JP2001525814A - グリシルリジン酸及び抗ウイルス活性を有する蛋白質を少なくとも一つ含む、抗ウイルス薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリシルリジン酸及び抗ウイルス活性を有する蛋白質を少なくとも一つ含む、薬剤組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 グリシルリジン酸及び抗ウイルス活性を有する蛋白質を少なくとも 一つ含む、抗ウイルス薬剤組成物 本発明は、グリシルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ）及び抗 ウイルス活性を有する蛋白質を少なくとも一つ含む、抗ウイルス薬剤組成物に関 する。 ヘルペスシンプレックスウイルス１型は、顔面及び口腔の病変を引き起こす事 が知られている（”「臨床微生物学マニュアル」（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉ ｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）”，Ｍｕｒｒａｙ，Ｂａｒｏｎ，Ｐｆ ａｌｌｅｒ，，Ｔｅｎｏｖｅｒ，Ｙｏｌｋｅｎ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａ ｇｅ ８７６−８８３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９３）。 過去においては、ヘルペスシンプレックスウイルス１型由来の感染は、ビダラ ビン（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ，”Ｌｅ ｂａｓｉ ｆａｒｍａｃｏｌｏ ｇｉｃｈｅ ｄｅｌｌａ ｔｅｒａｐｉａ”，Ｚａｎｉｃｈｅｌｌｉ，Ｂｏｌｏ ｇｎａ，７ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅ１１５６，１１９１）で治療されたが、その 毒性のために、これは殆ど完全にアシクロビール（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａ ｎ，”「治療の薬学的基礎」（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）”，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｃｏ ｍｐａｎｉｅｓ，９ｔｈ ｅｄ．，ｃｈａｐｔｅｒ５０，ｐａｇｅ１１９３，１ １９６；”Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．”，７３，Ｓｕｐｐｌ．，１８６−１９２，１９ ８２ ａｎｄ Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｋｉｎｅｔ．”８，１８７−２０１，１ ９８３）に取って替わられて来た。 そのために、アシクロビールは口及び唇の病変（熱による発疹）の治療に現在 のところ最も最も使用されている薬物であるが、その局所投与により、粘膜の灼 熱感及び炎症がしばしば引き起こされる。更に、アシクロビールは最初の感染の 間に投与された時にはかなり有効であるが、再発感染の場合にはそれほど有効で はなく、そのために、ヘルペスシンフルックスウイルス１型による再感染を解決 したり防止するものではない。 加えるに、経口的治療は、悪心、下痢、そう痒、頭痛、腎障害及び腎毒性の様 な副作用を引き起こすという、欠点がある。 そこで、再発感染の場合でもヘルペスシンプレックスウイルス１型の感染の治 療に有効であり、副作用のない薬物が、今でもに本当に必要とされている。 実際に、グリシルリジン酸が、ある抗ウイルス活性を示す事も知られている。 抗ウイルス活性を示す用量において、それはウイルスの糖蛋白質の生合成を大き く抑制し、非常に高い用量においてのみ、それは細胞の糖蛋白質の生合成も抑制 する。実際に、蛋白質生合成に対するグリシルリジン酸の作用は、正常な細胞と 感染した細胞の両者において、４ｍＭの用量でも本当は不適切であるが、正常な 細胞と感染した細胞の間において糖蛋白質の生合成は相当な差を示す。実際に、 ０．５ｍＭの濃度（ウイルス複製の５０％を抑制する）において、グリシルリジ ン酸は１０％以上のグルコサミン−Ｈ³の取り込みの抑制を感染細胞において引 き起こすが、正常細胞においては抑制を引き起こさない。１ｍＭまでグリシルリ ジン酸の用量を増加させると、８０％のウイルス抑制を引き起こし、コントロー ルにおいては糖蛋白質の生合成を抑制を引き起こさず、かつ感染細胞においては 糖蛋白質の生合成の２０％の抑制を引き起こす。４ｍＭにおいては、正常細胞に おける糖蛋白質の生合成も少し変化するが、ウイルスの生成は９９％抑制される （”Ｌ ｌｇｉｅｎｅ Ｍｏｄｅｍａ”，Ｐｏｍｐｅｉ Ｒ．ａｎｄ Ｍａｒｃ ｉａｌｉｓ Ｍ．Ａ．，８３，３８５−３９１，１９８５）。 更に、ＨＳＶ１により感染した細胞を、８ｍＭのグリシルリジン酸で処理を行 った試験の結果を、表Ａに示す。３７℃で２時間の間、感染した細胞をグリシル リジン酸と接触させ続けた。前記の表の中で与えられる実験結果は、１２、１７ 及び２２時間において強い感染抑制があり、かつ細胞は完全な状態を保っている 事を示している。感染から１２時間においてはその抑制はおよそ２対数であり、 感染から２２時間においてはおよそ３対数（９９．９％）である（”Ｎａｔｕｒ ｅ”，Ｐｏｍｐｅｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２８１，Ｎｏ．５７３３，６８９−６ ９０，１９７９）。 表Ａ 下記の時間の後のウイルス生成（ＰＦＵ／ｍｌ＊） ＊ＰＦＵ＝プラーク形成ウイルスユニット 種々の型のリゾチームが、抗ウイルス活性、より特異的には抗ヘルペス（ＨＳ Ｖ１）活性を示す事もまた、文献において知られており、その様なリゾチームに は、シチメンチョウリゾチーム、ヒトリソチーム、ニワトリリゾチーム、変性（ 熱で不活性化した）ニワトリリゾチーム及びトリプシンで消化したニワトリリゾ チーム等がある（”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｃｉｓａｎ ｉ ｅｔ ａｌ．，１０，３５−４０，１９８４）。 リゾチーム類は、実際に、自然界において広範囲に広まっている酵素であり、 感染因子の分解（即ち溶菌）を引き起こし、又は分解に協力する事により、いく つかの感染因子より生物を防御する事に協力している（”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．”，Ｊｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，６３，１６５−１８９，１９ ８４；”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．”，Ｓａｖｅ ｅｔ ａｌ．， ９， ５８３−５９２，１９８９）。 更に、ラクトフェリンの抗ウイルス活性、より特異的には抗ヘルペス（ＨＳＶ １）活性が、文献中に記載されている（Ｆｕｊｉｈａｒａ Ｔ．ａｎｄ Ｈａｙ ａｓｈｉ Ｈ．”「ラクトフェリンは、マウス角膜へのヘルペスシンプレックス ウイルス１型（ＨＳＶ１）の感染を抑制する」（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ ｈｉｂｉｔｓ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｌ（ＨＳ Ｖ１）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒｎｅａ）”，”Ａｒｃｈ ．Ｖｉｒｏｌ．”，１４０，１４６９−１４７２，１９９５；Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．”「血漿および乳蛋白質の抗ウイルス効果：ヒト免疫不全ウ イルス及びヒトサイトメガロウイルスの両者のインビトロでの複製に対して 、ラクトフェリンは強力な活性を示す」Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｌａｃｔｏｆｅｒｒ ｉｎ ｓｈｏｗｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂｏｔ ｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈ ｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”，”Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．”，１７２，３８０−３８８，１９９４ ）。 ここで驚くべき事に、抗ウイルス活性を有する蛋白質に対して、グリシルリジ ン酸が相乗的な効果を有する事を発見した。 そこで、グリシルリジン酸及び抗ウイルス活性を有する少なくとも一つの蛋白 質を含む事を特徴とする、薬剤組成物を提供する事が、本研究の第一の目的であ る。 好ましくは、前記蛋白質は、リゾチーム及びラクトフェリンよりなる群より選 択される。 リゾチームの典型的な例は、シチメンチョウリゾチーム、ヒトリソチーム、ニ ワトリリゾチーム、熱で不活性化したニワトリリゾチーム及びトリプシンで消化 したニワトリリゾチームである。好ましくは、前記リゾチームはニワトリリゾチ ーム又はヒトリゾチームである。 ラクトフェリンの典型的な例は、ウシ及びヒトラクトフェリンである。 典型的には、本発明の薬剤組成物は、局所的なウイルス感染の治療に有用であ る。好ましくは、前記ウイルスはヘルペス型である。更に好ましくは、それはヘ ルペスシンプレックスウイルス１型（ＨＳＶ１）である。 好ましくは、本発明の薬剤組成物は、適切な投与形態に調剤される。適切な投 与形態の例は、局所投与を行う為のクリーム、軟膏及び薬物硬膏である。 上記投与形態は、他の一般的な成分を含むことがあり、その様な成分には、例 えば、保存剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧を制御する為の塩、乳化 剤、甘味剤、着色剤、風昧剤及びその様な物がある。 本発明の薬剤組成物中の活性成分の量は、既知の因子に依存して広い範囲で変 える事が可能であり、その様な因子として、例えば、感染の段階及び重篤度、患 者の体重、投与形態の型、投与経路、一日あたりに投与される投与回数及び活性 成分の有効性がある。しかしながら、当業者により、最適量は容易にかつ日常的 に決定されるであろう。 好ましくは、本発明の投与形態中における、グリシルリジン酸、リソチーム及 び／又はラクトフェリンの総量は、０．２５−８ｍｇ／ｋｇのグリシルリジン酸 、０．５−１０ｍｇ／ｋｇのリゾチーム及び／又は０．１−４ｍｇ／ｋｇのラク トフェリンを１日あたり投与する事を保証する様なものであろう。より好ましく は、０．５−２ｍｇ／ｋｇのグリシルリジン酸、０．５−４ｍｇ／ｋｇのリゾチ ーム及び／又は０．２５−１ｍｇ／ｋｇのラクトフェリンを１日あたり投与する 事を保証する様なものであろう。本発明の薬剤組成物の投与形態は、薬化学者に 良く知られ、混合、造粒、圧縮、溶解及びその様なものを含む技術に従って調製 されるであろう。 下記の実施例は、本発明を述べる事を意図するものであり、いかなる意味でも 本発明を限定するものではない。 実施例中において使用された化合物は以下の物である。 −フルカ株式会社より提供された、グリシルリジン酸（アンモニウム塩として） −ＮＩＨ（メリーランド州、ロックビル）より提供された、ヘルペスシンフルッ クスウイルス１型 −シグマより提供された、ニワトリリゾチーム −シグマより提供された、ラクトフェリン −ＩＣＮ ＦＬＯＷ（カリフォルニア州、コスタメサ）より提供された、アフリ カミドリザル（ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）の腎臓由来のベロ 細胞 −５６℃で３０分間不活性化したウシ胎児血清を添加し、ＩＣＮ ＦＬＯＷ（カ リフォルニアナ州、コスタメサ）より提供された、ダルベッコにより改変された イーグル培地（ＤＭＥＭ） 実施例１ 単層の細胞層のベロ細胞を２４ウェルのプレートにまき、およそ１ＨＳＶウイ ルス感染単位×１００の細胞を用いて、室温で１時間感染させた。その後、ニワ トリ、シチメンショウ及びヒトリゾチームを、０から８ｍｇ／ｍｌまで量を変化 させて、３７℃のサーモスタットの中で、かつ二酸化炭素（５％）の存在下にお いて添加した。 ４８時間後、対照例において細胞変性効果が全体に及んだ時に、細胞の凍結及 び解凍を２回行って細胞を破裂させ、それによってウイルスを放出させた。 それぞれのリゾチーム希釈物につき作られた、感染しているウイルス微粒子の 濃度を、遠心分離の後に滴定した。それぞれのウェルの含有物を１０^-1から１０^-7 まで希釈し、その希釈液を、６ウェルを有するマルチウェルの中の単層の細胞 と、それぞれ室温で１時間接触させる事により、滴定を行った。 一度感染が起こると、細胞は栄養寒天の土壌で覆われて、そして４８時間イン キュベーションした後、細胞はくすんだ赤色となり、そして顕微鏡で見る事がで きるウイルスのプラークを計測した。それにより、ウイルスのプラークについて 得られた、リゾチームによる阻害パーセンテージを、対照例と比較を行って確立 した。 この様にして得られた実験データを、表１に示す。 表１種々のリゾチームによる、ウイルスプラークの阻害（％） ＊対照例に対するパーセンテージ±標準偏差 表１は、以下の事を示す。 １）ニワトリリゾチームは、 i)ベロ細胞上のヘルペスウイルスプラークの形成を、顕著に阻害し； ii)前記作用は用量依存的であり、 iii)８ｍｇ／ｍｌの用量において、ＨＳＶ１をおよそ９２％抑制し； iv)５０％阻害用量（ＩＤ５０）はおよそ１ｍｇ／ｍｌであり； ２）シチメンチョウ及びヒトリゾチームは、ニワトリリゾチームと類似した抗ヘ ルペス活性を示した。 実施例２ ０から１ｍｇ／ｍｌまで用量を変化させたグリシルリジン酸を単独で、ＨＳＶ １で感染させた単層のベロ細胞に添加した事を除いて、実施例２は実施例１と同 様に行った。実験結果を表２に示す。 表２グリシルリジン酸−ウイルスプラークの抑制（％） 実施例３ ０．５ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸及び０から１ｍｇ／ｍｌまで用量を変化 させたニワトリリゾチームを、ＨＳＶ１で感染させた単層のベロ細胞に添加した 事を除いて、実施例３は実施例１と同様に行った。 実験結果を表３に示す。 表３ウイルスプラークの抑制（％） （グリシルリジン酸０．５ｍｇ／ｍｌ＋異なった用量のニワトリリゾチーム） 表３より見られるように、グリシルリジン酸とリゾチームの組み合わせは、顕 著な相乗効果を示すという特徴を有する。例えば、別々に測定された活性の合計 （表１及び表２）を考えると、０．５ｍｇ／ｍｌのニワトリリゾチームと０．５ ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸より成る組み合わせについて予想される抑制効果 （％）は、およそ３５−４０％である。それとは対照的に、表３に示される結果 は、この組み合わせによる抑制はおよそ８４％である事を証明している。 相乗性は、ＦＩＣインデックスによっても確認され、この実験の場合において はＦＩＣインデックスは０．１２５である。 知られている様に、ＦＩＣインデックス（ｆｒａｃｔｉｏｎｅｄ ｉｎｈｉｂ ｉｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ：分画された抑制濃度）は２つの生 成物の混合物の５０％ウイルス抑制濃度を、それぞれの生成物単独の５０％ウイ ルス抑制濃度で割り算を行う事により得られる。０．５以下のＦＩＣインデック スは、２つの生成物の間に顕著な相乗性がある事を意味している。 実施例４ 異なった用量のウシ及びヒトラクトフェリンを、ＨＳＶ１で感染させた単層の ベロ細胞に添加した事を除いて、実施例４は実施例１と同様に行った。 この様にして得られた実験データを表４に示す。 ＊ ５０％の細胞に対する最小毒性用量として示される毒性 ＊＊ ベロ細胞上のウイルスプラークを５０％抑制する用量 表４は、ラクトフェリンの毒性は強くなく、かつ毒性を示すレベルより明らか に低いレベルにおいて、ラクトフェリンのウイルスに対する作用は、すでに非常 に顕著である事を示している。 実施例５ ０．５ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸と、０から１ｍｇ／ｍｌまでの異なった 用量のヒトラクトフェリンを、ＨＳＶ１で感染させた単層のベロ細胞に添加した 事を除いて、実施例５は実施例１と同様に行った。 実験結果を表５に示す。 表５ウイルスプラークの抑制（％） （グリシルリジン酸０．５ｍｇ／ｍｌ＋異なった用量のヒトラクトフェリン） ヒトラクトフェリン 表５より見られるように、グリシルリジン酸とラクトフェリンの組み合わせは 、顕著な相乗効果を示すという特徴を有する。例えば、別々に測定された活性の 合計（表２及び表４）を考えると、０．２５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと０． ５ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸より成る組み合わせについて予想される抑制効 果（％）は、およそ６５−７５％である。それとは対照的に、表５に示される結 果は、この組み合わせによる抑制はおよそ１００％である事を証明している。 相乗性は、ＦＩＣインデックスによっても確認され、ＦＩＣインデックスは０ ．０６である。 実施例６ ０．５ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸、０．１ｍｇ／ｍｌのヒトラクトフェリ ン及び０から１ｍｇ／ｍｌまでの異なった用量のニワトリリゾチームを、ＨＳＶ １で感染させた単層のベロ細胞に添加した事を除いて、実施例６は実施例１と同 様に行った。 実験結果を表６に示す。 表６ウイルスプラークの抑制（％） （グリシルリジン酸０．５ｍｇ／ｍｌ及びヒトラクトフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ ＋異なった用量のニワトリリゾチーム） ニワトリリゾチーム 表６より見られるように、グリシルリジン酸、ラクトフェリン及びリゾチーム の組み合わせは、顕著な相乗効果を示すという特徴を有する。例えば、別々に測 定された活性の合計を考えると、０．１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリン、０．５ｍ ｇ／ｍｌのグリシルリジン酸及び０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームより成る組み合 わせについて予想される抑制効果（％）は、およそ６５％である。それとは対照 的に、表６に示される結果は、この組み合わせによる抑制はおよそ９８％である 事を示している。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１１月１６日（１９９９．１１．１６） 【補正内容】 １．明細書第５頁第３行〜第11行を次の通りに補正する。 「 好ましくは、本発明の投与形態中における、グリシルリジン酸、リソチーム 及び／又はラクトフェリンの総量は、０．２５−８ｍｇ／ｍｌのグリシルリジ ン酸、０．５−１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム及び／又は０．１−４ｍｇ／ｍｌ のラクトフェリンを１日あたり投与する事を保証する様なものであろう。より 好ましくは、０．５−２ｍｇ／ｍｌのグリシルリジン酸、０．５−４ｍｇ／ｍ ｌのリゾチーム及び／又は０．２５−１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンを１日あ たり投与する事を保証する様なものであろう。本発明の薬剤組成物の投与形態 は、薬化学者に良く知られ、混合、造粒、圧縮、溶解及びその様なものを含む 技術に従って調製されるであろう。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｋ 37/14 31/22 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬剤組成物であり、前記組成物はグリシルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚ ｉｃ ａｃｉｄ）及び抗ウイルス活性を有する蛋白質を少なくとも一つ含む事 を特徴とし、ただし、前記蛋白質がリゾチームであり、かつ前記組成物が水溶 液の形態である時には、前記組成物はアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩 を含まない事を特徴とする、薬剤組成物。 ２．前記蛋白質がリゾチーム及び／又はラクトフェリンである事を特徴とする、 請求項１記載の組成物。 ３．前記リゾチームが、ニワトリリゾチーム、シチメンチョウリゾチーム、ヒト リソチーム、熱で不活性化したニワトリリゾチーム、トリプシンで消化したニ ワトリリゾチームより成る群より選択されている事を特徴とする、請求項２記 載の組成物。 ４．ラクトフェリンがヒト又はウシラクトフェリンである事を特徴とする、請求 項２記載の組成物。