PL189218B1

PL189218B1 - Przeciwwirusowa kompozycja farmaceutyczna obejmująca kwas glicyryzowy i przynajmniej jedno białko oaktywności przeciwwirusowej

Info

Publication number: PL189218B1
Application number: PL98336802A
Authority: PL
Inventors: Raffaello Pompei; Mario Pinza
Original assignee: Acraf
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2005-07-29
Also published as: CZ399199A3; ITMI971119A0; CA2289550A1; UA63955C2; PT980254E; GEP20022672B; BG64748B1; EP0980254B1; IL132651A0; DK0980254T3; DE69803565D1; AU740944B2; SK283584B6; TR199902730T2; JP2009102370A; CN1255859A; HU224956B1; PL336802A1; KR100592193B1; HK1028347A1

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje kwas glicyryzowy i przynajmniej jedno bialko o aktywnosci przeciwwirusowej, przy czym gdy bialkiem jest lizozym, i gdy kompozycja jest w postaci roztworu wodnego, nie zawiera soli alkalicznych ani metali ziem alkalicznych. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy przeciwwirusowej kompozycji farmaceutycznej, obejmującej kwas glicyryzowy i przynajmniej jedno białko o aktywności przeciwwirusowej.

Wiadomo, że wirus opryszczki pospolitej typu 1 powoduje zmiany na twarzy i jamie ustnej (Manuał of Clinical Microbiology, Murray, Baron, Pfaller, Tenover, Yolken, wyd. 6, str. 876883, American society for Microbiology, Washington D.C., 1993).

W przeszłości, zakażenie wirusem opryszczki pospolitej typu 1 leczono vidarabiną (Goodman i Gilman; Le basi farmacologiche della terapia, Zanichelli, Bolonia, wyd. 7, str. 1156, 1991), ale obecnie została ona całkowicie zastąpiona przez acyklovir (Goodman i Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hill Companies, wyd. 9, rozdział 50, str. 1193, 1996; Am. J. Med. 73, supl., 186-192, 1982 i Clin. Pharmacokinet. 8, 187-201, 1983) z powodu swej toksyczności.

Obecnie, acyklovir jest najczęściej używany, lekiem w leczeniu zmian ust i warg (zaczerwienienie od gorączki), ale miejscowe stosowanie go często powoduje stan zapalny i podrażnienie błon śluzowych. Ponadto, acyklovir jest znacznie skuteczniejszy przy podawaniu podczas pierwszego zakażenia, ale nie jest zbyt skuteczny w przypadku zakażeń nawracających, nie lecząc i nie zapobiegając ponownym zakażeniom wirusem opryszczki pospolitej typu 1.

Oprócz tego, leczenie doustne powoduje takie objawy uboczne jak nudności, biegunka, swędzenie, bóle głowy, niewydolność nerek i nefrotoksyczność.

Stąd, wciąż istnieje rzeczywista potrzeba leku, który jest aktywny w leczeniu zakażeń wirusem opryszczki pospolitej typu 1, nawet w przypadku nawracających zakażeń i który jest pozbawiony efektów ubocznych.

W rzeczywistości, wiadomo również, że kwas glicyryzowy wykazuje pewną aktywność przeciwwirusową. W dawkach przeciwwirusowych w większości hamuje syntezę glikoprotein wirusowych i tylko w dużych dawkach hamuje również syntezę glikoprotein komórkowych. 0 ile działanie kwasu glicyryzowego na syntezę białek, w komórkach zakażonych i normalnych, jest praktycznie nieistotne nawet w dawce 4 mM, synteza glikoproteiny wykazuje zasadniczą różnicę pomiędzy komórkami normalnymi i zakażonymi. Przy stężeniu 0,5 mM (które hamuje 50% replikacji wirusa), kwas glicyryzowy powoduje zmniejszenie wbudowywania glukozaminy-³H o ponad 10% w komórkach zakażonych i brak zahamowania w komórkach normalnych. Zwiększona dawka kwasu glizyryzowego do 1 mM, powoduje 80% zmniejszenie ilości wirusa, brak zahamowania syntezy glikoprotein w kontroli i 20% zmniejszenie syntezy glikoproteiny w zakażonych komórkach. Przy 4 mM, synteza glikoprotein jest

189 218 w komórkach normalnych nieco zmieniona, ale wytwarzanie wirusa jest zahamowane o 99% (L'Igiene moderna, Pompei i Marcialis, 83:385-391, 1985).

Ponadto, tabela A pokazuje wyniki testów przeprowadzonych nad leczeniem komórek zakażonych HSV1 przy użyciu 8 mM kwasu glicyryzowego. Zakażone komórki traktowano kwasem glicyryzowym przez 2 godziny w 37°C. Wyniki doświadczalne pokazane w tabeli pokazują, że występuje silne zmniejszenie zakażenia po 12, 17 i 22 godzinach oraz, że komórki zachowują integralność komórkową. Zahamowanie wynosi około 2 logarytmy w 12 godzin po zakażeniu i 3 logarytmy (99,9%) w 22 godziny po zakażeniu (Nature, Pompei i in., 281, 5733,689-690, 1979).

Tabela A

Wytwarzanie wirusa (PFU*/ml) po czasie podanym w godzinach

Godziny	12	17	22
Kontrola	3 x 10⁶	5,4 x 106	2,6 x 10⁷
Kwas glicyryzowy 8 mM	4,2 x 10⁴	1,2 x 104	1,1 x 104

PFU = jednostki tworzące łysinki wirusa

Znana jest również z literatury aktywność przeciwwirusowa, zaś konkretniej, aktywność przeciw wirusom herpes (HSV1) różnych rodzajów lizozymów, takich jak lizozym indyka, lizozym ludzki, lizozym kurzy, denaturowany (inaktywowany ciepłem) lizozym kurzy i lizozym kurzy trawiony trypsyną (Current Microbiology, Cisani i in., 10:35-40, 1984).

Lizozymy są enzymami szeroko rozpowszechnionymi w przyrodzie i kooperują w obronie organizmu przeciwko niektórym czynnikom zakaźnym powodując albo kooperując w ich cięciu (tj. lizie) (Mol. Cell. Biochem. Jolles i in., 63:165-189, 1984; Anticancer Res., Save i in., 9:583-592, 1989).

Ponadto, w literaturze opisuje się działanie przeciwwirusowe, zaś konkretniej przeciwko wirusom herpes (HSV1) laktoferryny (Fujihara i Hayashi, „Lactoferrin inhibits herpes virus type 1 (HSV1) infection to mouse cornea”, Arch. Virol., 140:1469-1472, 1995; Harmsen i in., „Antiviral effects of plasma and milk protein: lactoferrin shows potent activity against both human immunodeficiency virus and human cytomegalovirus replication in vitro”, J. Infect. Dis., 172:380-388, 1994).

Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że kwas glicyryzowy wykazuje synergistyczne działanie z białkami o aktywności przeciwwirusowej.

Stąd, pierwszym celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznej obejmującej kwas glicyryzowy i przynajmniej jedno białko o aktywności przeciwwirusowej.

Korzystnie, białko jest wybrane z grupy obejmującej lizozymy i laktoferyny.

Typowym przykładem lizozymów są: lizozym indyka, lizozym ludzki, lizozym kurzy, denaturowany (inaktywowany ciepłem) lizozym kurzy i lizozym kurzy trawiony trypsyną. Korzystnie, lizozymem jest lizozym kurzy albo lizozym ludzki.

Typowymi przykładami laktoferryn są laktoferryny bydlęce i ludzkie.

Zwykle, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest przydatna do leczenia miejscowych zakażeń wirusowych. Korzystnie, wirus należy do wirusów herpes. Jeszcze korzystniej, jest wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV1).

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest w postaci przydatnych postaci dawkowania. Przykłady przydatnych postaci dawkowania obejmują kremy, maści i plastry lecznicze, do podawania miejscowego.

Postaci dawkowania mogą również zawierać inne konwencjonalne składniki takie jak: konserwanty, stabilizatory, surfaktanty, bufory, sole regulujące ciśnienie osmotyczne, emulgatory, środki słodzące i barwiące oraz smakowe itp.

Ilość składnika czynnego w kompozycji farmaceutycznej może się zmieniać w szerokim zakresie w zależności od znanych czynników takich jak, przykładowo, stan i ciężkość zakażenia, ciężar ciała pacjenta, rodzaj postaci dawkowania, droga podania, liczba postaci dawkowania podawanych dziennie i skuteczność składników czynnych. Jednakże, optymalną ilość oznaczą w sposób łatwy i rutynowy specjaliści w dziedzinie.

189 218

Korzystnie, ilość kwasu glicyryzowego, lizozymu i/lub laktoferryny w postaci dawkowania według wynalazku powinna zapewniać dzienne podawanie 0,25-8 mg/ml kwasu glicyryzowego, 0,2-10 mg/ml lizozymu i/lub 0,1-4 mg/ml laktoferryny. Jeszcze korzystniej, ilości powinny zapewniać dzienne podawanie 0,5-2 mg/ml kwasu glicyryzowego, 0,5-4 mg/ml lizozymu i/lub 0,25-1 mg/ml laktoferryny. Postaci dawkowania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można wytworzyć dobrze znanymi technikami i obejmującymi mieszanie, granulowanie, prasowanie, rozpuszczanie itp.

Poniższe przykłady mają ilustrować wynalazek bez ograniczania go w żaden sposób.

W poniższym doświadczeniu zastosowano następujące związki:

- kwas glicyryzowy (jako sól amonowa) z Fluka AG;

- wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV1) z NIH, Rockville, Maryland;

- kurzy lizozym z SIGMA;

- laktoferryna z SIGMA;

- komórki VERO z nerki afrykańskiej małpy zielonej z ICN FLOW, Costa Mesa, CA;

- pożywka Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM), z dodatkiem surowicy płodowej cielęcej, inaktywowanej przez 30 minut w 56°C, z ICN FLOW, Costa Mesa, CA.

Przykład 1

Pojedyncze warstwy komórek VERO wysiano do płytek 24-studzienkowych i zakażono HSV-1 w ilości około 1 jednostki zakażającej x 100 komórek przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, dodawano różne ilości od 0 do 8 mg/ml lizozymu kurzego, indyczego i ludzkiego, w termostacie w 37°C i w obecności CO2 (5%).

Po 48 godzinach, gdy efekt cytopatyczny w kontroli był całkowity, komórki zamrożono i odmrożono dwukrotnie w celu wywołania zniszczenia komórek i uwolnienia wirusa.

Stężenie zakaźnych cząstek wirusowych wytworzonych w każdym z rozcieńczeń lizozymu miareczkowano po odwirowaniu. Miareczkowanie przeprowadzono przez rozcieńczenie zawartości każdej ze studzienek do 10'¹ do 10’⁷ i doprowadzenie do kontaktu z pojedynczą warstwą komórek w płytce 6-studzienkowej przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po zakażeniu, komórki przykryto warstwą odżywczego agaru i po 48 godzinach inkubacji zabarwiono czerwienią obojętną, i liczono łysinki widoczne makroskopowo. W ten sposób porównano procent zahamowania tworzenia łysinek wirusowych przez lizozym w porównaniu z kontrolą.

Dane doświadczalne uzyskane w ten sposób podano w tabeli 1.

Tabela 1

Zahamowanie (%) łysinek wirusowych przy użyciu różnych lizozymów.

Dawka (mg/ml)*	8	6	4	2	1	0,5
Kurzy	93 ±3	82 ±4	71 ±6	60 ±6	49 ±5	20 ±4
Indyczy	89 ±5	80 ±4	68 ±5	55 ±6	45 ±5	10 ± 3
Ludzki	90 ±5	79 ±6	70 ±4	59 ±4	45 ±3	18 ± 3

* Procent kontroli ± odchylenie standardowe

Tabela 1 pokazuje, że:

1) lizozym kurzy

1) hamuje w sposób istotny tworzenie łysinek wirusa herpes w komórkach VERO;

ii) działanie jest zależne od dawki;

iii) dawka 8 mg/ml hamuje HSVT w około 92%;

iv) dawka hamująca w 50% (ID50) wynosi około 1 mg/ml;

2) lizozym indyczy i ludzki wykazują aktywność przeciwko wirusom herpes podobną do lizozymu kurzego.

Przykład 2

Przeprowadzono doświadczenie jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że różne ilości od 0 do 1 mg/ml kwasu glicyryzowego dodano do pojedynczych warstw komórek VERO zakażonych HSV1. Wyniki doświadczalne pokazano w tabeli 2.

189 218

Tabela 2

Zahamowanie przez kwas glicyryzowy (%) tworzenia łysinek wirusowych

Dawki (mg/ml)	0,2	0,4	0,6	0,8	1
Zahamowanie (%)	0	10 ± 4	27 ±7	50 ±8	75 ± 12

Przykład 3

Przeprowadzono doświadczenie jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że do pojedynczych warstw komórek VERO zakażonych HSV1 dodano 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego i kurzy lizozym w ilości od 0 do 1 mg/ml. Wyniki doświadczalne pokazano w tabeli 3.

Tabela 3

Zahamowanie tworzenia (%) łysinek wirusowych (kwas glicyryzowy 0,5 mg/ml + różne dawki kurzego lizozymu)

Dawki kurzego lizozymu (mg/ml)	0,2	0,4	0,6	0,8	1
Zahamowanie (%)	72 ±6	83 ±8	85 ±8	87 ±9	88 ±8

Jak widać z tabeli 3, połączenie kwasu glicyryzowego i lizozymów charakteryzuje się istotnym działaniem synergistycznym. Przykładowo, w świetle sumy aktywności mierzonych osobno (tabela 1 i 2), zahamowanie (%) oczekiwane dla połączenia 0,5 mg/ml kurzego lizozymu i 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego wynosi około 35-40%. Według wynalazku przeciwieństwie, wyniki pokazane w tabeli 3 pokazują, że zahamowanie (%) tego połączenia wynosi 84%.

Synergizm potwierdzono wskaźnikiem FIC, który w tym przypadku wynosił 0,125.

Jak wiadomo, wskaźnik FIC (frakcjonowane stężenie zahamowania) otrzymuje się przez podzielenie stężenia hamującego 50% mieszaniny dwóch produktów przez 50% zahamowania każdego z produktów osobno. Wskaźnik FIC < 0,5 oznacza istotny synergizm dwóch produktów.

Przykład 4

Doświadczenie przeprowadzono jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że do pojedynczych warstw komórek VERO zakażonych HSV1 dodawano różne ilości laktoferryny bydlęcej i ludzkiej.

Dane przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

	MTD50 (mg/ml)*	MDI50 (mg/ml)**
Laktoferryna bydlęca	2	0,25
Laktoferryna ludzka	3	0,25

* Toksyczność wyrażona jako minimalna dawka toksyczna wobec 50% komórek; ** Dawka hamująca 50% łysinek wirusowych w komórkach VERO.

Tabela 4 pokazuje, że laktoferryny nie są bardzo toksyczne, zaś ich działanie przeciwwirusowe jest wyrażone na poziomie niższym niż poziom toksyczny.

Przykład 5

Przeprowadzono doświadczenie jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że do pojedynczych warstw komórek VERO zakażonych HSV1 dodano 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego i ludzką laktoferrynę w ilości od 0 do 1 mg/ml. Wyniki doświadczalne pokazano w tabeli 5.

189 218

Tabela 5

Zahamowanie tworzenia (%) łysinek wirusowych (kwas glicyryzowy 0,5 mg/ml + różne dawki ludzkiej laktoferryny)

Ludzka laktoferryna mg/ml	0	0,0075	0,015	0,031	0,062	0,125	0,250	0,5	1
Zahamowanie (%)	30 ±2	30 ±4	50 ±6	50 ±5	60 ± 10	80 ± 15	100	100	100

Jak widać z tabeli 5, połączenie kwasu glicyryzowego i ludzkiej laktoferryny charakteryzuje się istotnym działaniem synergistycznym. Przykładowo, w świetle sumy aktywności mierzonych osobno (tabela 2 i 4), zahamowanie (%) oczekiwane dla połączenia 0,25 mg/ml laktoferryny i 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego wynosi około 65-75%. Według wynalazku przeciwieństwie, wyniki pokazane na tabeli 5 pokazują, że zahamowanie (%) tego połączenia wynosi 100%.

Synergizm potwierdzono wskaźnikiem FIC, który wynosił 0,06.

Przykład 6

Przeprowadzono doświadczenie jak w przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że do pojedynczych warstw komórek VERO zakażonych HSV1 dodano 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego, 0,1 mg/ml ludzkiej laktoferryny i kurzy lizozym w ilości od 0 do 1 mg/ml. Wyniki doświadczalne pokazano w tabeli 6.

Tabela 6

Zahamowanie tworzenia (%) łysinek wirusowych (kwas glicyryzowy 0.5 mg/ml, 0,1 mg/ml ludzkiej laktoferryny + różne dawki kurzego lizozymu)

Dawki kurzego lizozymu (mg/ml)	0	0,25	0,5	0,75	1
Zahamowanie (%)	48 ± 2	95 ±5	98 ±2	99 ± 1	100

Jak widać z tabeli 6, połączenie kwasu glicyryzowego i laktoferryny i lizozymu charakteryzuje się istotnym działaniem synergistycznym. Przykładowo, w świetle sumy aktywności mierzonych osobno, zahamowanie (%) oczekiwane dla połączenia 0,1 mg/ml laktoferryny, 0,5 mg/ml kwasu glicyryzowego i 0,5 mg/ml lizozymu wynosi około 65%. Według wynalazku przeciwieństwie, wyniki pokazane w tabeli 6 pokazują, że zahamowanie (%) tego połączenia wynosi około 98%.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Claims

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje kwas glicyryzowy i przynajmniej jedno białko o aktywności przeciwwirusowej, przy czym gdy białkiem jest lizozym, i gdy kompozycja jest w postaci roztworu wodnego, nie zawiera soli alkalicznych ani metali ziem alkalicznych.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że białkiem jest lizozym i/lub laktoferryna.

3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że lizozym jest wybrany z grupy obejmującej lizozym indyczy, lizozym ludzki, lizozym kurzy, lizozym kurzy inaktywowany ciepłem i lizozym kurzy trawiony trypsyną.

4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że laktoferrynąjest laktoferryna ludzka albo bydlęca.