CZ291932B6

CZ291932B6 - Farmaceutický prostředek s antivirovým účinkem, obsahující kyselinu glycyrrhizovou a alespoň jeden protein projevující antivirový účinek

Info

Publication number: CZ291932B6
Application number: CZ19993991A
Authority: CZ
Inventors: Raffaello Pompei; Mario Pinza
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C.
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2003-06-18
Also published as: HUP0002985A3; IT1291366B1; PT980254E; ZA983917B; AU7764698A; CZ399199A3; DK0980254T3; SK154499A3; HUP0002985A2; KR20010012419A; EP0980254B1; IL132651A0; CA2289550A1; AR012849A1; SK283584B6; TR199902730T2; BG103968A; JP2001525814A; ITMI971119A0; PL189218B1

Abstract

Farmaceutick² prost°edek, kter² obsahuje kyselinu glycyrrhizovou a alespo jeden protein maj c antivirov² · inek.\

Description

Tento vynález se týká farmaceutického antivirového prostředku obsahujícího kyselinu glycyrrhizovou a alespoň jeden protein projevující antivirový účinek.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že virus Herpes simplex typu 1 zapříčiňuje obličejové a orofaryngální léze (Murray, Baron, Pfaller, Tenover, Yolken, „Manual of Clinical Microbiology“, 6. vydání, strany 876 až 883, Američan Society for Microbiology, Washington D.C. (1993)).

V minulosti byly infekce způsobené virem Herpes simplex typu 1 léčeny vidarabinem (Goodman aGilman, „Le basi farmacologiche della terapia“, Zanichelli, Bologna, 7. vydání, strana 1156 (1991)), ale ten byl téměř úplně nahrazen acyklovirem (Goodman & Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, McGraw Hill Companies, 9. vydání, kapitola 50, strana 1193 (1996); „Am. J. Med.“, 73, Suppl., 186 až 192 (1982) a „Clin. Pharmacokinet“, 8, 187 až 201 (1983)) kvůli jeho toxicitě.

Proto je nyní acyklovir nejvíce používaným medikamentem při léčbě lézí v ústech a na rtech (vyrážka z horečky), ale jeho místní užití často zapříčiňuje pálení a podráždění sliznic. Acyklovir je docela účinný, když je podáván při první infekci, ale není velmi účinný v případě opakovaných infekcí, nepřináší tak konečné řešení a nebrání opětné infekci virem Herpes simplex typu 1,

Dále podávání ústy má tu nevýhodu, že má za následek vedlejší účinky, jako je pocit nevolnosti, průjem, svědění, bolesti hlavy, renální nedostatečnost a nefrotoxicitu.

Z tohoto důvodu je stále reálná potřeba léku, který je účinný při léčbě infekcí způsobených virem Herpes simplex typu 1, právě pro případy opakovaných infekcí, a který nemá vedlejší účinky.

Je také známo, že kyselina glycyrrhizová vykazuje určitou antivirovou aktivitu. Při antivirových dávkách kyselina glycyrrhizová inhibuje z velké části syntézu virových glykoproteinů a pouze při velmi vysokých dávkách také inhibuje syntézu buněčných glykoproteinů. Zatímco působení kyseliny glycyrrhizové na syntézu proteinů jak normálních, tak infikovaných buněk je prakticky nepodstatné dokonce při dávkách 4 mM, syntéza glykoproteinů vykazuje značný rozdíl mezi normálními a infikovanými buňkami. Ve skutečnosti při koncentraci 0,5 mM (která inhibuje z 50 % replikaci viru) kyselina glycyrrhizová způsobuje snížení inkorporace H³ glukosaminu o více než 10% u infikovaných buněk a žádnou inhibici u normálních buněk. Zvýšená dávka kyseliny glycyrrhizové až na 1 mM způsobuje 80 % redukci virů, žádnou inhibici syntézy u kontrolních buněk a 20 % snížení syntézy glykoproteinů u infikovaných buněk. Při 4 mM je syntéza glykoproteinů u normálních buněk mírně změněna, ale tvorba vírů je inhibována z 99 % (Pompei R. a Marcialis M. A., „LTgiene Moderna“, 83, 385 až 391 (1985)).

Dále uvedená tabulka A ukazuje výsledky testů prováděných na buňkách infikovaných HSV1, které byly ošetřeny 8mM kyselinou glycyrrhizovou. Infikované buňky byly udržovány v kontaktu s kyselinou glycyrrhizovou po dobu 2 hodiny při 37 °C. Experimentální výsledky v tabulce ukazují, že nastává silný pokles infekce po 12, 17 a 22 hodinách a že si buňky uchovávají svou buněčnou celistvost. Inhibice je v rozsahu asi 2 řádů (logaritmus) po 12 hodinách a 3 řádů (logaritmus) (99,9 %) po 22 hodinách od infekce (Pompei R. a kol., „Nátuře“, 281, No. 5733, 689 až 690 (1979)).

-1 CZ 291932 B6

Tabulka A

Tvorba virů (*PFU/ml) po určitých hodinách

Hodiny	12	17	22
Kontrola	3 χ Ϊ0⁶	5,4 χ 10⁶	2,6x10⁷
Kyselina glycyrrhizová, 8 mM	4,2 χ 10⁴	1,2 χ 10⁴	1,1 χ 10⁴

* PFU = virová jednotka tvořící plak („plaque forming viral unit“)

Z literatury je také známo, že různé typy lysozymů, jako je krůtí lysozym, lidský lysozym, kuřecí 10 lysozym, denaturovaný (tepelně inaktivovaný) kuřecí lysozym a kuřecí lysozym štěpený trypsinem, mají antivirovou aktivitu a obzvláště antiherpetickou (HSV1) aktivitu (Cisani a kol., „Current Microbiology“, 10,35 až 40 (1984)).

Lysozymy jsou ve skutečnosti enzymy, které jsou široce rozšířené v přírodě a které spolupůsobí 15 při obraně organismu proti některým původcům infekcí tím, že způsobují jejich štěpení nebo se podílí na jejich štěpení, tj. na jejich lýze (Jolles a kol., „Mol. Cell. Biochem.“, 63. 165 až 189 (1984); Savé a kol., „Anticancer Res.“, 9, 583 až 592 (1989)).

Kromě toho v literatuře je popsána antivirová aktivita a obzvláště antiherpetická (HSV1) aktivita 20 laktoferrinu (Fujihava T. a Hayashi H. „Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 (HSV1) infection to mouše comea“, Arch. Virol., 140, 1469 až 1472 (1995); Harmsen MC. a kol. „Antiviral effects of plasma and milk protein: lactoferrin shows potent activity against both human immunodeficiency virus and human cytomeqalovirus replication in vitro“, „J. Inf. Dis.“, 172. 380 až 388 (1994)).

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že kyselina glycyrrhizová má synergický efekt na proteiny projevující antivirový účinek.

Podstata vynálezu

Proto prvním předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí farmaceutického přípravku, který se vyznačuje tím, že obsahuje kyselinu glycyrrhizovou a alespoň jeden protein mající antivirový účinek.

Výhodně je protein vybrán ze skupiny, která obsahuje lysozymy a laktoferriny.

Typickými příklady lysozymů jsou krůtí lysozym, lidský lysozym, kuřecí lysozym, tepelně inaktivovaný kuřecí lysozym a kuřecí lysozym štěpený trypsinem. Výhodně se jako lysozym 40 používá kuřecí nebo lidský lysozym.

Typickými příklady laktoferrinů jsou hovězí a lidský laktoferrin.

Farmaceutický prostředek, který je popsán v tomto vynálezu, je užitečný při léčbě místních 45 virových infekcí. Je výhodný proti herpetickým virům, a dokonce zvláště výhodný proti viru Herpes simplex typu 1 (HSV1).

Výhodně jsou farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu připravovány ve formách vhodných pro aplikaci. Příklady vhodných forem pro místní aplikaci jsou krémy, masti a léčivé 50 náplasti.

-2CZ 291932 B6

Dávkovači formy mohou také obsahovat jiné obvyklé složky, jako jsou konzervační prostředky, stabilizátory, povrchově aktivní látky, pufiy, soli pro regulaci osmotického tlaku, emulgátory, sladidla, barviva, aromatizační přísady a podobně.

Množství aktivních složek ve farmaceutické kompozici podle tohoto vynálezu se může pohybovat v širokém rozsahu v závislosti na známých faktorech, jako jsou například stadium a síla infekce, tělesná hmotnost pacienta, typ dávkovači formy, způsob aplikace, počet dávkovačích forem podávaných během dne a účinnost aktivních složek. Ale optimální množství bude snadno stanoveno odborníkem v oboru.

Výhodně bude množství kyseliny glycyrrhizové, lysozymu a/nebo laktoferrinu v dávkovači formě podle tohoto vynálezu takové, aby zajistilo denní aplikaci 0,25 až 8 mg/ml kyseliny glycyrrhizové, 0,5 až 10 mg/ml lysozymu a/nebo 0,1 až 4 mg/ml laktofeninu. Zvláště výhodně bude množství takové, aby zajistilo denní aplikaci 0,5 až 2 mg/ml kyseliny glycyrrhizové, 0,5 až 4 mg/ml lysozymu a/nebo 0,25 až 1 mg/ml laktoferrinu. Dávkovači formy farmaceutického přípravku podle tohoto vynálezu mohou být připraveny podle postupů, které jsou dobře známé farmaceutickému chemikovi a zahrnují míchání, granulaci, lisování, rozpouštění a podobně.

Následující příklady mají objasnit tento vynález bez omezení v jakémkoliv směru.

V experimentech byl použit následující materiál a chemikálie:

- kyselina glycyrrhizová (jako amonná sůl), dodávána firmou FLUKA AG;

- virus Herpes simplex typu 1, dodáván firmou NIH, Rockville, Maryland;

- kuřecí lysozym, dodáván firmou Sigma;

- laktoferrin, dodáván firmou Sigma;

- VĚRO buňky z ledvin afrických opic (Afričan green monkey), dodávány firmou ICN FLOW, Costa Mesa, CA;

- DMEM (Eagle medium modified by Dulbecco), do kterého bylo přidáno telecí fetální sérum, inaktivované po dobu 30 minut při 56 °C, ICN FLOW, COStd MeSd, CA.

Příklad 1

Jednobuněčné vrstvy VĚRO buněk byly zaočkovány na 24 jamkových destičkách a byly infikovány asi 1 virovou infikující jednotkou HSV1 obsahující 100 buněk po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno různé množství (od 0 do 8 mg/ml) kuřecího, krůtího a lidského lysozymu, vzorky byly inkubovány při 37 °C v přítomnosti CO₂ (5 %).

Po 48 hodinách, kdy u kontrol nastal úplný cytopatický efekt, byly buňky dvakrát zmraženy a rozmraženy, a proto popraskaly a uvolnil se virus.

Koncentrace infikujících virových částic, které se vytvořily při každém ředění lysozymu, byly titrovány po odstředění. Titrace byla prováděna po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ředěním obsahu každé jamky od 10“¹ do 10~⁷ a přidáním kjednovrstevným buňkám na mikrotitrační destičce mající 6 jamek pro každé ředění.

Když se objevila infekce, buňky byly zality vrstvou výživného agaru, po 48 hodinách inkubace byly obarveny neutrální červení, makroskopicky viditelné virové plaky byly počítány. Tak byla stanovena procentická inhibice lysozymu na virový plak ve srovnání s kontrolními vzorky.

-3CZ 291932 B6

Experimentální data získaná výše popsaným postupem jsou shrnuta v tabulce 1.

Tabulka 1

Inhibice (%) virových plaků při použití různých lysozymů

Dávky (mg/ml)*	8	6	4	2	1	0,5
kuřecí	93±3	82±4	71±6	60±6	49±5	20±4
krůtí	89±5	80±4	68±5	55±6	45±5	10±3
lidský	90±5	79±6	70±4	59±4	45±3	18±3

* inhibice v % vůči kontrole ± standardní odchylka

Tabulka 1 ukazuje, že:

1) kuřecí lysozym

i) významně inhibuje vznik herpetických virových plaků na VĚRO buňkách;

ii) účinek závisí na dávce;

iii) při dávce 8 mg/ml inhibuje HSV1 z asi 92 %;

iv) 50% inhibiční dávka (ID50) je asi 1 mg/ml;

2) krůtí a lidský lysozym vykazují antiherpetickou aktivitu, která je podobná aktivitě kuřecího lysozymů.

Příklad 2

Byl prováděn stejně jako příklad 1 kromě toho, že bylo přidáno rozdílné množství samotné kyseliny glycyrrhizové v rozsahu od 0 do 1 mg/ml k jednovrstevným VĚRO buňkám, které byly infikovány HSV1. Experimentální výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Kyselina glycyrrhizová - inhibice (%) virových plaků

Dávky (mg/ml)	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Inhibice (%)	0	10±4	27±7	50±8	75±12

Příklad 3

Byl prováděn stejně jako příklad 1 kromě toho, že bylo přidáno 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhizové a rozdílné množství kuřecího lysozymů v rozsahu od 0 do 1 mg/ml k jednovrstevným VĚRO buňkám, které byly infikovány HSV1. Experimentální výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

-4CZ 291932 B6

Tabulka 3

Inhibice (%) virových plaků (Kyselina glycyrrhizová 0,5 mg/ml + různé dávky kuřecího lysozymu)

Kuřecí lysozym dávky (mg/ml)	0,2	0,4	0,6	0,8	1
Inhibice (%)	72±6	83±8	85±8	87±9	88±8

Jak může být vidět z tabulky 3, společné působení kyseliny glycyrrhizové a lysozymů se vyznačuje patrným synergickým účinkem. Například z pohledu součtu aktivit měřených odděleně (tabulka 1 a 2), byla by očekávaná společná inhibice (%) 0,5 mg/ml kuřecího lysozymu a 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhizové asi 35 až 40 %. Naopak výsledky z tabulky 3 dokazují, že inhibice (%) při současném působení obou látek je asi 84 %.

Synergie je potvrzena FIC indexem, který je v případě této zkoušky 0,125.

Jak je známo, FIC index (frakční inhibující koncentrace) je získána dělením 50% virové inhibující koncentrace směsi dvou produktů 50% virovou inhibující dávkou každého produktu zvlášť. FIC index < 0,5 znamená, že je významná synergie mezi dvěma produkty.

Příklad 4

Byl prováděn stejně jako příklad 1 kromě toho, že byla přidána rozdílná množství hovězího a lidského Iaktoferrinu k jednovrstevným VĚRO buňkám, které byly infikovány HSV1.

Experimentální výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

	MTD₅o (mg/ml)*	MDI50 (mg/ml)**
Hovězí laktoferrin	2	0,25
Lidský laktoferrin	3	0,25

* Toxicita vyjádřená jako minimální toxická dávka pro 50 % buněk.

♦* Dávka inhibující 50 % virových plaků na buňkách.

Tabulka 4 ukazuje, že laktoferriny nejsou velmi toxické a že jejich virový účinek je již velmi výrazný při koncentracích, které jsou významně pod toxickými koncentracemi.

Přiklad 5

Byl prováděn stejně jako příklad 1 kromě toho, že bylo přidáno 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhizové a rozdílné množství lidského Iaktoferrinu v rozsahu od 0 do 1 mg/ml k jednovrstevným VĚRO buňkám, které byly infikovány HSV1.

Experimentální výsledky jsou shrnuty v tabulce 5.

-5CZ 291932 B6

Tabulka 5

Inhibice (%) virových plaků (Kyselina glycyrrhizová 0,5 mg/ml + rozdílné dávky lidského laktoferrinu)

L. laktoferrin, dávky (mg/ml)	0	0,0075	0,015	0,031	0,062	0,125	0,250	0,5	1
Inhibice (%)	30±2	30±4	50±6	5O±5	60±10	80±15	100	100	100

Jak je vidět z tabulky 5, společné působení kyseliny glycyrrhizová a laktoferrinu se vyznačuje patrným synergickým účinkem. Například z pohledu součtu aktivit měřených odděleně (tabulka 10 2 a 4) by byla očekávaná společná inhibice (%) 0,25 mg/ml laktoferrinu a 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhizové asi 65 až 75 %. Naopak výsledky z tabulky 5 dokazují, že inhibice (%) při současném působení obou látek je asi 100%.

Synergie je potvrzena FIC indexem, který je 0,06.

Příklad 6

Byl prováděn stejně jako příklad 1 kromě toho, že bylo přidáno 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhi20 zové, 0,1 mg/ml lidského laktoferrinu a rozdílné množství kuřecího lysozymu v rozsahu od 0 do mg/ml k jednovrstevným VĚRO buňkám, které byly infikovány HSV1.

Experimentální výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.

Tabulka 6

Inhibice (%) virových plaků (Kyselina glycyrrhizová 0,5 mg/ml a lidský laktoferrin 0,1 mg/ml + rozdílné dávky kuřecího lysozymu)

Kuřecí lysozym, dávky (mg/ml)	0	0,25	0,5	0,75	1
Inhibice (%)	48±2	95±5	98±2	99±1	100

Jak je vidět z tabulky 6, společné působení kyseliny glycyrrhizové, laktoferrinu a lysozymů se vyznačuje patrným synergickým účinkem. Například z pohledu součtu aktivit měřených odděleně by byla očekávaná společná inhibice (%) 0,1 mg/ml laktoferrinu, 0,5 mg/ml kyseliny glycyrrhizové a 0,5 mg/ml lysozymu asi 65 %. Naopak výsledky v tabulce 6 ukazují, že inhibice (%) při současném působení všech látek je asi 98 %.

Claims

1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kyselinu qlycyrrhizovou a alespoň jeden protein mající antivirový účinek, avšak za předpokladu, že když tímto proteinem je lysozym a prostředek je ve formě vodného roztoku, neobsahuje sůl alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným proteinem je lysozym a/nebo laktoferrin.

3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že lysozym je vybrán ze skupiny obsahující kuřecí lysozym, krůtí lysozym, lidský lysozym, tepelně inaktivovaný kuřecí lysozym, kuřecí lysozym štěpený trypsinem.

4. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že laktoferrin je lidský nebo hovězí laktoferrin.