KR100596940B1 - 엽산 길항제 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한`컨쥬게이트의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

엽산 길항제 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트 {CONJUGATE COMPRISING A FOLIC ACID ANTAGONIST AND A CARRIER}
본 발명은 엽산 길항제 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트, 그러한 컨쥬게이트의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
엽산은 자연계에 존재하는 화합물로서, 세포내에서 메틸기의 전이 및 그에 따른 세포의 성장에 중요하다. 엽산은 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112003015572423-pct00004
글루탐산의 CH 기는 비대칭 C 원자를 나타낸다. 따라서, 엽산은 두개의 거울상 이성질체, 즉 D- 및 L- 거울상 이성질체 형태로서 존재한다.
그러나, 상기 거울상 이성질체 형태중에서 단지 L-거울상 이성질체만이 세포내에서 발견되며, 따라서 D-거울상 이성질체가 아닌 상기 L-거울상 이성질체 형태 만이 엽산의 활성에 관여한다. 그 이유는, 엽산은 세포내에서 엽산염 수용체에 의해 흡수되는데, 상기 수용체는 단지 엽산의 L-거울상 이성질체만을 흡수할 뿐 D-거울상 이성질체는 흡수하지 않기 때문이다.
엽산 길항제는 엽산 유도체 화합물이지만 표적영역, 즉 세포내에서 엽산에 대해 길항작용한다. 따라서, 엽산 길항제는 D-거울상 이성질체가 아닌 L-거울상 이성질체로서 존재한다.
엽산 길항제의 예로는 아미노프테린(aminopterin) 및 아메토프테린 (ametopterin)이 있으며, 상기 아메토프테린은 또한 메토트렉세이트(methotrexate)라고 한다.
메토트렉세이트, 즉 아메토프테린의 L-거울상 이성질체는 종양 및 염증의 치료를 위해 종종 사용된다. 그러나, 이에 대한 중요한 부작용이 밝혀졌으며, 이는 메토트렉세이트가 또한 건강한 조직에 흡수되어 독성을 나타내기 때문이다. 건강한 세포보다 종양 세포에 의해 보다 더 잘 흡수되고, 따라서 보다 덜 독성인 메토트렉세이트와 알부민과의 컨쥬게이트가 DE-A-41 22 210.5에 유일하게 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 휠씬 약한 부작용을 갖는 약제에 대한 커다란 필요성이 존재한다.
본 발명의 목적은 질환이 있는 조직, 특히 종양의 치료를 위한 약제로서 부작용을 최소화한 약제를 제공하는 것이다,
이는 본 발명에 따른 청구항의 목적물에 의해 얻어진다.
따라서, 본 발명의 목적물은 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트이다.
본 발명은 담체와 함께 컨쥬게이트내의 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체가 질환이 있는 조직, 특히 종양 세포에 의해 바람직하게 흡수되며, 그 안에서 질환의 치료 효과를 보인다는 사실에 대한 출원인의 통찰에 기초한다. 또한, 출원인은 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체 단독으로는, 즉 본 발명에 의한 컨쥬게이트로 존재하지 않는 경우에는 건강한 조직에 대해 아무런 부작용을 갖지 않는다는 것을 인식하였다.
"컨쥬게이트"는 엽산 길항제와 담체가 공유결합, 예를 들어, 아미드 및/또는 에스테르 결합에 의해 및/또는 링커를 통해 공유결합된 것을 의미한다.
"엽산 길항제의 D-거울상 이성질체"는 엽산으로부터 유도된 화합물의 일종이며, 엽산 길항제로서 작용하고 D-거울상 이성질체로서 존재한다. 구성 성분으로서, 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체는 프테리딘(pteridine), 특히 프테린(pterine), p-아미노벤조산 및 D-아미노산, 특히 D-글루탐산 등을 포함하며, 이들은 엽산의 구성 성분에 따라 화학적으로 변경(alteration), 즉 변형 (modification)된다. 그러한 변경은, 예를 들어 C1-C4 알킬기, 특히 메틸기, F, Cl, Br, I 와 같은 할로겐 원자, OH- 및 NH2- 기에 의한 H 원자의 치환, 상기 알킬기, NH2- 기, H- 및 할로겐 원자에 의한 OH- 기의 치환, 및 알킬기, OH- 기, H- 및 할로겐 원자에 의한 NH2- 기의 치환 등이다. 또한, 글루탐산의 산 기(acid group) 중의 하나 또는 두개 모두가, 예를 들어 에스테르 또는 아미드와 같은 산 유도체로서 존재할 수 있다. 하나 이상의 상기 변경이 본 발명에 따라 사용되는 엽산 길항제에 존재할 수 있다.
바람직한 엽산 길항제는 D-아메토프테린(이하, D-메토트렉세이트라 함),
Figure 111999014539619-pct00002
D-아미노프테린,
Figure 111999014539619-pct00003
및 D-e,t-FMTX(글루탐산(Glu)이 D-에리트로, 트레오-4-플루오로-Glu(D-erythro, threo-4-fluoro-Glu)에 의해 치환된 메토트렉세이트 동족체)이다.
하나 이상의 엽산 길항제가 본 발명에 따른 컨쥬게이트에 존재한다. 만약 여러개가 존재한다면, 이들은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
"담체(carrier)"는 질환이 있는 조직, 예를 들어 종양 또는 염증 부위에서 컨쥬게이트를 축적시키는데 적합한 임의의 종류의 화합물을 포함한다. 그러한 담체의 예로는 체내에서 이종 단백질로 인식되지 않는 단백질 및 폴리에테르가 있다.
단백질은 바람직하게는 천연 형태로 존재한다. 천연 형태에서, 단백질은 분자내- 및/또는 분자간 가교(cross-linking)를 갖지 않는다. 바람직한 단백질의 분자량은 100,000 달톤 이하이며, 특히 30,000 내지 100,000 달톤이다. 또한, 단백질은 인간의 단백질인 것이 보다 더 바람직하다. 상기 단백질의 예로는 알부민(albumin), 피브리노겐(fibrinogen), 트란스페린(transferrin), 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 및 지단백질(lipoprotein)이 있으며, 인간 알부민이 바람직하다. 상기 단백질의 단편을 또한 사용할 수 있다. 또한, 단백질 및/또는 상기 단편의 서열은 상기 단백질 및/또는 그의 단편의 공지 서열과 비교할 때, 하나 이상의 아미노산의 변경이 있을 수 있다.
폴리에테르의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 특히 분자량이 100 내지 20,000 달톤인 것이 있다. 바람직하게는, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 C1-C12 알킬기, 특히 메틸기를 갖는 말단 히드록실기에서 에스테르화되거나 에테르화된다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 하나 이상, 특히 두개의 상기 담체를 가질 수 있다. 만약 여러개의 담체가 존재한다면, 이들은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 만약 여러개의 폴리에테르가 존재한다면, 모든 폴리에테르의 분자량의 합이 약 20,000 달톤 이상이 되도록 선택하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 엽산 길항제는 담체와 직접 공유 결합하거나, 또는 링커를 통해 결합할 수 있다. 즉, 상기 링커는 담체와 엽산 길항제 사이에 존재한다. 엽산 길항제와 담체 모두를 결합시킬 수 있는 모든 화합물이 링커로서 적합하다.
바람직하게는, 상기 링커는 세포내에서 절단될 수 있다. "세포"란 개별 세포 및 세포 집단을 포함한다. 전자의 예로는 집단으로 존재하지 않는 내인성 세포가 있다. 세포 집단은 조직, 기관 및 종양을 포함한다.
상기한 유형의 링커는 당업자에게 공지이다. 당업자는 또한, 예를 들어 세포내에서 특정 화학 결합의 절단을 야기하는 효소와 같은 인자를 인식하고 있다. 따라서, 당업자는 세포내에서 절단가능한 링커를 구성시킬 수 있다. 링커가 하기의 화학식을 갖는 것이 특히 바람직하다:
-Y-R-N=N-
상기식에서,
R은 유기 기(organic group)이고, 바람직하게는 방향족(aromatic)이며, 특히 바람직하게는 페닐렌(phenylene) 또는 그의 유도체이고, Y는 C(O), S(O)2, P(O)OH 및 As(O)OH 기로부터 선택된다.
상기 바람직한 링커의 구조는 본 발명에 따른 컨쥬게이트내의 링커의 구조와 일치한다. 또한, 상기 구조는, 적어도 R이 페닐렌 또는 그의 유도체인 경우에, 종양, 염증 및 자가면역 질환의 치료에 특히 적합한 활성 화합물을 포함한다. 상기 화합물은 링커의 절단 및 링커에 여전히 결합된 단백질의 임의적인 변성 후에 완전한 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 엽산 길항제와 담체 및 선택적으로 링커와의 공유 결합에 의해 제조될 수 있다. 이에 대한 적합한 방법 및 필수적인 물질이 당업자에게 공지이다.
엽산 길항제가, 예를 들어 글루탐산에 존재하는 것과 같은 하나 이상의 카르복실기를 갖는 경우, 카르보디이미드 및 히드록시숙신이미드에 의해 엽산 길항제를 반응성의 숙신이미딜 에스테르로 전환시키고, 이들을 담체와 반응시킴에 의해 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 여러개의 엽산 길항제를 갖는 컨쥬게이트인 경우, 공동으로 또는 별개로 숙신이미딜 에스테르를 제조할 수 있다.
카르보디이미드 및 히드록시숙신이미드를 갖는 엽산 길항제의 전환은 극성 비양성자성(aprotic) 용매, 바람직하게는 디메틸포름아미드(DMF)내에서 발생한다. 엽산 길항제 : 카르보디이미드 : 히드록시숙신이미드의 몰 비는 1 : 1.5 : 10 이다. 그 다음, 형성된 숙신이미딜 에스테르를 수성 완충용액, 바람직하게는 NaHCO3 중에서 알부민 등의 담체와 반응시킨다. 상기 담체의 농도는 약 10 내지 70 ㎎/㎖ 에 이른다. 그 다음, 이러한 방법으로 활성화된 카르복실기를 담체의 OH- 및 NH- 기와 반응시킴으로써 산 아미드 또는 산 에스테르 결합을 형성하며, 본 발명에 따른 컨쥬게이트가 수득된다. 상기 컨쥬게이트를, 예를 들어 한외여과 (ultrafiltration)에 의해 수차례 정제하고, 최종적으로 살균 여과시킴으로써 적용에 대한 준비가 완료된다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 장시간에 걸쳐 환자의 순환계에 잔류하는 특징이 있다. 또한, 상기 컨쥬게이트는 질환이 있는 조직, 특히 종양 및 염증 부위에 축적된다. 또한, 상기 컨쥬게이트는 질환이 있는 조직, 특히 종양 및 염증 부위에 대한 작용이 유지되는 동안, DE-A-41 22 210.5 에서 제시된 대로, L-엽산 길항제와의 컨쥬게이트 보다 훨씬 약한 부작용을 갖는다는 점에서 구별된다.
따라서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는, 혈액학적 종양 및 고형 종양(solid tumor) 등의 종양, 염증, 예를 들어 만성의 다발관절염 또는 건선과 같은 류마티스성 질환, 및 자가 면역 질환의 치료에 매우 적합하다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1: 본 발명에 따른 D-메토트렉세이트 및 인간 혈청 알부민의 컨쥬게이트 제조방법.
D-메톡트렉세이트(D-MTX)를 DMF 중에 20 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1.5 배 몰량의 디-시클로헥실카르보디이미드 및 약 10 배 몰량의 히드록시숙신이미드를 투명한 노란색 용액에 첨가하였다. 12시간 동안 반응시킨 후, 숙신이미딜 에스테르(D-MTX-HSIE)로의 전환을 종결시켰으며, 이를 디-시클로헥실우레아(DCU)의 침전량으로 검정하였다. 반응의 분석적인 제어는 TLC에 의해 수행되었다.
플레이트: 형광 지시제를 갖는 실리카 겔 60,
러닝 약제(running agent): 에틸 아세테이트/MeOH: 75/25,
Rf 값 : D-MTX 0.0
D-MTX-HSIE 0.35 - 0.38
DMF 중의 D-MTX-HSIE의 투명한 노란색 용액을 지속적인 교반과 함께 단백질 용액(0.17 M NaHCO3 중의 인간의 혈청 알부민 50-70㎎, pH 8.5 )에 천천히 첨가시켰고, 수시간 후, DMF 중에 반응되지 않은 디-시클로헥실카르보디이미드 및 여전히 용해되어 있는 DCU로 구성된 혼탁물이 형성되었다. 30분 이상 반응시킨 후에, 혼탁물을 살균 필터(0.22 ㎛)를 통해 분리하고, DMF를 적절한 막 필터(YM30; Amicon)를 이용한 한외여과에 의해 분리하였다.
HPLC를 사용하여 순도를 조절하였다.
예비 컬럼: 50 × 4 ㎜ 조르박스 디올(Zorbax Diol)
컬럼 : 1차 조르박스 GF 450
2차 조르박스 GF 250
러닝 약제: 0.2 M 인산염 완충액, pH 7.4
유속 : 1.0 ㎖/분
압력 : 약 65 바(bar)
본 발명에 따른 D-메토트렉세이트와 인간의 혈청 알부민과의 컨쥬게이트를 수득하였다.
실시예 2 : 본 발명에 따른 D-메토트렉세이트와 인간의 혈청 알부민과의 컨쥬게이트 및 메토트렉세이트와 인간의 혈청 알부민과의 컨쥬게이트 사이의 독성 비교
상기 실험을 위해, 실시예 1 중의 본 발명에 따른 D-메토트렉세이트와 인간의 혈청 알부민과의 컨쥬게이트(D-MTX-HSA)를 사용하였다. 또한, DE-A-41 22 210.5에 개시된 메토트렉세이트와 인간 혈청 알부민(MTX-HSA)과의 컨쥬게이트를 사용하였다.
각각 5 마리의 건강한 Spraque-Dawley 래트에 D-MTX-HSA 또는 MTX-HSA를 주입하였다. 각각의 경우에 체중 ㎏ 당 4㎎의 컨쥬게이트(컨쥬게이트의 MTX 또는 D-MTX를 기준으로)를 2일 간격으로 주사하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1 : 3일 후 MTX-HSA 및 D-MTX-HSA의 독성 측정 결과
투여량/㎏ MI DI SC WL 치사
MTX-HSA 2 × 4 ㎎ 5 5 5 5 5
D-MTX-HSA 2 × 4 ㎎ 0 0 0 0 0
약어 : MI: 점막 염증; DI: 설사; SC: 섀기 외피(shaggy coat); WL: 체중 감소
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 래트는 MTX-HSA 투여 3일 후부터 이미 심한 부작용을 겪었다. 4일째에, 2마리의 래트가 우리 속에서 치사한 것을 발견하였다. 다른 3마리의 래트는 매우 심한 부작용을 겪었기 때문에 안락사시킬 수 밖에 없었다. 이와는 대조적으로, 본 발명에 따른 D-MTX-HSA 컨쥬게이트로 처리된 래트 중 부작용을 보인 것은 한마리도 없었다.
따라서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 약한 부작용을 갖는다.
실시예 3: 종양 치료에 있어서 본 발명에 따른 D-메토트렉세이트 및 인간 혈청 알부민의 컨쥬게이트와, 메토트렉세이트 및 인간 혈청 알부민의 컨쥬게이트와의 효과 비교
본 실험을 위해, 상기 실시예 2에서 얻은 컨쥬게이트를 사용하였다. 실험동물로서 워커-256(walker-256) 암육종(carcinosarcoma)이 있는 래트를 사용하였다. 종양 이식 6일 후에 치료하기 시작하였으며, 이때 종양의 부피는 1,000 내지 2,500 ㎣(종양의 직경은 1×1 내지 1×2 ㎝)이었다. 5마리의 래트에 MTX-HSA를 주입하였다(2일 간격으로 3회 주사하였고, 투여량은 체중 ㎏ 당 MTX-HSA 2㎎ (MTX를 기준으로) 이었다). 본 발명에 따른 컨쥬게이트 D-MTX-HSA를 상기 프로토콜에 따라 두배 용량으로 투여하였다. 상기 투여량을 사용한 경우에, MTX-HSA에서는 이미 상당한 정도의 부작용이 나타났으나, 본 발명에 따른 컨쥬게이트 D-MTX-HSA에서는 나타나지 않았다(실시예 2와 비교).
그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2: MTX-HSA 컨쥬게이트 및 본 발명에 따른 D-MTX-HSA 컨쥬게이트를 사용한 종양 치료의 결과
투여량/㎏ 경감 재발 부작용(SE) 치사
MTX-HSA 3 × 2 ㎎ 3 2 3 2
D-MTX-HSA 3 × 4 ㎎ 5 0 0 0
약어: SE: 부작용; 치사: 종양 재발로 인한 사망
표 2의 결과로부터, MTX-HSA 그룹 중 3마리의 래트에서 종양이 퇴행되었음(경감)을 알 수 있다. 상기 그룹에서, 2마리의 래트는 종양이 재발되어 안락사 시켜야 했다. 3마리의 래트에서는 부작용이 나타났다. 이와는 반대로, 본 발명에 따른 D-MTX-HSA 컨쥬게이트로 치료된 래트에서는 MTX-HSA와 비교하여 두배의 투여량을 사용하였으나, 모든 동물의 종양이 치유되었으며 그에 의한 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 가장 약한 부작용을 가지며, 그 결과 상기 컨쥬게이트를 사용함으로써 우수한 종양 치료 효과를 얻을 수 있다.

Claims (15)

  1. 엽산 길항제의 D-거울상 이성질체와 담체를 포함하는 컨쥬게이트로서, 담체가 인간 혈청 단백질 또는 폴리에테르이고 엽산 길항제에 직접적으로 공유결합되거나 링커를 통해서 결합되며, 엽산 길항제가 D-e,t-FMTX(글루탐산(Glu)이 D-에리트로, 트레오-4-플루오로-Glu(D-erythro, threo-4-fluoro-Glu)에 의해 치환된 메토트렉세이트 동족체), D-아메토프테린 (D-메토트렉세이트) 또는 D-아미노프테린인 컨쥬게이트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 컨쥬게이트가 여러개의 엽산 길항제를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 단백질이 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  8. 제 1항에 있어서, 폴리에테르가 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  9. 제 1항, 제 5항, 제 7항 및 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 여러개의 담체가 존재하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  10. 제 1항, 제 5항, 제 7항 및 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 담체가 링커를 통해서 엽산 길항제에 결합됨을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  11. 제 10항에 있어서, 링커가 세포내에서 절단되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  12. 제 11항에 있어서, 링커가 아조기(azo group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  13. 담체를 엽산 길항제에 직접적으로 공유결합시키거나 링커를 통해서 결합시킴을 특징으로 하는 제 1항, 제 5항, 제 7항 및 제 8항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트의 제조방법.
  14. 제 1항, 제 5항, 제 7항 및 제 8항중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는, 종양 질환, 염증 또는 자가면역 질환 치료용 약제 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 담체를 엽산 길항제에 링커를 통해서 공유결합시킴을 특징으로 하는 컨쥬게이트의 제조방법.
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