JP2612362B2 - トリコデルマ・ビリデ由来のｄｎａ断片 - Google Patents
トリコデルマ・ビリデ由来のｄｎａ断片Info
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- JP2612362B2 JP2612362B2 JP7898290A JP7898290A JP2612362B2 JP 2612362 B2 JP2612362 B2 JP 2612362B2 JP 7898290 A JP7898290 A JP 7898290A JP 7898290 A JP7898290 A JP 7898290A JP 2612362 B2 JP2612362 B2 JP 2612362B2
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- Japan
- Prior art keywords
- dna fragment
- trichoderma viride
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- protein
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はトリコデルマ・ビリデにおけるプロモーター
及び発現・分泌に必要な配列を有するDNA断片を利用し
たトリコデルマ・ビリデを宿主とする有用蛋白質及びペ
プチドの生産に関する。
及び発現・分泌に必要な配列を有するDNA断片を利用し
たトリコデルマ・ビリデを宿主とする有用蛋白質及びペ
プチドの生産に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 遺伝子工学技術において、蛋白質の生産量はいくつか
の因子によって決定されている。例えば次のような因子
がある。
の因子によって決定されている。例えば次のような因子
がある。
転写の制御領域（オペレーターやプロモーターを含む
領域）および転写終結配列の構造。
領域）および転写終結配列の構造。
SD（Shine−Dalgarno）配列を含むリボソーム認識の
構造。
構造。
アミノ酸を規定するコドンの種類とその使用頻度とre
ading frame（読み枠）。
ading frame（読み枠）。
蛋白質の分泌などの局在化（分解からの保護）の問
題。
題。
遺伝子の量（コピー数）の問題。
これらのうち、特にのプロモーター領域、及び
のシグナルペプチドは成熟蛋白質をコードする遺伝子の
上流に位置し、工業的見地から蛋白質の大量生産にとっ
て重要な役割を果たしていることが知られている。
のシグナルペプチドは成熟蛋白質をコードする遺伝子の
上流に位置し、工業的見地から蛋白質の大量生産にとっ
て重要な役割を果たしていることが知られている。
トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）はセル
ラーゼ生産菌として有名であり、著量の蛋白質を菌体外
に分泌する。この生産蛋白質組成のち、量的に最大のも
のはセロビオハイドラーゼＩ（以下CBH Iと称す）であ
り、この菌において、このように大量の蛋白質の生産に
関与するプロモーター及び発現・分泌に必要な配列は知
られていなかった。
ラーゼ生産菌として有名であり、著量の蛋白質を菌体外
に分泌する。この生産蛋白質組成のち、量的に最大のも
のはセロビオハイドラーゼＩ（以下CBH Iと称す）であ
り、この菌において、このように大量の蛋白質の生産に
関与するプロモーター及び発現・分泌に必要な配列は知
られていなかった。
そこで本発明者らは、トリコデルマ・ビリデ由来のCB
H Iの生産に関するプロモーター及び発現・分泌に必要
な配列を有すDNA断片を得るべく検討を行った。
H Iの生産に関するプロモーター及び発現・分泌に必要
な配列を有すDNA断片を得るべく検討を行った。
（課題を解決するための手段） 本発明は、第１図に示したDNA配列を含有し、トリコ
デルマ・ビリデにおいて、該遺伝子の下流に存在する構
造遺伝子の強い発現能を有するDNA断片に関する。又、
該遺伝子の下流に構造遺伝子を容易に結合すべく、第１
図の408番目のＴをＡに部分変異させ、Xho I制限酵素切
断部位を導入したDNA断片に関する。
デルマ・ビリデにおいて、該遺伝子の下流に存在する構
造遺伝子の強い発現能を有するDNA断片に関する。又、
該遺伝子の下流に構造遺伝子を容易に結合すべく、第１
図の408番目のＴをＡに部分変異させ、Xho I制限酵素切
断部位を導入したDNA断片に関する。
本発明のDNA断片は第１図に示す配列、及び第１図の4
08番目のＴをＡに部分変異させたDNA断片を有するが、
その機能を有す限り配列の一部が欠失、置換あるいは付
加されたものでもよい。
08番目のＴをＡに部分変異させたDNA断片を有するが、
その機能を有す限り配列の一部が欠失、置換あるいは付
加されたものでもよい。
トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼとして例えば
メイセラーゼ（明治製菓社製）があり、これを出発原料
としてCBH Iを精製し、CBH IのＮ−末端のアミノ酸配列
の決定し、実施例にしたがってトリコデルマ・ビリデ由
来（セルラーゼ、化学の領域選書８、西澤一俊著（南江
堂）、115〜119頁及びセルラーゼ、村尾沢夫他（講談社
サイエンティフィック）、125〜127頁参照）の染色体DN
AからCBH I関連の遺伝子をクローニングした。
メイセラーゼ（明治製菓社製）があり、これを出発原料
としてCBH Iを精製し、CBH IのＮ−末端のアミノ酸配列
の決定し、実施例にしたがってトリコデルマ・ビリデ由
来（セルラーゼ、化学の領域選書８、西澤一俊著（南江
堂）、115〜119頁及びセルラーゼ、村尾沢夫他（講談社
サイエンティフィック）、125〜127頁参照）の染色体DN
AからCBH I関連の遺伝子をクローニングした。
実施例１ （１）トリコデルマ・ビリデのCBH Iの精製 Biochem.Biophys.Acta523,147（1978）及びBiochem.B
iophys.Acta446,371（1976）の方法に従って精製した。
アビセルカラム（15×1.5cm）に1gのトリコデルマ・ビ
リデ由来のセルラーゼであるメイセラーゼ（明治製菓社
製）を吸着させ、50mM酢酸バッファーで洗い、水で溶出
した。水溶出画分を回収し、蛋白質の回収率は約70％で
あった。
iophys.Acta446,371（1976）の方法に従って精製した。
アビセルカラム（15×1.5cm）に1gのトリコデルマ・ビ
リデ由来のセルラーゼであるメイセラーゼ（明治製菓社
製）を吸着させ、50mM酢酸バッファーで洗い、水で溶出
した。水溶出画分を回収し、蛋白質の回収率は約70％で
あった。
水溶出画分のうち10mg蛋白質をDEAE−SephadexA50カ
ラム（ファルマシア社製）（８×2.8cm）に吸着させ、p
H5.0のコハク酸バッファーで洗い、０〜0.5Mの塩化ナト
リウム濃度勾配で溶出し、主要な蛋白質画分を回収し
た。蛋白質の回収率は65％であつた。さらに同じ操作を
繰り返したところ、蛋白質の回収率は79％であった。電
気泳動で分子量72,000を示すCBH Iを5mg精製した。
ラム（ファルマシア社製）（８×2.8cm）に吸着させ、p
H5.0のコハク酸バッファーで洗い、０〜0.5Mの塩化ナト
リウム濃度勾配で溶出し、主要な蛋白質画分を回収し
た。蛋白質の回収率は65％であつた。さらに同じ操作を
繰り返したところ、蛋白質の回収率は79％であった。電
気泳動で分子量72,000を示すCBH Iを5mg精製した。
（２）CBH IのＮ−末端アミノ酸配列の決定 精製されたCBH IのＮ−末端アミノ酸のピログルタミ
ン酸をpyroglutamate aminopeptidase処理法（Biochem.
Biophys.Res.commun.81,176〜185（1978））で除いてか
ら、Applied Biosystems477A protein sequencer（Appl
ied Biosystems社製）によってＮ−末端16個のアミノ酸
配列を次の通り決定した。
ン酸をpyroglutamate aminopeptidase処理法（Biochem.
Biophys.Res.commun.81,176〜185（1978））で除いてか
ら、Applied Biosystems477A protein sequencer（Appl
ied Biosystems社製）によってＮ−末端16個のアミノ酸
配列を次の通り決定した。
（３）CBH Iの遺伝子のクローニング トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の染色
体DNAをprotoplast−SDS−phenol法（Biochem.13,3606
〜3615（1974））で分離し、制限酵素BamH Iで部分分解
し、得られたDNA断片をEMBL3 DNA（Stratagene社製）に
挿入してから、λファージのin vitro packagingの系
（Stratagene Co.の“Giga pack plus"system）を利用
して、遺伝子のライブラリーを作成した。
体DNAをprotoplast−SDS−phenol法（Biochem.13,3606
〜3615（1974））で分離し、制限酵素BamH Iで部分分解
し、得られたDNA断片をEMBL3 DNA（Stratagene社製）に
挿入してから、λファージのin vitro packagingの系
（Stratagene Co.の“Giga pack plus"system）を利用
して、遺伝子のライブラリーを作成した。
CHB IのＮ−末端７番目から16番目までのアミノ酸配
列に基づいて、30個の塩基からなる、５′CAA TCG GAG
ACT CAC CCG CCT CTG ACA TGG3′の配列をもつDNAを合
成した。これをプローブとし、上記のトリコデルマ・ビ
リデ遺伝子ライブラリーから常法によりCBH Iの遺伝子
をクローン化した。
列に基づいて、30個の塩基からなる、５′CAA TCG GAG
ACT CAC CCG CCT CTG ACA TGG3′の配列をもつDNAを合
成した。これをプローブとし、上記のトリコデルマ・ビ
リデ遺伝子ライブラリーから常法によりCBH Iの遺伝子
をクローン化した。
また、M13ファージを用いてジデオキシ法（Science21
4,1205〜1210（1981））でCBH Iの遺伝子の全塩基配列
を決定した。その配列と既に報告されているトリコデル
マ・リーセイ（Trichoderma reesei）のCBH Iの配列（B
io/Technology1,691〜696（1983））と比較することに
よって、本実施例の遺伝子は17個のアミノ酸からなるシ
グナルペプチドと496個のアミノ酸からなる蛋白質をコ
ードし、２つのイントロンを含んでいることが分かっ
た。トリコデルマ・リーセイのCBH Iとのホモロジーは
５′非翻訳領域で67％、イントロン１で58％、イントロ
ン２で66％（３′非翻訳領域で低い）であった。又、ア
ミノ酸配列でのホモロジーは95％であった。５′上流に
強いプロモーター活性に重要と考えられるTATA、CTリッ
チな領域があった（第１図）。
4,1205〜1210（1981））でCBH Iの遺伝子の全塩基配列
を決定した。その配列と既に報告されているトリコデル
マ・リーセイ（Trichoderma reesei）のCBH Iの配列（B
io/Technology1,691〜696（1983））と比較することに
よって、本実施例の遺伝子は17個のアミノ酸からなるシ
グナルペプチドと496個のアミノ酸からなる蛋白質をコ
ードし、２つのイントロンを含んでいることが分かっ
た。トリコデルマ・リーセイのCBH Iとのホモロジーは
５′非翻訳領域で67％、イントロン１で58％、イントロ
ン２で66％（３′非翻訳領域で低い）であった。又、ア
ミノ酸配列でのホモロジーは95％であった。５′上流に
強いプロモーター活性に重要と考えられるTATA、CTリッ
チな領域があった（第１図）。
本実施例によりクローン化したDNAを使いプロモータ
ーを含むEcoR I−EcoR Iの1.2Kb断片をpUC118（宝酒造
製）のEcoR Iサイトに挿入した。このプラスミドを常法
によりエシェリヒア・コリJM103に導入した。この菌は
工業技術院微生物工業研究所にEsherichia coli JM103/
pCE1として寄託されている（FERM P−11394）。
ーを含むEcoR I−EcoR Iの1.2Kb断片をpUC118（宝酒造
製）のEcoR Iサイトに挿入した。このプラスミドを常法
によりエシェリヒア・コリJM103に導入した。この菌は
工業技術院微生物工業研究所にEsherichia coli JM103/
pCE1として寄託されている（FERM P−11394）。
このプラスミドのSal Iサイトの下流20bpぐらいにATG
（start codon）がある。EcoR I−Hind III間にpUC118
のマルチクローニングサイトがある。
（start codon）がある。EcoR I−Hind III間にpUC118
のマルチクローニングサイトがある。
実施例２ シグナルペプチド部位におけるXho Iサイトの作製 ５′CTA−CTG−CTC−GAG−CTC−AGT−CGG3′の配列を
有する合成プローブを作成した。この合成プローブと実
施例１の（３）のEcoR I−EcoR Iの1.2Kb断片を使い、A
mersham社のcligonucleotide−directed in vitro muta
genesis system Version2（製品番号RPN.1523）に従っ
て部位特異的変異を生じたDNA断片を得た。即ち、第１
図の第408番目のＴをＡに部分変異させた。
有する合成プローブを作成した。この合成プローブと実
施例１の（３）のEcoR I−EcoR Iの1.2Kb断片を使い、A
mersham社のcligonucleotide−directed in vitro muta
genesis system Version2（製品番号RPN.1523）に従っ
て部位特異的変異を生じたDNA断片を得た。即ち、第１
図の第408番目のＴをＡに部分変異させた。
（発明の効果） 本発明により、トリコデルマ・ビリデを宿主として異
種蛋白質の生産が可能となった。
種蛋白質の生産が可能となった。
第１図：トリコデルマ・ビリデ中のCBH I関連DNA（クロ
ーニングした1.2kbDNA断片）のうちプロモーター及び発
現・分泌に必要な配列に関する部分。アンダーライン部
分はシグナルペプチドをコードする部分である。
ーニングした1.2kbDNA断片）のうちプロモーター及び発
現・分泌に必要な配列に関する部分。アンダーライン部
分はシグナルペプチドをコードする部分である。
Claims (2)
- 【請求項１】トリコデルマ・ビリデ中のCBH I関連遺伝
子より得られたプロモーター及び発現・分泌に必要な下
記の遺伝子配列を有するDNA断片。 - 【請求項２】請求項１記載のDNA断片の第408番目のＴを
Ａに部分変異させ、Xho I制限酵素切断部位を導入した
下記の遺伝子配列を有するDNA断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7898290A JP2612362B2 (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | トリコデルマ・ビリデ由来のｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7898290A JP2612362B2 (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | トリコデルマ・ビリデ由来のｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03280886A JPH03280886A (ja) | 1991-12-11 |
| JP2612362B2 true JP2612362B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=13677099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7898290A Expired - Fee Related JP2612362B2 (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | トリコデルマ・ビリデ由来のｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2612362B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1198939C (zh) * | 1996-09-13 | 2005-04-27 | 明治制果株式会社 | 来自绿色木霉的纤维素酶cbh1基因的调控序列以及利用该序列的蛋白质或多肽的大量生产体系 |
| US6015703A (en) * | 1998-03-10 | 2000-01-18 | Iogen Corporation | Genetic constructs and genetically modified microbes for enhanced production of beta-glucosidase |
-
1990
- 1990-03-29 JP JP7898290A patent/JP2612362B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03280886A (ja) | 1991-12-11 |
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