JP2000175681A - 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高い生産効率でニトリルをアミドに変換する
新規な微生物を得る。 【解決手段】 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、
特定の塩基配列である新規な微生物を用い、構造の複雑
なニトリル化合物（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブ
チロニトリルなど）を、高い生産効率でアミド化合物に
変換する。前記微生物としては、ロドコッカス（Rhodoc
occus ）ｓｐ. Ｃｒ４株及びロドコッカス（Rhdococcu
s）ｓｐ．Ａｍ８株などが用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリルからアミ
ドを得るのに有用な微生物、及びその微生物を用いたア
ミド化合物の製造方法に関する

【０００２】

【従来の技術】アミド及びその誘導体は、様々な分野で
利用される有用な化合物であり、例えば、２−ヒドロキ
シ−４−メチルチオ酪酸アミドを加水分解して得られる
２−ヒドロキシ−４−酪酸は、家畜、特に家禽の飼育
に、含硫アミノ酸類の不足を補う目的で添加される飼料
添加物として利用されている。

【０００３】近年、微生物又は微生物より抽出した酵素
の作用を利用して、ニトリルからアミドを生産する方法
が提案されている。微生物としては、例えば、バチルス
（Bacillus）属、バクテリジューム（Bacteridium ）
属、ミクロコッカス（Micrococcus ）属、ブレビバクテ
リウム（Brevibacterium）属に属する微生物（特公昭６
２−２１５１９号公報）、コリネバクテリウム（Coryne
bacterium ）属、ノカルジア（Nocardia）属に属する微
生物（特公昭５６−１７９１８号公報）、シュードモナ
ス（Pseudomonas ）属に属する微生物（特公昭５９−３
７９５１号公報）、ロドコッカス（Rhodococcus ）属、
アルスロバクター（Arthrobacter）属、ミクロバクテリ
ウム（Microbacterium）属に属する微生物（特開昭６１
−１６２１９３号公報）、フサリウム（Fusarium）属に
属する微生物（特開昭６４−８６８８９号公報）、アシ
ネトバクター（Acinetobacter ）属に属する微生物（特
開平２−１５４６９２号公報）などが提案されている。

【０００４】また、ニトリルからアミドを生成する方法
として、キサントバクター（Xanthobacter）属を用いる
方法( 特開平２−１５４６９２号公報）、クレブシエラ
（Klebsiella）属を用いる方法（Arch.Microbiology ，
Vol ．156 ｐ．231 −238(1991））、ストレプトマイ
セス（Streptomyces）属、セラチア（Serratia）属、エ
ルビニア(Erwinia) 属、ツカムレア(Tukamurella) 属、
ゴルドナ（Gordona ）属、モルガネラ（Morganella）
属、プロテウス（Proteus ）属、エンテロバクター（En
terobacter）属、ミクロアスカス（Microascucs ）属、
キャンディダ（Camdida ）属、パントエア（Pantoea ）
属を用いる方法（特開平５−１５３８４号公報）、シト
ロバクター（Citrobacter ）属を用いる方法（特開平５
−３０９８３号公報）、リゾビウム（Rhizobium ）属を
用いる方法（特開平５−２３６９７７号公報）、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium ）属を用いる方法（特開
平６−１４７８６号公報）などが知られている。しか
し、これらの方法は、いずれも生産性が低く、工業的に
効率よくアミドを生成させることが困難である。

【０００５】特開平４−４０８９９号公報には、２−ヒ
ドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルから２−ヒド
ロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドを製造する方法に関
して、ロドコッカス（Rhodococcus ）属、コリネバクテ
リウム（Coynebacterium）属、シュードモナス(Pseudom
onas) 属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アル
カリゲネス（Alcaligenes ）属の微生物を用いることが
開示されている。この文献の実施例には、ロドコッカス
ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous ）ＡＴＣＣ
３３２７８が反応４０時間で４００ｍＭの２−ヒドロ
キシ−４−メチルチオブチロニトリルから２−ヒドロキ
シ−4 −メチルチオ酪酸アミドを最大２５３ｍＭ（濃度
３７．７ｇ/ Ｌ、収率６３％）生成することが記載され
ている。しかし、この方法では、アミド生産速度が１ｇ
/ Ｌ・ｈｒ以下と極めて低く、生産効率及び経済性を向
上できない。

【０００６】また、ＷＯ９８/ ３２８７２には、ロドコ
ッカス（Rhodococcus ）属 strain５２及び５６ｗｔが
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンニトリルから２
−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸アミドを生産するこ
とが記載され、生産方法の詳細も記載されている。しか
し、この方法では反応開始後一時間以内の菌体の比活性
が乾燥菌体１ｇ当たり１００μｍｏｌ/ ｍｉｎ・ｇ- ｄ
ｒｙｃｅｌｌと極めて低く、生産効率の改善が未だ不十
分である。

【０００７】なお、一般に、微生物の水和活性及びアミ
ドへの変換効率は、ニトリルの構造が複雑化するほど小
さくなる。そのため、構造が複雑なニトリルから高い効
率及び速度でアミドを生成させることが困難である。

【０００８】

【本発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目
的は、ニトリルから対応するアミドを効率よく高い生産
速度で製造するのに有用な新規な微生物及びそれを用い
たアミド化合物の製造方法を提供することにある。

【０００９】本発明の他の目的は、ニトリルの構造が複
雑であっても、高い生産速度でアミドを生成できる新規
な微生物及びそれを用いたアミド化合物の製造方法を提
供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するため鋭意検討の結果、ニトリルからアミド化
合物を高い生産性で生成する能力を有する新種の微生物
を見出し、本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明の微生物は、１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１及び配
列番号２に示す塩基配列を含む新種の微生物である。こ
の微生物は、通常、ニトリルをアミドに変換する能力を
有している。前記微生物はロドコッカス（Rhodococcus
）属に属する微生物、例えば、ロドコッカス（Rhodoco
ccus ）ｓｐ．Ｃｒ４株（生命研条寄第６５９６号）、
ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ．Ａｍ８株（生命研
条寄第６５９５号）などであってもよい。さらに、本発
明には、前記微生物又はその処理物をニトリルに作用さ
せアミドに変換させるアミド化合物の製造方法も含まれ
る。前記ニトリルは２−ヒドロキシ−４−メチルチオブ
チロニトリルなどのシアンヒドリンなどであってもよ
い。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の微生物は、１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１及び配列
番号２に示される塩基配列を含み、機能（ニトリルから
アミドを生成する機能）が共通する微生物である限り、
野生株、変異株、又は細胞融合もしくは遺伝子操作法な
どの遺伝的手法により誘導される組換え株などのいずれ
の株であってもよい。

【００１３】前記塩基配列を有する微生物は、多数のニ
トリル分解菌を土壌より分離することにより得ることが
できる。特にニトリルからアミドへの変換能力の高い菌
株としてロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株
及びロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ａｍ８株が例
示できる。これらの微生物は、それぞれ、生命研条寄第
６５９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５９６号）、生命研条
寄第６５９５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５９５号）として
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株は岡山県
岡山市の畑土より採取した土壌から分離された菌株であ
る。この菌株の分離方法としては選択培地での培養によ
る集積法を用いた［選択培地の組成：ペンテンニトリル
０．１ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．４ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７
Ｈ₂ Ｏ ０．０１ｇ、ビタミン混液０．１ｍｌ、ＣｏＣ
ｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．１ｍｇ、ＦｅＳＯ₄ ０．１ｍ
ｇ、蒸留水 １００ｍｌ、ｐＨ６．０］。なお、前記ビ
タミン混液の組成は、蒸留水１リットル中：ビオチン
１００ｍｇ、パントテン酸カルシウム ２０ｍｇ、イノ
シトール １００ｍｇ、ニコチン酸 ２０ｍｇ、ピリド
キシン ＨＣｌ ２０ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸 １０
ｍｇ、リボフラビン １０ｍｇ、葉酸 ０．５ｍｇであ
った。

【００１４】また、ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓ
ｐ. Ａｍ８株は岐阜県岐阜市の水田より採取した土壌か
ら分離された菌株である。この菌株の分離方法として
は、前記Ｃｒ４株と同様に前記組成の培地による集積法
を用いた。

【００１５】前記菌株は、双方ともに好気性のグラム陽
性の桿菌であり、細胞壁組成にメソジアミノピメリン酸
を含み、ミコール酸組成がＣ_40-48 であった。このよう
な菌学的性質より、前記両菌株は、バージェイの細菌分
類書（Bergey's manual ofdeterminative bacterio
logy, ninth edition ，１９９４）に従って、ロド
コッカス（Rhodococcus ）属に属する微生物であること
が明らかとなった。

【００１６】また、前記両菌株について、１６Ｓ リボ
ソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を決定し
た。この塩基配列は、具体的には、前記両菌株よりＤＮ
Ａを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡに対応する１６ＳｒＤＮ
Ａの塩基を慣用のポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法によって増幅し、シークエンサーにより決
定した。両菌株から得られた塩基配列は全く同一であっ
た。決定された塩基配列を配列表の配列番号１及び配列
番号２に示す。さらに、得られた塩基配列に基づいてデ
ータベース検索を行い、前記両菌株と類縁菌との相同性
を調べた。その結果を表１及び２に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】

【００１９】さらに、前記相同性の結果に基づいて系統
樹を作成した。結果を図１に示す。前記両菌株の塩基配
列は、表１及び２に示すように、ロドコッカス（Rhodoc
occus ）属の他の種とは９９．３％以下の相同性を示し
た。従って、前記両菌株は全く新種の微生物であること
が明らかとなった。

【００２０】前記微生物は、ニトリルからアミド化合物
を生成させるのに有用である。ニトリルは、特に制限さ
れず、広い範囲のニトリル化合物から選択できる。代表
的なニトリルは、例えば、式ＲＣＮ又はＲＣＯＣＮで表
わすことができる（式中、Ｒは脂肪族炭化水素基、脂環
族炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基を示し、
これらの基はさらに置換基を有していてもよい）。ニト
リルには、ポリニトリル類も含まれる。すなわち、前記
脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素
基又は複素環基は一価の基に限らず、二価以上の多価基
であってもよい。

【００２１】前記脂肪族炭化水素基には、例えば、アル
キル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチ
ル、ヘキシル、オクチル、デシル基などのＣ_1-12アルキ
ル基、好ましくはＣ_1-6 アルキル基など）、前記アルキ
ル基に対応するアルキレン基（Ｃ_1-12アルキレン基な
ど）などの飽和脂肪族炭化水素基；アルケニル基（ビニ
ル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブ
テニルなどのＣ_2-12アルケニル基など）、前記アルケニ
ル基に対応する２価の基、アルキニル基（エチニル、２
−プロピニルなどのＣ_2-12アルキニル基など）などの不
飽和脂肪族炭化水素基などが含まれる。

【００２２】脂環族炭化水素基には、シクロアルキル基
（例えば、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキ
シル、シクロオクチル基などのＣ_3-10シクロアルキル基
など）、前記シクロアルキル基に対応するシクロアルキ
レン基などの飽和脂環族炭化水素基；シクロアルケニル
基（シクロペンテニル、シクロヘキセニル基などのＣ
_3-10シクロアルケニル基など）、前記シクロアルケニル
基に対応する２価の基などの不飽和脂環族炭化水素基な
どが含まれる。

【００２３】芳香族炭化水素基としては、例えば、フェ
ニル、ナフチルなどのＣ_6-14アリール基、前記アリール
基に対応するアリーレン基などが例示できる。複素環基
には、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選
択された少なくとも１つの原子をヘテロ原子として含む
複素環基が含まれる。複素環基は、芳香族性複素環基、
非芳香族性複素環基、縮合複素環基のいずれであっても
よい。

【００２４】前記複素環基に対応する複素環としては、
例えば、ピロリン、ピロール、ピペリジン、ピペラジ
ン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアゾー
ル、キノリンなどの窒素原子含有複素環；テトラヒドロ
フラン、フラン、ピランなどの酸素原子含有複素環；テ
トラヒドロチオフェン、チオフェンなどの硫黄原子含有
複素環；チアゾリン、チアジアゾリン、チアゾール、チ
アジン、モルホリンなどの窒素原子、酸素原子及び硫黄
原子から選ばれた少なくとも２つのヘテロ原子を有する
複素環などが挙げられる。

【００２５】Ｒで示されるこれらの基は、さらに、ハロ
ゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基（メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピルなどのＣ_1-5 アルキル基な
ど）、アリール基（フェニル、トリル、クロロフェニ
ル、ナフチルなどのＣ_6-14アリール基など）、オキソ
基、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシなどの
Ｃ _1-5 アルコキシ基など）、アリールオキシ基（例え
ば、フェノキシなど）、メルカプト基、アルキルチオ基
（例えば、メチルチオ、エチルチオなどのＣ_1-5 アルキ
ルチオ基など）、アリールチオ基（例えば、フェニルチ
オなどのＣ_6-14アリールチオ基など）、カルボキシル
基、エステル基（例えば、メトキシカルボニルなどのＣ
_1-6 アルコキシカルボニル基；アセトキシなどのＣ_2-12
アシルオキシ基など）、アシル基（例えば、アセチル、
ベンゾイルなどのＣ_2-12アシル基）、アミノ基、モノま
たはジ置換アミノ基（例えば、メチルアミノ、ジメチル
アミノなどのモノまたはジ−Ｃ_1-5 アルキルアミノ
基）、ニトロ基などの置換基を有していてもよい。置換
基の個数は、例えば、１〜４程度である。

【００２６】脂肪族ニトリルには、例えば、炭素数２〜
６程度の飽和又は不飽和脂肪族ニトリル（アセトニトリ
ル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリ
ル、イソバレロニトリルなどの飽和モノニトリル類；マ
ロニトリル、アジポニトリルなどの飽和ジニトリル類；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、シアン化アリ
ル、クロトンニトリルなどの不飽和ニトリル類）などが
含まれる。脂肪族ニトリルには、炭素数３〜８程度のピ
ルボニトリル、例えば、アセチルニトリル、エチルカル
ボニトリルなどのＣ_1-4 アルキルカルボニトリル；ビニ
ルカルボニトリル、アリルカルボニトリルなどのＣ_2-5
アルケニル−カルボニトリルなども含まれる。

【００２７】脂環族ニトリルには、例えば、炭素数４〜
１０程度の飽和脂環族ニトリル［シアノＣ_4-8 シクロア
ルカン（シアノシクロペンタン、シアノシクロヘキサン
など）などの飽和脂環族ニトリル、シアノ−Ｃ_4-8 シク
ロアルケン（シアノシクロペンテン、シアノシクロヘキ
センなど）などの不飽和脂肪族ニトリルなど］などが含
まれる。脂環族ニトリルには、炭素数４〜１２程度のカ
ルボニトリル類、例えば、Ｃ_4-8 シクロアルカンカルボ
ニトリル（シクロペンタンカルボニトリル、シクロヘキ
サンカルボニトリルなど）、Ｃ_4-8 シクロアルケンカル
ボニトリル（シクロペンテンカルボニトリル、シクロヘ
キセンカルボニトリルなど）なども含まれる。

【００２８】芳香族ニトリルには、例えば、ベンゾニト
リル、ｏ−、ｍ−及びｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ
−、ｍ−及びｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−
及びｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−及びｐ−ト
ルベンゾニトリル、２，４−ジクロロベンゾニトリル、
アニソニトリル、α−ナフトニトリル、β−ナフトニト
リル、フェニルカルボニトリル、ナフチルカルボニトリ
ルなどのＣ_6-14芳香族モノニトリル；フタロニトリル、
イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、フタロイル
ジニトリルなどのＣ_6-14芳香族ジニトリルなどが含まれ
る。芳香族ニトリルには、例えば、フェニルアセトニト
リル、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトニトリル、ｐ−メ
トキシフェニルアセトニトリル、ベンジルアセトニトリ
ル、ベンゾイルアセトニトリル、ベンジルカルボニトリ
ル、フェネチルカルボニトリルなどのＣ_7-14アラルキル
基を有するニトリルなども含まれる。

【００２９】複素環式ニトリルには、ヘテロ原子を含む
５又は６員複素環基を有するニトリル化合物、例えば、
２−チオフェンカルボニトリル、シアノチオフェン、シ
アノチアピラン、チアピランカルボニトリルなどのヘテ
ロ原子として硫黄原子を含む５〜６員複素環式ニトリ
ル；シアノフラン、シアノピラン、フランカルボニトリ
ル、ピランカルボニトリルなどのヘテロ原子として酸素
原子を含む５〜６員複素環式ニトリル；シアノピリジ
ン、シアノピラジン、シアノピペリジン、ニコチノニト
リル、イソニコチノニトリルなどのヘテロ原子として窒
素原子を含む５〜６員複素環式ニトリル；シアノチアゾ
ール、シアノジオキソラン、シアノモルホリン、トリア
ジンカルボニトリルなどの２つ以上のヘテロ原子を含む
５〜６員複素環式ニトリルなどが含まれる。また、前記
複素環式ニトリルは複素環にベンゼンなどの芳香族環が
縮合した縮合環式ニトリル（例えば、５−シアノインド
ール、２−シアノクマロン、２−シアノキノリン、２−
シアノベンゾモルホリンなど）であってもよい。

【００３０】好ましいニトリルとしては、アミノ基、ヒ
ドロキシル基などを置換基として有する前記ニトリル類
が挙げられる。特に、アミノニトリル（例えば、アミノ
アセトニトリル、α−アミノプロピオニトリル、α−ア
ミノブチロニトリルなどのα−アミノニトリル；３−ア
ミノプロピオニトリルなどのβ−アミノニトリルな
ど）、シアンヒドリンが好ましい。

【００３１】シアンヒドリンとしては、例えば、下記式
（１）

【００３２】

【化２】

【００３３】（式中、Ｒ¹ は炭化水素基又は複素環基を
表し、これらの基は置換基を有していてもよい）で表さ
れる化合物が例示できる。

【００３４】前記Ｒ¹ で示される炭化水素基、複素環基
及びこれらの基が有していてもよい置換基としては、前
記Ｒについての説明箇所で述べた脂肪族炭化水素基、脂
環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、複素環基及びこれ
らが有していてもよい置換基などが挙げられる。

【００３５】好ましいＲ¹ には、例えば、前記Ｒの説明
箇所で述べた炭素数１〜１２（好ましくは１〜６）程度
のアルキル基、炭素数２〜１２程度のアルケニル基、炭
素数２〜１２程度のアルキニル基、炭素数３〜１０程度
のシクロアルキル基、炭素数６〜１４程度のアリール
基、及びＣ_7-10アラルキル基（フェニルメチル、２−フ
ェニルエチル、１−フェニルエチル、３−フェニルプロ
ピル、４−フェニルブチル基など）などが含まれる。

【００３６】シアンヒドリンの炭素数は、例えば２〜１
８、好ましくは３〜１２、さらに好ましくは３〜８程度
である。シアンヒドリンには、例えば、α−シアンヒド
リン、β−シアンヒドリン、γ−シアンヒドリンなどが
含まれる。

【００３７】α−シアンヒドリンとしては、例えば、下
記式（２）

【００３８】

【化３】

【００３９】（式中、Ｒ² 、Ｒ³ は、同一又は異なっ
て、水素原子、又は置換基を有していてもよい炭化水素
基を示し、Ｒ² とＲ³ は隣接する炭素原子と共に環を形
成していてもよい。但し、Ｒ² とＲ³ は同時に水素原子
ではない）で表わされる化合物が例示できる。

【００４０】前記Ｒ² 、Ｒ³ で示される炭化水素基及び
この炭化水素基が有していてもよい置換基としては、前
記Ｒについての説明箇所で述べた脂肪族炭化水素基、脂
環式炭化水素基、芳香族炭化水素基及びこれらの基が有
していてもよい置換基などが挙げられる。好ましい
Ｒ² 、Ｒ³ には、例えば、前記好ましいＲ¹ などから選
ばれた基が含まれる。

【００４１】Ｒ² とＲ³ が隣接する炭素原子と共に環を
形成する場合の前記環としては、シクロブチル、シクロ
ヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル環などの炭
素数３〜１０程度のシクロアルカン環などが挙げられ
る。

【００４２】α−シアンヒドリンの具体的な例として、
例えば、ヒドロキシアセトニトリル、ラクトニトリル、
ヒドロキシメチルチオアセトニトリル、アセトンシアン
ヒドリン、２−メチルチオラクトニトリル、ヒドロキシ
ジメチルチオアセトニトリル、２−ヒドロキシブチロニ
トリル、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリ
ル、２−ヒドロキシ−２−メチルブチロニトリル、２−
ヒドロキシ−３−メチルブチロニトリル、２−ヒドロキ
シ−３−メチルチオブチロニトリル、２−ヒドロキシペ
ンタンニトリル、２−ヒドロキシヘキサンニトリル、２
−ヒドロキシ−４−メチルチオヘキサンニトリル、２−
ヒドロキシオクタンニトリルなどの飽和脂肪族α−シア
ンヒドリン；２−ヒドロキシ−３−ブテンニトリル、２
−ヒドロキシ−４−メチルチオ−３−ブテンニトリルな
どの不飽和脂肪族α−シアンヒドリン；２−ヒドロキシ
−シクロヘキサンアセトニトリル、シクロペンタノンシ
アンヒドリン、シクロヘキサノンシアンヒドリンなどの
脂環式α−シアンヒドリン；１−シアノ−１−ヒドロキ
シベンゼン、マンデロニトリル、２−ヒドロキシ−３−
フェニルブチロニトリル、２−ヒドロキシ−３−フェニ
ル−４−メチルチオブチロニトリルなどの芳香族α−シ
アンヒドリンなどが挙げられる。

【００４３】β−シアンヒドリンとしては、例えば、３
−ヒドロキシプロパンニトリル、３−ヒドロキシ−３−
メチルチオプロパンニトリル、３−ヒドロキシブチロニ
トリル、３−ヒドロキシ−４−メチルチオニトリル、３
−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシ−４−
メチルチオヘキサンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フ
ェニルプロパンニトリルなどの３−ヒドロキシＣ_3-8 ア
ルカンニトリル；３−ヒドロキシプロパンカルボニトリ
ル、３−ヒドロキシブタンカルボニトリルなどの３−ヒ
ドロキシＣ_3-8 アルカンカルボニトリル；１−シアノ−
２−ヒドロキシシクロペンタン、１−シアノ−２−ヒド
ロキシシクロヘキサンなどの１−シアノ−２−ヒドロキ
シＣ_3-8 シクロアルカン；３−ヒドロキシシクロペンタ
ンカルボニトリル、３−ヒドロキシシクロヘキサンカル
ボニトリルなどの３−ヒドロキシＣ_3-8 シクロアルカン
カルボニトリル；ｏ−シアノフェノール、２−シアノナ
フトール、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニト
リル、３−ヒドロキシ−４−フェニルブチロニトリル、
３−ヒドロキシ−４−メチルチオ−４−フェニルブチロ
ニトリルなどの芳香族β−シアンヒドリンが例示でき
る。

【００４４】γ−シアンヒドリンとしては、例えば、４
−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヒドロキシヘキサン
ニトリルなどの４−ヒドロキシＣ_3-8 アルカンニトリ
ル；３−ヒドロキシヘキサンカルボニトリルなどの３−
ヒドロキシＣ_3-8 アルカンニトリル；４−ヒドロキシ−
４−フェニルブチロニトリルなどの芳香族γ−シアンヒ
ドリンなどが挙げられる。

【００４５】好ましいニトリルには、α−シアンヒドリ
ン（ラクトニトリル、アセトンシアンヒドリンなどの炭
素数３〜８程度の脂肪族α−シアンヒドリンなど）、特
にメチルチオ基を有するα−シアンヒドリン（２−ヒド
ロキシ−４−メチルチオブタンニトリルなど）などが含
まれる。

【００４６】前記ニトリルは慣用の方法で得ることがで
きる。例えば、脂肪族ニトリルは、ハロゲン化アルキル
又は硫酸ジアルキルにシアン化カリウムなどのシアン化
アルカリ等を反応させることにより製造できる。芳香族
ニトリルは、例えば、アミンをジアゾ化した後、シアン
化銅（Ｉ）を反応させる方法などにより製造することが
できる。

【００４７】ニトリルのうち、特に、α−シアンヒドリ
ンは、アルデヒド又はケトンにシアン化水素を作用させ
る方法、アルデヒド又はケトンと亜硫酸水素ナトリウム
との付加物に、シアン化カリウムなどのシアン化アルカ
リ等を作用させる方法などにより製造できる。また、β
−シアンヒドリンは、エポキシドとシアン化水素とを反
応させることによって製造できる。

【００４８】本発明では、前記微生物の菌体又はその処
理物を、前記ニトリルに作用させて、対応するアミド化
合物に変換する。前記微生物は、好ましくは、例えば、
液体培地または平板培地上にて培養した菌体を採取し、
必要に応じて固定化菌体、粗酵素、固定化酵素等の菌体
処理物を調製してニトリル化合物に作用させる。

【００４９】前記微生物を培養する際の培地としては、
微生物が通常資化し得るグルコース、フルクトース、ス
クロース、デキストリン、デンプン等の糖類、グリセロ
ール、ソルビトール、エタノール等のアルコール類、フ
マル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類お
よびその塩類、パラフィン等の炭化水素類などから選択
された少なくとも一種の炭素源；硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム等の窒素源；硫酸マグネシウム、塩化第
二鉄、塩化コバルト等の無機栄養素や金属を含有する培
地、又はこれらの培地に酵母エキス、肉エキス等の天然
有機窒素源を添加した培地などを用いることができる。

【００５０】前記培地には、必要に応じて、微生物の増
殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、
反応生成物であるアミドの生成能力を高める因子（誘導
源や金属）などを添加してもよい。

【００５１】前記誘導源としては、例えば、各々の微生
物に適したアセトニトリル、イソバレロニトリル、イソ
ブチロニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル化合物、
また、アセトアミド、プロピオアミド等のアミド化合物
が含まれる。

【００５２】これらの誘導源及び金属は一種又は二種以
上組み合わせて使用できる。また、前記培地は、液体培
地、固体培地（平板培地など）などであってもよい。微
生物の培養は、生育可能な条件下であればよく、例え
ば、培地のｐＨは、通常、ｐＨ２〜１２、好ましくはｐ
Ｈ４〜１０、さらに好ましくはｐＨ５〜８程度であり、
培養温度は、例えば、５〜６０℃、好ましくは1 ０〜５
０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。培養
は、微生物の活性が最大となるまで培養すればよく、そ
の期間は、例えば、１０時間〜１０日間程度、好ましく
は１〜４日間程度である。微生物の培養は、嫌気性又は
好気性条件下のいずれで行ってもよいが、好気性条件下
で行うのが好ましい。

【００５３】前記微生物の培養物からの菌体の採取は、
慣用の方法、例えば遠心分離法などにより行うことがで
きる。また、菌体の破砕は、例えば、ホモジナイザーな
どにより機械的に行ってもよく、超音波などを用いて行
ってもよい。

【００５４】前記微生物は、生菌体として用いてもよ
く、菌体処理物として用いてもよい。前記処理物として
は、菌体に種々の処理を施したもの、例えば、菌体破砕
物、アセトン処理物、凍結乾燥物、菌体からの抽出物
［酵素（粗酵素又は精製酵素）など］などが含まれる。
これらの菌体又は菌体処理物は、例えば、ポリアクリル
アミドゲル法、含流多糖ゲル法（カラギーナンゲル法な
ど）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの慣用の方法
により固定化して用いてもよい。

【００５５】ニトリルからアミドへの変換は、得られた
菌体又は処理物を含む水又は緩衝液などと、菌体又は処
理物を含む基質（ニトリル化合物）の有機溶媒（ｎ−ヘ
キサン、酢酸エチルなどの非水溶性溶媒）溶液とを含む
二相系における反応により行ってもよく、また、菌体又
は処理物を含む水又は緩衝液の懸濁液に、基質（ニトリ
ル化合物）の緩衝液溶液又は水溶性有機溶媒（エタノー
ルなど）溶液を直接添加、混合する単相系の反応により
行ってもよい。前記基質（ニトリル化合物）は完全に溶
解していなくてもよい。

【００５６】反応系の前記菌体又は菌体処理物の濃度
は、例えば、０．０１〜７０重量％、好ましくは０．０
５〜３０重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％
程度である。基質濃度は、例えば、０．１〜８０重量
％、好ましくは１〜６０重量％程度、さらに好ましくは
５〜５０重量％程度である。

【００５７】反応温度は反応が進行する程度であればよ
く、例えば、０〜６０℃、好ましくは５〜５０℃、さら
に好ましくは１０℃〜４０℃程度である。例えば、水溶
性有機溶媒を添加した系においては、反応系の温度が０
℃以下であってもよい。反応ｐＨは、例えば、３〜１
２、好ましくは４〜１０、さらに好ましくは５〜８程度
である。反応時間は、例えば１分〜１００時間、好まし
くは５分〜５０時間、さらに好ましくは３０分〜３０時
間程度である。

【００５８】前記のような反応により、前記ＲＣＮ、Ｒ
ＣＯＣＮで表されるニトリル化合物は、対応するＲＣＨ
₂ ＮＨ₂ 、ＲＣＯＣＨ₂ ＮＨ₂ （式中、Ｒは前記に同
じ）で表されるアミド化合物に変換される。例えば、ニ
トリルとして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロ
ニトリルを用いると、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ
酪酸アミドが得られる。

【００５９】得られたアミド化合物は、慣用の方法によ
り分離精製できる。例えば、反応液を濃縮、イオン交
換、電気透析、抽出、晶析、膜分離、遠心分離などの分
離手段に供したり、反応液から菌体を遠心分離、膜分離
などによって除去した後、前記分離手段に供する方法な
どにより、目的化合物であるアミド化合物を分離するこ
とができる。

【００６０】また、得られたアミド化合物からは、カル
ボン酸を製造することもできる。例えば、本発明によっ
て得られた２−ヒドロキシアミドなどのアミド化合物
を、特開平１０−１７９１８３号公報に記載されている
方法などに従って加水分解することにより、２−ヒドロ
キシカルボン酸などのカルボン酸が製造できる。特開平
１０−１７９１８３号公報には、微生物をニトリルに作
用させて対応するアミドを生成させ、このアミドを塩基
（水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物など）
の存在下で加水分解して対応するカルボン酸の塩を生成
させ、さらにこのカルボン酸の塩を電気透析して対応す
るカルボン酸と塩基とを生成することが開示されてい
る。この方法と本発明の微生物によるアミド化合物の製
造方法とを組み合わせて用いると、ニトリルの水和触媒
として硫酸を用いることなく重硫酸アンモニウムなどの
副生成物を伴なわずにカルボン酸を得ることもできる。

【００６１】

【発明の効果】本発明の新規な微生物は、特定の塩基配
列を有するので、ニトリルをアミドに変換する能力に優
れ、変換反応に対する（反応活性及び選択性）が高い。
また、ニトリル化合物の構造が複雑であっても、高い生
産速度で対応するアミド化合物を生成できる。さらに、
前記微生物をニトリル化合物に作用させると、効率よく
高い生産性でアミド化合物を製造できる。

【００６２】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００６３】反応生成物の定量は、高速液体クロマトグ
ラフィー［カラム：J'sphere ＯＤＳ−Ｍ８０（４．６
×２５０ｍｍ、ＹＭＣ（株）社製）］を用いて下記条件
で行った。

【００６４】移動相：０．１重量％リン酸：アセトニト
リル：メタノール＝８：１：１ 流速：１．０ｍＬ／分 検出波長：２１０ｎｍ カラム温度：４０℃ 実施例１ （Ａ）培養 ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株及びロド
コッカス（Rhdococcus）ｓｐ．Ａｍ８株を下記の条件で
培養した。 （１）培地組成（単位：ｗ/ ｖ） クロトンアミド ０．５％ 酵母エキス ０．２％ ペプトン ０．０２％ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １．５％ 硫酸マグネシウム５水塩 ０．０５％ 塩化コバルト６水塩 ２×１０^-5％ 硫酸第二鉄７水塩 ２×１０^-5％ 脱イオン水 残部 ＰＨ ６．８ （２）培養条件 斜面培地から１白金耳のロドコッカス（Rhodococcus ）
ｓｐ. Ｃｒ４株及びロドコッカス（Rhdococcus）ｓｐ．
Ａｍ８株の菌体を採取し、これらの菌体をそれぞれ、上
記の組成の液体培地５０ｍｌを入れて滅菌した坂口フラ
スコに植菌し、３７℃で３日間、好気条件下で振盪培養
した。培養終了後、液体培地から菌体を遠心分離により
集菌して、湿菌体を得た。 （Ｂ）反応 ５０ｍＬビーカーに上記湿菌体０．２５ｇと０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ６．０）２３．７５ｇとを仕込み、
攪拌しながら１０℃に冷却した。前記混合液が１０℃に
なったところで２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロ
ニトリル１．９６ｇを加え、１２０分間反応させた。反
応終了後、いずれの菌体の場合においても、反応液中の
２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを完全
に消費していた。また、２−ヒドロキシ−４−メチルチ
オ酪酸アミドの生成量は、いずれも８９．７g ／Ｌであ
り、収率はほぼ１００％であった。また、２−ヒドロキ
シ−４−メチルチオ酪酸アミド生成速度は４５g ／L ・
ｈｒであり、乾燥菌体１ｇ当たりの比活性は７８００μ
ｍｏｌ／ｍｉｎ・ｇ- ｄｒｙｃｅｌｌであった。

【００６５】「配列表フリーテキスト」配列番号１は、
ロドコッカス（Rhodococcus ）ｓｐ. Ｃｒ４株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６５９６号）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩
基配列である。配列番号２は、ロドコッカス（Rhdococc
us）ｓｐ．Ａｍ８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５９５号）の
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。

【００６６】

【配列表】 Sequence Listing <110> Daicel Chemical Industries, Ltd. <120> Novel microorganisms and processes for producing amide compounds <130> P980140 <160> 2 <210> 1 <211> 1480 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> CDS <222> (1)...(1480) <223> 16S rRNA gene of Rhodococcus sp. Cr4 (FERM BP-6596). <400> 1 cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc 60 agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac 120 ttcgggataa gcccgggaaa ctgggtctaa taccggatat gaccatgagc tgcatggctc 180 gtggtggaaa ggtttactgg tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt 240 aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga 360 aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420 gcagggacga agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggccaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg 540 taggcggttt gtcgcgtcgt ctgtgaaaac ccgcagctca actgcgggct tgcaggcgat 600 acgggcagac ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc 660 agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg 720 agcgaaagcg tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg 780 ggcgctaggt gtgggtttcc ttccacggga tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc 840 cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900 cggcggagca tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatat 960 accggatcgc ctcagagatg gggtttccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg 1020 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080 gtgttgccag cacgtaatgt tggggactcg caggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa 1140 ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtccag ggcttcacac atgctacaat 1200 ggccggtaca gagggctgcg ataccgtgag gtggagcgaa tcccttaaag ccggtctcag 1260 ttcggatcgg ggtctgcaac tcgaccccgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca 1320 gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcatgaaag 1380 tcggtaacac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga gggagccgtc gaaggtggga 1440 tcggcgattg ggacgaagtc gtaacaaggt agccgtaccg 1480 <210> 2 <211> 1480 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> CDS <222> (1)...(1480) <223> 16S rRNA gene of Rhodococcus sp.Am8 (FERM BP-6595). <400> 2 cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc 60 agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac 120 ttcgggataa gcccgggaaa ctgggtctaa taccggatat gaccatgagc tgcatggctc 180 gtggtggaaa ggtttactgg tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt 240 aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga 360 aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420 gcagggacga agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggccaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg 540 taggcggttt gtcgcgtcgt ctgtgaaaac ccgcagctca actgcgggct tgcaggcgat 600 acgggcagac ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc 660 agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg 720 agcgaaagcg tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg 780 ggcgctaggt gtgggtttcc ttccacggga tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc 840 cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900 cggcggagca tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatat 960 accggatcgc ctcagagatg gggtttccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg 1020 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080 gtgttgccag cacgtaatgt tggggactcg caggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa 1140 ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtccag ggcttcacac atgctacaat 1200 ggccggtaca gagggctgcg ataccgtgag gtggagcgaa tcccttaaag ccggtctcag 1260 ttcggatcgg ggtctgcaac tcgaccccgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca 1320 gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcatgaaag 1380 tcggtaacac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga gggagccgtc gaaggtggga 1440 tcggcgattg ggacgaagtc gtaacaaggt agccgtaccg 1480

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のロドコッカス（Rhodococcus
）属に属する新種の微生物と類縁菌との１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性に基づく系統樹を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA80 CA03 DA05 GA19 HA20 4B064 AE02 CA02 CB01 CC03 CD12 DA11 4B065 AA45X AC20 BA23 BB12 CA16 CA43

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、
   配列表の配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を含
   む微生物。
2. 【請求項２】 ニトリルをアミドに変換する能力を有す
   る請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 ロドコッカス（Rhodococcus ）属に属す
   る微生物である請求項１記載の微生物。
4. 【請求項４】 微生物が、ロドコッカス（Rhodococcus
   ）ｓｐ．Ｃｒ４株（生命研条寄第６５９６号）である
   請求項１記載の微生物。
5. 【請求項５】 微生物が、ロドコッカス（Rhodococcus
   ）ｓｐ．Ａｍ８株（生命研条寄第６５９５号）である
   請求項１記載の微生物。
6. 【請求項６】 請求項１記載の微生物又はその処理物を
   ニトリルに作用させアミドに変換させるアミド化合物の
   製造方法。
7. 【請求項７】 ニトリルが下記式（１）で表されるシア
   ンヒドリンである請求項６記載のアミド化合物の製造方
   法。 【化１】 （式中、Ｒ¹ は炭化水素基又は複素環基を表し、これら
   の基は置換基を有していてもよい）
8. 【請求項８】 シアンヒドリンがメチルチオ基を有する
   α−シアンヒドリンである請求項７記載のアミド化合物
   の製造方法。
9. 【請求項９】 シアンヒドリンが２−ヒドロキシ−４−
   メチルチオブチロニトリルである請求項７記載のアミド
   化合物の製造方法。
10. 【請求項１０】 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列
    が、配列表の配列番号１及び配列番号２に示される塩基
    配列と９９．４％以上の相同性を示す微生物又はその処
    理物をニトリルに作用させ、前記ニトリルをアミド化合
    物に変換させるアミド化合物の製造方法。