
varias construcciones genéticas a partir de la cepa Trichoderma
reesei M2C38. Los Ejemplos 9 y 11-15 describen
la transformación y expresión de construcciones genéticas de
beta-glucosidasa en las cepas de Trichoderma
reesei M2C38, BTR48, y RutC30.
Las cepas Trichoderma reesei M2C38 y BTR48
son cepas propiedad de Iogen Corporation, y fueron derivadas a
partir de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765,
Montenecourt y Eveleigh, 1979, "Selective isolation of high
yielding celulasa mutants of T. reesei", Adv. Chem. Ser.
181: 289-301), las cuales a su vez fueron derivadas
a partir de Trichoderma reesei Qm6A (ATCC 13631 Mandels y
Reese, 1957 "Induction of celulasa in Trichoderma viride
as influenced by carbon sources and metals", J. Bacteriol. 73:
269-278).
En el Ejemplo 1 y Ejemplos subsecuentes, las
endonucleasas de T4 ADN polimerasa, T4 ADN ligasa y el fragmento de
Klenow de la E. coli ADN polimerasa fueron adquiridas de
Gibco/BRL, New England Biolabs, Boehringer Mannheim o Pharmacia y
se usaron según las recomendaciones del fabricante. La Pwo
polimerasa con actividad verificada (Boehringer Mannheim) fue usada
en todas las reacciones de polimerasa en cadena (PCR) de acuerdo
con el protocolo del fabricante. La Hygromicina B fue adquirida de
CalBiochem.
Para aislar el ADN genómico, se inocularon 50 ml
de Caldo Patata Dextrosa (Difco) con esporas de T. reesei
recogidas de una placa de Agar Patata Dextrosa con un asa de
inoculación estéril. Los cultivos se agitaron a 200 rpm durante
2-3 días a 28ºC. Los micelios fueron filtrados sobre
un filtro de microfibra de vidrio GFA (Whatman) y se lavaron con
agua fría desionizada. La torta fúngica fue congelada en nitrógeno
líquido y triturada hasta pulverizar con mortero y pistilo
pre-enfriados; 0.5 g de la biomasa pulverizada
fueron resuspendidos en 5 ml de 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.5 más
dodecilsulfato de sodio al 1% (SDS). El lisado fue centrifugado
(5000 g por 20 min, 4ºC) hasta sedimento residual de células. El
sobrenadante fue extraído con 1 volumen de solución reguladora (10
mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) de fenol saturada seguida por
extracción con 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(25:24:1) saturada con reguladora para remover las proteínas
solubles. El ADN fue precipitado de la solución añadiendo 0.1
volumen de acetato de, pH 5.2 y 2.5 volúmenes de etanol fría al
95%. Después de incubar por al menos 1 ha -20ºC, el ADN fue
granulado por centrifugación (5000 g por 20 min, 4ºC), enjuagado con
10 ml 70% etanol, secado con aire y resuspendido en 1 ml 10mM Tris,
1 mM EDTA, pH8.0. El ARN se digiere por adición de Ribonucleasa A
(Boehringer Mannheim) añadida hasta una concentración final de 0.1
mg/ml e incubación a 37ºC por 1 hora. Se usaron extracciones
secuenciales con 1 volumen de fenol saturado en regulador y un
volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) saturado
en regulador, para remover la ribonucleasa de la solución de ADN. El
ADN se precipitó de nuevo con 0.1 volumen de acetato de sodio 3M,
pH 5.2 y 2.5 volúmenes de etanol frío al 95%, se granuló por
centrifugación, se enjuagó con etanol al 70%. Se secó con aire y se
resuspendió en 50 ml de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0. La
concentración de ADN fue determinada midiendo la absorbancia de la
solución a 260 nm (p. C1 in Sambrook, Fritsch y Maniatis,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold
Spring Harbor Press 1989, en lo sucesivo llamado Sambrook
et al.).
et al.).
\newpage
Dos bibliotecas de plásmidos y una biblioteca de
fagos se construyeron usando el ADN genómico aislado a partir de la
cepa T. reesei M2C38. Las bibliotecas de plásmidos se
construyeron en el vector pUC119 (Viera and Messing, "Isolation
of singlestranded plasmid DNA", Methods Enzymol. 153:3, 1987)
como sigue: 10 mg de ADN genómico se digirieron durante 20 horas a
37ºC en un volumen de 100 ml con 2 unidades/mg de enzimas de
HindIII, BamHI o EcoRI. El ADN digerido fue fraccionado sobre un
gel de azarosa al 0.75% en Tris-acetate0.04M, 1 mM
EDTA, y teñido con bromuro de etidio. Cortes de gel
correspondientes al los tamaños de los genes de interés (con base
en la información publicada y a los transferencias Southern) fueros
escindidos y sometidos a electroelución para recuperar los
fragmentos de ADN (Sambrook et al., pp.
6.28-6.29). Estas fracciones enriquecidas de ADN se
ligaron con pUC119 para crear bibliotecas de genes que contienen
20-50 mg/ml de ADN en una relación molar 2:1 de
vector:inserto de ADN, 1 nM de ATP y 5 unidades de T4ADN ligasa en
un volumen total de 10-15 ml a 4ºC por 16 h. La
cepa de Escherichia coli HB101 fue sometida a
electroporación con las reacciones de ligazón usando el Cell
Porator
System.
System.
(Gibco/BRL) siguiendo el protocolo del fabricante
y los transformantes seleccionados sobre agar LB que contenía 70
mg/ml amplicilina.
La biblioteca de fagos fue construida en el
vector lambda DASH (Stratagene, Inc.) como sigue: ADN genómico (3
mg) fue digerido con 2, 1, 0.5 y 0.2 unidades/mg Bam HI por 1 hora
a 37ºC para generar fragmentos 9-23 kB en tamaño.
El ADN de cada digestión fue purificado por extracción con 1 volumen
de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) saturado en
regulador seguido por precipitación con 10 ml 3M de acetato de
sodio, pH 5.2 y 250 ml etanol 95% (-20ºC). EL ADN digerido fue
granulado por microcentrifugación, enjuagado con 0.5 ml de etanol
frío al 70%, secado con aire y suspendido en 10 ml de agua estéril
desionizada. El enriquecimiento de los fragmentos de ADN
9-23 kB en tamaño fue confirmado por electroforesis
sobre gel de azarosa (0.8% agarosa in 0.04 M
Tris-acetato, 1 mM EDTA). El ADN digerido (0.4 mg)
fue ligado a 1mg de brazos de lambdaDASH predigerido con BamHI
(Stratagene) en una reacción que contenía 2 unidades de T4 ADN
ligasa y mM ATP en un volumen total de 5 ml a 4ºC durante la noche.
La mezcla de ligazón fue empacada en partículas de fago usando los
extractos de empacado GigaPack® II Gold (Stratagene) siguiendo el
protocolo del fabricante. La biblioteca fue titulada usando la cepa
huésped E. coli XL1-Blue MRA (P2) y se
encontró que contenía 3 x 105 clones independientes.
Los clones transformantes fondeadores de E.
coli HB101 cbh1, cbh2 o bgl1 de las bibliotecas recombinantes
pUC119-Hind III, -BamHlor -EcoRIibraries fueron
identificados por hibridización en levantamiento de colonia:
1-3 x 104 colonias fueron transferidas sobre
membranas de nylon HyBond™ (Amersham); las membranas fueron
colocadas, con la colonia hacia arriba, sobre papel de transferencia
(VWR 238) saturado con 0.5MNaOH, 1MNaCl por 5 min para producir
lisis de las células bacterianas y desnaturalizar el ADN. Entonces
fueron neutralizadas las membranas colocándolas con la colonia
hacia arriba; las membranas fueron entonces neutralizadas
colocándola con la colonia hacia arriba sobre papel de transferencia
(VWR 238) saturado con 1.5 M Tris, pH 7.5 más 1 M NaCl por 5 min;
las membranas se dejaron secar con aire durante 30 minutos y el ADN
se fijó a las membranas horneándolas a 80ºC por 32 horas.
Sondas marcadas 32P fueron preparadas por
amplificación por PCR de fragmentos cortos (0.7-1.5
kB) de las regiones de codificación bgl1, cbh1y cbh2 del grupo
enriquecido de los fragmentos Hind III, BamHI o EcoRI,
respectivamente, en una reacción de marcación que contiene
10-50 ng del ADN objetivo, 0.2 mM de cada
d(GCT)TP, 0.5 mM dATP, 20-40 mCi
alfaa-32P-dATP, 10 pmol de
iniciadores oligonucleótido y 0.5 unidades de Taq polimerasa en un
volumen total de 20 ml. La reacción fue sometida a
5-7 ciclos de amplificación (95ºC, 2 min; 56ºC, 1.5
min; 70ºC, 5 min). El ADN 32-P marcado amplificado
fue precipitado por adición de 0.5 ml al 10% (p/p) de ácido
tricloroacético y 0.5 mg de ARNt de levadura. El ADN fue granulado
por microcentrifugación, se lavó dos veces con 1 ml de etanol al
70%, se secó con aire y resuspendió en 1M Tris pH7.5, 1 mM EDTA.
Las membranas de nylon sobre las cuales se habían
fijado los plásmidos recombinantes pUC119, fueron prehibridizadas
en bolsas selladas al calor durante 1 h a 60-65ºC
en 1 M NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.5 con 100 mg/ml ADn
de esperma de salmón desnaturalizado desmenuzado. Las
hibridizaciones fueron llevadas a cabo en bolsas selladas al calor
en el mismo regulador con sólo 50 mg/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado desmenuzado y 5 x 106 - 5 x 107 cpm de sonda bgl1,
cbh1 o cbh2 por 16-20 h a 60-65ºC.
Las membranas se lavaron una vez por 15 minutos con 1 M NaCl, 0.5%
SDS a 60ºC, dos veces durante 15 minutos cada una con 0.3 M NaCl,
0.5% SDS a 60ºC y una vez por 15 min con 0.03 M NaCl, 0.5% SDS a
55ºC. Las membranas fueron colocadas de nuevo en bolsas selladas al
calor y expuestas a película de rayos-X Kodak RP
X-ray de 16-48 h a -70ºC. La
película de rayos-X fue revelada siguiendo los
protocolos de los fabricantes. Las colonias que dieron señales
fuertes y débiles fueron recolectadas y cultivadas en medio 2xYT
suplementado con 70 mg/ml de ampicilina. El ADN plásmido fue
aislado a partir de estos cultivos usando el método de lisis
alcalina (Sambrook et al., pp. 1.25-1.28) y
analizado por digestión de restricción, hibridización Southern
(Sambrook et al., pp. 9.38-9.44) y análisis
por PCR (Sambrook et al., pp.
14.18-14.19).
Los clones portadores del gen bg11 fueron
identificados por hibridización de levante por colonia de la
biblioteca pUC119-Hind III (Ejemplo 2) con una
sonda 1.0 kb bgl1 preparada usando iniciadores oligonucleótidos
diseñados para amplificar bp 462-1403 de la
secuencia bp11 publicada (Barnett et al.). Un clon bgl1,
pJEN200, fue aislado con un contenido de 6.0 kb Hind III de
fragmento correspondiente al promotor, al gen estructural y a las
secuencias de terminación. Los clones que portan el gen cbh1 fueron
identificados por hibridización de levante por colonia de la
biblioteca pUC119-BamHI con una sonda chb1 0.7 kb
preparada usando iniciadores oligonucleótidos diseñados para
amplificar el bp 597-1361 de la secuencia chb1
publicada (Shoemaker, Schweikart, Ladner, Gelfand, Kwok, Myambo and
Innis, "Molecular cloning of
exo-cellobiohidrolyase 1 derived from Trichoderma
reesei strain L27", Bio/Technology 1:
691-696, 1983, en lo sucesivo denominada Shoemaker
et al.). Se aisló un clon cbh1 pCOR132, con contenido de una
fragmento 5.7 kb BamHI correspondiente al promotor (4.7 kb) y kb
del gen estructural. A partir de esto, se subclonó un fragmento
2.5 kb EcoRI que contenía el promoter chb1 fragmento (2.1 kb) y el
extremo 5' de la región de codificación cbh1, para dar pUC119 para
generar pCB152. Los clones portadores del gen cbh2 fue identificado
por hibridización de levante por colonia de la biblioteca
pUC119-EcoRI con una sonda 1.5 kb cbh2usando
iniciadores oligonucleótidos diseñados para amplificar bp
580-2114 de la secuencia cbh2 publicada (Chen,
Gritzali y Stafford, "Nucleotide sequence and deduced primary
structure of cellobiohidrolase II from Trichoderma
reesei", Bio/Technology 5: 274-278, 1987, en
los sucesivo denominada Chen et al.). Un clon cbh2, pZUK600,
fue aislado conteniendo un fragmento 4.8 kb EcoRIalde gen promotor
(600 bp), gen estructural (2.3 kb) y gen terminador (1.9 kbp).
Se prepararon sondas marcadas
Digoxigen-11-dUTP a partir de región
de codificación amplificada por PCR de los genes cbh1, xln2 y pgk
por marcación primaria aleatoria usando el juego DIG Labeling and
Detection (Boehringer Mannheim) y siguiendo los protocolos del
fabricante. Se identificaron los clones genómicos que contenían los
genes cbh1, xln2 y pgk, por hibridización de levante en placa de la
biblioteca lambdaDASH. Para cada gen de interés, se transfirieron 1
x 10^{4} clones a membranas de nylon Nytran® (Schleicher and
Schull). Las partículas de fago fueron lisadas y el ADN del fago
fue desnaturalizado membranas con el lado de la placa hacia arriba
sobre papel de transferencia (VWR238) saturado con 0.5MNaOH, 1MNaCl
por 5 min; las membranas fueron entonces neutralizadas colocándolas
con el lado de la placa hacia arriba sobre papel de transferencia
(VWR238) saturado con 1.5 M Tris, pH 7.5 más 1 M NaCl por 5 min; las
membranas se dejaron secar al aire durante 30 minutos y el ADN se
fijó a las membranas calentándolas a 80ºC por 2 h. Las membranas
fueron prehibridizadas en bolsas selladas al calor en una solución
de Denhardt 6X SSPE, 5X más 100 mg/ml desnaturalizada 1% SDS, más
100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado a 65ºC por 2 h.
Las membranas fueron entonces hibridizadas en bolsas selladas al
calor en la misma solución conteniendo con 50 mg/ml de ADN de
esperma de salmón desmenuzado y 0.5 mg de sondas marcadas de
digoxigen-dUTP a 65ºC durante la noche. Las
membranas fueron lavadas dos veces por 15 min en 2X SSPE, 0.1% SDS a
RT, dos veces por 15 min en 0.2X SSPE, 0.1% SDS a 65ºC y una vez
por 5 min en 2X SSPE. Los clones positivamente hibridizantes fueron
identificados por reacción con un conjugado anticuerpo
anti-digoxigenina/fosfatasa alcalina,
5-bromo-4-cloro-3-indoil
fosfato y cloruro de 4-nitro azul tetrazolio
(Boehringer Mannheim) siguiendo el protocolo del fabricante. Los
clones positivamente hibridizantes fueron purificados
adicionalmente mediante una segunda ronda de barrido con las sondas
marcadas de digoxigendUTP. Los clones individuales fueron aislados
y el ADN fago se purificó según se describió en Sambrook, et
al. (1989) pp. 2.118-2.121 con la excepción de
que la etapa del gradiente CsCl fue reemplazada por extracción con
1 volumen de enol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y un
volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). El ADN fue
precipitado con 0.1 volumen de acetato de sodio 3M, y pH 5.2 y 2.5
volúmenes de etanol frío al 95%. El fago ADN precipitado fue lavado
con 0.5 ml de etanol frío al 70%, secado con aire y resuspendido en
50 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH8.0. Los fragmentos de restricción que
contenían los genes de interés fueron identificados por digestión
de restricción del ADN fago purificado e hibridización por
transferencia de Southern. (Sambrook et al., pp.
9.38-9.44) usando las mismas sondas marcadas
digoxigendUTP usadas para barrer la biblioteca lambdaDASH. Las
membranas fueron hibridizadas y los fragmentos positivamente
hibridizados fueron visualizados por los mismos métodos usados para
los levantamientos de play se escindieron las bandas deseadas. El
ADN fue eluido de las tiras de gel usando el Sephaglas BandPrep Kit
(Pharmacia) siguiendo el protocolo del fabricante. Los clones que
portan el gen cbh1 fueron identificados por hibridización de
levante de colonia de la biblioteca lambda DASH (Ejemplo 2) con una
sonda cbh1 que comprende bp 45-2220 de la secuencia
cbh1 publicada (Shoemaker et al.). Un fragmento de 1.8 kb
BamHI que contenía el extremo 3' de la región de codificación cbh1
(0.5 kb) y el terminador cbh1 (1.3 kb) fue aislado por digestión de
restricción del ADN fago purificado a partir de un clon lambdaDASH
cbh1. Este fragmento fue subclonado en el sitio BamHI del vector
plásmido de E. coli pUC119 para generar el plásmido pCB1Ta.
Los clones portadores del gen xln2 fueron identificados por
hibridización de levantamiento de colonia de la biblioteca
lambdaDASH (ejemplo 2) con una sonda xln2 que comprende bp
100-783 de la secuencia xln2 publicada
(Saarelainen, Paloheimo, Fagerstrom, Suominen y Nevalainen,
"Cloning, sequencing and enhanced expression of the Trichoderma
reesei endoxylanase II (pI 9) gene xln2", Mol. Gen. Genet.
241: 497-503, 1993, en lo sucesivo denominada
Saarelainen et al.). Un fragmento 5.7 kb KpnI que contenía
el promotor, la región de codificación (0.8 kb) y el terminador
(2.6 kb) el gen xln2 fue aislado por digestión de restricción del
ADN fago purificado a partir de un clon lambdaDASH xln2. Este
fragmento fue subclonado al sitio KpnI del pUC119 para generar el
plásmido pXYN2K-2. Los clones portadores del gen
pgk fueron identificados por hibridización de levantamiento de
colonia de la biblioteca lambdaDASH (Ejemplo 2) con una sonda pgk1
que comprende bp 4-1586 de la secuencia de pgk
publicada (Vanhanen, Penttila, Lehtovaara y Knowles, "Isolation
and characterization of the 3-phosphoglycerate
kinase gene (pgk) from the filamentous fungus Trichoderma
reesei", Curr. Genet. 15: 181-186, 1989). Un
fragmento 5.0 kb EcoRI que contenía el promotor (2.9 kb), la región
de codificación (1.6 kb) y el terminador (0.5 kb) del gen pgk fue
aislado por digestión de restricción del ADN fago purificado a
partir del clon lambdaDASH. Este fragmento fue subclonado al sitio
EcoRI del pUC119 para generar el plásmido pGK5.0.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector que contiene el promotor de celobiohidrolasa I de
Trichoderma y la región de codificación de la señal de
secreción y de la beta-glucosidasa madura.
Un fragmento de ADN que contenía la región de
codificación bgl1 menos la señal de secreción de la
beta-glucosidasa (bp 474-2679) fue
amplificado por PCR a partir de la plantilla pJEN200 usando
iniciadores homólogos a la secuencia publicada bgl1 que contenía
bien un sitio Sph1 5' al Val32 de la
beta-glucosidasa codificada o un sitio KpnI 3' al
codón de detención bcl1 usando Pwo polimerasa. Este fragmento
amplificado fue digerido con SphI y KpnI e insertado en pCB219N
digerido con SphI t KpnI para generar pBgstrf. Para obtener pCB219N,
se amplificó un fragmento terminador cbh2 a partir de la plantilla
pZUK600 usando un iniciador homólogo al bp 2226-2242
de la región no traducida 3' publicada del gen cbh2 (Chen et
al., 1987) que contenía un sitio KpnI en el extremo 5' y el
iniciador de avance pUC (Cat. No. 1224, New England Biolabs) que se
enlaza hacia abajo del sitio EcoRI en el extremo 3' del cbh2 en
pZUK600. Este fragmento fue digerido en los sitios KpnI y EcoRI
manipulados e insertado en los sitios correspondientes del pUC119
para generar pCB219N. Un fragmento que contenía el promotor cbh1 y
la señal de secreción fue amplificado a partir de pCB152 usando un
iniciador específico cbh1 (bp 249-284 de la
secuencia publicada cbh1, Shoemaker et al., 1983) que
contenía un sitio SphI 3' a Ser19 del CBH1 codificado y el iniciador
de avance pUC (Cat. No. 1224, New England Biolabs) que se enlaza
hacia arriba del sitio EcoRI en el extremo 5' de cbh1 en pCB152. El
promotor cbh1+ el producto de PCR de la señal de secreción fue
digerido con Sph1 y EcoRI e insertado en los sitios
correspondientes en pBR322L (un derivado de pBR322 en el cual la
región entre los sitios SphI y SalI fue reemplazada con un enlazante
SphI-NotI-SalI) para generar
pBR322LCS. Para obtener el casete de expresión, la región de
codificación cbh1 y el terminador cbh2 fueron aislados a partir de
pBgstrf como un fragmento 4.1 kb SphI/NotI e insertados en
pBR322LCS digerido con SphI and NotI. Para mantener el marco de
lectura correcto en la unión de la señal de secreción cbh1 y la
beta-glucosidasa madura, el plásmido resultante,
pCBGstrf, fue linealizado en el sitio exclusivo SphI y el sitio
SphI fue anulado con T4 DNA polymerase. El plásmido resultante,
pCBG1, fue entonces modificado adicionalmente mediante la
conversión del sitio exclusivo NotI en el extremo 3' del terminador
cbh2 a un sitio exclusivo XhoI mediante la adición de enlazantes
XhoI (Cat. No.1073, New England Biolabs). El plásmido final,
pCBG1-Xho, es el plásmido del casete de
expresión.
El gen higromicina fosfotransferasa de E.
coli (hph) usado como marcador seleccionable para T.
reesei fue amplificado con Pwo polimerasa a partir del plásmido
pVU1005 (Van den Elzen, Townsend, Lee y Bedbrook, "A chimaeric
hygromycin resistance gene as a selectable marker in plant
cells", Plant Mol. Biol. 5: 299-302, 1989). Los
iniciadores fueron diseñados para introducir los sitios SphO y KpnI
en los extremos 5' y 3' de la región de codificación hph (bp
211-1236de la secuencia publicada hph, Gritz y
Davies, "Plasmid-encoded hygromycin b resistance:
the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its
expression in Escherichia coli and Saccharomyces
cerevisiae" Gene 25: 179-188,1983),
respectivamente. El producto de PCR fue digerido con SphI y KpnI e
insertado en los sitios correspondientes en la región polienlazante
de pUC119. El plásmido resultante, pHPT100 fue usado como plásmido
de partida para la construcción del casete de selección. Dos nuevas
regiones enlazantes fueron introducidas en este plásmido para
facilitar la clonación de los fragmentos promotor y terminador. Un
enlazante
HindIII-XbaI-XhoI-SphI
fue insertado entre los sitios HindIII y SphI así como un enlazante
KpnI-NotI-SacI fue insertado entre
los sitios KpnI y SacI del polienlazante pUC119 remanente en
pHPT100. Esta construcción fue diseñada como pHPT102. Los
iniciadores usados para amplificar el promotor pgk (Vanhanen,
Saloheimo, Ilmen, Knowles y Penttila, "Promoter structure and
expression of the 3-phosphoglycerate kinase gene
(pgk1) of Trichoderma reesei", Gene 106:
129-133, 1991) fueron diseñados para introducir un
sitio XhoI y un sitio SphI en las posiciones -970 y +1 del promotor
respectivamente. Estos sitios fueron usados subsecuentemente para
insertar el promotor pgk en los sitios XhoI y SphI del pHPT102 para
generar pHPT115. Un fragmento terminador 1.3 kb cbh1 fue
amplificado con Pwo polimerasa a partir de pCB1Ta usando un
iniciador enlazante a la región 3' no traducida del cbh1 (bp
1864-1899 de la secuencia cbh1 publicada) que
contenía un sitio KpnI en 1877-1882y el iniciador
reverse pUC. (Cat. No., 18432-013, Gibco/BRL) que
se enlaza hacia abajo del sitio EcoRI en el extremo 3' del
terminador cbh1 en pCB1Ta. El terminador cbh1 producto de PCR fue
digerido con KpnI e insertado en el sitio exclusivo KpnI de pHPT115
para generar el plásmido del casete de selección pHPT136.
Para obtener el vector de transformación, el
casete de expresión de pCBG1-Xho fue aislado como
un fragmento 5.6 kb Xba1/ Xho1e insertado entre los sitios
exclusivos XbaI y XhoI arriba del casete de selección de
pHPT136.
El vector de transformación final,
pCBG1-TV, como se delinea en la Figura 1, fue
introducido como un plásmido circular en T. reesei M2C38 vía
bombardeo con microproyectiles como se describe más adelante en el
Ejemplo 9.
Este Ejemplo describe la construcción de un
vector que contiene el promotor de xilanasa II de
Trichoderma y la señal de secreción, y la región de
codificación de la beta-glucosidasa madura.
La región de codificación de la
b-glucosidasa (bp 474-2680) fue
amplificada con Pow polimerasa a partir del clon genómico bgl1
pJEN200 usando iniciador para insertar un sitio XbaI directamente
arriba de bp 474 en la secuencia bgl1 publicada (Barnett, et
al.) y un sitio KpnI directamente arriba de bp 2680. El
producto de PCR de terminación bloqueada fue insertado en el sitio
SmaI del pUC118 para generar el plásmido designado como pBGm.s.
Dado que el sitio XbaI fue manipulado para estar inmediatamente
arriba del inicio de la beta-glucosidasa madura en
Va132, el fragmento clonado no incluyó la señal de secreción de la
beta-glucosidasa. El plásmido pBGm.s fue digerido
con XbaI y KpnI y el fragmento 2.2 kb que contenía la región de
codificación bgl1 menos la señal de secreción fue aislado e
insertado en los sitios XbaI y KpnI arriba del terminador cbh2 en el
plásmido pCB219N (descrito en el Ejemplo 5 anterior), para producir
el fragmento de plásmido pBG2X. A 2.3 kb que contiene el promotor y
la señal de secreción del gen xln2 (bp -2150 a +99 donde +1 indica
el codón de inicio ATG) fue amplificada con Pwo polimerasa del
subclón genómico xln2 pXYN2K-2 usando un iniciador
específico para xln2 que contiene un sitio NheI directamente abajo
del bp 103 de la secuencia publicada xln2 (Saarelainen et
al.) y el iniciador reverso pUC (Cat. No.
18432-013, Gibco/BRL) que se enlaza arriba del
sitio KpnI en el extremo 5' del gen xln2. Este producto xln2 de PCR
fue digerido con EcoRI (el cual fue amplificado como parte del
polienlazante pUC119 del pXYN2K-2) y NheI e
insertado en el plásmido pBR322L (descrito en el Ejemplo 5
anterior) para generar pBR322LXN. El sitio EcoRI del pBR322LXN fue
entonces bloqueado con Klenow y se añadieron enlazantes SpeI para
generar pBR322SpXN. El plásmido pBG2X fue cortado con XbaI y NotI
y se aisló un fragmento 4.2 kb que contenía la región de
codificación seguida por el terminador cbh2. Este fragmento fue
insertado en el plásmido pBR322SpXN cortado con NheI y NotI (NheI
y NotI tienen enganches compatibles). Esta clonación resultó en la
fusión de la señal de secreción de la xilanasa directamente en la
beta-glucosidasa madura creando el casete de
expresión completo pXBG-2.
El terminador cbh1 en el plásmido del casete de
selección pHPT136 descrito en el Ejemplo 5 anterior, fue
reemplazado con un fragmento 2.6 kb KpnI que contenía el terminador
transcripcional xln2. El terminador xln2 fue amplificado con Pwo
polimerasa a partir del subclón genómico pXYN2K-2
usando un iniciador para introducir un sitio KpnI directamente abajo
del bp780 de la secuencia xln2 publicada (Saarelainen et
al.) y del iniciador de avance pUC (Cat. No.
18431-015, Gibco/BRL) que se enlaza abajo del
extremo 3' del gen pXYN2K-2. El terminador xln2
producto de PCR fue digerido con KpnI y ligado a un fragmento 5.1
kb del pHPT136 que contenía el gen hph promovido por pgk en pUC119
para generar el plásmido del casete de selección pHPT136X.
La construcción del vector de transformación
involucró la inserción del casete de expresión directamente arriba
del promotor pgk del casete de selección. El plásmido del casete de
expresión pXBG2 fue digerido con NotI seguido por la reacción de
llenado para crear los extremos bloqueados y luego una digestión con
XbaI. Una ligazón de bloqueo pegajosa de estos dos fragmentos fue
llevada acabo para ligar el fragmento 6.5 kb SpeI/bloqueado NotI a
partir de pXBG2 en el fragmento XbaI/bloqueado XhoI del pHPT136X
(SpeI yXbaI tienen enganches compatibles). El vector final de
transformación, pXBG-TV, según se delinea en la
Figura 2, fue linealizado en su NotI exclusivo antes de la
transformación del T. reesei M2C38 vía bombardeo con
microproyectiles, según se describe más adelante en el Ejemplo
9.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector que contiene el promotor de celobiohidrolasa 1 de
Trichoderma, la señal de secreción de xilanasa II y la
región de codificación de beta-glucosidasa
madura.
Este ejemplo fue desarrollado para probar los
efectos combinados del promotor cbh1 y de la señal de secreción
xln2 sobre la expresión bgl. Un fragmento 1.2 kb HindIII que
comprende de bp -1399 a -204 del promotor cbh1 fue amplificado por
PCR usando el plásmido que contiene el promotor, pBR322LCS (Ejemplo
5) como una plantilla para insertar un sitio exclusive XbaI en bp
-1393 a -1388. Este fragmento promotor cbh1 modificado fue digerido
con HindIII y fue usado para reemplazar bp -1400 a -121 del
promotor xln2 en pXBG1 (Ejemplo 6) para generar el nuevo plásmido
de casete de expresión pC/ XBG1. El casete de expresión de 6.4 kb
de pC/XBG1 fue aislado por digestión con NotI seguida por bloqueo
del sitio NotI con el fragmento de Klenow y subsecuente digestión
con SpeI. Este fragmento fue insertado entonces por ligazón de
bloqueo/pegado arriba del casete de selección hph en pHPT136X el
cual había sido digerido con XhoI, bloqueado en el sitio XhoI con
Klenow y digerido con XbaI. El vector de transformación final,
pC/XBG(Xba1)-TV (Accession No. 209613,
depósito de fecha 3 de febrero de 1998, American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA), como se
muestra en la Figura 3, fue linealizado en los sitios exclusivos
XbaI y NotI en el extremo 5' del promotor cbh1 y el extremo 3' del
terminadorxln2 antes de la transformación del T. reesei M2C38
vía bombardeo con microproyectiles, como se describe más abajo en
el Ejemplo 9.
El ADN genómico se aisló a partir de cada cepa
según se describió en el Ejemplo 1. Para las transferencias
Southern, se digirió 1 mg de ADN con 3-10 unidades
de endonucleasa de restricción a 37ºC durante al menos 2 horas y
los productos de digestión se resolvieron sobre gel de azarosa al
0.8% en 0.04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA. El ADN fue
transferido por membranas de nylon (Boehringer Mannheim) por
transferencia capilar (Sambrook et al., pp.
9.38-9.44). En la Figura 4 y 5, las líneas 2, 4,
6, 8 , 10 y 12 contienen ad M2C38 digerido y las líneas 3, 5, 7,
9, 11 y 13 contienen ADN RutC30 digerido. Las endonucleasas de
restricción usadas fueron BamHI (líneas 2 and 3), EcoRI (líneas 4
and 5), XbaI (líneas 6 y 7), Hind III (líneas 8 y 9), SstI (líneas
10 y 11) y KpnI (líneas 12 y 13). En ambas figures, la línea 1
contiene estándares de tamaño molecular IambdaHindIII (Gibco/ BRL,
cat. no. 15612-013) y la línea 14 contiene 1 ng de
un fragmento no marcado usado para producir la sonda. Las
transferencias Southern fueron hibridizadas con una sonda iniciada
al azar marcada digoxigen-11-dUTP
preparada usando el juego DIG Labeling and Detection Kit (Boehringer
Mannheim). La plantilla para la sonda usada en la Figura 4 fue un
fragmento 2.3 kb que comprendía el promotor xln2 de T.
reesei y la señal de secreción (Saarelainen et al.). La
plantilla para la sonda usada en la Figura 5 fue un fragmento 2.1
kb que comprendía bp 574-2679 de la región de
codificación madura bgl1del T. reesei (Barnett, et
al.). Después de los lavados
post-hibridización, los complejos
dig-dUTP fueron visualizados por incubación con
fosfatasa alcalina anti-digoxigenina conjugada
(Boehringer Mannheim) seguida por reacción con
5-bromo-4-cloro-3-indoil
fosfato y cloruro de 4-nitro azul tetrazolio
(Boehringer Mannheim).
El sistema Biolistic PDS-1000/He
(BioRad; E.I. DuPont de Nemours and Company) fue usado para
transformar esporas de las cepas de T. reesei RutC30, M2C38 y
BTR48, y todos los procedimientos fueron llevados a cabo según las
recomendaciones del fabricante. Se usaron partículas de tungsteno
M-10 (diámetro medio de 0.7 mm) como
microtransportadores. Se usaron los siguientes parámetros en la
optimización de la transformación: una presión de ruptura de 1100
psi, una presión de helio de 29 mm de Hg, una distancia de 0.95 cm,
una distancia de viaje del macrotransportador de 16 mm y una
distancia al objetivo de 9 cm. Se prepararon placas con 1x10^{6}
esporas sobre medio Patata Dextrosa Agar (PDA). Las placas
bombardeadas se incubaron a 28ºC. Cuatro horas después del
bombardeo, las esporas se someten a selección primaria
superponiendo el medio selectivo PDA complementado con 80
unidades/ml de HygB. Las placas bombardeadas se incuban a 28ºC. Los
transformantes pueden ser observados después de 3-6
días de crecimiento; sin embargo, se necesita incubación adicional
para alcanzar la esporulación.
Después de que haya ocurrido la esporulación, se
realiza un Segundo proceso de selección para aislar los
transformantes individuales. Las esporas son recolectadas de la
placa con un asa de inoculación y se resuspenden en agua estéril.
Esta suspensión se filtra entonces a través de una jeringa estéril
dotada con microfibras de vidrio. Esto permite el paso de las
esporas a la vez que retiene micelios indeseados. Se requiere una
determinación de la concentración de esporas y diluciones
subsecuentes se siembran en placas de PDA con 0.75% Oxgall (Difco)
y HygB (40 unidades/mL) para obtener 20-50 esporas
por placa. El Oxgall actúa como restrictor de colonias, permitiendo
por tanto aislar colonias individuales sobre estas placas de
selección secundarias. Las colonias aisladas pueden ser observadas
después de 2-3 días.
El ADN genómico fue aislado de cada cepa como se
describió en el Ejemplo1. Para las transferencias, el ADN genómico
fue aislado de cada cepa según se describió en el Ejemplo 1. Para
transferencias Southern, se digirió 1 mg de ADN con
3-10 unidades de Kpn1 o Xba1 a37ºC por al menos 2
horas y los productos de digestión se resolvieron sobre un gel de
azarosa al 0.8% en 0.04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA.
El ADN fue transferido por membranas de nylon (Boehringer Mannheim)
por transferencia capilar (Sambrook et al., pp.
9.38-9.44). Las transferencias Southern se
hibridizaron con una sonda iniciada al azar marcada
digoxigen-11-dUTP usando el juego
DIG Labeling and Detection Kit (Boehringer Mannheim). La plantilla
fue un fragmento 1.3 kb EcoR1-Bgl II que comprendía
bp1215-2464 de la secuencia bgl1 publicada (Bamett
et al.). Después de los lavados
post-hibridización los complejos
dig-dUTP fueron visualizados por incubación con un
conjugado anti-digoxigenina fosfatasa alcalina
(Boehringer Mannheim) seguido por reacción con el reactivo de
quimioluminiscencia CSPD (Boehringer Mannheim) ay exposición a una
película de rayos (Kodak). Los resultados se resumen en la tabla
1.
Este ejemplo describe los métodos utilizados para
determinar la cantidad de enzima beta-glucosidasa
producida por una cepa de Trichoderma.
Las colonias individuales de Trichoderma
son transferidas a placas de PDA para la propagación de cada
cultivo. La esporulación es necesaria para la inoculación uniforme
de los matraces de agitación que se usan para probar l capacidad del
cultivo para producir la beta-glucosidasa y la
celulasa. El medio de cultivo se compone de lo siguiente:
El volumen de líquido por matraz de 1 litro es
150 mL, el pH inicial es 5.5 y cada matraz es esterilizado por
vapor en el autoclave durante 30 minutos a 121ºC antes de la
inoculación.
Tanto para células no transformadas (esto es,
nativas) como transformadas, las esporas son aisladas a partir de
la placa PDA como se describió en el Ejemplo 9 y de
1-23106 esporas se usan para inocular cada matraz.
Los matraces se agitan a 200 rpm una temperatura de 28ºC por un
periodo de 6 días. El filtrado que contenía la proteína secretada
fue recogido por filtración a través de filtros con microfibra de
vidrio GF/A (Whatman). La concentración de proteína se determina
usando el Bio-Rad Protein Assay (Cat. No.
500-0001) usando celulasa de Trichoderma
como estándar. La actividad de la beta-glucosidasa
se determina como se describe en el Ejemplo 16.
Los transformantes fueron examinados en cuanto a
su capacidad para producir al menos 10 veces más
beta-glucosidasa (en UI/mg) que la cepa huésped no
transformada, según fue determinada a partir de la actividad en
UI/mg de la beta-glucosidasa del cultivo filtrado
dividido por la concentración de la proteína (en mg/ml) del cultivo
filtrado.
*La solución de elementos traza contenía 5 g/l
FeSO 4-7H2O; 1.6 g/l MnSO4-H2O; 1.4
g/l ZnSO4-7H2O.
** 5 g/l glucosa más 10 g/l Solka floc (cuando se
usa cbh1 u otro promotor de celulasa), 10 g/l de xilano (cuando se
usó el promotor xln2) u otra fuente de carbono compatible con el
promotor dirigiendo la expresión de la
beta-glucosidasa. La fuente de carbono puede
esterilizarse separadamente como una solución acuosa a pH 2 a 7 y
añadirse al medio restante.
Con base en región de codificación de la
beta-glucosidasa madura fue situada abajo del
promotor cbh1 y de la señal de secreción en la construcción genética
mostrada en la Figura 1 y descrita en el Ejemplo 5
(pCBG1-TV). El vector fue introducido en T.
reesei RutC30 por bombardeo de partículas (Ejemplo 9) y el
transformante resultante RC-300, produjo 7 veces más
beta-glucosidasa que la cepa original (Tabla 2).
Este incremento de 7 veces resultó de la incorporación de una copia
del vector de transformación en los cromosomas huéspedes (Ejemplo
10, Tabla 1). El mayor incremento en la actividad de la
beta-glucosidasa obtenida de una copia de una
construcción en la cual la beta-glucosidasa se
expresa usando el promotor cbh1 y la señal de secreción, sugiere que
esta estrategia es mejor que la empleada por Barnett et al.
y Fowler et al. La cual se tradujo en un incremento de sólo 5
veces en la actividad de la beta-glucosidasa a
partir de 5-10 copias de una construcción en la cual
la beta-glucosidasa es expresada a partir de su
propio promotor y señal de secreción. Sin embargo, el incremento de
7 veces resultante en la actividad de la
beta-glucosidasa no fue todavía suficiente para
aliviar la disminución de la beta-glucosidasa para
la hidrólisis de la celulosa.
La cepa no transformada de T. reesei
RutC30 fue transformada por bombardeo de partículas (Ejemplo 9) con
una construcción genética del vector
pC/XBG(Xba1)-TV que codifica la enzima
beta-glucosidasa madura de T. reesei
enlazada a la señal de secreción de xilanasa II de T.
reesei.
La cepa no transformada RutC30 y la cepa
transformada resultante de este huésped, RC-302,
fueron cultivadas usando los procedimientos del Ejemplo 11 con 10
g/L Solka floc y 5 g/L glucosa como fuentes de carbono. Los
resultados se muestran en la Tabla 2.
La cepa no transformada produjo 0.14 IU de
beta-glucosidasa por mg de proteína.
La transformante RC-302 con el
promotor CBH1 y la señal de secreción de la xilanasa II produjeron
19 IU/mg de beta-glucosidasa. Esto representa
aproximadamente una mejora de 136 veces frente a la cepa no
transformada, lo que es muy significativo para un proceso celulosa
a etanol.
La transformante RC-302 con el
promotor CBH1 y la señal de secreción de la xilanasa II produjeron
aproximadamente 19 veces más actividad de
beta-glucosidasa que la mejor transformante RutC30
con el promotor CBH1 y la señal de secreción CBH1.
| Producción de \beta-glucosidasa en cepas de T.reesei RutC30, RC-300 y RC-302 en cultivos en | |||
| matraz de 150 ml | |||
| Cepa | Promotor | Señal de secreción | -g (UI/mg) |
| RutC30 | Bgl1 | bgl1 | 0.14 |
| RC-300 | Cbh1 | cbh1 | 1.0 |
| RC-302 | Cbh1 | xln2 | 19 |
El vector pCBG1-TV, en el cual la
beta-glucosidasa se expresa a partir del promotor
CBH1 y la señal de secreción (Figura 1 y Ejemplo 5), fue introducido
en T. reesei M2C38 por bombardeo de partículas (Ejemplo 9).
La transformante resultante RM4-300 produjo
aproximadamente 7-12 veces más actividad
beta-glucosidasa que la cepa original
(Tabla 3).
(Tabla 3).
La cepa no transformada de T. reesei
M2C38 fue transformada mediante bombardeo de partículas (Ejemplo
9) con una construcción genética del vector
pC/XBG(Xba1)-TV que codifica la enzima
beta-glucosidasa madura del T. reesei unida
a la señal de secreción de la xilanasa II de T. reesei.
La cepa no transformada M2C38 y la cepa
transformada de este huésped, RM4-302, fueron
cultivadas usando los procedimientos del Ejemplo 11 con 10 g/L
Solka floc y 5 g/L de glucosa como fuentes de carbono. Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
La cepa no transformada produjo 0.35 UI de
beta-glucosidasa por mg de proteína.
El transformante RM4-302 con el
promotor CBH1 y la señal de secreción de la xilanasa II produjeron
14.1 IU/mg de beta-glucosidasa. Esto representa un
mejoramiento de aproximadamente de 40 veces de la cepa no
transformada, lo que es muy significativo para un proceso
celulosa-etanol.
EL transformante RM4-302 con el
promotor CBH1 y la señal de secreción de la xilanasa II produjeron
aproximadamente 3 veces más beta-glucosidasa que el
transformante con el promotor CBH1 y la señal de secreción CBH1.
Ésta es una diferencia significativa, ya que el promotor CBH1 y la
señal de secreción no llevan a producción suficiente de
beta-glucosidasa para suprimir completamente la
producción de celobiosa en hidrólisis.
| Producción de \beta-glucosidasa en cepas de T.reesei M2C38, RM4-300 y RM4-302 en cultivos en | |||
| matraz de 150 ml | |||
| Cepa | Promotor | Señal de secreción | -g (UI/mg) |
| M2C38 | Bgl1 | bgl1 | 0.35 |
| RM4-300 | Cbh1 | cbh1 | 4.5 |
| RM4-302 | Cbh1 | xln2 | 14.1 |
La cepa M2C38 no transformada de T. reesei
fue transformada mediante bombardeo de partículas (Ejemplo 9) con
una construcción genética del vector pXBG1-TV que
codifica la beta-glucosidasa madura de T.
reesei enlazada al promotor de xilanasa y a la señal de
secreción.
La cepa no transformada M2C38 y una cepa
transformada de este huésped, RM4-301, fueron
cultivadas usando los procedimientos del Ejemplo 11 con 5 g/L
glucosa y 10 g/L de xilano como fuente de carbono. Los resultados
se muestran en la Tabla 4.
La cepa no transformada produjo 0.16 UI de
beta-glucosidasa por mg de proteína. El
transformante RM4-301 con el promotor de xilanasa II
y la señal de secreción de la xilanasa II produjeron 20.4 IU/mg de
beta-glucosidasa. Esto representa un mejoramiento
de aproximadamente 127 veces sobre la cepa no transformada, lo que
es muy significativo para un proceso
celulosa-etanol.
| Producción de \beta-glucosidasa en cepas de T. reesei M2C38 y RM4-301 con xilano en cultivos en | |||
| matraz de 150 ml | |||
| Cepa | Promotor | Señal de secreción | -g (UI/mg) |
| M2C38 | Bgl1 | bgl1 | 0.16 |
| RM4-301 | Xln2 | xln2 | 20.4 |
La cepa no transformada de T.reesei BTR48
fue transformada mediante bombardeo de partículas con una
construcción genética del vector pXBG1-TV que
codifica la beta-glucosidasa de T. reesei
madura enlazada con el promotor de xilanasa y la señal de
secreción.
La cepa no transformada BTR-48 y
una cepa transformada de este huésped, RB48-301,
fueron cultivadas usando los procedimientos del ejemplo 11 con 5 g/L
glucosa y 10 g/L Solka floc como fuente de carbono. Los resultados
se muestran en la Tabla 5.
La cepa no transformada produjo 0.16 UI de
beta-glucosidasa por mg. El transformante
RB48-301 con el promotor de xilanasa II y la señal
de secreción de xilanasa II produjeron aproximadamente 21.9 IU/mg
de beta-glucosidasa. Esto representa un
mejoramiento de aproximadamente 136 veces sobre la cepa no
transformada, lo que es muy significativo para un proceso
celulosa-etanol.
| Producción de \beta-glucosidasa en cepas de T.reesei BTR48 y RB48-301 con Solka floc en cultivos en | |||
| matraz de 150 ml | |||
| Cepa | Promotor | Señal de secreción | -g (UI/mg) |
| BTR48 | bgl1 | bgl1 | 0.16 |
| RB48-301 | xln2 | xln2 | 21.9 |
La actividad de beta-glucosidasa
de una enzima se mide usando los procedimientos de Ghose,
"Measurement of Celulasa Activities," Pure and Appl. Chem.,
59:257-268 (1987), como sigue. La muestra de enzima
se diluye hasta varias concentraciones en regulador de citrato de
sodio 50 mM, pH 4.8, a un volumen de 0.5 ml. Un rango conveniente
de diluciones es 3 a 24 veces la actividad estimada de la muestra.
Por ejemplo, una muestra de 10 unidades/ml debería ser diluida de
1.30 hasta 1:240. Independientemente de las diluciones usadas, se
añade una muestra de 0.5 ml del regulador de citrato a cada tubo de
enzima. El sustrato se prepara como celobiosa 15 mM (5.13 g/L). Las
soluciones de enzima diluidas y el sustrato se precalientan
separadamente a 50ºC durante 5 minutos, luego se añade una alícuota
de 0.5 ml del sustrato a cada tubo con enzima. Los tubos de ensayo
se incuban durante 30 minutos a 50ºC. Las reservas de enzima
diluida y el sustrato se precalientan separadamente a 50ºC durante
5 minutos, luego se añade una alícuota de 0.5 ml del sustrato a cada
tubo con enzima. Los tubos de prueba se incuban durante 30 minutos
a 50ºC. La reacción es terminada sumergiendo cada tubo en un baño
de agua hirviente durante 5 minutos. Los tubos son mezclados
mediante vortex, y la cantidad de azúcar producida por cada muestra
de enzima se mide en un analizador de glucosa YSI, teniendo en
cuenta la pequeña señal de fondo de la enzima.
Una unidad de actividad de
beta-glucosidasa se define como el número de
micromoles de glucosa producidos por minuto. L actividad se calcula
con base en la Ecuación 1 usando el valor promedio de cada una de
las diluciones lo cual produce de 0.15 a 1.5 mg/ml de glucosa.
(1)A =
C*G*D
donde
A = actividad, unidades/ml de
beta-glucosidasa (o micromoles de glucosa/ml/min) C
= 16.7 micromoles/mg/min
G = glucosa producida, mg/ml
D = dilución de la enzima, sin dimensiones
El propósito de este experimento era demostrar la
efectividad de la beta-glucosidasa hecha mediante
la Trichoderma transformada para mejorar la hidrólisis de la
celulosa.
Las enzimas usadas para este estudio fueron Iogen
Celulasa, una enzima celulasa comercial de Iogen Corporation, y el
producto de RM4-302 cultivado en un vaso de
fermentación de 30 litros usando los procedimientos descritos en el
Ejemplo 11, con dos veces el nivel de concentración de los medios
listados en ese ejemplo. La concentración enzimática fue
incrementada por ultrafiltración a través de una membrana Amicon
10,000 MWCO y normalizada hasta la misma actividad de celulasa de
la Iogen Celulasa. Las actividades de las dos enzimas se muestran en
la Tabla 6.
La celulosa usada para este estudio consistía de
cascarillas de avena, preparadas según los procedimientos de Foody,
et al, Improved Pretreatment Process for Conversion of
Celulose en Fuel Etanol, US patent application filed June 9, 1997,
del Ejemplo 6.
| Actividades enzimáticas usadas en el estudio | |||
| Enzima | Beta-glucosidasa UI/ml | Celulasa FPU/ml | BG UI/mg @ 10 FPU/g |
| Iogen Celulasa | 112 | 140 | 8.0 |
| RM4-301 | 1170 | 140 | 83.6 |
Muestras de 0.5 g celulosa de cascarillas de
avena pretratadas fueron añadidas a matraces de 25 ml con 49.5 g de
regulador de citrato de sodio 0.05 molar, pH 4.8.
Las enzimas fueron añadidas al matraz en una
cantidad correspondiente a 10 FPU por gramo de celulosa. Las dosis
resultantes de beta-glucosidasa se muestran en la
Tabla 6.
En ambos casos, los matraces fueron agitados a
250 RPM y mantenidos a 50ºC durante 34 horas. En este momento, se
tomaron muestras, se filtraron para remover la celulosa insoluble y
se analizaron sus concentraciones de glucosa y celobiosa usando
métodos de análisis de carbohidratos estándar por HPLC de pulsación
amperométrica Dionex. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
La Iogen Celulasa, Trichoderma celulasa
convencional, convirtió sólo el 45% de la celulosa en glucosa. Esto
es inaceptablemente bajo para un proceso de etanol. La acumulación
de celobiosa es significativa, representando el 13% de la
celulosa.
La celulasa con beta-glucosidasa
mejorada se comportó mucho mejor. La conversión de celulosa en
glucosa alcanzó el 84%. La razón para este excelente rendimiento
fue que la acumulación de celobiosa fue despreciable, debido a la
abundancia de beta-glucosidasa.
| Hidrotrópico de celulosa mejorada por alta beta-glucodidasa | ||
| Enzima | Glucosa (% de celulosa) | Celobiosa (% de celulosa) |
| Iogen celulasa | 45 | 13 |
| RM4-301 | 84 | < 1 |
El análisis de transferencias de Southern fue
llevado a cabo sobre M2C38 y RutC30 DNA digeridos con seis
diferentes enzimas de restricción que cortaron a ambos dentro y
fuera de las regiones que codifican la
beta-glucosidasa madura y la señal de secreción de
la xilanasa (Ejemplo 8) para determinar si existe cualquier
polimorfismo entre las dos cepas digeridas con seis diferentes
restricciones. Como se muestra en las Figuras 4 y 5, se encontró que
las bandas idénticas hibridizaban con sondas marcadas preparadas a
partir de fragmentos de M2C38 que codificaban la enzima
beta-glucosidasa madura y el promotor de la
xilanasa II más la señal de secreción, indicando que no había
polimorfismos y una alto grado de homología en la secuencia de ADN
en estas regiones, entre las dos cepas.
Las sondas e iniciadores usados para identificar
y clonar las secuencias de ADN M2C38 necesarias para generar las
construcciones descritas en los Ejemplos 5-7 se
basaron en secuencias de ADN publicadas de los diversos genes a
partir de diferentes cepas de Trichoderma reesei incluyendo
QM9414 (pgk, Vanhanen et al., 1989 and cbh2, Chen et
al.), los derivados de QM9414, VTT-D79125
(xln2, Saarelainen et al.) y L27 (cbh1, Shoemaker et
al.), y el derivado de la cepa RL-P37, P40
(bgl1, Barnett et al.). Todas estas cepas, igual que M2C38,
son derivadas de la cepa QM6a (Carter, Allison, Rey y
Dunn-Coleman, "Chromosomal and genetic analysis
of the electrophoretic karyotype of Trichoderma reesei:
mapping of the celulasa and xylanase genes", Molecular
Microbiology 6: 2167-2174, 1992).
Puesto que RutC30 es el progenitor derivado de
QM6a de la M2C38, los inventores confían en que el método como se
describe en los Ejemplos 2-4, para el aislamiento
de las secuencias de genes usados para hacer los vectores de
expresión de la beta-glucosidasa descritos en los
Ejemplos 5-7, trabajarán igualmente bien para el
aislamiento de las mismas secuencias de genes de ambos, M2C38 y
RutC30. Con base en el linaje de cepas antes descrito y en los datos
de transferencias Southern, los inventores tienen también un alto
grado de confianza en que las construcciones genéticas preparadas a
partir de RutC30 ADN contendrán los segmentos de ADN idénticos que
codifican la enzima beta-glucosidasa madura y la
señal de secreción de la xilanasa II como los preparados a partir
del ADN M2C38. Puesto que las construcciones preparadas a partir de
ADN M2C38 (Ejemplos 5-7) resultan en una expresión
mejorada de la beta-glucosidasa en ambos, M2C38 y
RutC30 (Ejemplos 12-14), los inventores también
confían en qué las construcciones hechas a partir de RutC30 ADN
resultarán en similares niveles de mejoramiento de la actividad de
la beta-glucosidasa en ambos, RutC30 y M2C38.
Claims (20)
1. Una construcción genética que comprende:
un promotor seleccionado del grupo consistente de
los promotores cbh1, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2 de
Trichoderma, en asociación operativa con una señal de
secreción de un gen de xilanasa II de la Familia 11, y una región de
codificación de beta-glucosidasa madura de un gen
de beta-glucosidasa seleccionado del grupo
consistente de los genes de beta-glucosidasa de
Trichoderma, Aspergillus, Humicola, y Fusarium.
2. La construcción genética de la reivindicación
1, donde dicho gen de xilanasa de la Familia 11 comprende un gen de
xilanasa de Trichoderma.
3. La construcción genética de la reivindicación
2, en donde dicho gen de xilanasa de Trichoderma comprende
un gen de xilanasa I Trichoderma o un gen de xilanasa II de
Trichoderma.
4. La construcción genética de la reivindicación
3, donde dicha región de codificación de
beta-glucosidasa madura comprende una región de
codificación de beta-glucosidasa madura de un gen
de beta-glucosidasa de Trichoderma.
5. La construcción genética de la reivindicación
4, donde dicho gen de beta-glucosidasa de
Trichoderma comprende un gen bgl1 Trichoderma.
6. Un microbio genéticamente modificado que
comprende:
un microbio seleccionado del grupo consistente de
Trichoderma, Humicola, y Fusarium, Streptomyces,
Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas, y Aspergillus,
y la construcción genética de la reivindicación 1 que ha sido
introducida en dicho microbio,
en donde dicho microbio genéticamente modificado
produce un nivel incrementado de beta-glucosidasa
de al menos 10 veces con respecto a dicho microbio.
7. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 6, donde dicho microbio es un microbio de
Trichoderma.
8. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 7, donde dicho microbio Trichoderma es un
microbio Trichoderma reesei.
9. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 6, donde dicho microbio genéticamente modificado
produce un nivel incrementado de beta-glucosidasa
de al menos 40 veces.
10. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 6, donde dicho microbio genéticamente modificado
produce un nivel incrementado de beta-glucosidasa
de al menos 120 veces.
11. El microbio genéticamente modificado de
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde dicho microbio
comprende de forma natural un gen de xilanasa de la Familia 11, y
dicha señal de secreción de xilanasa es nativa en dicho microbio a
partir del cual se deriva dicho microbio genéticamente
modificado.
12. El microbio genéticamente modificado de
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde dicha señal de
secreción de xilanasa es una señal de secreción de un gen de
xilanasa de la Familia 11.
13. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 12, donde dicho gen de xilanasa de la Familia 11 es
un gen de xilanasa de Trichoderma.
14. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 13, donde dicho gen de xilanasa de
Trichoderma comprende un gen de xilanasa I de
Trichoderma o un gen de xilanasa II de
Trichoderma.
15. El microbio genéticamente modificado de la
reivindicación 13, donde dicha región de codificación de
beta-glucosidasa madura comprende una región de
codificación de beta-glucosidasa madura de un gen
bgl1 de Trichoderma bglI.
16. El microbio genéticamente modificado de
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, donde dicha región de
codificación de beta-glucosidasa madura comprende
una región de codificación de beta-glucosidasa
madura de un gen de beta-glucosidasa de
Trichoderma.
17. Un método para producir
beta-glucosidasa, que comprende transformar un
microbio con la construcción genética de la reivindicación 1 para
crear un microbio genéticamente modificado; y el uso del microbio
genéticamente modificado para producir un nivel incrementado
relativo de beta-glucosidasa de al menos 10 veces
con respecto al microbio antes de ser transformado.
18. El método de la reivindicación 17, donde
dicha etapa de transformación comprende transformar un microbio
seleccionado del grupo consistente de Trichoderma, Humicola,
y Fusarium, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus,
Cellulomonas, y Aspergillus, para crear un microbio
genéticamente modificado.
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 18, donde dicha etapa de uso comprende usar
el microbio genéticamente modificado para producir un nivel
incrementado de beta-glucosidasa de al menos 40
veces.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, donde dicha etapa de uso comprende usar
el microbio genéticamente modificado para producir un nivel
incrementado de beta-glucosidasa de al menos 120
veces.
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