JP2001103987A - 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド

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クック，フィリップ・ダン
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ホーク，グレン
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有
するオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】すべてのヌクレオシドユニットが実質的に
すべてＳｐのホスホロチオエート糖間結合または実質的
にすべてＲｐのホスホロチオエート糖間結合のいずれか
により一緒に連結されているホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド、好ましくは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの
配列の少なくとも一部に相補的であるホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチド、ならびに、実質的にキラル的に
純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドを合成する化学的および酵素的方法
を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願のクロスリファレンス 本出願は、１９９４年８月２９日に出願された、米国特
許出願０８／２９７，７０３の一部継続出願であり、こ
れは、１９９１年１０月１６日に出願され、取り下げら
れた米国特許出願０７／７７７，００７の継続出願であ
る。本出願はまた、１９９３年５月５日に出願された米
国特許出願０８／０５８，０２３の一部継続出願であ
り、これは、１９９１年１０月１５日に出願された米国
特許出願０７／７７７，６７０（米国特許５，２１２，
２９５として１９９３年５月１８日に発行）の分割出願
であり、これは、米国特許出願０７／７７７，００７の
一部継続出願である。上述の各特許出願は、本発明の譲
受人にともに譲渡されており、各出願の全開示を本明細
書の一部としてここに引用する。
【０００２】発明の分野 本発明は、糖間結合により結合したヌクレオシドを含む
配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、お
よびそれらの合成および使用に関する。より詳細には、
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドをつなぐ糖
間結合は、実質的に純粋なすべてＳｐのまたはすべてＲ
ｐのキラルホスホロチオエート結合である。そのような
オリゴヌクレオチドは、化学的または酵素的合成により
製造される。これらは、診断、治療および研究試薬とし
て特によく適している。
【０００３】発明の背景 オリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ
にハイブリダイズすることが知られている。ハイブリダ
イゼーションは、オリゴヌクレオチドの塩基の標的ＲＮ
ＡまたはＤＮＡの塩基への配列特異的塩基対水素結合で
ある。そのような塩基対は互いに相補的であるといわれ
る。
【０００４】オリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイ
ブリダイゼーションの程度の決定においては、オリゴヌ
クレオチドが相補的核酸と結合する相対的能力を、特定
のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を測定する
ことによって比較することができる。融解温度（Ｔｍ）
は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん
形（ハイブリダイズしている）対コイル形（ハイブリダ
イズしていない）が５０％の比率で存在する温度（℃）
を表す。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイ
ゼーション複合体の形成および崩壊（融解）を判定する
ことにより測定される。ハイブリダイゼーションの間に
生ずる塩基のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色
化）を伴う。したがって、ＵＶ吸収の減少はより高いＴ
ｍを示す。Ｔｍがより高くなればなるほど、鎖の間の結
合強度はより大きくなる。
【０００５】オリゴヌクレオチドを用いて、細胞内酵素
ＲＮａｓｅ Ｈを用いる標的ＲＮＡの酵素的切断を行う
ことができる。そのようなＲＮａｓｅ Ｈ切断のメカニ
ズムは、２’−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオ
チドが標的ＲＮＡにハイブリダイズすることを必要とす
る。得られるＤＮＡ−ＲＮＡデュープレックスはＲＮａ
ｓｅ Ｈ酵素を活性化し、活性化された酵素はＲＮＡ鎖
を切断する。ＲＮＡ鎖の切断は、標的ＲＮＡの正常な機
能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
はこのタイプのメカニズムにより作用する。しかし、Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈの細胞性活性
化に有用であるためには、オリゴヌクレオチドは、ＲＮ
ａｓｅ Ｈ活性化に十分な時間細胞内で生き残るため、
ヌクレアーゼに対して適度に安定でなければならない。
非細胞的な用途、例えばオリゴヌクレオチドの研究試薬
としての使用においては、そのようなヌクレアーゼ安定
性は必要ではないだろう。
【０００６】Ｗａｌｄｅｒらのいくつかの刊行物は、Ｒ
Ｎａｓｅ Ｈとオリゴヌクレオチドとの相互作用を記載
する。特に興味深いものは以下のものである：（１）Ｄ
ａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０，１８，４７５１；
（２）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１９９１，１，１１；（３）Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，６４７
２；および（４）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １９９１，１
９，１８０５。これらの刊行物によれば、未修飾ホスホ
ジエステルヌクレオシド間結合と修飾ホスホロチオエー
トヌクレオシド間結合との両方を有するＤＮＡオリゴヌ
クレオチドは、細胞性ＲＮａｓｅ Ｈの基質である。こ
れらは基質であるため、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮ
Ａの切断を活性化する。しかし、著者はさらに、アフリ
カツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚において、ホスホジ
エステル結合およびホスホロチオエート結合の両方がエ
キソヌクレアーゼ分解をも受けることに注目している。
そのようなヌクレアーゼ分解は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化
に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に枯渇させるた
め、有害である。
【０００７】文献（１）、（２）および（４）に記載さ
れるように、なおＲＮａｓｅ Ｈ活性化を与えたままオ
リゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解に対して安定化さ
せるために、ホスホルアミデート、アルキルホスホネー
トまたはホスホトリエステル結合の区域の間に配置され
たホスホジエステル結合ヌクレオチドの短い区域を有す
る２’−デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホ
スホルアミデート含有オリゴヌクレオチドは、エキソヌ
クレアーゼに対して安定化されていたため、文献（４）
においては、著者はそれぞれのホスホルアミデート結合
が、ホスホルアミデート含有オリゴヌクレオチドの測定
Ｔｍ値において１．６℃の低下をもたらしたことに注目
している。このようなＴｍ値の低下は、オリゴヌクレオ
チドとその標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーション
の減少を示している。
【０００８】診断、研究試薬、および治療剤としてのオ
リゴヌクレオチドの適用には、オリゴヌクレオチドが細
胞膜を越えて移送されることまたは細胞により取り込ま
れること、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに適切にハイブリダ
イズすること、および続いて核酸機能を停止または破壊
することが必要である。これらの必須の機能は、部分的
には、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの
初期の安定性に依存する。さらに、これらの機能は、標
的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチド
の特異性に依存する。
【０００９】オリゴヌクレオチドのこれらの目的に関す
る深刻な欠陥は、細胞内および細胞外に存在しうる偏在
する種々のヌクレアーゼによる酵素的分解に対して感受
性であることである。未修飾の、”野生型”オリゴヌク
レオチドは、ヌクレアーゼにより急速に分解されるた
め、治療剤としては有用ではない。したがって、ヌクレ
アーゼ耐性を付与するためのオリゴヌクレオチドの修飾
は、オリゴヌクレオチド治療および診断の開発をめざす
研究の主要な焦点であった。
【００１０】オリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアー
ゼ耐性を増強させることは、一般に糖−リン酸主鎖にお
いて、特にリン原子上で行われてきた。ホスホロチオエ
ートは、ヌクレアーゼに耐性を示すことが報告されてい
る。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは
一般に、天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドよ
り化学的により安定である。ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドはまた、水性媒体中での溶解性を示す。さ
らに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド−ＲＮＡ
ヘテロデュープレックスは、外来ＲＮａｓｅ Ｈのため
の基質として働くことができる。さらに、ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドは、高い熱力学的安定性を示
す。しかし、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡまたはＤ
ＮＡに確実性をもって結合する能力は、標的ＲＮＡまた
はＤＮＡへのハイブリダイゼーションにとって重要であ
るが、オリゴヌクレオチドのリン原子における修飾は、
種々の程度のヌクレアーゼ耐性を示すものの、一般に劣
ったハイブリダイゼーション特性という欠点を有する
［Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲ
Ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆ
Ｌ，１９８９］。
【００１１】この劣ったハイブリダイゼーションの理由
は、リン原子のプロキラルな性質であろう。修飾された
リンのオリゴヌクレオチドの内部リン原子における修飾
は、ＲｐおよびＳｐ立体異性体を生ずる。
【００１２】現在までに得られた、得られる分子が非対
称の置換基を有する修飾リンオリゴヌクレオチドは、２
n個（ｎはオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート
糖間結合の数と等しい）の異性体を有するラセミ混合物
であった。したがって、１４個の非対称中心を含む１５
−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２
14すなわち１６，３８４個のジアステレオマーを含む。
この観点から、ラセミ混合物においては、少ないパーセ
ントのオリゴヌクレオチドのみが、十分な親和性をもっ
て標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡに特異的にハイブリダイズ
するようである。
【００１３】キラル的に純粋な糖間結合を有する化学的
に合成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
は、これまでのところ、１つまたは２つのジアステレオ
マー性糖間結合のみを有する分子に限定されている。キ
ラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオチドの
合成は、自動化合成によってはまだ達成されていないた
め、配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
の化学的に合成されたラセミ混合物に導入されたキラル
性の効果は最近まで評価されなかった。これは、自動化
合成の間にイオウが非立体特異的に取り込まれるためで
ある。例えば、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３２６：２６３（１９８５）
は、ラセミ糖間結合を有するある種のオリゴヌクレオチ
ドホスホロチオエートを合成したが、１つまたは最大で
も２つのジアステレオマー性リン糖間結合を有するある
種の小さいオリゴマーのジアステレオマーを解明するこ
とができたのみである。
【００１４】しかし、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１
９９１）］は続いてオリゴヌクレオチドの自動化立体制
御合成を報告した。上述の文献に記載される方法は、５
価のホスホロチオイル中心における、塩基により触媒さ
れる求核置換を利用する。
【００１５】酵素的方法を用いる、すべてＲｐの糖間結
合を有するホスホロチオエートの合成は、何人かの著者
により研究されてきた［Ｂｕｒｇｅｒｓ ａｎｄ Ｅｃ
ｋｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，２５４：６８８９（１９７９）；Ｇｕｐｔａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：
７６８９（１９８２）；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｆｒｅｙ，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：１２４５（１９８
１）；およびＥｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｊｏｖｉｎ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２：４５４６（１９８
３）］。Ｂｒｏｄｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２
１：２５７０（１９８２）］、およびＲｏｍａｎｉｕｋ
およびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５７：７６８４（１９８２）］は、ポリＴｐＡおよび
ポリＡｐＴホスホロチオエートを酵素的に合成した。Ｂ
ｕｒｇｅｒｓおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：４７９
８（１９７８）］は、ポリＵｐＡホスホロチオエートを
酵素的に合成した。Ｃｒｕｓｅら［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１９２：８９１（１９８６）］は、３つのジアス
テレオマー性ＲｐのＧｐＣホスホロチオエートダイマー
を天然のホスホジエステル結合により結合させてヘキサ
マーとした。
【００１６】オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合す
る相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体
の融解温度を測定することによって比較することができ
る。融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学
的性質であり、らせん形対コイル形（ハイブリダイズし
ていない）が５０％で存在する温度（℃）を表す。Ｔｍ
は、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの
形成および崩壊（融解）を判定することにより測定され
る。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッ
キングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴う。したがっ
て、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。Ｔｍがより
高くなればなるほど、鎖の間の結合強度はより大きくな
る。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い
不安定化効果を有する。
【００１７】予備的報告［Ｓｔｅｃ，Ｊ．Ｗ．，Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓＡｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｊ
ｕｎｅ １８−２１，１９８９］においては、天然のホ
スホジエステル結合により結合した２つのチミジンメチ
ルホスホネート４量体ジアステレオマーから、糖間結合
に１つを除いてすべて修飾リン酸結合を有するチミジン
ホモポリマー８量体（”１つ以外”）のＲｐ立体コンフ
ィギュレーションまたは”１つ以外”Ｓｐ立体コンフィ
ギュレーションが形成された。１つを除きすべてＲｐの
糖間結合を有するＲｐ”１つ以外”メチルホスホネート
配列非特異的チミジンホモ８量体、すなわち（ｄＴ）8
は、１５量体デオキシアデノシンホモポリマー、すなわ
ち（ｄＡ）15と、”１つを除く”Ｓｐコンフィギュレー
ションメチルホスホネート結合を有する同様のチミジン
ホモポリマー、すなわち１つを除きすべてＳｐの糖間結
合を有するｄ（Ｔ）15とｄ（Ａ）15により形成されたハ
イブリッド（Ｔｍ＜Ｏ℃）よりも、熱力学的により安定
なハイブリッド（Ｔｍ ３８℃）を形成したことに注目
されたい。天然のホスホジエステル結合を有する（ｄ
Ｔ）8、すなわちオクタチミジル酸とｄ（Ａ）15との間
のハイブリッドは、１４℃のＴｍを有することが報告さ
れている。
【００１８】より最近では、Ｕｅｄａら［Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５４７（１
９９１）］は、翻訳系において用いるための、Ｒｐジア
ステレオマー性ホスホロチオエート結合を断続的に取り
込んだｍＲＮＡを酵素的に合成した。Ｕｅｄａらは、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼのための１７のプロモーターおよ
び１つの停止部位を有するＴ７コリファンＤＮＡを用い
た。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ合成は、
数百から数万個のヌクレオチドを有するｍＲＮＡを生成
した。
【００１９】主鎖キラル性はまた、ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロデュープレックスの
ＲＮａｓｅ Ｈ活性に対する感受性に影響を与えるであ
ろう。ＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドヘテロデュープレックス中のＲＮＡ成分の切断を引
き起こすことが示唆されているため、ＲＮａｓｅ Ｈの
ためのテンプレートとして働く能力は著しい治療的意味
を有する。ＲｐおよびＳｐ糖間結合のラセミ混合物を含
むオリゴヌクレオチドについては、すべてのホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈの基質と
して同等に機能しうるか否かはわかっていない。種々の
触媒反応について、核酸のホスホジエステル主鎖の加水
分解は、立体特異的メカニズム（インラインメカニズ
ム）およびコンフィギュレーションの反転により進行す
る。したがって、ラセミ混合物には、最大のハイブリダ
イゼーション効率および翻訳の停止のための正しいキラ
ル性を含むオリゴヌクレオチドは少ないパーセンテージ
でのみ存在するであろう。すなわち、ヘテロデュープレ
ックス中でＲＮａｓｅ Ｈのための基質として働くこと
ができるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのパー
センテージを増加させることは、アンチセンス療法のた
めのより有効な化合物につながるであろう。
【００２０】ハイブリダイゼーションの確実性を増強さ
せるために、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが非常に望ま
れている。さらに、そのような実質的にキラル的に純粋
な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは、より有効な治療化合物につながるであろう。し
かし、これまでのところ、そのような分子の合成にはほ
とんど成功していない。したがって、実質的にキラル的
に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドを合成する簡単な方法が非常に望まれてい
る。
【００２１】オリゴヌクレオチド治療の開発においてオ
リゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性およびハイブリダ
イゼーションの確実性が非常に重要であることが認識さ
れてきた。ヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチ
ドはまた、研究試薬および診断薬としても望まれてい
る。
【００２２】発明の概要 本発明にしたがえば、すべてのヌクレオシドユニットが
実質的にすべてＳｐのホスホロチオエート糖間結合また
は実質的にすべてＲｐのホスホロチオエート糖間結合の
いずれかにより一緒に連結されているホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは、本発
明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標的Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡの配列の少なくとも一部に相補的であ
る。
【００２３】さらに、本発明にしたがえば、実質的にキ
ラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドを合成する化学的および酵
素的方法が提供される。ここで、前記ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドは、実質的にすべてＲｐのまたは
実質的にすべてＳｐの糖間結合のいずれかにより一緒に
連結された、少なくとも１０ヌクレオシドユニットから
なる。好ましくは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合により連結
された約１０から約５０ヌクレオシドユニットからな
る。より好ましくは、前記ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合によ
り連結された約１５から約３０ヌクレオシドユニットか
らなる。最も好ましくは、前記ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合
により連結された約１７から２１ヌクレオシドユニット
からなる。前記方法は、配列プライマー、テンプレー
ト、および過剰量の４つすべてのキラル的に純粋なヌク
レオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）を組
み合わせることを含む。前記方法はさらに、ポリメラー
ゼの付加およびそれに続く相補的オリゴヌクレオチドか
らのプライマーの切断により、相補的オリゴヌクレオチ
ドを合成することを含む。さらに、前記方法は、前記相
補的オリゴヌクレオチドを前記テンプレートから解離さ
せることを含む。
【００２４】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
る配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを
合成する本発明の方法の別の態様においては、配列プラ
イマー、テンプレートおよびヌクレオシド５’−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）のラセミ混合物を組み合
わせる。実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有し、テ
ンプレートに相補的であるホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドを、ポリメラーゼおよび選択された金属イオ
ンを添加することにより合成する。このようにして合成
されたオリゴヌクレオチドを、テンプレートおよびプラ
イマーから解離させる。
【００２５】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮ
ＡおよびＤＮＡとともに形成されたヘテロデュープレッ
クスの熱力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性
を引き出すのに有用である。さらに、本発明のオリゴヌ
クレオチドは、ＲＮＡの活性を調節するのに有用であ
る。
【００２６】発明の詳細な記載 オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合中のリン原
子は、”プロキラル”であるということができる。ホス
ホジエステル結合の非結合酸素原子が置換または修飾さ
れると、キラルな糖−リン酸結合が生成する。得られる
糖間結合は、Ｓｐ糖間結合またはＲｐ糖間結合のいずれ
かである。天然のホスホジエステル結合の非結合酸素原
子をイオウで置換してホスホロチオエート結合を得る
と、キラル中心が生成し、ＳｐおよびＲｐジアステレオ
マーが生ずる。糖主鎖中のリン原子の実質的にすべてが
ＳｐまたはＲｐである分子は、本明細書においてキラル
的に純粋であると称される。
【００２７】リボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）（ＮＴＰαＳ）および２’−デオキ
シリボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフ
ェート）（ｄＮＴＰαＳ）は、ＬｕｄｗｉｇおよびＥｃ
ｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３１（１９
８９）］の方法論を用いて、ＳｐおよびＲｐのラセミ混
合物として合成された。この例示的合成スキームにおい
ては、非保護ヌクレオシドを、２−クロロ−４Ｈ−１，
３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンと反応さ
せ、これは５’−ヒドロキシル基をホスフィチル化す
る。続くピロホスフェートとの反応により、イオウに対
して反応性である環状トリホスフェート誘導体が生成
し、ＲｐおよびＳｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）、すなわち、α−チオトリホスフェ
ートの混合物が得られる。生成物を、例えば、ＤＥＡＥ
−セファデックスクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ
ＭＲ分光分析法を用いて（特徴的なＲｐまたはＳｐ化学
シフトにより）同定することができる。
【００２８】以下の実施例で示されるように、純粋なＲ
ｐおよびＳｐヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリ
ホスフェート）ジアステレオマーは、例えば、逆相ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィーを用いて製造規模で容易に単離
することができる。このようなＨＰＬＣで単離されたヌ
クレオチドジアステレオマーは、そのようなＲｐおよび
Ｓｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェー
ト）ジアステレオマーの市販試料との分析ＨＰＬＣ比較
により、さらに特性決定することができる。
【００２９】配列特異的な天然のオリゴヌクレオチド、
すなわち天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドの
酵素的合成は、テンプレートおよびプライマーの存在下
で適当なヌクレアーゼを用いることにより行うことがで
きる。同様に、キラル的に混合された糖間結合を有する
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのラセミ混合物
を合成することができる。本発明にしたがえば、そのよ
うな酵素的合成は、配列特異的テンプレートおよびプラ
イマーの存在下に、鏡像異性体に関して純粋なすべてＳ
ｐのまたはすべてＲｐのヌクレオシド５’−Ｏ−（１−
チオトリホスフェート）を適当なヌクレアーゼの基質と
して用いることにより、実質的にキラル的に純粋な糖間
結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドの合成を含むようにさらに発展させることがで
きる。例えば、市販のＤＮＡポリメラーゼであるシーク
エナーゼTM（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎ
ｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いることによ
り、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドテンプレート
およびラセミ体のホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドを合成することができる。このポリメラーゼを用
いることにより、ホスホジエステルおよびホスホロチオ
エートプライマーの両方を伸長することができる。
【００３０】酵素的に合成されたホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドの収量は、テンプレートおよびプライ
マーを繰り返し添加することにより、ポリメラーゼを繰
り返し添加することにより、ヌクレオシド三リン酸を繰
り返し添加することにより、またはこれらのいくつかま
たはすべてを組み合わせることにより最適化することが
できる。例えば、テンプレートおよびプライマーの繰り
返し添加により、酵素的カスケードによる収量は最大化
する。さらなる最適化は、テンプレートとプライマーと
を系の緩衝液中で一緒にプレハイブリダイゼーション
し、つづいて冷却し、ヌクレオシド三リン酸およびポリ
メラーゼを加えることにより行うことができる。
【００３１】適当なポリメラーゼを選択して、ＤＮＡま
たはＲＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを生
成することができる。このようなポリメラーゼとして
は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ、例えば上記に論及したシークエナーゼTM、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリクレノーフラ
グメントポリメラーゼ、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）
ポリメラーゼ、Ｔ４バクテリオファージポリメラーゼ、
修飾Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる
が、必ずしもこれらに制限されない。
【００３２】酵素的合成は、リン原子のキラル中心のま
わりでのコンフィギュレーションの反転を伴って進行す
る。すなわち、すべてＳｐのα−チオトリホスフェート
の使用により、実質的にすべてＲｐのホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドが生じ、すべてＲｐのα−チオト
リホスフェートの使用により、実質的にすべてＳｐのホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じる。本発明
の別の態様においては、ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドは、金属イオンを反応溶液中で用いて一方また
は他方のキラルα−チオトリホスフェートを優先的に取
り込むことを促進することにより、ヌクレオシド−５’
−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）のラセミ混合物か
ら合成することができる。上述したように、ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ合成は、前
駆体ヌクレオシド−α−チオトリホスフェートのキラル
中心のまわりでのコンフィギュレーションの反転を伴っ
て達成される。理論に拘束されることを望むものではな
いが、すべてＲｐのコンフィギュレーションの最適化
は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼを用いる反応緩
衝液中に高濃度のマグネシウムイオンを加えることによ
り達成することができると考えられる。同様に、再度理
論に拘束されることを望むものではないが、すべてＳｐ
のコンフィギュレーションは、反応緩衝液中において高
いマンガンイオン濃度を用いることによって得られると
考えられる。
【００３３】本発明にしたがえば、”実質的にすべて
の”とは、少なくとも７５％の糖間結合がキラル的に純
粋であるすべてのオリゴヌクレオチドを含むことを意味
する。より好ましくは、約８５％から約１００％のキラ
ル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオチドは、
実質的にキラル的に純粋である。最も好ましくは、約９
５％から約１００％のキラル的に純粋な糖間結合を有す
るオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋であ
る。
【００３４】本発明の分脈において、用語”ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド”は、天然に生ずる塩基、
糖およびホスホロチオエート結合から形成されるホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。天然に生ずる
塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよ
びウラシルが含まれる。天然の糖には、β−Ｄ−リボフ
ラノシルおよびβ−Ｄ−２’−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシルが含まれる。”ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド”はまた、ヌクレオシド−５’−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）類似体が適当なポリメラ
ーゼのための基質である程度まで、オリゴヌクレオチド
のホスホロチオエートヌクレオチドユニット中に取り込
まれた修飾された塩基または修飾された糖を含む。本発
明のオリゴヌクレオチドの修飾された塩基には、アデニ
ン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチ
ン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチ
ル、２−プロピルおよび他のアルキル−アデニン、５−
ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、
６−アザシトシンおよび６−アザチミン、シュードウラ
シル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミ
ノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアル
キルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８
−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニ
ン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグア
ニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グ
アニン、他のアザおよびデアザウラシル、他のアザおよ
びデアザチミジン、他のアザおよびデアザシトシン、他
のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグ
アニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−ト
リフルオロシトシンが含まれる。糖成分は、デオキシリ
ボースであってもリボースであってもよい。本発明のオ
リゴヌクレオチドはまた、修飾された核塩基または本発
明の精神に合致する他の修飾、特に、治療、診断または
研究試薬としての使用を容易にするため、そのヌクレア
ーゼ耐性を増加させる修飾を有する核塩基を含んでいて
もよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療お
よび研究試薬として使用することができる。これらは、
有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを適当な薬学的に
許容しうる希釈剤または担体に加えることにより、医薬
組成物中で使用することができる。これらはさらに、蛋
白質の望ましくない生成により特徴づけられる疾患を有
する生物を治療するために用いることができる。生物
を、望ましくない蛋白質をコードする標的核酸の鎖と特
異的にハイブリダイズしうる配列を有する本発明のオリ
ゴヌクレオチドと接触させることができる。
【００３５】治療組成物の処方およびその続いての投与
は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。一般
に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者
に本発明にしたがうオリゴヌクレオチドを、通常は薬学
的に許容しうる担体中で、処置される患者の年齢および
疾患状態の重篤度に依存して、体重１ｋｇあたり０．０
１μｇから１００ｇの範囲の用量で投与する。さらに、
治療計画は、特定の疾患の特性、その重篤度、および患
者の全体的状態に依存して変わるであろう期間継続し、
１日に１回から数年に１回まで拡張することができる。
処置後、患者をその状態の変化についておよび疾患状態
の症状の緩和について監視する。患者が現在の用量レベ
ルに有意に応答しない場合には、オリゴヌクレオチドの
用量を増加することができ、または疾患状態の症状の緩
和が観察された場合、または疾患状態が除去された場合
には、用量を低下させることができる。
【００３６】場合により、他の伝統的な治療モダリティ
ーと組み合わせて、本発明のオリゴヌクレオチドで患者
を処置することがより有効であろう。用量は、治癒が行
われるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、
数日から数ヶ月の処置過程で、治療すべき病状の重篤度
および応答性に依存する。最適用量スケジュールは、患
者の体内での薬剤の蓄積の測定から計算することができ
る。当業者は、最適用量、投与法および反復率を容易に
決定することができる。最適用量は、個々のオリゴヌク
レオチドの相対的効力に依存して変化し、一般に、イン
ビトロおよび動物モデルのインビボで有効であることが
見いだされたＥＣ50に基づいて見積もることができる。
一般に、用量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１０
０ｇであり、１日に１回またはそれ以上、１週間に１
回、１ヶ月に一回または１年に１回、または数年に１
回、与えられる。
【００３７】治療の成功に続き、疾患状態の再発を防ぐ
ため、オリゴヌクレオチドを体重１ｋｇあたり０．０１
μｇから１００ｇ、１日に１回またはそれ以上から数年
に１回の範囲の維持用量で患者に投与する維持療法を行
うことが望ましいであろう。
【００３８】本発明の医薬組成物は、局所または全身の
処置が望まれているか、および処置されるべき領域に依
存して、多くの方法により投与することができる。投与
は、局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、
経口で、または非経口で行うことができる。非経口投与
には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、ま
たは髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）または脳室内
（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与が含まれ
る。
【００３９】局所投与のための処方には、経皮パッチ、
軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座
剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。
通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤
などが必要かまたは望ましいであろう。被覆されたコン
ドーム、手袋等もまた有用であろう。
【００４０】経口投与のための組成物には散剤、顆粒
剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプ
セル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化
剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤
が望まれるであろう。
【００４１】髄腔内または脳室内投与のための組成物に
は、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を含ん
でいてもよい無菌水溶液が含まれる。非経口投与のため
の処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加
剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。
【００４２】本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドは、ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ耐性
およびＲＮａｓｅ Ｈ活性に及ぼすそれらの影響に関し
て、天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよび
ラセミ体ホスホロチオエートヌクレオチドの両方と比較
することができる。同様に、実質的にキラル的に純粋な
糖間結合を有する純粋なホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドを、インビボ試験系において治療の有効性を増
加させる能力について評価することができる。そのよう
な治療の有効性の増加には、薬物動態学または代謝、毒
性学、配剤（すなわち吸収および分布）、および種比較
等の特性が含まれる。
【００４３】すべてＲｐのまたはすべてＳｐの糖間結合
を有するホモポリマーは、安定性および他の特性の最初
の研究には有用であった。しかし、これらのオリゴヌク
レオチドは、標的分子に特異的ではないため、治療的に
はほとんど用途はない。標的核酸に特異的にハイブリダ
イズするためには、特異的配列を有するホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドが必要である。
【００４４】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
る配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
は、標的ＲＮＡおよびＤＮＡとのヘテロデュープレック
スの熱力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を
付与するのに有用である。
【００４５】放射性標識を用いて、実質的にキラル的に
純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドの同定を助けることができる。自動化合成機で
合成されたラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドについては、合成機から得られた水素ホスホネート
オリゴマーの酸化反応のために［35Ｓ］（放射性標識さ
れた元素イオウ）を用いることができる。酵素的に合成
されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの標識
は、［α−32Ｐ］ＡＴＰおよびリガーゼにより、または
ポリメラーゼ反応において［α−35Ｓ］ＡＴＰを用いて
行うことができる。また、放射性標識ヌクレオシドトリ
ホスフェートを、プローブおよび配列決定分析において
用いることができる。オートラジオグラムは標準的な方
法で作成される。
【００４６】本発明のテンプレートは、疾患増強性蛋白
質の合成を指令する核酸配列の領域であることが最も好
ましい。前記テンプレートオリゴヌクレオチドの領域に
対して塩基対を形成する短いオリゴヌクレオチドは、ポ
リメラーゼによるオリゴヌクレオチド合成の出発点を形
成するプライマーとして作用する。
【００４７】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレア
ーゼ切断、例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断に感受
性である部位をその上に有するように選択されたプライ
マーを用いて合成することができる。前記切断部位は、
前記プライマーの３’末端に位置していてもよい。適当
な制限エンドヌクレアーゼによる前記部位における切断
により、最初の５’末端ヌクレオシドを前記プライマー
から得るオリゴヌクレオチドが得られる。本発明の前記
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの別のヌクレオ
シドは、酵素的手段により付加されたヌクレオシドキラ
ルチオトリホスフェートである。
【００４８】選択されたプライマーとともに適当な制限
ヌクレアーゼを選択することにより、所望のホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドの種々の５’−末端ヌクレ
オシドをホスホロチオエートヌクレオチドの５’末端に
適切に配置させることができる。すなわち、互い違いの
切断によりプライマーからの１つのヌクレオシドが新た
に合成された本発明の配列特異的ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドの最初の５’ヌクレオシドとなる限
り、任意のエンドヌクレアーゼ認識部位を設計すること
ができる。このことにより、本発明の酵素的に合成され
たホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの５’末端に
おいて各種のヌクレオシドが生成する。
【００４９】所望の配列の適当なテンプレート上での前
記プライマーの酵素的伸長を完了したら、適当なヌクレ
アーゼを用いることにより、本発明のホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドを前記プライマーから脱離させる
ことができる。例えば、所望のホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドの５’末端にグアノシンヌクレオシドを
取り込ませるために、３’末端に配列ＣＴＧＣＡＧを有
するプライマーを用いることができる。次に、Ｐｓｔ１
制限ヌクレアーゼを用いることにより、Ａ−Ｇ結合を切
断することができる。したがって、このＡ−Ｇ結合のグ
アノシンヌクレオシド成分は、所望のホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオシドとして取
り込まれることができる。他の制限エンドヌクレアーゼ
としては、制限されないが、ＢａｍＨ１、Ｓｍａｌおよ
びＨｉｎＤ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼがある。
【００５０】前記テンプレートとなお会合したオリゴヌ
クレオチドは、前記テンプレートから解離させ、次に、
例えば、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィ
ーによって精製することができる。例えば、適当な精製
は、ＳｅｐＰａｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒ
ｄ，ＭＡ）クロマトグラフィーと組み合わせた標準的な
ポリアクリルアミド／尿素ゲル電気泳動を用いて行うこ
とができる。使用しうる他の有用なクロマトグラフィー
技術は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーである。
【００５１】本発明のキラルホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドはまた、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１
９９１）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗ
ｓｋｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖｏｌ
ｕｍｅ ２０，ｐ．２８５，１９９３］に記載されるよ
うに、１，３，２−オキサチアホスホラン中間体を介し
て化学的に合成することができる。
【００５２】本発明の方法にしたがって合成される実質
的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは、多くの方法によって分析す
ることができる。例えば、得られる実質的にキラル的に
純粋なすべてＳｐのまたはすべてＲｐの糖間結合を有す
る配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの
コンフィギュレーション分析は、［31Ｐ］ＮＭＲ化学シ
フトを用いて判定することができる。このような化学シ
フトは、ホスホロチオエートジヌクレオチドのＲｐエピ
マーを同定するのに使用されている（Ｌｕｄｗｉｇ ａ
ｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６
３１−６３５（１９８９）］。
【００５３】本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドの配列の正確さは、Ｓ１ヌクレアーゼに対するヘ
テロデュープレックスの感受性を使用して判定すること
ができる。
【００５４】ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの
配列は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの３’
−ヒドロキシル基を〔α−32Ｐ〕コルジセピントリホス
フェート（すなわち、３’−デオキシアデノシン−５’
−トリホスフェート）で標識することによって、さらに
確証を高めることができる。得られたオリゴヌクレオチ
ドを酵素的分解に供することもできる。
【００５５】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが相補的鎖に
結合する相対的能力は、実質的にキラル的に純粋な糖間
結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと
その相補的鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融解
温度を測定することによって比較することができる。融
解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質
であり、らせん形対コイル形（ハイブリダイズしていな
い）が５０％の比率で存在する摂氏温度を意味してい
る。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼー
ションの形成および崩壊（融解）を測定することによっ
て測定される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩
基のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴
う。結果的に、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。
Ｔｍが高くなればなるほど、鎖の結合強度はより大きく
なる。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強
い不安定化効果を有する。したがって、オリゴヌクレオ
チドのその標的ＲＮＡへの最適の結合を得るためには、
塩基対ができるだけ最適に近い正確さであることが望ま
しい。
【００５６】本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドはさらに、種々のエキソヌクレアーゼおよびエン
ドヌクレアーゼの分解能力に対する抵抗性に関して評価
することができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドをヌクレアーゼで処理し、次に、例えばポリアクリ
ルアミドゲルによる電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、そし
て適切な染色剤〔例えばＳｔａｉｎｓ ＡｌｌTM（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）〕
を使用して染色することによって分析することができ
る。分解生成物は、レーザー・デンシトメトリーを使用
して定量化することができる。
【００５７】ウシ胎児血清およびヒト血清を使用して、
実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドに対する核酸分解（ｎｕｃ
ｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を評価することができる。例え
ば、実質的にすべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドをこのような仕方で評価す
ることができる。３’または５’末端がキャップされた
分子（１キャップ当たり１つまたはいくつかのホスホロ
チオエート結合を有する）の組み合わせに関する試験を
使用して、最も大きなヌクレアーゼ安定性を生じる組み
合わせを求めることができる。キャッピングは、精製さ
れたＲｐモノマーを使用して配列のキャップ部分を化学
的に合成し、次いで前記キャップをＤＮＡ合成機上のオ
リゴヌクレオチド中に取り込ませることによって行うこ
とができる。キャッピングに関する分析により、核酸分
解安定性に及ぼすキラル性の重要性および、最大の安定
性を得るのに必要とされる結合の数を決定することがで
きる。
【００５８】ＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性に対するホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロデュー
プレックスの感受性も評価することができる。ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを、種々のハイブリダイ
ゼーション温度で、放射性標識した標的ｍＲＮＡ（例え
ばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを介して合成）と共にインキ
ュベートすることができる。次に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ
ａｎｄ Ｈｕｎｔ［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，６４
３３（１９８６））に記載の方法にしたがって、ヘテロ
デュープレックスをＥ．ｃｏｌｉからのＲＮａｓｅ Ｈ
とともに３７℃でインキュベートすることができる。次
に、生成物をノザンブロット分析法によりＲＮａｓｅ
Ｈ活性に関して評価することができる。この方法におい
ては、生成物を１．２％アガロース／ホルムアルデヒド
ゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移す。次に、標
的ｍＲＮＡに相補的なランダムプライマー〔32Ｐ〕−標
識ｃＤＮＡを用いてフィルターを探索し、オートラジオ
グラフィーによって定量化する。各種のホスホロチオエ
ート類似体を比較することにより、ＲＮＡと複合体を形
成したときにＲＮａｓｅ Ｈに対する基質として作用し
うる能力に及ぼすキラル性の影響を調べることができ
る。
【００５９】Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈおよび哺乳
動物ＲＮＡｓｅ Ｈの触媒作用に対するヘテロデュープ
レックスの感受性の比較を行うことができる。ヘテロデ
ュープレックスを、翻訳の条件下にてラビットの網状赤
血球溶解物中でインキュベートし、内在ＲＮａｓｅ Ｈ
によるｍＲＮＡの触媒切断に関して、ノザンブロット分
析によりアッセイすることができる。このことにより、
哺乳動物ＲＮＡｓｅＨ活性に及ぼすキラル性の影響を調
べることができる。
【００６０】実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、細胞
培養のモデルシステムにおける遺伝子発現の阻害に関し
て評価することができる。実質的に純粋なキラル的に純
粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドが遺伝子発現のより強力なまたはより特異的な阻
害剤であるか否かを調べるために、レポーター遺伝子を
標的とするよう設計された、実質的にキラル的に純粋な
糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドを合成し、遺伝子発現の細胞培養モデルにおいて試験
することができる。ベクターｐＳＶ２ＣＡＴを用いて遺
伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を調べることが前
に記載されている［Ｈｅｎｔｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８５：６３４２（１９８８）］。このベクター
は、ＳＶ４０プロモーターの調節制御下の細菌クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有
する。ＣＡＴ ｍＲＮＡの翻訳開始に相補的な配列の、
すべてＲｐの糖間結合を有する１５−ｍｅｒホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＳＶ２ＣＡＴ
をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、次にすべてＲｐ
の糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドで細胞を４８時間処理して、細胞内のＣＡＴ活性を
アッセイすることができる。次に、実質的にキラル的に
純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートの遺伝子発
現の阻害における活性を、ジアステレオマー性糖間結合
を有する化学的に合成したランダムホスホロチオエー
ト、および同じ配列の天然ホスホジエステルオリゴヌク
レオチドと直接比較することができる。
【００６１】ベクターｐＳＶ２ＡＰＡＰ［Ｍａｒｃｕｓ
−Ｓｅｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５７４９（１９８
７）］は、哺乳動物胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子
（ＰＡＰ）を含む。これはまた、遺伝子発現に及ぼすア
ンチセンスの影響を測定するためのレポーターとして使
用することもできる。ＰＡＰは、イントロンおよび他の
ＲＮＡプロセシング信号を含む細菌遺伝子ではなく哺乳
動物遺伝子であるという点において、レポーター遺伝子
としてはＣＡＴを凌ぐ利点を有する。現時点では、ＰＡ
Ｐの発現は、天然の哺乳動物遺伝子の発現における事象
をより近似して模倣すると考えられている。ＣＡＴ ｍ
ＲＮＡに関して前述したような、実質的にキラル的に純
粋な糖間結合を有する１５−ｍｅｒホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドを、類似の配列を有する化学合成し
たラセミ体ホスホロチオエートおよび天然のホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドと平行して調べることができ
る。ＰＡＰおよびＣＡＴレポーター構築物を、遺伝子発
現に及ぼす非特異的影響を調べるための繰り返し実験に
おける対照として用いる。
【００６２】さらに、実質的にキラル的に純粋な糖間結
合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、
インビボでＲＮＡ翻訳の阻害剤として作用するその能力
について評価することができる。種々の治療分野が本発
明のオリゴヌクレオチドによるそのような操作の標的と
することができる。１つの治療分野はＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）により引き起こされる肝炎である。以下のホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ肝炎の
治療に適用を有する：オリゴ＃２５９、CCTTTCGCGA CCC
AACACTA（配列番号１）、オリゴ＃２６０、GCCTTTCGCG
ACCCAACACT（配列番号２）、オリゴ２７０、GTACCACAAG
GCCTTTCGCG（配列番号３）、オリゴ＃３３０、GTGCTCA
TGG TGCACGGTCT（配列番号４）およびオリゴ＃３４０、
TTTAGGATTC GTGCTCATGG（配列番号５）。別の治療分野
は、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）により媒介される
炎症性疾患である。炎症性疾患の治療に適用を有するオ
リゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ−２３０２、GCCCAAGC
TG GCATCCGTCA（配列番号６）が含まれる。別の治療分
野には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により引き起
こされる感染が含まれる。ＩＳＩＳ−２９２２は、ＣＭ
Ｖ網膜炎の治療に適用を有するホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドであり、配列GCGTTTGCTC TTCTTCTTGC G
（配列番号７）を有する。別の治療分野には、蛋白質キ
ナーゼＣ−α（ＰＫＣ−α）により媒介される癌が含ま
れる。ＩＳＩＳ−３５２１は、そのような癌の治療に適
用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであ
り、配列GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA（配列番号８）を有す
る。さらに別の治療分野には、Ｃ−ｒａｆキナーゼ媒介
性癌が含まれる。ＩＳＩＳ−５１３２は、そのような癌
の治療に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドであり、配列TCCCGCCTGT GACATGCATT（配列番号
９）を有する。さらに別の治療分野は、Ｈａ−ｒａｓま
たはＫｉ−ｒａｓにより媒介される癌を含む。以下のホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、そのような癌
の治療に適用を有する：ＩＳＩＳ−２５０３、TCCGTCAT
CG CTCCTCAGGG（配列番号１０）、ＩＳＩＳ−２５７
０、CCACACCGAC GGCGCCC（配列番号１１）、およびＩＳ
ＩＳ−６９５７、CAGTGCCTGC GCCGCGCTCG（配列番号１
２）。別の治療分野にはＨＩＶにより媒介されるＡＩＤ
Ｓおよび他の関連する感染が含まれる。ＩＳＩＳ−５３
２０は、ＡＩＤＳの治療に適用を有するホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドであり、配列TTGGGGTT（配列番
号１７）を有する。上述の配列において、オリゴヌクレ
オチドの個々のヌクレオチドユニットは左から右へ５’
から３’方向に表記される。
【００６３】本発明の分脈において、”ハイブリダイゼ
ーション”とは、相補的ヌクレオチドユニット間の水素
結合を意味し、これはワトソン−クリック、フーグステ
ィーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよ
い。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成に
よって対合する相補的核塩基である。本明細書において
用いる場合、”相補的”とは、２つのヌクレオチドユニ
ット間の配列相補性をも表す。例えば、オリゴヌクレオ
チドのある位置にあるヌクレオチドユニットがＤＮＡま
たはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドユニットと
水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドと
ＤＮＡまたはＲＮＡとはその位置において互いに相補的
であると考えられる。オリゴヌクレオチドとそのＤＮＡ
またはＲＮＡとは、それぞれの分子中の十分な数の対応
する位置が互いに水素結合しうるヌクレオチドユニット
により占められる場合、互いに相補的である。すなわ
ち、”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補
的”とは、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡまたはＤＮ
Ａとの間に安定かつ特異的な結合が生ずるような十分な
程度の相補性を示すために用いられる用語である。オリ
ゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズしうるために
は、その標的ＤＮＡ配列に１００％相補的である必要は
ないことが理解されるであろう。オリゴヌクレオチドの
標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子への結合が標的ＲＮＡまた
はＤＮＡの正常な機能を妨害し、かつ特異的結合が望ま
れる条件、例えば、インビボアッセイまたは治療処置の
場合には生理学的条件下で、またはインビトロアッセイ
の場合にはアッセイを行う条件下で、オリゴヌクレオチ
ドの非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十
分な程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特
異的にハイブリダイズすることができる。
【００６４】特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、以
下の米国特許出願（本発明の譲受人に譲渡されている）
中に明記されているように、治療において、診断とし
て、および研究のために用いることができる。これらの
出願は次の表題を有する：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎ
ｇ ＲＮＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、１９９０年１月１１日
出願の第４６３，３５８号；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、１９８９年
１２月４日出願の第４４５，１９６号；Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓｆｏｒ Ｍｏｄ
ｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｕｓ、１９９０年２月２６日出願の第４
８５，２９７号；Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ Ｍｉｍ
ｉｃｒｙ、１９９０年３月２１日出願の第４９７，０９
０号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ、，１９９０年４月３０日出願の第５１６，９６９
号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒＭｏｄ
ｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｙ
ｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，
１９９０年８月１６日出願の第５６８，３６６号；Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ
ｉｒｕｓ、１９９０年５月１１日出願の第５２１，９０
７号；Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｙｒ
ｉｍｉｄｉｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒＭｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、１９９０年７月２
７日出願の第５５８，８０６号；Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｌｙ
ａｍｉｎｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９０年７月２７日出願の第５５
８，６６３号；Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＲＮＡＳｅｃｏｎｄａｒｙ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９０年５月４日出願の第５
１８，９２９号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍ
ｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＣｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏ
ｎ、１９９０年８月１４日出願の第５６７，２８６号；
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖ
ｉｒｕｓｅｓ、１９９０年８月１４日出願の第５６７，
２８７号；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄ
ａ、１９９０年８月１６日出願の第５６８，６７２号；
およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏＰａｐｉｌｌｏｍ
ａｖｉｒｕｓ、１９９０年１２月３日出願のＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９０／０７０６７号。これらの特許出願は、オリゴヌ
クレオチドの相互作用によりＲＮＡおよびＤＮＡの活性
の改良された調節を行うことのできる多くの手段を開示
している。上記特許出願中に開示される特定の配列を本
発明とともに使用しうる点において、上記米国特許出願
の開示内容を本明細書の一部としてここに引用する。
【００６５】
【実施例】以下の実施例は例示であり、本発明を限定す
るものではない。実施例１ すべてＳｐのまたはすべてＲｐの５’−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）ヌクレオシドの単離 ５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）デオキシヌク
レオシドおよびリボヌクレオシドは、ＯＤＳ Ｈｙｐｅ
ｒｓｉｌ（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｒｕｎ
ｃｏｎ，ＵＫ）を充填したカラムを用い、溶媒Ａ（５ｍ
Ｍのテトラブチルアンモニウムイオンを含む３０ｍＭリ
ン酸カリウム、ｐＨ７．０）および溶媒Ｂ（５ｍＭ水酸
化テトラブチルアンモニウムのメタノール溶液）のアイ
ソクラチック混合物で溶出するＣ−１８逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単離される。ある
いは、２０分間で０％から１５％のアセトニトリルの直
線濃度勾配変化を含む１００ｍＭ炭酸水素トリエチルア
ンモニウム、ｐＨ７．５、を用いると効果的な分離が達
成される。
【００６６】そのようなＨＰＬＣで分離したエナンチオ
マーの純度を確認するため、ＨＰＬＣで分離されたＳｐ
およびＲｐデオキシヌクレオチドエナンチオマーを、
Ｅ．Ｉ．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥか
ら市販品として入手可能なデオキシヌクレオシド５’−
Ｏ−（１−チオトリホスフェート）類と比較する。
【００６７】実施例２ ラセミ体ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドの実質的にすべてＲｐの糖間結合を有
するホスホロチオエート伸長物の合成 ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライ
マーのすべてＲｐのホスホロチオエート伸長物の酵素的
合成は、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼＩ，シークエナー
ゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を
用いて行う。このＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２
１ｍｅｒの天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチド
にハイブリダイズした１８ｍｅｒホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドプライマーを伸長させる。３０ピコモ
ル（ｐｍｏｌ）のプライマーおよびテンプレートを含む
１ＸシークエナーゼTM反応緩衝液（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
Ｈ）（最終用量１０μｌ）を９５℃で５分間加熱し、室
温までゆっくり冷却する。１８０ｐｍｏｌのデオキシ
５’−［α−35Ｓ］シチジントリホスフェートおよびシ
ークエナーゼTM酵素（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベートする。生成物を、２０
％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素変性ゲルを用いるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析す
る。生成物のオートラジオグラフをプライマー／テンプ
レートなしの対照反応と比較する。最終生成物を、例え
ば、酵素的分解によりさらに特性決定する。そのような
分解の１つは、ヘビ毒ホスファターゼ分解である。Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成したジヌ
クレオシドモノホスホロチオエートのヘビ毒ホスファタ
ーゼ分解は、ジヌクレオシドがＲｐコンフィギュレーシ
ョンであることを示す。
【００６８】実施例３ 実質的に純粋なＲｐ糖間結合を
有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCGACTATG
CA AGTAC（配列番号１３）の合成 配列特異的なすべてＲｐのホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドの大規模な酵素的合成は、５５ｍｅｒの天然
ホスホジエステルテンプレートおよび４１ｍｅｒの天然
ホスホジエステルプライマーを用いて行った。テンプレ
ート配列は：GTACTTGCAT AGTCGATCGG AAAATAGGGT TCTCA
TCTCC CGGGATTTGG TTTGAG（配列番号１４）であった。
プライマー配列は、CTCAACCAAA TCCCGGGAGA TGAGAACCCT
ATTTTCCGAT C（配列番号１５）であった。テンプレー
トは所望の特異的配列CGACTATGCA AGTAC（配列番号１
３）に相補的な配列を有するように選択された。５×か
ら１×に希釈されたシークエナーゼTM緩衝液（Ｕ．Ｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌ
ａｎｄ，ＯＨ）を使用した。テンプレートおよびプライ
マーを両方とも２０ｎＭの濃度で４０μＬのこの緩衝液
に加えた。テンプレートおよびプライマーを９５℃で５
分間ハイブリダイズさせ、室温まで冷却した。緩衝液を
冷却後、緩衝液を７ｍＭＤＴＴに調整した。次に、２０
μＬの１：８希釈シークエナーゼTM酵素および各々３２
０μＭのＳｐのＧＴＰαＳ，ＣＴＰαＳ，ＡＴＰαＳお
よびＴＴＰαＳを加えた。反応溶液はＨ2Ｏにより１４
０μＬに調整した。反応液を３７℃で１８時間インキュ
ベートした。反応溶液を常法通り等量のフェノールで２
回抽出し、常法通り−２０℃で２．５容量の１００％エ
タノールで処理することにより沈殿させ、ペレット化
し、５００μＬの７０％エタノールで洗浄し、再びペレ
ット化して乾燥した。沈殿を３０分間２０μＬのＨ2Ｏ
に懸濁し、次に４０μＬのＨ2Ｏ中１ｍＭ ＣａＣｌ2，
２５ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０に調整した。この溶
液を９５℃に５分間維持し、急冷した（すなわち、氷で
非常に急速に冷却した）。４．６μＭ ＤＮａｓｅ Ｉ
を加え、３７℃で１０分間インキュベートすることによ
り、合成されたオリゴヌクレオチドからテンプレートお
よびプライマーを除去した。反応混合物をフェノールで
２回抽出し、上記のごとくエタノールで沈殿させた。沈
殿をＨ2Ｏに再懸濁し、ＳｅｐＰａｋTMクロマトグラフ
ィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と
組み合わせた２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル
電気泳動を用いて精製した。
【００６９】別の合成法においては、ＰｓｔＩ制限ヌク
レアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、プ
ライマー結合ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを
制限部位で切断した。所望のホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドCGACTATGCA AGTAC（配列番号１３）は、Ｓ
ｅｐＰａｋTMクロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と組み合わせたポリアクリ
ルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動を用いて精製した。反
応を通しての反復テンプレート−プライマー付加により
影響される酵素的カスケードを用いて、収率を最適化し
た。カスケード増加合成により２０ｍｌの反応液から７
５ Ａ260単位のすべてＲｐのコンフィギュレーション
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCA AGT
AC（配列番号１３）を得た。
【００７０】実施例４ 自動化ＤＮＡ合成を用いての、
糖間結合のラセミ体混合物を有するホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、常法により水素ホスホネート化
学を用いる自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０Ｂ）で合成した［Ａｇ
ｒａｗａｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７０７９（１９８
８）］。最終カップリング工程後、結合オリゴマーを二
硫化炭素／トリエチルアミン／ピリジン中イオウで酸化
することによりホスホロチオエート結合を発生させた。
イオウ酸化後、水酸化アンモニウムによる標準脱保護法
を使用して支持体からオリゴヌクレオチドを解離させ、
塩基保護基を除去した。ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドは、オリゴヌクレオチド精製カラム（ＯＰＣ；
ＡＢＩ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）クロマトグラフ
ィーおよびＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣを用いて）により精製した。ＨＰＬ
Ｃ精製オリゴヌクレオチドは、続いてエタノールで沈殿
させ、２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素上のゲル電気泳
動または分析用ＨＰＬＣにより最終純度を評価した。オ
リゴヌクレオチド配列の確実性は、ピリジン／水中での
ヨウ素酸化および標準配列決定法により評価した。これ
らのオリゴヌクレオチドは、各々のリン結合において全
ての可能なＲｐおよびＳｐ異性体の組合せの混合物を含
む。
【００７１】実施例５ 熱力学的および速度論的ハイブ
リダイゼーション分析のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
を用いる相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の合成 天然ホスホジエステル結合の短い相補的ＤＮＡオリゴヌ
クレオチドの合成は、ＡＢＩモデル３８０ＢＤＮＡ合成
機による標準自動化合成を利用して実施した。正しい長
さのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製し、標準
技術により配列決定した。
【００７２】Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ハイ
ブリダイゼーション分析のための短い相補的ＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドを合成した。短いＲＮＡを合成するのに
必要とされる多くのサイクルの開始のために高濃度で多
量のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが必要であった。この必
要性のため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼ発現ベクター、ＢＬ２１／ｐＡＲ１２１
９を含む大腸菌株（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹから
入手された）から得た。２Ｌの細胞からの単離により約
３００，０００から５００，０００単位のＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼが得られた。吸光度値＝１．２Ａ600。これ
を短い（１０−３０ヌクレオチド）ＲＮＡ種の合成のた
め十分に濃縮した。合成のため、ＡＢＩ合成機（ＡＢ
Ｉ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＴ７プロ
モーター、および相補的標的配列およびＴ７プロモータ
ーハイブリダイゼーション配列を含むテンプレートを合
成した。テンプレートおよびプロモーターをＨＰＬＣに
より精製し、酵素的合成のために正しい化学種が存在す
ることを確実にした。合成された生成物を２０％ポリア
クリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で精製し、常法により配
列決定した。
【００７３】実施例６ 熱変性 オリゴヌクレオチド（本発明のホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドまたはその他のもの）は、相補的ＤＮＡ
またはＲＮＡオリゴヌクレオチドとともに、各々のオリ
ゴヌクレオチドに対し４μＭの標準濃度で１００ｍＭの
イオン強度緩衝液（８９．８ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ
リン酸ナトリウム，ｐＨ７．０，０．２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中でインキュベートした。試料を９０℃に加熱し、
Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計
（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて最初の吸光度を測定した。
次に試料を徐々に１５℃まで冷却し、熱変性過程の間２
６０ｎｍで吸光度の変化をモニターした。温度を１度ず
つ上げて吸光度を読み、融解曲線の一次導関数をとって
変性プロフィールを分析した。データはまたＴｍおよび
デルタＧを決定するため２相線形回帰分析を用いて分析
した。これらの試験の結果は表１に示されている。
【００７４】
【表１】
【００７５】実施例７ 放射性標識オリゴヌクレオチド
の合成 種々のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの結合ス
トリンジェンシーを定量するため、フィルター結合アッ
セイを利用した。すなわち、これらがＤＮＡまたはＲＮ
Ａとハイブリダイズして、ヘテロデュープレックスを形
成する傾向を定量した。これらのアッセイは放射性標識
オリゴヌクレオチドを必要とする。
【００７６】すべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｐモノマーから精製
された［35Ｓ］−モノマーから酵素的方法により合成し
た。キラル混合糖間結合を含むホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドの自動合成のために、水素ホスホネート
を含むオリゴヌクレオチドを合成し、次にピリジン／二
硫化炭素混合物中で元素状［35Ｓ］存在下で硫化した。
得られた放射性標識ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドはＯＰＣクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣにより
精製することができる。標的ｍＲＮＡをニトロセルロー
スフィルターに適用し、８０℃で２時間焼き、ブロッキ
ングし、続いて放射性標識ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドとハイブリダイズさせた。結合ストリンジェ
ンシーは、温度を高くした後または溶出緩衝液（例えば
トリスＮａＣｌ緩衝液）のイオン強度を増加させた後に
フィルターから溶出された放射性標識オリゴヌクレオチ
ドを定量することにより評価した。溶出されたオリゴヌ
クレオチドはまた、アイソクラチックリン酸緩衝液を利
用したアニオン交換ＨＰＬＣプロトコールにおけるそれ
らの移動度によっても評価した。結果を、糖間結合のラ
セミ体混合物を有するように製造された標準オリゴヌク
レオチドの移動度と比較した。
【００７７】実施例８ ヌクレアーゼ消化 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地中でのホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解速
度の決定は、１０％熱不活性化ＦＣＳを含むダルベッコ
改良必須培地（ＤＭＥＭ）中で実施した。培地に添加す
る前に５５℃で１時間ＦＣＳの熱不活性化を実施した。
ラセミ体およびキラル的に純粋な糖間結合を有するオリ
ゴヌクレオチドについて、別々にヌクレアーゼ消化に対
する耐性を試験した。各々６６μｇ／ｍｌのオリゴヌク
レオチドを別々に培地に添加し、表２に示した時間間隔
で３７℃でインキュベートした。１５μｌのアリコート
をとり、１５μｌの９Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３），０．１Ｍホウ酸および２ｍＭＥＤ
ＴＡに加えた。アリコートをボルテックスにより混合
し、−２０℃で保存した。２０％ポリアクリルアミド／
７Ｍ尿素スラブゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＰＡＧＥ）分析を行った。電気泳動後“Ｓｔａｉｎ
ｓ Ａｌｌ”（Ｓｉｇｍａ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてゲルを染色した。脱染色
後、ゲルをＵｌｔｒａＳｃａｎ ＸＬ装置（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｕ）を用いたレーザーデンシト
メトリーにより分析した。積分を実施し、データはイン
キュベーション前の完全長（ｎ）からｎ−１へのパーセ
ント減少値として表した。Ｒｐのキラル的に純粋な糖間
結合を有するオリゴヌクレオチド配列CGACTATGCA AGTAC
（配列番号６）についての結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
【００７９】表２から明らかなように、実質的にキラル
的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドは、ラセミ体糖間結合を有するホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドよりもより高いヌクレアー
ゼ消化耐性を示した。
【００８０】実施例９ ＲＮａｓｅ Ｈ分析 ラセミ体の、および実質的にキラル的に純粋な糖間結合
を有するホスホロチオエートのＲＮａｓｅ Ｈに対する
感受性を分析した。オリゴヌクレオチド（ＲＮＡに対し
２倍モル過剰）および５μｇ（３．１ｋｂ）のインビト
ロで合成されたｍＲＮＡ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターを用いて）を５μｌのＲＮａｓｅ Ｈハイブリ
ダイゼーション緩衝液中６０℃にて３０分間インキュベ
ートした。試料を徐々に室温まで冷却し、次に３．７ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ，２０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮ
ａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ），１４２ｍＭ ＤＴＴ，
１５０ｍＭ ＫＣｌおよび３ｍＭ ＭｇＣｌ2に調節し
た。試料は３７℃で３０分間インキュベートした。次に
試料をフェノール抽出、エタノール沈殿させ、１．２％
アガロースゲルでの電気泳動、続いてのエチジウムブロ
ミド染色により分析した。ＲＮＡ試料のおおよその長さ
を決定するため、試料と同時にマーカーをゲルに流し
た。
【００８１】実施例１０ ＨＣＶにより引き起こされる肝炎に罹患した患者を、そ
れぞれ実施例３または実施例１９の方法にしたがって合
成した、オリゴ＃２５９（配列番号１）、オリゴ＃２６
０（配列番号２）、オリゴ２７０（配列番号３）、オリ
ゴ＃３３０（配列番号４）またはオリゴ３４０（配列番
号５）で処置する。１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリ
ゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ま
せ、静脈内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去
されるまで必要に応じて反復することができる。
【００８２】実施例１１ ＩＣＡＭ−１により媒介される炎症性疾患に罹患した患
者をＩＳＩＳ−２３０２、すなわち実施例３または実施
例１９にしたがって合成され、配列GCCCAAGCTGGCATCCGT
CA（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドで処置す
る。１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチド
を薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内また
は筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要
に応じて反復することができる。
【００８３】実施例１２ サイトメガロウイルスにより引き起こされる網膜炎に罹
患した患者を、ＩＳＩＳ−２９２２、すなわち実施例３
または実施例１９にしたがって合成され、配列GCGTTTGC
TC TTCTTCTTGC G（配列番号７）を有するオリゴヌクレ
オチドで処置する、１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリ
ゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ま
せ、硝子内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）投与す
る。処置は、感染が除去されるまで必要に応じて反復す
ることができる。
【００８４】実施例１３ ＰＫＣ−α−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳＩＳ−３
５２１、すなわち実施例３または実施例１９にしたがっ
て合成され、配列GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA（配列番号
８）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０
００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許
容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉内投与
する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復
することができる。
【００８５】実施例１４ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳ
ＩＳ−５１３２、すなわち実施例３または実施例１９に
したがって合成され、配列TCCCGCCTGT GACATGCATT（配
列番号９）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１
−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学
的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉
内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じ
て反復することができる。
【００８６】実施例１５ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、それ
ぞれ実施例３または実施例１９にしたがって合成したＩ
ＳＩＳ−２５０３（配列番号１０）、ＩＳＩＳ−２５７
０（配列番号１１）またはＩＳＩＳ−６９５７（配列番
号１２）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−
１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的
に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉内
投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて
反復することができる。
【００８７】それぞれ実施例１６、１７および１８の化
合物１、２および３は、Ｓｔｅｃｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１
９９１）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗ
ｓｋｉ［Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖｏｌｕ
ｍｅ２０、ｐ．２８５，１９９３）の方法にしたがって
合成した。
【００８８】実施例１６ ２−クロロ−１，３，２−オ
キサチアホスホラン（１）の合成 ピリジン（１ｍｏｌ）、ベンゼン（４００ｍＬ）、２−
メルカプトエタノール（０．５ｍｏｌ）および三塩化リ
ン（０．５ｍｏｌ）の混合物を室温で３０分間撹拌す
る。塩化ピリジニウムを濾別し、溶媒を減圧下に蒸発さ
せ、粗生成物を減圧下の蒸留により精製する。７０−７
２℃／２０ｍｍＨｇで沸騰する画分を回収し、31Ｐ Ｎ
ＭＲにより特性決定する。
【００８９】実施例１７ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミ
ノ−１，３，２−オキサチアホスホラン（２）の合成 化合物１（０．２ｍｏｌ）をｎ−ペンタン（３００ｍ
Ｌ）に溶解し、ジイソプロピルアミン（０．４ｍｏｌ）
を滴加する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、その
後ジイソプロピルアミン塩酸塩を濾別し、溶媒を減圧下
に蒸発させて、粗生成物を真空蒸留により精製する。生
成物２は、７０℃／０．１ｍｍＨｇで沸騰する画分とし
て得られ、これを31Ｐ ＮＭＲおよび質量分析により特
性決定する。
【００９０】実施例１８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ルチミジン−３’−Ｏ−［２−チオノ−１，３，２−オ
キサチアホスホラン］（３）の合成 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１０ｍｍｏ
ｌ）および１Ｈ−テトラゾール（１１ｍｍｏｌ）を真空
乾燥し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解する。化合
物２（１１ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応混合物を室温
で２時間撹拌する。乾燥元素イオウ（１５ｍｍｏｌ）を
加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌し、放置する。
次に未反応イオウを濾別し、濾液を減圧下に濃縮する。
残渣をクロロホルム（３ｍＬ）に溶解し、シリカゲル
（２３０−４００メッシュ）カラムクロマトグラフィー
により精製し、最初にクロロホルム、次にクロロホル
ム：メタノール（９７：３）で溶出する。シリカゲル上
のカラムクロマトグラフィーにより化合物３の別々のジ
アステレオマー種を得る。化合物３を酢酸エチルに溶解
し、シリカゲル６０Ｈカラムに負荷する。酢酸エチルを
溶出溶媒として用い、溶出はＨＰＴＬＣ（シリカゲル６
０、展開溶媒として酢酸エチル）によりモニターする。
化合物３の分離されたジアステレオマーを含む画分を減
圧下に濃縮し、残渣を31Ｐ ＮＭＲおよびＨＰＬＣ（Ｌ
ｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５μＭ、溶出剤と
して酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により特性決定す
る。早い溶出画分はＳｐジアステレオマーに対応し、遅
い溶出画分はＲｐジアステレオマーである。
【００９１】実施例１９ 固相自動化合成における５’−ＯＨヌクレオシドとジア
ステレオマー的に純粋な化合物３との反応の立体特異的
制御 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３８０Ｂ自動化ＤＮＡ合成機
を用いて、Ｓｔｅｃらの方法にしたがった。５’−ＯＨ
ヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋なヌクレオシ
ドオキサチアホスホラン、例えば化合物３との間の反応
は、触媒として１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）
ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）の使用を必要とする。自
動化ＤＮＡ合成においてオリゴヌクレオチドを支持体マ
トリックスに結合するために用いられる市販のリンカー
はＤＢＵに対して不安定であるため、リンカーにおける
修飾が必要である。オキサチアホスホラン法によるオリ
ゴヌクレオチド合成のための適当なリンカーは、ＤＢＵ
に耐性であり、濃水酸化アンモニウムにより室温で１時
間以内に加水分解することができる”コハク酸−サルコ
シニル”リンカーである。
【００９２】（Ａ）”コハク酸−サルコシニル”リンカ
ーを用いる、固体マトリックスに結合した５’−Ｏ−ジ
メトキシトリチルヌクレオシドの合成 （１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−サルコシン（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，ＰＡ）（１．６ｍｍｏｌ）を長鎖アルキルアミン−
ＣＰＧ（ＬＣＡ−ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）（２ｇ）に加え、真空下に乾燥した。無水Ｄ
ＭＦ（５ｍＬ）、ピリジン（０．５ｍＬ）およびＤＣＣ
（２．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１２時
間振盪した。次に溶媒を濾別し、支持体をメタノール：
アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ２０ｍ
Ｌ）で洗浄した。支持体をピリジン中のピペリジンの１
０％溶液１０ｍＬで処理することにより、Ｎ−Ｆｍｏｃ
保護基を除去した。Ｎ−サルコシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧ
をメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：
１、３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、真空下に乾燥した。
【００９３】（２）５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌク
レオシドを、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ピリジン（０．２ｍ
Ｌ）およびＤＣＣ（５０ｍｇ）の存在下に、（１）に記
載のようにして得たサルコシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧに加
えた。反応混合物を室温で１２時間振盪し、次にメタノ
ール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ２
０ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、支持体をＮ−メチルイミ
ダゾール：ＴＨＦ（１ｍＬ）および無水酢酸／ルチジン
（１ｍＬ）で１５分間処理した。次に、支持体をメタノ
ール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ１
０ｍＬ）、続いてアセトニトリル（３ｘ１０ｍＬ）で洗
浄し、次に真空下に乾燥した。
【００９４】（Ｂ）次に、ジアステレオマー的に純粋な
活性化ヌクレオシドを、３００倍モル過剰のＤＢＵの存
在下に、サルコシニルＬＣＡ−ＣＰＧ支持体に結合した
オリゴヌクレオチドの上に加えた。活性化ヌクレオシド
のジアステレオマーは、カップリング反応において用い
る前に、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０
Ｈ、溶出溶媒として酢酸エチルを用いる、溶出はＨＰＴ
ＬＣ（シリカゲル６０、展開溶媒として酢酸エチル）に
よりモニターした］で精製した。合成プロトコルは表３
に示される。
【００９５】
【表３】
【００９６】ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの
ジアステレオマー純度は、31Ｐ ＮＭＲにより、ＨＰＬ
Ｃ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５ＡＭ、溶
出剤として酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により、酵素
的に、または電気泳動法により判定することができる。
【００９７】実施例２０ ヒト患者における疾患状態の
治療 本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の疾患状態の治療
に用いることができる。特定の疾患状態であると診断さ
れた患者の治療は、薬学的に許容される処方中の有効用
量のオリゴヌクレオチドを適当な経路で患者に投与する
ことを含む。有効なオリゴヌクレオチド用量は、治療す
べき疾患状態、疾患状態の重篤度および治療される患者
の年齢に依存する。オリゴヌクレオチドの有効用量はそ
のＩＣ50に基づいて決定することができ、これは当業者
には日常的な方法である。あるいは、オリゴマーの有効
用量は、薬物動態学ソフトウエアプログラムＴｏｐＦｉ
ｔを用いることにより決定することができる。例えば、
オリゴヌクレオチドの用量は、疾患状態の進行に依存し
て、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ（子供用）から１０
０ｇ（成人用）まで様々である。同様に、投与の頻度
は、疾患状態の進行に依存し、１日１回またはそれ以上
から、２０年に１度まで様々であろう。
【００９８】オリゴヌクレオチド投与の経路は、治療す
べき疾患状態による。例えば、炎症性疾患について処置
される患者へのオリゴヌクレオチドの投与は、経口また
は直腸経路で行うことができる。ＡＩＤＳに苦しむ患者
の処置の場合には、オリゴヌクレオチド投与の最も有効
な方法は、経口経路または皮下注射によるものであろ
う。癌、例えば乳癌は、皮下注射により処置することが
でき、一方、結腸癌はオリゴヌクレオチドの経口または
直腸投与により処置することができる。中枢神経系の疾
患または疾病は、オリゴヌクレオチドを患者の脊柱また
は脳に送達するために、髄腔内または脳室内投与により
最もよく処置されるであろう。
【００９９】オリゴヌクレオチド投与に続き、患者を疾
患状態に伴う症状の緩和についてモニターすることがで
きる。次に、疾患状態の重篤度および処置に対する反応
性により、用量を調節（増加または減少）することがで
きる。
【０１００】本発明のオリゴヌクレオチドを他の伝統的
治療と組み合わせて投与することが好ましいであろう。
オリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳに苦しむ患者の治療の
ためのＡＺＴ、炎症性疾患、例えば潰瘍性大腸炎の治療
のためのスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎ
ｅ）、および結腸癌の治療のための５−フルオロウラシ
ル等の薬剤と組み合わせて投与することができるが、こ
れらに限定されない。
【０１０１】また、疾患状態について治療が成功した患
者に維持療法を投与することが望ましいであろう。維持
投与計画の一部としてのオリゴヌクレオチド投与の用量
および頻度は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１０
０ｇで、１日１回またはそれ以上から数年に１回まで様
々である。
【０１０２】実施例２１ オリゴヌクレオチドの脳室内
投与 薬剤を患者の脳に直接送達するための脳室内薬剤投与
は、脳を苦しめる疾患を有する患者の治療に望ましいで
あろう。このオリゴヌクレオチド投与のモードを行うた
めに、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者の脳の
脳室内に導入し、これを腹部に外科手術で移植した皮下
注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続する［Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８（１９８４）］。ポン
プを用いてオリゴヌクレオチドを注入し、外部プログラ
ミング装置の補助によって正確な用量調節および用量ス
ケジュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は１８−
２０ｍＬであり、注入速度は０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ
／ｈの範囲であろう。毎日から毎月の投与の頻度および
投与すべき薬剤の体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１
００ｇの範囲の用量に依存して、ポンプ貯蔵器は、３−
１０週間間隔で補充することができる。ポンプの補充
は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に穿刺することに
より行われる。
【０１０３】実施例２２ オリゴヌクレオチドの髄腔内
投与 患者の脊柱に薬剤を導入するための髄腔内薬剤投与は、
中枢神経系の疾患を有する患者の治療に望ましいであろ
う。このオリゴヌクレオチド投与の経路を行うために
は、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者のＬ３−
４腰椎脊柱空間中に移植し、これを上部腹部に外科手術
で移植した皮下注入ポンプに接続する［Ｔｈｅ Ａｎｎ
ａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２
７：９１２（１９９３）およびＣａｎｃｅｒ，４１：１
２７０（１９９３）］。ポンプを用いてオリゴヌクレオ
チドを注入し、外部プログラミング装置の補助によって
正確な用量調節および用量スケジュールの変更を行う。
ポンプの貯蔵器容量は１８−２０ｍＬであり、注入速度
は０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ／ｈの範囲であろう。毎日
から毎月の投与の頻度および投与すべき薬剤の体重１ｋ
ｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲の用量に依存
して、ポンプ貯蔵器は、３−１０週間間隔で補充するこ
とができる。ポンプの補充は、ポンプの自己密封性隔膜
を経皮的に１回穿刺することにより行われる。
【０１０４】実施例２３ ＡＩＤＳに罹患した患者を、ＩＳＩＳ−５３２０、すな
わち実施例３または実施例１９にしたがって合成し、配
列TTGGGGTT（配列番号１７）を有するオリゴヌクレオチ
ドで処置する。体重１ｋｇあたり１−１０００μｇのオ
リゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込
ませ、硝子内投与する。処置は、感染が除去されるまで
必要に応じて反復することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０８／４６８，５６９ (32)優先日 平成７年６月６日(1995．6．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６６，６９２ (32)優先日 平成７年６月６日(1995．6．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７１，９６６ (32)優先日 平成７年６月６日(1995．6．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６９，８５１ (32)優先日 平成７年６月６日(1995．6．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７０，１２９ (32)優先日 平成７年６月６日(1995．6．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ホーク，グレン アメリカ合衆国メリーランド州21771，マ ウント・エアリー，リーフィー・ホロー・ サークル 919

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号７により表され、ヌクレオシド
    ユニットの少なくとも７５％は、Ｓｐホスホロチオエー
    ト３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌ
    クレオチド。
  2. 【請求項２】 ヌクレオシドユニットのすべてがＳｐホ
    スホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合され
    ている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び許容しうる担体を含む組成物。
  4. 【請求項４】 配列番号７により表され、ヌクレオシド
    ユニットの少なくとも７５％は、Ｒｐホスホロチオエー
    ト３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌ
    クレオチド。
  5. 【請求項５】 ヌクレオシドユニットのすべてがＲｐホ
    スホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合され
    ている、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項４記載のオリゴヌクレオチドおよ
    び許容しうる担体を含む組成物。
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