CN109022351B - 重组人溶菌酶的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用。本发明提供了重组人溶菌酶在体外宿主细胞培养中抑制单纯疱疹病毒II型感染的应用。本发明发现重组人溶菌酶在体外宿主细胞培养中对单纯疱疹病毒II型感染有抑制作用，并且抗HSV‑2作用呈现量效关系。

Description

重组人溶菌酶的新应用
技术领域
本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用。
背景技术
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)属于人类疱疹病毒α亚科，是DNA双链病毒，人类是其唯一自然宿主。根据其抗原性质的不同，可分为单纯疱疹病毒I型(HSV-1型)型和单纯疱疹病毒II型(HSV-2型)，两者之间的基因同源序列约为50％。HSV-1型多感染口、面、眼等腰部以上部位，而HSV-2型则通常感染生殖器及肛周等腰以下部位。疱疹的典型临床表现出皮肤粘膜上出现集簇性水疱、脓疱、溃疡和结痂。
由于缺乏有效的病毒疫苗，药物治疗成为HSV病毒感染的主要治疗途径。目前临床应用核苷类药物作为抗HSV病毒的主要药物，但该类药物主要适用于病毒复制的原发性和复发性感染，对潜伏感染则难以奏效。早起的核苷类药物包括碘脱氧尿铺、阿糖腺苷、三夫腺苷，其选择性低，对正常细胞毒性较大。目前广泛使用的是以阿昔洛韦为代表的无环鸟苷类药物，包括阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦等。
其中，核苷类药物作为治疗HSV病毒感染的主要手段，存在两个主要问题：1、部分核苷类药物如碘脱氧鸟苷、阿糖腺苷、更昔洛韦等为诱变剂，导致其使用安全性较低；2、耐药株的出现增加了HSV感染治疗的困难。如使用无环鸟苷类药物时，当HSV的胸苷激酶或DNA聚合酶发生突变时，病毒即可产生耐药能力。由于临床用核苷类药物基本都作用于病毒胸苷激酶或DNA聚合酶相同位点，对一种核苷类药物产生耐药的病毒株往往对其他核苷类药物同样具有耐药性，因而使得HSV感染的治疗更加困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于公开了一种安全性强的，治疗单纯疱疹病毒II型感染的药物。
本发明提供了重组人溶菌酶在体外宿主细胞培养中抑制单纯疱疹病毒II型感染的应用。
需要说明的是，溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)又称细胞壁质酶(Murami dase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-Acetyl muramide Glycanohydralase)。1922年英国细菌学家A.Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14700，等电点为10.1—10.3，最适温度为50℃，最适pH值为6～7，其化学性质非常稳定，在pH1.2～11.3范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在pH4～7、100℃处理1min不失活，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下对热稳定性较差。人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中。
作为优选，所述应用包括以下步骤：
步骤1、在体外将宿主细胞与重组人溶菌酶混合培养后，除去重组人溶菌酶得到预处理宿主细胞；
步骤2、将单纯疱疹病毒II型感染所述预处理宿主细胞，所述重组人溶菌酶在体外宿主细胞培养中对单纯疱疹病毒II型感染的抑制作用。
本发明还意外发现，预先将宿主细胞与重组人溶菌酶混合培养一段时间后，除去重组人溶菌酶后，宿主细胞具有很好的抑制单纯疱疹病毒II型感染的作用。
作为优选，所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。
作为优选，所述宿主细胞为HEK293细胞。
其中，所述人溶菌酶为天然存在的人溶菌酶。
作为优选，所述重组人溶菌酶的细胞半最大效应浓度的范围为145.38μg/ml-252.05μg/ml。
作为优选，所述重组人溶菌酶的细胞的最大无毒浓度的范围为39.0625μg/ml-1250μg/ml。
作为优选，所述重组人溶菌酶的细胞的半数中毒浓度的范围为2500μg/ml-5000μg/ml。
本发明还公开了重组人溶菌酶在制备治疗单纯疱疹病毒II型感染的产品的应用。
作为优选，所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。
其中，所述人溶菌酶为天然存在的人溶菌酶。
作为优选，所述重组人溶菌酶的活性为6000U～100000U/ml，所述重组人溶菌酶的用量为300μg～1200μg/kg/d，更为优选的，所述重组人溶菌酶的活性为50000U～100000U/ml。
需要说明的是，以上为单独使用重组人溶菌酶治疗单纯疱疹病毒II型感染的用量。
优选的，所述重组人溶菌酶纯度为90％～99％。
本发发明还提供了一种治疗单纯疱疹病毒II型感染的组合物，包括重组人溶菌酶和阿昔洛韦；
所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。
作为优选，所述重组人溶菌酶的活性为200U～10000U/ml，所述重组人溶菌酶的用量为9.76μg/ml～300μg/ml/kg/d；所述阿昔洛韦的用量为0.14μg/ml-1.95μg/ml。
优选的，所述重组人溶菌酶纯度为90％～99％。
本发明还公开了治疗单纯疱疹病毒II型感染的组合物在治疗单纯疱疹病毒II型感染的产品的应用。
本发明提供的治疗单纯疱疹病毒II型感染的组合物可以制备成针剂、喷雾剂、膏剂或凝胶剂进行使用。
本发明的目的针对现有技术中治疗单纯疱疹病毒II型感染的药物具有耐药性的问题。本发明的人溶菌酶的抗病毒活性主要是通过与胞外的病毒核酸结合，能和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。人溶菌酶还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。结果证明，与未经治疗的病毒对照鼠比较，重组人溶菌酶能提高感染鼠的存活率，延长平均存活时间，并且抗HSV-2作用呈现量效关系，500μg/kg/d以上剂量较好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例1的不同稀释度下的HSV-2(sav株)对HEK293细胞的致病变效应图，其中，A为正常细胞对照、B为病毒稀释度为10-1、C为病毒稀释度为10-3、D为病毒稀释度为10-4；
图2示本发明实施例4的重组人溶菌酶作用于HEK293细胞24h后镜下观察的细胞形态变化统计图；
图3示本发明实施例3的重组人溶菌酶(5000μg/ml)作用24h后HEK293细胞的形态；
图4示本发明实施例3的重组人溶菌酶(2500μg/ml)作用24h后HEK293细胞的形态；
图5示本发明实施例3的重组人溶菌酶(1250μg/ml)作用24h后HEK293细胞的形态；
图6示本发明实施例3的阿昔洛韦(500μg/ml)作用24h后HEK293细胞的形态；
图7示本发明实施例3的正常HEK293细胞的形态图；
图8示本发明实施例3的MTT测定重组人溶菌酶对HEK293细胞活力的影响；
图9示本发明实施例3的MTT测定对照药阿昔洛韦对HEK293细胞活力的影响；
图10示本发明实施例4的重组人溶菌酶对HSV-2(sav株)感染致HEK293细胞病变的保护作用；
图11示本发明实施例4的阿昔洛韦对HSV-2(sav株)感染致HEK293细胞病变的保护作用；
图12示本发明实施例4的重组人溶菌酶(1250μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的保护作用；
图13示本发明实施例4的重组人溶菌酶(156.25μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的保护作用；
图14示本发明实施例4的重组人溶菌酶(9.7656μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的保护作用；
图15示本发明实施例4的阿昔洛韦(3.9063μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的保护作用；
图16示示本发明实施例4的阿昔洛韦(0.1221μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的保护作用；
图17示本发明实施例4的病毒对照(无药对照)的HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的细胞图；
图18示本发明实施例4的正常HEK293细胞的细胞图；
图19示本发明实施例4的重组人溶菌酶对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图20示本发明实施例4的阿昔洛韦对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图21示本发明实施例4的重组人溶菌酶(1250μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图22示本发明实施例4的重组人溶菌酶(156.25μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图23示本发明实施例4的阿昔洛韦(3.9063μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图24示本发明实施例4的阿昔洛韦(0.1221μg/ml)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图25示本发明实施例4的病毒对照(无药对照)对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用；
图26示本发明实施例4的正常HEK293细胞的细胞图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，重组人溶菌酶的提供单位为广州奇龙生物科技有限公司，批号为20171219，纯度为91.06％，活性为16400U/mg。阿昔洛韦的来源为中国食品药品检定研究院，批号为140630-201403，含量为99.8％。人胚肾HEK293细胞，来源于上海细胞生物研究所细胞库。病毒为HSV-2质控株(sav株)，其来源为卫生部生物制品药品检定所。DMEM完全高糖培养液(含10％杭州四季青新生牛血清)购买自江苏凯基生物技术股份有限公司。DMEM不完全高糖培养液购买自江苏凯基生物技术股份有限公司。新生牛血清购买自浙江天杭生物科技有限公司。胰蛋白酶购买自AMRERSCO。二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)购买自SIGMA公司。96孔细胞培养板购买自Costar，Corning Incorporated。MM-1型微量振荡器购买自金坛区白塔新宝仪器厂。BP 211D型电子天平购买自sartorius公司。400C型医用低速离心机购买自北京白洋医疗器械有限公司。超低温冰箱为海尔，其型号为DW-86L486。二氧化碳培养箱购买自Thermo SCIENTIFIC。酶联免疫检测仪(MULTISKAN APECTRUM)购买自Thermo Scientific公司。ECLIPSE TS100倒置相差显微镜(带成像系统)购买自Nikon公司。含2％新生牛血清的DMEM维持液(下称维持液)的配制方法为临用前吸取49ml DMEM不完全培养液加1ml新生牛血清配制而成。
实施例1
本实施例提供了含2％新生牛血清的DMEM维持液、重组人溶菌酶和阿昔洛韦的配制方法。
1、含2％新生牛血清的DMEM维持液(下称维持液)的配制方法为临用前吸取49mlDMEM不完全培养液加1ml新生牛血清配制而成。
2、重组人溶菌酶的配制方法为称取重组人溶菌酶样品22.60mg，用4.52ml完全DMEM培养液溶解(抗病毒试验时此步用维持液配制)，即成5000μg/ml原液。然后依次对倍稀释至终浓度分别为2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625、19.5313和9.7656μg/ml的药液。
3、阿昔洛韦的配制方法为称取阿昔洛韦1.36mg，用2.72ml完全DMEM培养液溶解(抗病毒试验时此步用维持液配制)，即成500μg/ml原液。然后依次对倍稀释至终浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9063、1.9531、0.9766、0.4883、0.2441和0.1221μg/ml的药液。
实施例2
本实施例为HSV-2(sav株)对HEK293细胞的毒力的测定，具体步骤如下：
1、取保存的HSV-2病毒悬液0.5ml接种至单层生长的HEK 293细胞中，吸附1小时后去除，补充维持液于37℃、5％CO2下继续培养，镜下观察直至95％以上细胞出现明显病变。将吸附病毒后的细胞反复冻融5次以裂解释放病毒，离心3000rpm×10min，收集上清，作为病毒液备用。
2、取对数生长期的HEK293细胞，制成密度为2×105/ml的细胞悬液，按0.1ml/孔接种96孔板，37℃、5％CO2下培养约18h，镜下观察已长成单层。取上述收集的病毒液，用DMEM维持液作顺序10倍稀释后接种至96孔板中长成单层的HEK293细胞中，0.1ml/孔，吸附1小时后去除，补充维持液于37℃、5％CO2下继续培养。本次实验判断时间点为24h，即在培养24h后显微镜下观察细胞病变情况。每个稀释度重复3孔。实验设正常细胞对照组。试验重复2次(表1记为试验一和试验二)。
3、判断指标：每个孔观察三个视野，判断视野中出现细胞病变效应(CPE)的百分率，取平均数。
4、病毒半数感染剂量(TCID50)计算：按Reed和Muencl常规法计算，即TCID50＝>50％病变率稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数；距离比例＝(>50％病变百分数－50％)/(>50％病变百分数－<50％病变的百分数)。
5、HSV-2毒力测定结果，两次病毒毒力测定结果见表1，所测TCID50分别为4.63和4.57。镜下观察到的不同稀释度下HSV-2(sav株)对HEK293细胞的致病变效应见图1，其中，图1的A为正常细胞对照、B为病毒稀释度为10-1、C为病毒稀释度为10-3、D为病毒稀释度为10-4。
表1 HSV-2(sav株)对HEK293细胞的毒力(TCID50)测定(24h)
Figure BDA0001815784250000071
Figure BDA0001815784250000081
实施例3
本实施例为通过镜下观察细胞形态法和MTT法测定了重组人溶菌酶和阿昔洛韦对HEK293细胞的毒性，具体步骤如下：
1、镜下观察细胞形态法：接种HEK293细胞于96孔培养板，长成单层。弃去上清，加入实施例1配制的含不同浓度重组人溶菌酶或对照药阿昔洛韦的培养液，0.2ml/孔，每个浓度重复3孔。实验设正常细胞对照组。37℃、5％CO2中培养。本次实验判断时间点为24h，显微镜下观察细胞生长情况和形态变化。每孔选择三个视野，计数每个视野中形态发生改变的细胞百分率，取三个视野的平均数。计算半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。试验重复2次(分别记为试验一和试验二)。
2、MTT法：观察完毕后，加入5mg/ml的MTT溶液，20μl/孔，继续培养4h。培养结束时弃去各孔上清液，每孔加DMSO 150μl。室温暗处震荡10min，在MULTISKAN APECTRUM酶联免疫检测仪上测定550nm处吸收值(OD550nm)。
3、镜下观察细胞形态法的两次结果显示，处理24小时后，重组人溶菌酶的TC50均>2500μg/ml，TC0分别为≤625μg/ml和≤1250μg/ml。两次试验对照药阿昔洛韦在500～3.9063μg/ml受试浓度范围内均未表现出对HEK293细胞活性的明显影响，TC50均>500μg/ml，TC0均≥500μg/ml。结果见表2和图2-7。
4、MTT测定法测定细胞活力的两次结果为：重组人溶菌酶在1250μg/ml及以下浓度范围内对HEK293细胞活性无明显影响，细胞存活率≥80％。对照药阿昔洛韦在500～3.9063μg/ml受试浓度范围内均未表现出对HEK293细胞活性的明显影响，细胞存活率在89％及以上。结果见表3和图8-9。
表2重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦作用于HEK293细胞24h后细胞形态学的改变—显微镜观察法测定TC50和TC0
Figure BDA0001815784250000091
Figure BDA0001815784250000101
Figure BDA0001815784250000111
表3 MTT法测定重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦对HEK293细胞活力的影响(24小时)
Figure BDA0001815784250000112
Figure BDA0001815784250000121
实施例4
本实施例为重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦对HSV-2感染HEK293细胞的影响，具体步骤如下：
1、重组人溶菌酶和阿昔洛韦预先处理对HSV-2感染致HEK293细胞病变的保护作用，步骤如下：取-70℃保存并已测定过TCID50的病毒液，稀释成100TCID50，备用。接种HEK293细胞于96孔培养板，长成单层。加入按3.2项方法用维持液配制的含不同浓度重组人溶菌酶或对照药阿昔洛韦的培养液预处理，0.2ml/孔，置37℃、5％CO2中孵育30min后弃去各孔上清，用维持液漂洗1遍。再将100TCID50病毒液接种于细胞中，0.1ml/孔，吸附1小时后弃去，用维持液漂洗2遍，再加入3.2项法配制的含不同浓度重组人溶菌酶和对照药的培养液，0.2ml/孔，置37℃、5％CO2中继续培养。每个受试浓度设3个复孔，试验设病毒对照(无药对照)和细胞对照(正常细胞对照)。培养期间注意显微镜下观察细胞病变情况，当无药对照孔的细胞病变率>95％时终止培养。本次试验判断时间点为24h。试验重复2次(记为试验一和试验二)。
2、重组人溶菌酶和阿昔洛韦对HSV-2感染HEK293细胞的抑制作用，步骤如下：取-70℃保存并已测定过TCID50的病毒液，稀释成100TCID50，备用。接种HEK293细胞于96孔培养板中并长成单层。将100TCID50病毒液接种于细胞中，0.1ml/孔，吸附1小时后弃去，用维持液漂洗2遍，再加入配制的含不同浓度重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦的培养液，0.2ml/孔，置37℃、5％CO2中继续培养。每个受试浓度设3个复孔，试验设病毒对照(无药对照)和细胞对照(正常细胞对照)。培养期间注意显微镜下观察细胞病变情况，当无药对照孔的细胞病变率>95％时终止培养。本次试验判断时间点为24h。
3、判断指标：同病毒毒力测定，即每个孔取三个视野，判断各视野中出现CPE的百分率，取三个视野的平均数。
4、根据受试药和对照药各浓度组出现CPE的百分率对药物浓度做直线回归方程，计算EC50或IC50值，并作相关系数的显著性检验。测试结果见表4和图10-18，测试结果见表5和图19-26。
5、根据细胞形态观察法和MTT测定法获得的药物对HEK293细胞毒性的结果，重组人溶菌酶选择1250μg/ml及以下浓度进行抗病毒试验。在受试浓度范围内，预先给予重组人溶菌酶或阿昔洛韦处理HEK293细胞后，再用100TCID50的HSV-2(sav株)感染细胞，随后再与药物共同孵育至观察终点。两次试验结果显示，不同浓度的重组人溶菌酶对HSV-2(sav株)所致的HEK293细胞病变有不同程度的保护作用，EC50值分别为145.38μg/ml和252.05μg/ml。对照药阿昔洛韦对HSV-2(sav株)的感染表现出较强的抑制作用，EC50值分别为0.07μg/ml(近似值)和0.25μg/ml。
6、重组人溶菌酶和阿昔洛韦对HSV-2感染HEK293细胞的抑制作用，步骤如下：在100TCID50的HSV-2(sav株)感染HEK293细胞后，给予不同浓度的重组人溶菌酶或阿昔洛韦处理，结果显示，重组人溶菌酶仅表现较弱的抑制作用，在最大受试浓度1250μg/ml时，细胞病变率仍然>60％。对照药阿昔洛韦表现出较强的抑制作用，EC50值为0.33μg/ml。
表4重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦预处理后对HSV-2(sav株)感染导致的HEK293细胞病变的保护作用(病毒稀释度：10-4.63，判断时间：24小时)
Figure BDA0001815784250000141
Figure BDA0001815784250000151
表5重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用(病毒稀释度：10-4.63，判断时间：24小时)
Figure BDA0001815784250000152
Figure BDA0001815784250000161
试验说明重组人溶菌酶预先给药后对人单纯疱疹病毒-II型sav株感染所致的HEK293细胞病变具有剂量依赖性的保护作用。
实施例5
本实施例为单独使用重组人溶菌酶对HSV-2感染HEK293细胞的保护效果和使用重组人溶菌酶和阿昔洛韦对HSV-2感染HEK293细胞的保护效果的比较，步骤如下：从下表6可知，重组人溶菌酶的浓度在1250、625、312.5、156.25、78.125、39.0625、19.5313、9.7656ug/ml，9.7656ug/ml时细胞病变率为93％，对细胞基本无保护作用，单独使用阿昔洛韦处理HEK293细胞，EC50为0.25μg/ml(表6)。从表7可知，选择重组人溶菌酶无明显细胞保护的浓度9.7656μg/ml与阿昔洛韦联合应用，使用重组人溶菌酶和阿昔洛韦对HSV-2感染HEK293细胞保护作用，重组人溶菌酶明显增强阿昔洛韦的保护作用，其EC50为重组人溶菌酶浓度为9.7656μg/ml，阿昔洛韦浓度为0.0736μg/ml，明显低于单独使用阿昔洛韦时的EC50的0.2441μg/ml(P<0.05)。
重组人溶菌酶联合阿昔洛韦预先给药后对人单纯疱疹病毒-II型sav株感染所致的HEK293细胞病变具有剂量依赖性的很好的保护作用，重组人溶菌酶可增强阿昔洛韦的抗病毒活性，对耐药的人单纯疱疹病毒-II型治疗有一定意义。
表6重组人溶菌酶和对照药阿昔洛韦预处理后对HSV-2(sav株)感染导致的HEK293细胞病变的保护作用(病毒稀释度：10-4.63，判断时间：24小时)
Figure BDA0001815784250000171
表7重组人溶菌酶联合阿昔洛韦对HSV-2(sav株)感染HEK293细胞的抑制作用(病毒稀释度：10-4.63，判断时间：24小时)
Figure BDA0001815784250000172
Figure BDA0001815784250000181
实施例6
本实施例为重组人溶菌酶在致病小鼠的抑制病毒作用，步骤如下：
1、实验材料：病毒为HSV-2质控株(sav株)，来源为卫生部生物制品药品检定所。小鼠为昆明种，体重(18±1)g，购于中山大学医学院实验动物中心。重组人溶菌酶，来源于广州奇龙生物科技有限公司，批号：20180317，纯度：99.03％。活性：43000U/mg。对照药：阿昔洛韦，来源：中国食品药品检定研究院，批号：140630-201403，含量：99.8％。
2、致病模型的建立，病毒滴度为50LD50/0.1mL，腹腔注射，每只0.03mL，每组10-12只，雌雄各半。
3、抗病毒治疗按100、200、500、1000μg/kg/d皮下注射给药，在病毒感染后24h进行治疗，疗程5d。观察小鼠的反应，出现死亡时间和死亡数，计算各组鼠存活率，对结果进行方差分析。另设阿昔洛韦和0.9％氯化钠对照组及不用药物的对照组(含病毒对照和正常对照)。每组10-12只，所有动物观察15d。
4、实验结果：重组人溶菌酶100、200、500、1000μg/kg/d剂量组，HSV-II感染鼠的平均存活天数分别为7.3±1.2天、9.3±3.3天、11.5±3.4天和13.9±2.7天，氯化钠治疗鼠存活时间7.0±1.8天，阿昔洛韦治疗鼠存活时间12.0±2.8天。小鼠感染病毒后第5天出现症状，表现为瘦弱、体重下降、腹部肿大、皮肤青紫、饮食量减少、倦缩、肢体麻痹、耸毛、衰竭。发病-3d内死亡，解剖发现脑、心、肝、肾有淤血。从存活率和平均存活时间看各组动物间显示出明显差异，重组人溶菌酶100、200、500、1000μg/kg/d时可使感染鼠的存活率达32％、56％、72％和85％，显示出量效关系，经直线回归分析，P<0.05，与氯化钠治疗鼠(存活率12％)比较，P<0.01，与阿昔洛韦(存活率70％)。正常对照组鼠均未死亡，存活率100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.人溶菌酶和阿昔洛韦在体外宿主细胞培养中抑制单纯疱疹病毒II型感染的应用；所述人溶菌酶是天然人溶菌酶或重组人溶菌酶；所述重组人溶菌酶是人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
步骤1、在体外将宿主细胞与重组人溶菌酶混合培养后，除去所述重组人溶菌酶得到预处理宿主细胞；
步骤2、将单纯疱疹病毒II型感染所述预处理宿主细胞，所述重组人溶菌酶在体外宿主细胞培养中对单纯疱疹病毒II型感染的抑制作用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞。
4.人溶菌酶和阿昔洛韦在制备治疗单纯疱疹病毒II型感染的产品的应用；所述人溶菌酶是天然人溶菌酶或重组人溶菌酶；所述重组人溶菌酶是人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶。
5.一种治疗单纯疱疹病毒II型感染的组合物，其特征在于，包括人溶菌酶和阿昔洛韦；
所述人溶菌酶是天然人溶菌酶或重组人溶菌酶；所述重组人溶菌酶是人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶。
6.权利要求5所述的治疗单纯疱疹病毒II型感染的组合物在制备治疗单纯疱疹病毒II型感染的产品的应用。
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蛋清溶菌酶对人单纯疱疹病毒I型抑制作用的实验研究;李亚男等;《军医进修学院学报》;20081228;第29卷(第6期);摘要 *

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