JP2001178475A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents
固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップInfo
- Publication number
- JP2001178475A JP2001178475A JP37133399A JP37133399A JP2001178475A JP 2001178475 A JP2001178475 A JP 2001178475A JP 37133399 A JP37133399 A JP 37133399A JP 37133399 A JP37133399 A JP 37133399A JP 2001178475 A JP2001178475 A JP 2001178475A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- fragment
- dna fragment
- nucleic acid
- chip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
- B01J2219/00387—Applications using probes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00608—DNA chips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/0061—The surface being organic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
- B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00623—Immobilisation or binding
- B01J2219/00628—Ionic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
- B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00722—Nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
- C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
Abstract
(57)【要約】
【課題】 固相担体表面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応に
よって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安
定に結合を維持することが可能な固定方法を開発し、ブ
ロッキング工程を特に要しないＤＮＡチップを得るこ
と。 【解決手段】 表面に０価遷移金属薄膜が形成された固
相担体の表面に、アルキン基を末端部に有するＤＮＡ断
片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断片をアルキン基末端
部にて０価遷移金属薄膜に結合させることを特徴とする
ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、この方法によ
り得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチップを用
いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有す
る核酸断片を検出する方法。
よって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安
定に結合を維持することが可能な固定方法を開発し、ブ
ロッキング工程を特に要しないＤＮＡチップを得るこ
と。 【解決手段】 表面に０価遷移金属薄膜が形成された固
相担体の表面に、アルキン基を末端部に有するＤＮＡ断
片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断片をアルキン基末端
部にて０価遷移金属薄膜に結合させることを特徴とする
ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、この方法によ
り得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチップを用
いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有す
る核酸断片を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させること
が可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持するこ
とが可能な固定方法、ブロッキング工程を特に必要とし
ないＤＮＡチップ、および核酸断片の検出方法を提供す
ることを、その課題とする。
面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させること
が可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持するこ
とが可能な固定方法、ブロッキング工程を特に必要とし
ないＤＮＡチップ、および核酸断片の検出方法を提供す
ることを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。本発明は、表面に０価遷移金属
薄膜が形成された固相担体の表面に、アルキン基を末端
部に有するＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断
片をアルキン基末端部にて０価遷移金属薄膜に結合させ
ることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定
方法にある。本発明の固定方法において、０価遷移金属
は、銀または銅であることが好ましい。
明によって解決された。本発明は、表面に０価遷移金属
薄膜が形成された固相担体の表面に、アルキン基を末端
部に有するＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断
片をアルキン基末端部にて０価遷移金属薄膜に結合させ
ることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定
方法にある。本発明の固定方法において、０価遷移金属
は、銀または銅であることが好ましい。
【００１３】本発明は、また、上記記載の本発明の固定
方法により得られたＤＮＡチップにもある。
方法により得られたＤＮＡチップにもある。
【００１４】本発明は、さらに、上記記載の本発明のＤ
ＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標
識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮ
Ａチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する
核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡ
チップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定
された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識
を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片
に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にもある。
ＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標
識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮ
Ａチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する
核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡ
チップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定
された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識
を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片
に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にもある。
【００１５】本発明は、さらにまた、上記記載の本発明
のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基
を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性
液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮ
Ａ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダーゼ
イションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そし
てＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成
されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレ
ータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を
介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチッ
プ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検
出方法。
のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基
を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性
液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮ
Ａ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダーゼ
イションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そし
てＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成
されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレ
ータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を
介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチッ
プ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検
出方法。
【００１６】本発明についてさらに詳しく述べる。０価
遷移金属が薄膜状に施された固相担体表面へのＤＮＡ断
片固定は化学結合の形成をもって行われる。一般に遷移
金属と末端アルキンが極めて速やかに化学結合を形成す
ることは広く知られている。例えば、山本明夫著「有機
金属化学」裳華房刊（１９８２年）、山崎博史、若槻康
雄著「有機金属の化学」大日本図書（１９８９年）、山
川浩司、松島美一、久留正雄著「有機金属錯体の化学」
講談社刊（１９８９年）、Ｃｈ．Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏ
ｉｃｈ、Ａ．Ｓａｌｚｅｒ著「オーガノメタリックス，
ア・コンサイス・イントロダクション（Organometallic
s, A Concise Introduction）」ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ刊（１９８９年）、渡部正利、矢野重信、碇屋隆
雄著「錯体化学の基礎」講談社（１９９０年）、伊藤
卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信著「＜化学総説１７
＞前周期遷移金属の有機化学」山崎博史編、学会出版セ
ンター刊（１９９３年）、辻二郎著「遷移金属が拓く有
機合成その多彩な反応形式と最新の成果」（株）化学同
人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｓ．Ｆ．
Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖｅｒｋｒｕｉｊｓｓ
ｅ共著「アプリケーション・オブ・トランジション・メ
タル・キャタリスツ・イン・オーガニック・シンセシス
（Application of Transition Metal Catalysts in Org
anic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ刊（１９９８
年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オーガニック・
シンセシス・イン・ウォーター（Organic Synthesis in
Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＆ Ｐ
ＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８年）などの成書
に、種々の０価遷移金属と末端アルキンが速やかな化学
結合を形成することが記載されている。
遷移金属が薄膜状に施された固相担体表面へのＤＮＡ断
片固定は化学結合の形成をもって行われる。一般に遷移
金属と末端アルキンが極めて速やかに化学結合を形成す
ることは広く知られている。例えば、山本明夫著「有機
金属化学」裳華房刊（１９８２年）、山崎博史、若槻康
雄著「有機金属の化学」大日本図書（１９８９年）、山
川浩司、松島美一、久留正雄著「有機金属錯体の化学」
講談社刊（１９８９年）、Ｃｈ．Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏ
ｉｃｈ、Ａ．Ｓａｌｚｅｒ著「オーガノメタリックス，
ア・コンサイス・イントロダクション（Organometallic
s, A Concise Introduction）」ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ刊（１９８９年）、渡部正利、矢野重信、碇屋隆
雄著「錯体化学の基礎」講談社（１９９０年）、伊藤
卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信著「＜化学総説１７
＞前周期遷移金属の有機化学」山崎博史編、学会出版セ
ンター刊（１９９３年）、辻二郎著「遷移金属が拓く有
機合成その多彩な反応形式と最新の成果」（株）化学同
人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎｄｓｍａ、Ｓ．Ｆ．
Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖｅｒｋｒｕｉｊｓｓ
ｅ共著「アプリケーション・オブ・トランジション・メ
タル・キャタリスツ・イン・オーガニック・シンセシス
（Application of Transition Metal Catalysts in Org
anic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ刊（１９９８
年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オーガニック・
シンセシス・イン・ウォーター（Organic Synthesis in
Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＆ Ｐ
ＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８年）などの成書
に、種々の０価遷移金属と末端アルキンが速やかな化学
結合を形成することが記載されている。
【００１７】一方、本発明の目的である核酸断片の検出
法においては、被検体試料の核酸断片には一般に０価遷
移金属と強固な相互作用を有する基は存在しないため、
０価遷移金属が固相担体表面に露出していても、ハイブ
リダイゼーションの際に被検体試料核酸断片は無差別に
は固相担体表面に結合せず、ハイブリダイゼーションの
有無を検出することができる。
法においては、被検体試料の核酸断片には一般に０価遷
移金属と強固な相互作用を有する基は存在しないため、
０価遷移金属が固相担体表面に露出していても、ハイブ
リダイゼーションの際に被検体試料核酸断片は無差別に
は固相担体表面に結合せず、ハイブリダイゼーションの
有無を検出することができる。
【００１８】本発明はさらに以下のように具体化するこ
とができる。本発明は、末端アルキンを結合したＤＮＡ
断片を準備し、該末端アルキンを有するＤＮＡ断片を含
む水性液を０価遷移金属を薄膜状に施した固相担体上に
点着することにより固定が完了する。
とができる。本発明は、末端アルキンを結合したＤＮＡ
断片を準備し、該末端アルキンを有するＤＮＡ断片を含
む水性液を０価遷移金属を薄膜状に施した固相担体上に
点着することにより固定が完了する。
【００１９】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）０価遷移金属を薄膜状に施した固相担体を作製す
る。 （２）ＤＮＡ断片として、末端アルキンを結合したＤＮ
Ａ断片で、その塩基配列が既知であるものを用いる。
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）０価遷移金属を薄膜状に施した固相担体を作製す
る。 （２）ＤＮＡ断片として、末端アルキンを結合したＤＮ
Ａ断片で、その塩基配列が既知であるものを用いる。
【００２０】（３）（１）で作成した固相担体表面に、
（２）で作成したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着
し、ＤＮＡ断片を固相担体上に固定する。
（２）で作成したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着
し、ＤＮＡ断片を固相担体上に固定する。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の代表的な固定方法につい
て説明する。ゼロ（０）価遷移金属を薄膜状に施された
固相担体の表面に、ＤＮＡ断片を含む水性液を点着し、
ＤＮＡ断片が固相担体表面と化学結合を形成する。この
ように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行い、必要に
よっては加熱処理を施すことによってＤＮＡチップを得
ることができる。
て説明する。ゼロ（０）価遷移金属を薄膜状に施された
固相担体の表面に、ＤＮＡ断片を含む水性液を点着し、
ＤＮＡ断片が固相担体表面と化学結合を形成する。この
ように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行い、必要に
よっては加熱処理を施すことによってＤＮＡチップを得
ることができる。
【００２２】０価遷移金属が薄膜状に施された固相担体
は、蒸着法によって作製することが好ましい。蒸着は、
通常の金蒸着装置を用いて行うことができる。薄膜の厚
さは、０．２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ま
しく、０．３乃至５００ｎｍの範囲にあることがさらに
好ましく、０．５乃至４００ｎｍの範囲あることが特に
好ましい。また、０価遷移金属が薄膜状に施された固相
担体としては、０価金属微粒子（直径は、１０乃至５０
０ｎｍの範囲にあることが好ましい）をポリビニルアル
コール、ゼラチン等のバインダーに分散したものを固相
担体上に塗布して作製したものも好ましく用いることが
できる。この場合には、公知の硬膜剤を用いて硬膜する
ことが好ましい。
は、蒸着法によって作製することが好ましい。蒸着は、
通常の金蒸着装置を用いて行うことができる。薄膜の厚
さは、０．２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ま
しく、０．３乃至５００ｎｍの範囲にあることがさらに
好ましく、０．５乃至４００ｎｍの範囲あることが特に
好ましい。また、０価遷移金属が薄膜状に施された固相
担体としては、０価金属微粒子（直径は、１０乃至５０
０ｎｍの範囲にあることが好ましい）をポリビニルアル
コール、ゼラチン等のバインダーに分散したものを固相
担体上に塗布して作製したものも好ましく用いることが
できる。この場合には、公知の硬膜剤を用いて硬膜する
ことが好ましい。
【００２３】本発明で用いる固相担体は、疎水性、ある
いは親水性の低い担体であることが好ましい。また、そ
の表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ま
しく用いることができる。固相担体の材質としては、ガ
ラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュ
ーセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セ
ルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シ
リコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、
多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物
質、金などの導電性材料などを拳げることができる。多
孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲
にあることが好ましく、２乃至５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしく
はシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処
理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによる
ものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。
いは親水性の低い担体であることが好ましい。また、そ
の表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ま
しく用いることができる。固相担体の材質としては、ガ
ラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュ
ーセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セ
ルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シ
リコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、
多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物
質、金などの導電性材料などを拳げることができる。多
孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲
にあることが好ましく、２乃至５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしく
はシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処
理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによる
ものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。
【００２４】末端アルキンを有するＤＮＡ断片を得る方
法は大別して次の二つの方法が挙げられる。一つは該官
能基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法にて、該官能
基を有するＤＮＡ断片を増幅する方法であり、他の一つ
はアミノ基などの反応性基を有するプライマーを用いて
ＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅したのち、末端アルキン
を有する化合物を連結する方法である。
法は大別して次の二つの方法が挙げられる。一つは該官
能基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法にて、該官能
基を有するＤＮＡ断片を増幅する方法であり、他の一つ
はアミノ基などの反応性基を有するプライマーを用いて
ＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅したのち、末端アルキン
を有する化合物を連結する方法である。
【００２５】通常は後者の方法が容易であり、本発明に
おいても好ましい。末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ
断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に
入手可能である。従って、カップリング成分を固相担体
に固定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、
カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソ
シアナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング
成分や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップ
リング成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮ
Ａ断片のアミノ基と結合させることができる。この中で
はカルボキシル基、ハロスルホニル基、イソシアナト
基、イソチオシアナト基を有するものが好ましく、カル
ボキシル基を有するものは適当な縮合剤（カルボジイミ
ド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好
ましい。
おいても好ましい。末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ
断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に
入手可能である。従って、カップリング成分を固相担体
に固定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、
カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソ
シアナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング
成分や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップ
リング成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮ
Ａ断片のアミノ基と結合させることができる。この中で
はカルボキシル基、ハロスルホニル基、イソシアナト
基、イソチオシアナト基を有するものが好ましく、カル
ボキシル基を有するものは適当な縮合剤（カルボジイミ
ド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好
ましい。
【００２６】末端アルキンを有するＤＮＡ断片を固相担
体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水お
よび有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができ
る。酸としては無機酸および有機酸のいずれでも用いる
ことができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫
酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフル
オロ酢酸、酢酸が好ましい。
体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水お
よび有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができ
る。酸としては無機酸および有機酸のいずれでも用いる
ことができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫
酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフル
オロ酢酸、酢酸が好ましい。
【００２７】塩基としては、無機塩基および有機塩基の
何れも用いることができるが、１メチル−２−ピロリド
ン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムあるい
は炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−メ
チル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピリ
ジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２−
ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱する場合
には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあることが
好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に好
ましい。
何れも用いることができるが、１メチル−２−ピロリド
ン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムあるい
は炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−メ
チル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピリ
ジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２−
ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱する場合
には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあることが
好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に好
ましい。
【００２８】表面処理された固相担体表面上には、さら
に、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤か
らなる層を設けてもよい。このような層を設けることに
よって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減すること
ができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親
水性高分子等を含有させることも可能であり、このよう
な処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。
に、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤か
らなる層を設けてもよい。このような層を設けることに
よって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減すること
ができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親
水性高分子等を含有させることも可能であり、このよう
な処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。
【００２９】末端アルキンを有するＤＮＡ断片は、当該
官能基とリン酸エステル基との間に、合成の都合上、ク
ロスリンカーを有していてもよい。クロスリンカーは、
単結合、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノアル
キレン基であることが好ましく、単結合、ヘキシレン基
あるいはＮ−メチルアミノへキシレン基であることが特
に好ましい。
官能基とリン酸エステル基との間に、合成の都合上、ク
ロスリンカーを有していてもよい。クロスリンカーは、
単結合、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノアル
キレン基であることが好ましく、単結合、ヘキシレン基
あるいはＮ−メチルアミノへキシレン基であることが特
に好ましい。
【００３０】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
【００３１】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
【００３２】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
【００３３】また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点
着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃
至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃
至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００３４】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００３５】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
【００３６】表面に０価遷移金属薄膜が形成された固相
担体の表面にに、アルキン基を有するＤＮＡ断片を点着
させると、該ＤＮＡ断片が固相担体表面の一部に固定さ
れる。該ＤＮＡ断片が固定されていない薄膜部分には、
ハイブリダイゼーションの際に、標識された核酸断片試
料が非特異的な反応によって固定される可能性があるた
め、予め、その薄膜部分をブロッキング処理（ブロッキ
ング処理を施さなくても、本発明の固定方法によって製
造された、ＤＮＡ断片固定固相担体は、充分にＤＮＡチ
ップとして使用することができる。）しておくことも好
ましい。ブロッキング処理に使用されるブロッキング試
剤としては、水溶性の末端アルキン化合物、あるいは水
溶性のメルカプト化合物を用いることが好ましく、具体
例としては、プロパルギルアルコール、３−スルホフェ
ニルアセチレン、チオグリコール酸、あるいはチオサリ
チル酸を挙げることができる。
担体の表面にに、アルキン基を有するＤＮＡ断片を点着
させると、該ＤＮＡ断片が固相担体表面の一部に固定さ
れる。該ＤＮＡ断片が固定されていない薄膜部分には、
ハイブリダイゼーションの際に、標識された核酸断片試
料が非特異的な反応によって固定される可能性があるた
め、予め、その薄膜部分をブロッキング処理（ブロッキ
ング処理を施さなくても、本発明の固定方法によって製
造された、ＤＮＡ断片固定固相担体は、充分にＤＮＡチ
ップとして使用することができる。）しておくことも好
ましい。ブロッキング処理に使用されるブロッキング試
剤としては、水溶性の末端アルキン化合物、あるいは水
溶性のメルカプト化合物を用いることが好ましく、具体
例としては、プロパルギルアルコール、３−スルホフェ
ニルアセチレン、チオグリコール酸、あるいはチオサリ
チル酸を挙げることができる。
【００３７】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
【００３８】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
【００３９】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
【００４０】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００４１】試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調
べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを
含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製すること
が好ましい。
べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを
含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製すること
が好ましい。
【００４２】ハイブリダイゼーション操作は、９６穴も
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
【００４３】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
【００４４】
【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）０価の遷移金属を薄膜状に施したスライド（Ｃ）
の作成 スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）の上に金属銀
（０価）を蒸着したものを作製し、スライド（Ｃ）とし
た。
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）０価の遷移金属を薄膜状に施したスライド（Ｃ）
の作成 スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）の上に金属銀
（０価）を蒸着したものを作製し、スライド（Ｃ）とし
た。
【００４５】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を５−ヘキ
シノイックアシッド（東京化成工業（株）製）および１
−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩（いずれも東京化成工業（株）製）で処理
し、３'末端に５−ヘプチノイルアミノ基が導入された
ＤＮＡ断片を作成した。このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×１０
-6Ｍ、１μＬ）とし、上記（１）で得たスライド（Ｃ）
にこれを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライ
ドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このス
ライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に
希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との
混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄
した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍプロ
パルギルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）中に１時間浸
漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断
片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド
（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、それぞれ１５５２であった。本発明の固定
化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに
固定されたことが分かる。
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を５−ヘキ
シノイックアシッド（東京化成工業（株）製）および１
−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩（いずれも東京化成工業（株）製）で処理
し、３'末端に５−ヘプチノイルアミノ基が導入された
ＤＮＡ断片を作成した。このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×１０
-6Ｍ、１μＬ）とし、上記（１）で得たスライド（Ｃ）
にこれを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライ
ドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このス
ライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に
希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との
混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄
した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍプロ
パルギルアルコール水溶液（ｐＨ８．０）中に１時間浸
漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断
片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド
（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、それぞれ１５５２であった。本発明の固定
化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに
固定されたことが分かる。
【００４６】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片を用
いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定さ
れた（Ｄ２）を得た。
いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定さ
れた（Ｄ２）を得た。
【００４７】（２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、５９８であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、５９８であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００４８】
【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面に金属銀を蒸着した場合には、末端アルキン
を結合したＤＮＡ断片を強固に固定することができる。
ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用
することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの
作製を可能になる。その一つの例として、本発明によっ
て作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片との
ハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチッ
プに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核
酸断片を感度よく検出することができる。
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面に金属銀を蒸着した場合には、末端アルキン
を結合したＤＮＡ断片を強固に固定することができる。
ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用
することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの
作製を可能になる。その一つの例として、本発明によっ
て作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片との
ハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチッ
プに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核
酸断片を感度よく検出することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR38 QR55 QR84 QS34 QS39 QX02 QX04 QX05
Claims (5)
- 【請求項１】 表面に０価遷移金属薄膜が形成された固
相担体の表面に、アルキン基を末端部に有するＤＮＡ断
片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断片をアルキン基末端
部にて０価遷移金属薄膜に結合させることを特徴とする
ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。 - 【請求項２】 ０価遷移金属が、銀または銅であること
を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体表
面への固定方法。 - 【請求項３】 請求項１もしくは２に記載の方法により
得られたＤＮＡチップ。 - 【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法。 - 【請求項５】 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検
出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
して相補性を有する核酸断片の検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37133399A JP3975042B2 (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
| US09/749,703 US20010006786A1 (en) | 1999-12-27 | 2000-12-27 | DNA chip and its preparation |
| US10/042,703 US6733975B2 (en) | 1999-12-27 | 2002-03-21 | DNA chip and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37133399A JP3975042B2 (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001178475A true JP2001178475A (ja) | 2001-07-03 |
| JP3975042B2 JP3975042B2 (ja) | 2007-09-12 |
Family
ID=18498529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37133399A Expired - Lifetime JP3975042B2 (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010006786A1 (ja) |
| JP (1) | JP3975042B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9315536B2 (en) | 2006-08-29 | 2016-04-19 | Creatrone, Inc. | Self-assembling oligonucleotides and methods |
| JP6003033B2 (ja) * | 2010-11-11 | 2016-10-05 | ソニー株式会社 | 核酸の検出方法及びサンプルの光学観察方法並びに蛍光体 |
| JP6074911B2 (ja) * | 2012-05-10 | 2017-02-08 | ソニー株式会社 | 核酸解析用マイクロチップ |
-
1999
- 1999-12-27 JP JP37133399A patent/JP3975042B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-27 US US09/749,703 patent/US20010006786A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-03-21 US US10/042,703 patent/US6733975B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20010006786A1 (en) | 2001-07-05 |
| US20030108878A1 (en) | 2003-06-12 |
| JP3975042B2 (ja) | 2007-09-12 |
| US6733975B2 (en) | 2004-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0988398A1 (en) | Nucleic acid arrays | |
| JP2001108683A (ja) | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 | |
| JP3398366B2 (ja) | Ｄｎａ分析用マイクロアレイの製造方法 | |
| JP3523188B2 (ja) | プローブ分子が固定された検出具の水性処理液 | |
| JP3996307B2 (ja) | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 | |
| JP2001183367A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP3975042B2 (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2003329685A (ja) | プローブ分子が固定された検出具の処理方法及び水性処理液 | |
| JP2001183378A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP3342695B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP2001178472A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP3568197B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP2001178470A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP4106215B2 (ja) | 高分子薄膜、高分子薄膜の製造方法、およびバイオチップ | |
| JP2001183368A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP4554110B2 (ja) | Ｄｎａチップ用結合剤、ｄｎａチップ、およびｄｎａチップの製造方法 | |
| JP3857075B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP4285875B2 (ja) | Ｄｎａ断片の固定方法 | |
| JP4054499B2 (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2001178442A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2001178474A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2001128697A (ja) | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 | |
| JP2001178459A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP3808389B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP2001178471A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040824 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20061208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070220 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070423 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070612 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070618 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3975042 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100622 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100622 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110622 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110622 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120622 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120622 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130622 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |