JP2002501512A - 葉酸アンタゴニストと担体とを含有してなるコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、葉酸アンタゴニストのＤ−エナンチオマーと担体とを含有してなるコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、かかるコンジュゲートの製造法およびその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 葉酸アンタゴニストと担体とを含有してなるコンジュゲート 本発明は、葉酸アンタゴニストと担体とを含有してなるコンジュゲート、かか るコンジュゲートの製造方法ならびにその使用に関する。 葉酸は、細胞内におけるメチル基転移に重要であり、したがって細胞の生育に 重要である、天然に存在する化合物である。葉酸は、下記式： を有する。 グルタミン酸のＣＨ基は、不斉Ｃ原子を示す。したがって、葉酸は、２つのエ ナンチオマー型、すなわちＤ−エナンチオマーおよびＬ−エナンチオマーとして 存在する。 しかしながら、これらのエナンチオマー型のうちＬ−エナンチオマーだけが細 胞内に見出され、Ｄ−エナンチオマーでなく、このＬ−エナンチオマー型のみが 葉酸の作用を担いうる。この理由は、葉酸のＬ−エナンチオマーはいかに取り込 もうが該葉酸のＤ−エナンチオマーは取り込まない葉酸レセプターにより、葉酸 が細胞内に吸収されることにある。 葉酸アンタゴニストは、葉酸から誘導体化されるが、その標的領域、すなわち 細胞では、後者を中和する化合物である。したかって、葉酸アンタゴニストは、 Ｌ−エナンチオマーとして存在するが、Ｄ−エナンチオマーとしては存在しない 。 葉酸アンタゴニストの例示は、アミノプテリン、およびメトトレキサートとも 称されるアメトプテリンである。 メトトレキサート、すなわちアメトプテリンのＬ−エナンチオマーは、しばし ば、腫瘍の治療および炎症の治療に用いられる。しかしながら、メトトレキサー トは健常組織にも吸収され、該健常組織に対して毒性であるため、重大な副作用 がこれに関して示される。独国特許出願公開第ＤＥ−Ａ−４１ ２２ ２１０． ５号明細書だけが健常組織よりも腫瘍によく吸収され、そのため毒性が少ない、 メトトレキサートとアルブミンとのコンジュゲートを記載する。それでもなお、 よりいっそう弱い副作用を有する薬剤に関する大きな要求がある。 したがって、本発明の目的は、患った組織、特に腫瘍の治療用の、ほとんど副 作用をもたない薬剤を提供することにある。 本発明によれば、これは、請求の範囲の主題により、達成される。 すなわち、本発明の主題は、葉酸アンタゴニストのＤ−エナンチオマーと担体 とを含有してなるコンジュゲートである。 本発明は、担体を有するコンジュゲート中の葉酸アンタゴニストのＤ−エナン チオマーが、患った組織、特に腫瘍細胞により、好んで吸収され、かつ該患った 組織における疾患に対して効果を示すという本出願人の洞察に基づく。さらに、 本出願人は、葉酸アンタゴニストのＤ−エナンチオマー単独、すなわち本発明の コンジュゲートで与えられたものは、健常組織に副作用を持たないことを認識し た。 「コンジュゲート」という用語は、葉酸アンタゴニストと担体とが、例えば、 アミド結合および／またはエステル結合を介して、および／またはリンカーを介 して、共有結合することを示す。 「葉酸アンタゴニストのＤ−エナンチオマー」という用語は、葉酸から得られ 、葉酸のアンタゴニストとして機能し、Ｄ−エナンチオマーとして存在するいか なる種類の化合物をも含有する。成分としては、葉酸アンタゴニストのＤ−エナ ンチオマーは、葉酸の構成要素に関して、化学的に改変された、即ち修飾された 、プテリジン、特にプテリン、ｐ−アミノ安息香酸およびＤ−アミノ酸、特にＤ −グルタミン酸を含有する。かかる改変は、例えば、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基、特に メチル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどのハロゲン原子、ＯＨ−基およびＮＨ₂−基 によるＨ原子の置換、前記アルキル基、ＮＨ₂−基、Ｈ−原子およびハロゲン原 子によるＯＨ基の置換、ならびに前記アルキル基、ＯＨ−基、Ｈ−原子およびハ ロゲン原子によるＮＨ₂−基の置換などの置換である。さらに、グルタミン酸の 酸性基の１つもしくは両方は、酸誘導体、例えば、エステルまたはアミドとして 存在しうる。前記改変の１以上は、本発明により用いられる葉酸アンタゴニスト に存在しうる。 好ましくは、葉酸アンタゴニストである、Ｄ−アメトプテリン（下記にＤ−メ トトレキサートとして示す） Ｄ−アミノプテリン およびＤ−ｅ，ｔ−ＦＭＴＸ〔グルタミン酸（Ｇｌｕ）がＤ−エリトロ、トレオ −４−フルオロ−Ｇｌｕにより置換されたメトトレキサートアナログ〕。 １以上の葉酸アンタゴニストは、本発明のコンジュゲートに存在しうる。複数 存在する場合、同時にこれらは同一であっても互いに異なっていてもよい。 「担体」という用語は、患った組織、例えば、腫瘍病巣または炎症病巣に前記 コンジュゲートを蓄積するにに適するいかなる種類の化合物をも含有する。かか る担体の例示は、身体にとって異質なものとしてみなさないタンパク質およびポ リエーテルである。 前記タンパク質は、好ましくは、未変性型で存在する。前記未変性型において 、該タンパク質はいかなる分子間架橋および／または分子内架橋をも有さない。 好ましくは、該タンパク質は、１００，０００ダルトンまでの分子量、特に３０ ，０００〜１００，０００ダルトンの分子量を有する。さらに、それは、該タン パク質がヒトタンパク質である場合好ましい。該タンパク質の例示は、アルブミ ン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、免疫グロブリンおよびリポタンパク 質であり、ヒトアルブミンが好ましい。前記タンパク質の断片も使用することが できる。さらにタンパク質および／またはその断片の配列は、該タンパク質およ び／またはその断片の公知配列と比較して、１以上のアミノ酸の改変を有するこ とができる。 ポリエーテルの例示は、ポリエチレングリコール、特に分子量１００〜２０， ０００ダルトンの分子量のものである。前記ポリエチレングリコールは、好まし くは、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキル基、特にメチル基により、末端水酸基についてエステ ル化またはエーテル化される。 本発明のコンジュゲートは１以上、特に２つの前記担体を有していてもよい。 複数の担体が存在する場合、これらは、同一でも互いに異なっていてもよい。複 数のポリエーテルが存在する場合、それらは、全てのポリエーテルの分子量が、 約２０，０００ダルトンまたはそれ以上になるような様式で好ましく選択される であろう。 本発明のコンジュゲートにおいて、前記葉酸アンタゴニストは、担体と直接的 に共有結合することまたはリンカーを介して結合することができ、すなわち該リ ンカーは担体と葉酸アンタゴニストとの間に存在する。全化合物は、前記葉酸ア ンタゴニストと担体とを結合しうるリンカーとして適する。 好ましくは、該リンカーは、細胞内で切断されうる。「細胞」という用語は、 各個の細胞および細胞凝集物を含有する。前者の例示は、凝集体中に存在しない 内因性細胞である。細胞凝集物は、組織、器官および腫瘍を含有する。 前記の型のリンカーは、当業者に知られている。前記当業者は、例えば、細胞 内でのある化学結合の切断を引き起こす酵素をも知っている。したがって、当業 者は、細胞内で切断されうるリンカーを構築することができる。特に好ましくは 、かかるリンカーは、アゾ基を含有する。それは、該リンカーが下記構造： −Ｙ−Ｒ−Ｎ＝Ｎ− 式中、Ｒは有機基、好ましくは芳香族基であり、特に好ましくはフェニレンまた はその誘導体であり、ＹはＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）₂、Ｐ（Ｏ）ＯＨおよびＡｓ（Ｏ ）ＯＨの群より選ばれる、 を有する場合に特に好ましい。 好ましいリンカーの前記構造は、リンカーが本発明のコンジュゲートにおいて 有する構造に対応する。さらに前記構造は、少なくともＲがフェニレンまたはそ の誘導体である場合、腫瘍性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に特に 適する活性化合物を含有する。前記化合物は、リンカーの切断および未だリンカ ーに結合したタンパク質の任意の分解の後に、その全ての効果を提示することが できる。 本発明のコンジュゲートは、葉酸アンタゴニストを担体および任意にリンカー により共有結合することにより製造しうる。好適な方法ならびにこのために必要 な物質は、当業者に知られている。 前記葉酸アンタゴニストが少なくとも１つのカルボキシル基、例えば、グルタ ミン酸を介して存在するものを有する場合、前記コンジュゲートは、葉酸アンタ ゴニストをカルボジイミドおよびヒドロキシスクシンイミドにより反応性スクシ ンイミジルエステルに変換し、これらを担体と反応することにより製造しうる。 複数の葉酸アンタゴニストを有するコンジュゲートの場合、スクシンイミジルエ ステルの生成は、連動してまたは別々に起こる。 カルボジイミドとヒドロキシスクシンイミジドとによる葉酸アンタゴニストの 変換は、極性非プロトン性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中 で起こる。葉酸アンタゴニスト：カルボジイミド：ヒドロキシスクシニミドのモ ル比は、約１：１．５：１０である。ついで、生成したスクシンイミジルエステ ルを、水性緩衝溶液、好ましくはＮａＨＣＯ₃中でアルブミンなどの担体と反応 させる。担体濃度は、約１０〜７０ｍｇ／ｍｌである。この様式により活性化さ れたカルボキシル基は、ついで担体のＯＨ−基およびＮＨ−基と反応させ、それ により酸アミド結合または酸エステル結合を生じ、本発明のコンジュゲートが得 られる。前記コンジュゲートは、例えば、限外濾過により複数回、精製すること ができ、最終的に滅菌濾過でき、それにより、コンジュゲートは、投与のための 準備がされる。 本発明のコンジュゲートは、長期間にわたって、該コンジュゲートが患者の循 環に残るという事実により区別化される。さらに、本コンジュゲートは、患った 組織、特に腫瘍病巣および炎症病巣に蓄積する。さらに、本コンジュゲートは、 前記コンジュゲートが、独国特許出願公開第ＤＥ−Ａ−４１ ２２ ２１０．５ 号明細書により公知のＬ−葉酸アンタゴニストを有するコンジュゲートよりもよ り一層弱い副作用しかもたず、患った組織、特に腫瘍病巣および炎症病巣に対す るそれらの作用は、維持されるという事実により区別化される。 したがって、本発明のコンジュゲートは、血液腫瘍および固形の腫瘍のような 腫瘍、炎症、例えば、慢性多発性神経症または乾癖のようなリュウマチ型の疾患 、ならびに自己免疫疾患の治療に完全に適する。 本発明を実施例により説明する。 実施例１：本発明のＤ−メトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲ ートの製造 Ｄ−メトトレキサート（Ｄ−ＭＴＸ）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＦ中に溶 解した。１．５倍モル量のジシクロヘキシルカルボジイミドと約１０倍モル量の ヒドロキシスクシンイミドとを明黄色溶液に添加した。約１２時間の反応時間の 後、スクシンイミジルエステル（Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳＩＥ）への変換が完結され、 該変換はジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の沈澱量により認識されうる。反応物 の分析検査（ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ）はＴＬＣにより行 なった。 プレート：蛍光指示薬を有するシリカゲル６０、 展開試薬：エチルアセテート／ＭｅＯＨ：７５／２５、 Ｒ_f 値：Ｄ−ＭＴＸ ０．０ Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳＩＥ ０．３５−０．３８ Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳＩＥのＤＭＦ明黄色溶液を一定に攪拌しなからゆっくりとタ ンパク質溶液（０．１７Ｍ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ８．５中５０〜７０ｍｇのヒト 血清アルブミン）に添加して、ＤＭＦにさらに溶解させた未反応のジシクロヘキ シルカルボジイミドとＤＣＵとからなる混濁物（Ｔｒｕｅｂｕｎｇ）が数時間後 に生じる。少なくとも３０分の反応時間の後、該混濁物を滅菌フィルター（０． ２２μｍ）に通して分離し、該ＤＭＦを適当なメンブランフィルター〔ＹＭ３０ ；アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）〕を用いた限外濾過により分離した。 純度検査をＨＰＬＣにより行なった： プレーカラム：５０×４ｍｍ ゾルバックス ジオール(Zorbax Diol) カラム： １． ゾルバックス ＧＦ ４５０ ２． ゾルバックス ＧＦ ２５０ 展開試薬： ０．２Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４ 流速： １．０ｍｌ／分 圧力： 約６５バール 本発明のＤ−メトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲートが得 られた。 実施例２：本発明のＤ−メトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲ ートの毒性およびメトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲートの 毒性の比較 本実験のために、実施例１の本発明のＤ−メトトレキサートとヒト血清アルブ ミンとのコンジュゲート（Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳＡ）を用いた。さらに独国特許出願 公開ＤＥ−Ａ−４１ ２２ ２１０．５号明細書により公知のメトトレキサート とヒト血清アルブミンとのコンジュゲート（ＭＴＸ−ＨＳＡ）を用いた。 ５匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットのそれぞれは、Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳ ＡまたはＭＴＸ−ＨＳＡを受けた。それぞれの場合、１ｋｇの体重あたり４ｍｇ コンジュゲート（コンジュゲートのＭＴＸの量またＤ−ＭＴＸの量に基づく）を ２日間隔で注射した。 結果を表１に示す。 表１：３日後のＭＴＸ−ＨＳＡの毒性および Ｄ−ＭＴＸ−ＨＳＡの毒性の測定結果 略語：ＭＩ：粘膜炎症；ＤＩ：下痢；ＳＣ：毛深い外皮；ＷＬ：体重の減量 表１から明らかになるように、ＭＴＸ−ＨＳＡの投与３日目から、ラットは、 すでに強い副作用を被っていた。４日目には、２匹のラットが飼育箱中で死んで いるのが見つかった。他の３匹のラットは、強い副作用を被っていたため、安楽 死させられた。対照的に、本発明のコンジュゲートであるＤ−ＭＴＸ−ＨＳＡで 処理したラットは、副作用がなかった。 したがって、本発明のコンジュゲートは、微弱な副作用しかもたない。 実施例３：メトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲートに比較し た本発明のＤ−メトトレキサートとヒト血清アルブミンとのコンジュゲートによ る腫瘍治療 本実験のため、実施例２で得られたコンジュゲートを用いた。Ｗａｌｋｅｒ− ２５６癌性肉腫を有するラットを実験動物として用いた。治療の開始は、１，０ ００〜２，５００ｍｍ³の腫瘍体積（腫瘍直径１×１〜１×２ｃｍ）の腫瘍移植 の６日後であった。５匹のラットがＭＴＸ−ＨＳＡを受けた（体重１ｋｇあたり ２ｍｇ ＭＴＸ−ＨＳＡの投与量（ＭＴＸの量に基づく）による、２日間隔で３ 回の注射）。本発明のコンジュゲートであるＤ−ＭＴＸ−ＨＳＡを前記プロトコ ールに従って、２倍投与量で投与した。この投与量では、ＭＴＸ−ＨＳＡでは、 かなりの副作用がすでに現れたが、しかしながら、本発明のコンジュゲートＤ− ＭＴＸ−ＨＳＡでは現れなかった（実施例２を比較のこと）。 結果を表２に示す。 表２：コンジュゲートＭＴＸ−ＨＳＡによる腫瘍治療および 本発明のコンジュゲートであるＤ−ＭＴＸ−ＨＳＡによる 腫瘍治療の結果 略語：ＳＥ：副作用；致死：腫瘍再発により致死 表２の結果は、ＭＴＸ−ＨＳＡ群の３匹のラット（軽減）において腫瘍が、後 退したことを示す。この群において、２匹のラットが再発を被り、安楽死をさせ なければならなった。３匹のラットにおいて、副作用が現れた。これに反して、 本発明のコンジュゲートであるＤ−ＭＴＸ−ＨＳＡで処理したラットにおいては 、ＭＴＸ−ＨＳＡと比較して２倍投与量を用いられたが、それにより全ての動物 が腫瘍を除去され、副作用は観察することができなかった。 したがって、本発明のコンジュゲートは、ほとんど副作用をもたず、したがっ て優れた腫瘍治療がこれらのコンジュゲートにより達成されうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マイエル−ボルスト，ヴォルフガンク ドイツ連邦共和国 ドッセンハイム デー ―69221 シュリュッセルヴェーク ９ (72)発明者 フライ，エーファ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー ―69124 オペルナー シュトラーセ ６ (72)発明者 ステーレ，ゲルト ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー ―69123 エーディンガー シュトラーセ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 葉酸アンタゴニストのＤ−エナンチオマーと担体とを含有してなるコンジ ュゲート。 ２． 該葉酸アンタゴニストがプテリジン、ｐ−アミノ安息香酸およびＤ−アミ ノ酸の１以上の誘導体を含有することを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲ ート。 ３． 該Ｄ−アミノ酸がグルタミン酸であることを特徴とする、請求項２記載の コンジュゲート。 ４． 該葉酸アンタゴニストがＤ−アメトプテリンまたはＤ−アミノプテリンで あることを特徴とする、請求項３記載のコンジュゲート。 ５． 該コンジュゲートが複数の葉酸アンタゴニストを有することを特徴とする 、請求項１〜４いずれか記載のコンジュゲート。 ６． 該担体が、身体に異質であるとみなされない未変性タンパク質またはポリ エーテルであることを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載のコンジュゲート 。 ７． 該タンパク質が血清アルブミンであることを特徴とする、請求項６記載の コンジュゲート。 ８． 該ポリエーテルがポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求 項６記載のコンジュゲート。 ９． 複数の担体が存在することを特徴とする、請求項１〜８いずれか記載のコ ンジュゲート。 １０． リンカーが葉酸アンタゴニストと担体との間に存在することを特徴とす る、請求項１〜９いずれか記載のコンジュゲート。 １１． 該リンカーが細胞内で切断されうることを特徴とする、請求項１０記載 のコンジュゲート。 １２． 該リンカーがアゾ基を含有することを特徴とする、請求項１１記載のコ ンジュゲート。 １３． 葉酸アンタゴニストと担体と任意にリンカーとが共有結合することを特 徴とする、請求項１〜１２いずれか記載のコンジュゲートの製造方法。 １４． 腫瘍性疾患、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の治療のための請 求項１〜１２のいずれか記載のコンジュゲートの使用。