ITMI941594A1 - Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus - Google Patents
Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI941594A1 ITMI941594A1 IT001594A ITMI941594A ITMI941594A1 IT MI941594 A1 ITMI941594 A1 IT MI941594A1 IT 001594 A IT001594 A IT 001594A IT MI941594 A ITMI941594 A IT MI941594A IT MI941594 A1 ITMI941594 A1 IT MI941594A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- process according
- hyaluronic acid
- carried out
- acid
- microorganism
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims description 36
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims description 36
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims description 36
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 title description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 40
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 claims description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 7
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 iron ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N phosphinic acid Chemical compound O[PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 3
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 claims 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 claims 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 2
- 235000010268 sodium methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 2
- PESXGULMKCKJCC-UHFFFAOYSA-M sodium;4-methoxycarbonylphenolate Chemical compound [Na+].COC(=O)C1=CC=C([O-])C=C1 PESXGULMKCKJCC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACNXXUCYLYKAPB-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-pyrrolidin-1-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCCC2)=N1 ACNXXUCYLYKAPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000030795 Annona lutescens Species 0.000 description 1
- 235000005288 Annona lutescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 101100532699 Drosophila melanogaster scyl gene Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001600609 Equus ferus Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000005569 Iron sulphate Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012052 concurrent chemoradiation therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000881 depressing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 150000004673 fluoride salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000000281 joint capsule Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229940072033 potash Drugs 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PROCEDIMENTO DI PREPARAZIONE DI ACIDO IALURONICO MEDIANTE FERMENTAZIONE CON STREPTOCOCCUS"
La presente invenzione si riferisce a un procedimento per la preparazione di acido ialurcnico mediante coltura sommersa di un microorganismo del genere Streptococcus.
Stato dell'arte e problema tecnico
L'acido ialuronico è una macromolecola costituita da N-acetilglucosammina ed acido glucuronico presenti in rapporto equimolare e possiede pesi molecolari variabili da alcune decine di migliaia a parecchi milioni di Daltcn (D), a seconda della sua provenienza.
Infatti l'acido ialurcnico è una sostanza molto diffusa in natura, in particolare negli organismi superiori,in quanto è uno ctei componenti della matrice extracellulare dei tessuti connettivi degli animali. E' anche abbondante nel cordone ombelicale, nell'occhio, nelle capsule articolari dei marmiferi, nelle cartilagini e nelle creste de gallinacei. Tuttavia la limitata disponibilità di questi materiali, unita al fatto che i prodotti di origine naturale risultano molto spesso contaminati da proteine, nonché la difficoltà di estrazione e le rese piuttosto basse, hanno stimolato la ricerca di sorgenti alternative, capaci di fornire un prodotto più puro e di più elevato peso molecolare, con costi di produzione inferiori grazie a una resa del processo più elevata e ad una maggiore facilità di estrazione e purificazione.
E' descritta da tempo la capacità di alcune specie batteriche di produrre acido ialuronico. Quasi tutti i microorganismi dotati di questa caratteristica appartengono al genere Streptococcus (S. equi, S. equisimilis, S. zooepidemicus, S. dysgalactiae, S. pyogenes) o al genere Pasteurella (P.multocida) o al genere Pseudomonas (P. aeruginosa).
S. zooepidemicus, al pari di S. equi, l'altro microorganismo più frequentemente usato per la produzione industriale di acido ialuronico, appartiene al gruppo C della classificazione di Lancefield la quale annovera ceppi associati abitualmente con infezioni di animali; l'utilizzo di questi ceppi in un processo produttivo ccrtporta meno rischi di quanto non ne oonporti l'impiego di ceppi appartenenti al gruppo A di Lancefield, quali S.pyogenes.
Gli Streptococchi seno in grado di produrre il caratteristico fenomeno della emolisi,comune a moltissimi microorganismi patogeni.
Questo fenomeno corrporta il fatto che l'acido ialuronico prodotto può essere contaminato da β-emolisine e tale contaminazione rende estremamente pericoloso l'uso di un prodotto che non sia stato accuratamente purificato.
Al pari della produzione di emolisine, anche la biosintesi di ialuronidasi è una caratteristica costante dei ceppi patogeni virulenti di Streptococcus, il che è causa di un ulteriore problema, ovvero la degradazione del prodotto desiderato.
Dal punto di vista delle richieste nutrizionali, gli Streptococchi patogeni sono da annoverare tra i microorganismi più esigenti. Per tale motivo il mantenimento dei ceppi avviene su terreni complessi, come ad esempio Brain Heart Infusion Broth agarizzato o Tryptic Soy Broth agarizzato (BHIA, TSA) a base di estratti o infusi di organi, quali cervello e cuore di bue. E' evidente che anche il medium di fermentazione dovrà contenere, accanto ad adatte sorgenti di carbonio e sali minerali, materie prime complesse che possano fornire il giusto apporto di quegli aminoacidi, vitamine, basi puriniche e pirimidiniche che il microorganismo non fosse in grado di sintetizzare autonomamente: uno sviluppo rigoglioso di biomassa è, infatti, premessa indispensabile per una buona produzione di acido ialurcnico.
La sorgente principale di carbonio è, generalmente, glucosio, fruttosio, raffinosio o mannitolo, in concentrazione tra 10 e 100 granuli/litro, a cui possono essere aggiunti acidi organici, quali acido acetico, acido aspartico, acido glutammico, addo malico o acido ossalacetico, in concentrazione tra 1 e 20 g/1, preferibilmente tra 5 e 10 g/1. Quando i carboidrati vengano usati in quantità elevata, possono venire aggiunti, come soluzione concentrata, gradualmente nel corso della fermentazione. La scelta del momento dell'aggiunta complementare di carboidrati è di cruciale importanza per una buona crescita del microorganismo e per una buona produzione di addo ialurcnico.
Il metabolismo degli zuccheri comporta la produzione di sostanze acide (principalmente acido lattico ed addo acetico), il cui accumulo abbassa ben presto il pH a valori tali da inibire la crescita stessa del microorganismo.
Si è già accennato all'importanza del ruolo svolto dalle materie prime complesse nella fermentazione dell'addo ialurcnico con S.
zooepidemicus. Tra queste, quelle che possono essere utilizzate con profitto per la coltivazione ricordiamo estratti di origine animale, come l'estratto di carne e l'estratto proteico di sangue, o di origine microbica, cane l'estratto di lievito. Parimenti, ottimi risultano i lisati o idrolizzati di varia origine, quali l'autolisato di lievito, il cor steep e l'idrolizzato di caseina, o peptoni come i peptcni di sangue, di carne, di fegato, di soia, di caseina e lo "skira milk”. La concentrazione ottimale di queste sostanze varia a seconda del ceppo impiegato, ma è compresa, generalmente, tra 5 e 50 g/1. Trattandosi di sostanze contenenti principi termolabili, il riscaldamento può ridurre, anche drasticamente, la qualità nutritiva del medium. Pertanto il profilo di sterilizzazione dei fermentatori deve essere accuratamente studiato, onde determinare la quantità minima di calore da fornire al medium senza diminuire apprezzabilmente la garanzia di poter condurre un processo perfettamente axenico.
Un approccio estremamente utile al fine del miglioramento di un processo fermentativo è lo studio delle vie metaboliche che conducono dai substrati al prodotto finale che si vuole produrre; ciò al fine di inpostare la fase di "medium improvement", in cui cioè si valutano i substrati o gli elementi nutrizionali in grado di favorire sostanziali miglioramenti nella resa del processo biosintetico delle sostanze utili, senza peraltro deprimere altre vie metaboliche indispensabili alla vita del microorganismo.
Normalmente l'inattivazione del microorganismo alla fine della fermentazione viene eseguita per aggiunta di acidi alla brodocultura, solitamente il preferito per queste operazioni è l'acido tricloroacetico. Si è notato che l'uso di questo acido porta su scala industriale aiseguenti svantaggi:
1) notevoli problemi per lo smaltimento ecologico dei rifiuti contenentiquesto acido,per l'elevatocontenuto incloro
2) si è osservatauna degradazione sensibile delpeso molecolare medio fra il valore misurato a fine fermentazione e quello riscontrato dopo l'isolamento delprodotto;questo fenomeno è tanto piùmarcato quantopiù lungoèiltarpo e quantopiùelevataè latemperaturadi lavorazione.
Le tecniche principali finora utilizzate per il recupero e la purificazione dell'acido ialuronico che possano avere una effettiva applicazione industriale seno;
ultrafiltrazione utilizzata sia per allontanare impurezze di basso peso molecolare siaper effettuare frazionamenti delprodotto sulla base del peso molecolare (si veda ad esempio WO 92/18543 e JP 63094988)
cromatografia su resine a scambio ionico dove normalmente l'acido ialurcnico viene fissato sulla resina per poter allontanare le inpurezzeche loacccnpagnano,quindiilprodottovieneliberatoper eluizione con tarpani in modo da effettuare uno spostamento selettivo (sivedaadesenpioJP 63289198).Inqualchecasoè stata descritta lapurificazione di acido ialurcnico dove solo unaparte dello stesso a peso molecolare ≤ 2.000.000 D è trattenuto dalla resina (sivedaadesempioWO89/06243)
precipitazione dell ' acido ialurcnico come sale di ammonio quaternario, suo isolamento per filtrazione e successiva ridissoluzione del sale in una soluzione che per aggiunta di ioni Na+ riforma lo ialurcnato di sodio (si veda ad esenpio JP 2947101 e JP 63270701).
Quando la purificazione finale di acido ialuronico è condotta mediante cromatografia a scambio ionico, si presentano i seguenti inconvenienti:
1 l'uso di reattivi per il distacco, che poi devono essere separati dall'acido ialuronico per ulteriore purificazione, come ad esenpio una precipitazione con solventi,
2 durante il distacco dell'acido ialuronico si ha una notevole variazione della viscosità della soluzione eluita che porta ad una diminuzione del flusso ed un aumento non trascurabile della pressione in colonna,
3 l'eluizione dell'acido ialuronico a livelli di interesse quantitativo porta ad un abbassamento della sua concentrazione, richiedendo poi quantità notevoli di solvente per la precipitazione. Riassumendo lo stato dell'arte, pertanto, gli attuali problemi che si presentano all'esperto del settore nella preparazione di acido ialurcnico per via microbiologica, in particolare utilizzando microorganismi del genere Streptococcus zooepidetnicus e Streptococcus equi, sono: la contaminazione da β-emolisine e da ialuronidasi; l'ottenimento di acido ialuronico ad elevato peso molecolare ed esente da sottoprodotti derivanti dalla sua degradazione; la ottimizzazione del mezzo di coltura in funzione della resa quantitativa di acido ialurcnico; l'ottenimento di un prodotto finale in condizioni farmaceuticamente accettabili, ovvero l'assicurazione di un prodotto sterile e apirogeno; una fase di purificazione ancora laboriosa.
Questi problemi sono stati risolti dalla presente invenzione che fornisce un procedimento per la preparazione di acido ialurcnico mediante coltura sonmersa di un microorganismo del genere Streptoooccus zooepi demicus oppure Streptoooccus equi. L'acido ialuronico ottenuto mediante il procedimento della presente invenzione risulta esente da βemolisine, stabile, di elevato peso molecolare e di elevata purezza. Sotmvario dell'invenzione
Un oggetto della presente invenzione è un procedimento per la preparazione di acido ialurcnico conprendente la coltura di un microorganismo del genere Streptoooccus zooepidemicus oppure Streptoooccus equi; inattivazione del microorganismo e isolamento di detto acido ialuronico,caratterizzato dal fatto che la coltivazione del microorganismo è condotta in presenza di ioni ferro bivalente.
E' stato inoltre isolato un ceppo di Streptoooccus zooepidemicus, ottenuto dalla richiedente dopo ripetuti cicli di mutagenesi e selezione e che è stato impiegato nel procedimento della presente invenzione, il quale è in grado di produrre con rese molto elevate acido ialurcnico che, oltre ad essere esente da β-emolisine, è caratterizzato da elevato peso molecolare.
Il ceppo mutato, qui denominato UVl, è stato depositato presso CNCM in data 21 luglio 1994 con il numero di accesso 1-1448 ed è un ulteriore oggetto della presente invenzione.
Un altro oggetto della presente invenzione è il procedimento sopra citato che conprende la coltivazione del ceppo UV1.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Secondo la presente invenzione, il procedimento di preparazione dell'acido ialurcnico è condotto mediante coltura di un microorganismo Streptocoocus zooepidemicus oppure Streptococcus equi reperibili da collezione.
La coltivazione è condotta secondo la convenzionale tecnica della coltura somtiersa, in un mezzo nutritivo adatto a questo tipo di microorganismo e la cui conposizione è nota all'esperto del settore.
E' stato sorprendentemente trovato che l'aggiunta di ioni ferrosi al terreno di coltura inibisce la produzione di β-emolisine. Pertanto, secondo la presente invenzione, il medium di fermentazione viene addizionato di sali inorganici di ferro, quali solfiti, solfati, cloruri, fluoruri, nitrati, clorati, fosfati, in quantità tale da avere 1-100 mg/1, preferibilmente 5-50 mg/1, di iene ferroso <Fe++) in soluzione. Tali concentraziani sono sorprendentemente in grado di reprimere i meccanismi di espressione dei sistemi di acquisizione del ferro specifici di S. zooepidemicus, segnatamente la sintesi di βemolisine. Si riesce in tal modo ad ottenere un prodotto privo di βemolisine contaminanti, a tutto vantaggio del processo di purificazione e della qualità finale dell'acido ialurcnico.
Sorprendentemente,in presenza di un eccesso di ione Fe++, il brodo a fine fermentazione, oltre che essere privo di emolisine, contiene acido ialurcnico di peso molecolare più elevato rispetto a quello ottenibile nel medesimo medium, ma carente in ferro. La presenza di un eccesso di ione ferro nel medium, unitamente all'acoortezza di monitorare costantemente la viscosità del brodo di fermentazione consente di ottimizzare sia la quantità che il peso molecolare dell'acido ialurcnico prodotto.
In una sua prima realizzazione preferita, il procedimento secondo la presente invenzione è condotto utilizzando il ceppo UV1 di Streptococcus zooepidemicus.
Detto ceppo è stato ottenuto dalla richiedente per mutagenesi di un ceppo selvaggio.
Alcune caratteristiche biochimiche del ceppo UV1 vengono qui di seguito elencate:
Il ceppo S. zooepidemicus UV1 cresce rapidamente su terreni complessi liquidi come il BrainHeart Infusion Broth (BHIB) o il Tryptic Soy Broth (TSB)e sui corrispondenti terreni agarizzati (GHIA e TSA). Su questi terreni solidi il ceppo presenta, dopo 24-36 ore di crescita alla tenperatura di 30°C, colonie circolari, traslucide e di consistenza più fortemente visoosa che non il normale ceppo non mutato: la mutazione pertanto si è rivelata nel senso di una maggiore produttività dell'acido ialurcnico.
Il ceppo qui descritto presenta buono sviluppo (in 24 ore a 30eC) su terreno solido Agar-Sangue, dove manifesta, in modo molto evidente, la caratteristica reazione β-emolitica degli Streptococchi.
In accordo a una seconda realizzazione, il procedimento oggetto della presente invenzione prevede, ai fini della ottimizzazione della produzione di biomassa, un particolare ciclo di aggiunta di carboidrati frazionata in 3 quote da eseguire rispettivamente al momento dell'inoculo, mezz'ora dopo il raggiungimento del livello minimo di ossigeno disciolto e 6 ore dopo la seconda aggiunta, tale ciclo ha la capacità di massimizzare la produzione di biomassa e, quindi di acido ialuronico.
Vantaggiosamente, il pH della brodocoltura viene controllato in continuo, mantenendolo nell'intervallo 6,5 ± 1,0 unità, preferibilmente tra 6,5 e 7,5 unità. La correzione avviene solitamente mediante soluzioni acquose concentrate di alcali, quali soda o potassa, e può essere effettuata anche durante la fase vegetativa. In alternativa si può impiegare anche calcio carbonato in polvere o altri metodi noti.
Questo accorgimento adottato non solo nel corso della fermentazione, ma anche nel corso degli stadi colturali vegetativi (seed) che precedano l'inoculo del fermentatore di produzione, consente di disporre di inoculi perfettamente vitali, in fase di crescita esponenziale, ad elevato contenuto di biomassa, con conseguente accorciamento della lag-fase nel successivo stadio fermentativo.
Una ulteriore misura procedurale che ha prodotto inaspettati risultati in termini di crescita della biomassa è poi rappresentata dall'innalzamento della contropressione nel fermentatore a valori superiori a 0,1 bar fino a 3,5 bar. Pur non volendo essere legati ad alcuna ccnsiderazione teorica, una possibile, ma non esaustiva spiegazione di questo fenomeno può essere cercata nella solubilità della CO2 nei mezzi acquosi: poiché nel processo produttivo di acido ialurcnico la crescita del microorganismo avviene in coltura sommersa, il terreno è sottoposto ad aerazione forzata e continua, il che determina l'allontanamento costante della CO2 prodotta dai batteri, quindi si suppone che la contropressione consenta di aumentare il contenuto di questo gas disciolto nel mezzo acquoso.
Si pone anche il problema della sterilizzazione del mezzo nutritivo prima dell'inoculo. Questa fase è inportante ai fini della resa, dato che molte sostanze nutritive seno termolabili.
Secondo la presente invenzione, un ciclo di sterilizzazione condotto senza superare i 120°C, per un periodo massimo di 30 minuti, porta a risultati assolutamente inattesi in termini di resa.
La presente invenzione ha anche affrontato il problema della ottimizzazione del mezzo di coltura.
Da questo punto di vista si è sorprendentemente rivelato utile l'innalzamento della concentrazione di UTΡ nel pool intracellulare, cosa realizzabile mediante l'aggiunta al medium di fermentazione di uracile, così come buoni risultati ha sorprendentemente prodotto l'aggiunta al medium di glutammina ed aspartato. Abbiamo effettivamente potuto constatare che, aggiungendo al medium di fermentazione di S. zooepidemicus, preferibilmente il ceppo UV1, le tre molecole sopra specificate (uracile, acido aspartico e glutanmina) si ottengano rese di produzione di acido ialurcnico del 20-25% superiori a quelle ottenibili in loro assenza. Le concentrazioni dei tre substrati utili per il conseguimento di tale risultato sono conprese tra 0,01 e 10 g/1, preferibilmente tra 0,5 e 3 g/1.
E' noto che l'inattivazione del microorganismo viene effettuata aggiungendo un acido al mezzo di coltura.
Come citato in precedenza, l'aggiunta convenzionale di acido tricloroacetico comporta problemi di trattamento degli scarichi e di integrità del prodotto finale.
Nel tentativo di superare questi problemi si seno utilizzati diversi acidi per l'operazione di inattivazione del microorganismo quali l'acido solforico, l'acido fosforico, l'acido ipofosforoso, l'acido lattico e l'acido tartarico; fra questi l'acido ipofosforoso aggiunto fino al raggiungimento di un pH inferiore a 4,8, è risultato il più interessante sotto il profilo del mantenimento del valore del peso molecolare medio.
Sorprendentemente si è verificato che, dopo la sterilizzazione del brodo di fermentazione, nel tentativo di allontanare le cellule del microorganismo dalla soluzione contenente l'acido ialurcnico per filtrazione tangenziale su membrana microfiltrante, il prodotto desiderato non permeava dalla stessa, ma la soluzione di ialuronato di sodio si concentrava con le cellule. Le operazioni di microfiltrazione sono state eseguite con membrane di tipo polimerico, ceramico, e di metallo sinterizzato con porosità compresa fra 0,05-5 μm.
Questa inprevista capacità delle membrane microfiltranti di trattenere l'acido ialurcnico ed i suoi sali costituisce un grosso vantaggio in termini economici di processo perché permette di ottenere soluzioni di acido ialuronico estremamente puro, con relativi costi di esercizio più ridotti e realizzabili con un impianto abbastanza modesto.
In questo modo, dopo isolamento si ottiene un prodotto ccn titolo maggiore del 95% sul secco con un contenuto di proteine residue ≤ 0,3%.
In un'altra serie di sperimentazioni, si è trovato che l'acido ialurcnico viene purificato, da proteine ed altre sostanze che lo accompagnano, per passaggio combinato su un primo letto di resina a scambio ionico in forma cationica H<+ >e successivamente su uno di resina in forma aniartica. Il fenomeno imevativo, non prevedibile da questa sperimentazione, è che l'acido ialurcnico di qualsiasi peso molecolare non viene fissato sulla resina, ma passa inalterato da entrambe, mentre rimangono fissate le impurezze; quali le proteine che vengono prevalentemente trattenute sulla resina in forma H+. L'effetto è così spiccato che il trattamento può essere effettuato anche non in colonna, ma in un reattore agitato "a batch”.
Secondo una ulteriore realizzazione, l'ottenimento del prodotto solido può avvenire direttamente dalle soluzioni di brodocultura senza alcun isolamento dello stesso fino all'essiccamento, ottenuto mediante i processi di liofilizzazione, atomizzazione, esposizione al calore sotto ridotta pressione.
Dalle soluzioni ottenute sia per cromatografia sia per microfiltrazionesi può recuperare l'acido ialurcnico come sale sodico, direttamente, mediante liofilizzazione o sottoponendo la soluzione all'azione di uno "spray dryer"; lo ialuronato sodico ottenuto in queste condizioni è sufficientemente puro per essere commercializzato. Qualora si volesse disporre di ialurcnato sodico ad elevata purezza (> 98%) si concentra la soluzione per microfiltrazione sino ad ottenere una soluzione fra 1 e 2%,dalla quale lo ialurcnato sodico è precipitato con solventi quali etanolo, isopropanolo e acetone, coadiuvando la formazione del precipitato con l'aggiunta di sali sodici, quali cloruro, solfato, fosfato, e preferibilmente acetato o altri anioni di acidi organici.
Tra la preparazione delle soluzioni di acido ialurcnico e la loro elaborazione per il recupero del prodotto purificato, si è riscontrata una notevole diminuzione del peso molecolare medio (da 1.500.000 D a circa 600.000 D) associata ad un aumento della torbidità delle soluzioni; l'aggiunta di solventi alcoolici o chetonici o di sostanze contenenti la funzione fenolica o di sostanze detergenti ioniche e non ioniche,è in grado di prevenire questo fenomeno mantenendo le soluzioni di acido ialurcnico limpide ed esenti nel tenpo da contaminazioni batteriche.
L'elevato grado di purezza dell'acido ialurcnico ottenuto con il procedimento descritto, ne fa un candidato ideale per l' impiego in prodotti di tipo farmaceutico e/o cosmetico di qualità superiore. La metodica rivendicata permette di ottenere un prodotto totalmente privo, come accertato, di problemi di tollerabilità ed il suo inpiego, quindi pur essendo validissimo a livello generale, risulta particolarmente vantaggioso per il trattamento di zone ipersensibili, come le mucose vaginali,nasali, oculari eco..
I seguenti esenpi illustrano ulteriormente l'invenzione. ESEMPIO 1
il pH viene portato a 7,00 mediante aggiunta di NaCH e quindi viene sterilizzato a 121°C per 20'. L'inoculo avviene in ragione del 2,5% di una coltura di Streptococcus zooepidemicus derivato da collezione. La fermentazione dura all'incirca 24 ore a 37°C ccn il pH mantenuto a 7.00 mediante aggiunte automatiche in continuo di NaOH. Il destrosio viene aggiunto per un 33% al momento dell'inoculo e per il resto viene somministrato in continuo. La resa del processo determinato per analisi HPLC è di 0,8 g/1 ccn un peso molecolare medio stimato intorno ai 500.000 D.
ESEMPIO 2
Operando come descritto nell' esempio precedente, viene condotta una fermentazione con l'unica differenza che l'inoculo avviene mediante Streptococcus zooepidemicus imitato e selezionato denominato UV1. La resa del processo determinata come sopra è di 1,5 g/1 con peso molecolare medio di 800.000 D.
ESEMPIO 3
La fermentazione viene condotta come descritto nell'esenpio precedente ma la quantità di ferro solfato viene triplicata mediante due aggiunte a 8 e 16 ore. La resa del processo è di 1,4 g/1,ma con un peso molecolare medio di 1,5-2,5 Milioni di D. Il brodo finale si presenta altresì privo di streptolisine.
ESEMPIO 4
Si opera come nell'esenpio precedente,ma l'inoculo viene mantenuto a pH 7,00 mediante aggiunte in continuo di NaOH. Ciò permette di raddoppiare la biomassa dell'inoculo. L'intera fermentazione si presenta accelerata e la resa, dopo 20 ore di fermentazione, a parità di peso molecolare medio,è di 1,8 g/1.
ESEMPIO 5
Operando carne nell'esenpio precedente, si conduce però una fermentazione dove viene mantenuta una sovrappressione di 0,6 Bar. La resa, a parità di peso molecolare aumenta di circa il 10%.
ESEMPIO 6
Si conduce la fermentazione operando come descritto nell'esenpio precedente, ma il tormento termico del brodo di coltura viene ridotto a 10' a 110°C al fine di preservarne la fertilità.La resa è di 2,8 g/1,a parità di peso molecolare.
ESEMPIO 7
Viene sperimentata l'influenza di alcuni precursori metabolici sulla fementazione: suddividendo lo stesso inoculo in 4 fermentatori condotti come nell'esempio precedente, dove però al terreno iniziale vengono aggiunti rispettivamente 2 g/1 di uracile, 2 g/1 acido aspartico, 2 g/1 glutamnina o contemporaneamente i 3 precursori alla stessa concentrazione di 2 g/1. I risultati ottenuti, sempre a parità di peso molecolare medio,seno i seguenti:
Piccoli miglioramenti (2-3%) si ottengono aggiungendo tutti e tre i precursori.
ESEMPIO 8
Si opera cane nell'esenpio precedente (7a) dove il glucosio viene aggiunto in ragione di un terzo al momento de11'inoculo, un terzo dopo mezz'ora dal raggiungimento della condizione di anaerobiosi della coltura ed un terzo dopo 5-6 ore dalla seconda.La resa di fermentazione è di 3,5 g/1 con un peso molecolare medio > di 2 Milioni di D.
ESEMPIO 9
Il batterio della brodocultura ottenuta nelle condizioni dell ’esempio 8 viene inattivato abbassando il pH fino a portarlo a 3,5 mediante aggiunta di acido ipofosforoso. La scomparsa dell'attività dello Streptococco viene valutata per pia str amento dopo aver riportato il pH alla neutralità.
A questo scopo sono stati provati diversi acidi organici ed inorganici. La tabella che segue dà indicazioni riguardo alla efficienza della inattivazione e alla influenze sulla lisi del polimero attraverso una misura di viscosità.
ESEMPIO 10
a) Da una quota di brodo di fermentazione acidificata a pH 3,5 con acido ipofosforoso contenente 5 g di acido ialurcnico titolato, addizionata di "filter aid", si allontanano gli insolubili per filtrazione lavando il filtro con acqua. Al filtrato si aggiunge acetone fino a indurre la precipitazione del prodotto grezzo che, dopo allontanamento delle acque madri, viene ridisciolto in acqua fino ad avere soluzione completa in presenza del 5% di acetone. Si passa la soluzione così ottenuta su colonna caricata con resina caticnica forte IMAC C16P forma H<+>. La soluzione, così trattata viene fatta passare attraverso una seconda colonna caricata con resina anicnica forte IRA 900 forma OH. Alla soluzione si aggiungono 20 g di sodio acetato, si porta a 40°C quindi si aggiunge etanolo fino ad ottenere la precipitazione dell'acido ialurcnico come Scile sodico. Si filtra lavando con etanolo, si secca sotto ridotta pressione e si ottengono 4 g di prodotto con il seguente profilo di qualità:
- Titolo sul secco circa 98%
- Contenuto di proteine residue circa 0,1% (saggio emolisina: negativo) - Peso molecolare medio superiore a 1.500,000 D
- Trasmittanza di una soluzione allo 0,2% è 99.8%.
b) Trattando una soluzione contenente 5 g di acido ialurcnico grezzo di peso molecolare medio < 200.000 D nelle stesse condizioni dell 'Esempio 10 a) si ottengono 4,3 g di acido ialurcnico con il seguente profilo di . qualità:
- Titolo sul secco circa 98%
- Contenuto in proteine residue 0,05%
- Peso molecolare medio 180.000 D
- Trasmittanza di una soluzione allo 0,2% 95%.
ESEMPIO 11
Si ripete la prova dell'esenpio 10 a) emettendo di aggiungere il 5% di acetone alla soluzione del prodotto prima del trattamento su resine: si ottengono 4 g di acido ialurcnico con il seguente profilo di qualità: - Titolo sul secco circa 98%
- Contenuto di proteine residue 0,1%
- Peso molecolare medio 650.000 D
- Trasmittanza di una soluzione allo 0,2% 95%.
ESEMPIO 12
Dopo aver precipitato il prodotto grezzo secondo le condizioni descritto nell'esenpio 10 lo si ridiscioglie in acqua contenente il 10% di acetone. La soluzione così ottenuta viene sottoposta a filtrazione tangenziale su membrane da microfiltrazione, avendo cura di mantenere nel "loop" di filtrazione una velocità lineare alta e comunque regolata in modo da dare il maggior flusso di permeazione. Si ha la fuoriuscita attraverso la membrana di un permeato che contiene proteine e sali minerali ed è esente da acido ialuronico. La miscela da purificare è continuamente alimentata con acqua ad una velocità tale da ripristinare il volume iniziale, finché il permeato risulta esente da residui. La soluzione viene quindi concentrata sino a circa l'l% prima di procedere all'isolamento del prodotto come nell'esempio 2. Le specifiche di qualità sono le seguenti:
- Titolo sul secco >96%
- Contenuto di proteine circa 0,1%
- Peso molecolare medio > 1.500.000 D
- Trasmi ttanza della soluzione allo 0,2% >99,5%
ESEMPIO 13
Si ripete la prova nelle condizioni dell ’esempio 12 omettendo l'aggiunta di solvente nella soluzione prima della filtrazione. Si ottiene un prodotto con le seguenti specifiche di qualità:
- Titolo sul secco >96%
- Contenuto di proteine circa 0,1
- Peso molecolare medio circa 600.000 D
- Trasmittanza della soluzione allo 0,2%, 91%
ESEMPIO 14
Viene ripetuta la preva nelle condizioni dell 'esempio 10 con la differenza che si sottopone la soluzione, trattata con le due resine, a liofilizzazione su piastra, congelando a —40°C per 4 ore e utilizzando un ciclo di Liofilizzazione molto lento sino ad una temperatura di riscaldamento massima di 30°C. In queste condizioni si ottengono 4,5 g di prodotto che presenta il seguente profilo di qualità:
- Titolo >94%
- Contenuto di proteine < 0.3%
- Peso molecolare medio circa 1.500.000 D
- Trasmi ttanza della soluzione allo 0,2% 99,8%
ESEMPIO 15
Come l'esempio 14 in cui si effettua la liofilizzazione in flaconi invece che in bulk. Si utilizzano flaconi di vetro neutro tipo I su cui vengono posizionati tappi da stoppering. Alla fine dell'operazione i flaconi vengono chiusi in atmosfera di gas inerte. La resa e la qualità dell'acido ialuronico sono perfettamente uguali a quelle del prodotto ottenuto secondo le condizioni dell'esempio 14.
ESEMPIO 16
La soluzione di acido ialurcnico ottenuta secondo le condizioni dell' esempio 12 viene sottoposta a liofilizzazione secondo le condizioni dell'esempio 14. Si ottengono 4,5 g di acido ialurcnico con le seguenti specifiche di qualità:
- Titolo >93%
- Contenuto di proteine < 0,3%
- Peso molecolare circa 1.500.000 D
- Trasmittanza di una soluzione 0,2% >99,8
ESEMPIO 17
La soluzione di acido iaiuranico ottenuta secondo le condizioni dell’eserrpio 12 viene sottoposta all'azione di uno "spray dryier". Si ottiene un prodotto di qualità uguale a quello dell'esempio 16 con la stessa resa.
ESEMPIO 18
Si effettua una prova nelle condizioni dell'esempio 10 con l'eccezione che, dopo la purificazione su resine, si carica la soluzione nell'apparecchio di microfiltrazione dove la si concentra ripristinando il volume iniziale fino a quando il residuo a secco del permeato si annulla. Si continua l'operazione fino ad arrivare ad una concentrazione del 2% quindi si sottopone la soluzione a liofilizzazione nelle condizioni degli eserpi 14 e 15. Si ottengono alla fine del trattamento 4 g di acido ialurcnico con le seguenti specifiche di qualità:
- Titolo sul secco > 98%
- Contenuto di proteine circa 0,1%
- Trasmittanza > 99,8%
- Peso molecolare circa 1.500.000 D.
ESEMPIO 15
1 g di lecitina di soia, 0,5 g di colesterolo, 3,5 g di isopropilmiristato e 0,02 g di tocoferolo acetato seno disciolti nella minima quantità di etanolo: Questa soluzione è dispersa sotto agitazione in circa 60 mi di una soluzione acquosa contenente 0,1 g di EDTA bisodico. Alla dispersione liposomiale così ottenuta si aggiunge 0,15 g di metilparaben sodico, 0,1 g di sodio ialurcnato ad elevata purezza, 2 g di estratti giocolici vegetali, 7 g di glicole propilenico ed una quantità sufficiente di carbowax per raggiungere la viscosità desiderata. Il gel ottenuto ripartito in contenitori monodose muniti di cannula, risulta idoneo, grazie alla elevata tollerabilità, al trattamento di mucose vaginali con condizioni patologiche o dismetaboliche come quelle affette da secchezza.
ESEMPIO 20
0,1 g di sodio ialurcnato vengono sciolti, sotto agitazione, in circa 90 mi di una soluzione acquosa contenente 0,15 g di metilparaben sodico, 0,015 g di prcpilparaben sodico e 15 g di Poloxamer F127<(>. Alla soluzione così ottenuta si aggiungerlo 5 g di estratti glicolici vegetali, 1 g di derivato siliconico ed 1 g di HPMC. La soluzione viene confezionata in appositi erogatori che, senza ricorrere, all’uso di propellenti, sono in grado di generare una schiuma soffice e persistente che, grazie alla elevata tollerabilità, può essere impiegata sulla cute, anche lesa, o convogliata sulla cavità vaginale per mezzo di una cannula.
ESEMPIO 21
0,2 g di sodio ialurcnato ad elevata purezza sano sciolti, sotto agitazione,in una soluzione acquosa contenente 0,9 g di sodio cloruro e q.b. di tampone fosfato. La soluzione viene portata ad un volume finale di 100 mi e confezionata sterilmente in contenitori monodose adatti alla instillazione.
Claims (21)
- RIVENDICAZION 1. Procedimento per la preparazione di acido iaiuronico comprendente la coltivazione in coltura sommersa di un microorganismo del genere Streptoooocus zooepidemicus oppure Streptoooccus equi, la inattivazione di detto microorganismo e l'isolamento di detto acido ialuronico, caratterizzato dal fatto che la coltura viene effettuata in presenza di ioni ferro bivalente.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la concentrazione di detti ioni ferro bivalente è compresa nell'intervallo da 1 a 100 mg/1.
- 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-2,caratterizzato dal fatto che detto ione ferro bivalente può essere fornito da un suo sale scelto nel gruppo costituito da: solfito, solfato, cloruro, fluoruro, nitrato, clorato, fosfato.
- 4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-3,caratterizzato dal fatto che la coltura viene effettuata utilizzando un ceppo di Streptoooccus zooepidemicus depositato presso CNCM in data 21 luglio 1994, con il numero di accesso 1-1448.
- 5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-4,caratterizzato dal fatto che le aggiunte delle fonti di carbonio avvengono in momenti diversi del ciclo di fermentazione e precisamente: a) una quota compresa tra il 20% e il 40% del totale al momento dell'inoculo; b) una quota compresa tra il 20 ed il 40% del totale entro 1 ora dal raggiungimento del livello minimo dell'ossigeno disciolto c) la rimanente quota entro un periodo di 5-6 ore dalla seconda aggiunta.
- 6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-5 caratterizzato dal fatto che il pH della brodocultura viene mantenuto all'interno di un intervallo di pH di 6,5 _+ 1,0 pH mediante aggiunte di base alcalina e che queste aggiunte seno effettuate anche durante le fasi di crescita vegetativa.
- 7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-6 caratterizzato dal fatto che durante tutte le fasi di crescita del microorganismo viene mantenuta all'interno del fermentatore una sovrappressione compresa tra 0,1 e 3,5 bar
- 8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7 caratterizzato dal fatto che la sterilizzazicne delle materie prime complesse dei terreni di crescita viene condotta ad una temperatura inferiore a 120°C per un periodo di tenpo non superiore a 30 minuti.
- 9. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-8 caratterizzato dal fatto che al terreno di fermentazione possono essere aggiunte singolarmente o in combinazione binaria o ternaria le seguenti sostanze: a) uracile in concentrazione compresa tra 0,01 e 10 g/1; b) acido aspartico in concentrazione ccnpresa tra 0,01 e 10 g/1; c) glutamnina in concentrazione conpresa tra 0,01 e 10 g/1.
- 10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-9 caratterizzato dal fatto che il microorganismo viene inattivato alla fine del ciclo fermentativo mediante aggiunta di acido ipofosforoso fino al raggiungimento di un pH inferiore a 4,8.
- 11. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-10 caratterizzato dal fatto che l'allontanamento delle sostanze nutritive e complesse contenute nel terreno di fermentazione, nonché dei residui solubili di inattivazione dei microrganismi, viene effettuato con uno o più stadi di processo di microfiltrazione effettuati con una pressione ortogonale o con un flusso tangenziale su membrana o fibre o cartucce di materiale ceramico, polimerico o di metallo sinterizzato.
- 12. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-11 caratterizzato dal fatto che il processo di microfritrazione può essere utilizzato anche come mezzo per concentrare le soluzioni di acido ialuronico o dei suoi sali.
- 13. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-12 caratterizzato dal fatto che la porosità delle strutture micro-filtranti è compresa tra 0,05 e 5 micrometri,preferibilmente tra 0,05 e 0,8 micrometri.
- 14. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-13 caratterizzato dal fatto che la soluzione di acido ialurcnico e dei suoi sali viene forzata attraverso un letto di resina a scambio ionico.
- 15. Procedimento secondo la rivendicazione 14 caratterizzato dal fatto che lo scambio ionico avviene attraverso la sequenza resina cationica forte seguita da anionica.
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 15 caratterizzato dal fatto che il trattamento con le resine può essere effettuato in colonna oppure in sospensione.
- 17. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-16 caratterizzato dal fatto che il processo di estrazione o parte di esso può essere condotto in presenza di sostanze antisettiche direttamente aggiunte alle soluzioni acquose da trattare.
- 18. Procedimento secondo la rivendicazione 17 caratterizzato dal fatto che le sostanze ad azione antisettica seno scelte nel gruppo comprendente detergenti anicnici, cationi o non ionici, alcoli, aldeidi, chetali, fenoli e derivati fenolici.
- 19. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-18 caratterizzato dal fatto che l'ottenimento del prodotto solido può avvenire direttamente dalle soluzioni di brodocultura senza alcun isolamento dello stesso fino all'essiccamento, ottenuto mediante i processi di liofilizzazione, atomizzazione,esposizione al calore sotto ridotta pressione.
- 20. Acido ialuronico ad elevata purezza esente da β-emolisine ottenibile mediante il procedimento delle rivendicazioni 1-19.
- 21. Streptococcus zooepidemicus depositato presso CNCM in data 21 luglio 1994,con il numero di accesso 1-1448.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI941594A IT1271001B (it) | 1994-07-26 | 1994-07-26 | Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus |
| EP95111587A EP0694616A3 (en) | 1994-07-26 | 1995-07-24 | Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus |
| JP7250023A JPH0956394A (ja) | 1994-07-26 | 1995-08-23 | 連鎖球菌を用いた発酵によるヒアルロン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI941594A IT1271001B (it) | 1994-07-26 | 1994-07-26 | Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus |
| JP7250023A JPH0956394A (ja) | 1994-07-26 | 1995-08-23 | 連鎖球菌を用いた発酵によるヒアルロン酸の製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI941594A0 ITMI941594A0 (it) | 1994-07-26 |
| ITMI941594A1 true ITMI941594A1 (it) | 1996-01-26 |
| IT1271001B IT1271001B (it) | 1997-05-26 |
Family
ID=26331179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ITMI941594A IT1271001B (it) | 1994-07-26 | 1994-07-26 | Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0694616A3 (it) |
| JP (1) | JPH0956394A (it) |
| IT (1) | IT1271001B (it) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH692919A5 (fr) * | 1999-01-28 | 2002-12-13 | Trb Chemedica S A | Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé. |
| KR100879908B1 (ko) | 2001-12-21 | 2009-01-21 | 노보자임스 바이오폴리머 에이/에스 | 재조합체 숙주 세포에서 히알루로난의 제조 방법 |
| US8003851B2 (en) | 2005-08-25 | 2011-08-23 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plant producing hyaluronic acid |
| EP1772052A1 (de) | 2005-10-05 | 2007-04-11 | Bayer CropScience GmbH | Verbesserte Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan |
| JPWO2008004530A1 (ja) * | 2006-07-03 | 2009-12-03 | 協和発酵バイオ株式会社 | ヒアルロン酸またはその塩の粉末およびその製造方法 |
| EP2046969B1 (en) | 2006-07-06 | 2011-09-28 | Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. | Process for producing high molecular weight hyaluronic acid |
| JP2009545637A (ja) | 2006-08-04 | 2009-12-24 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | 分岐ヒアルロン酸及びその製造方法 |
| JP2008280430A (ja) * | 2007-05-10 | 2008-11-20 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ヒアルロン酸の製造方法 |
| EP2036983A1 (de) | 2007-09-12 | 2009-03-18 | Bayer CropScience AG | Pflanzen, die erhöhte Mengen an Glucosaminglycanen synthetisieren |
| JP5523338B2 (ja) | 2007-12-19 | 2014-06-18 | エヴォニク ゴールドシュミット ゲーエムベーハー | エマルジョン中の架橋ヒアルロン酸 |
| EP2213315A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-04 | Mero S.r.L. | Antibacterial hydrogel and use thereof in orthopedics |
| IT1401498B1 (it) | 2010-07-30 | 2013-07-26 | Mero Srl | Idrogelo a base di acido ialuronico e suo uso in ortopedia |
| EP2750665A1 (en) | 2011-09-02 | 2014-07-09 | Novozymes Biopharma DK A/S | Oral formulations containing hyaluronic acid for sustained drug release |
| WO2014100837A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Bui The Duy | Computer aided implantation of body implants |
| EP2985019B1 (en) | 2014-08-16 | 2021-10-20 | Church & Dwight Co., Inc. | Nasal composition having anti-viral properties |
| EP2985027B1 (en) | 2014-08-16 | 2021-03-31 | Church & Dwight Co., Inc. | Nasal composition comprising mixture of hyaluronic acids and saline solution |
| JP2017112901A (ja) * | 2015-12-24 | 2017-06-29 | キッコーマン株式会社 | 高分子ヒアルロン酸の製造方法 |
| EP3572068A1 (en) * | 2018-05-22 | 2019-11-27 | RECORDATI INDUSTRIA CHIMICA E FARMACEUTICA S.p.a. | New salt of cysteamine for the preparation of highly respirable particles |
| RU2719140C1 (ru) | 2019-07-26 | 2020-04-17 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех" | Бактерия рода bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту, и способ получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной бактерии |
| CN116874637A (zh) * | 2020-11-20 | 2023-10-13 | 广东双骏生物科技有限公司 | 一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法 |
| CN112592849A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-02 | 宁夏泰胜生物科技有限公司 | 利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316926A (en) * | 1983-11-25 | 1994-05-31 | Miles Inc. | Method for the microbiological production of non-antigenic hyaluronic acid |
| US5023175A (en) * | 1986-05-01 | 1991-06-11 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor |
| US4897349A (en) * | 1989-04-28 | 1990-01-30 | Medchem Products, Inc. | Biosynthesis of hyaluronic acid |
| GB9024223D0 (en) * | 1990-11-07 | 1990-12-19 | Fermentech Ltd | Production of hyaluronic acid |
-
1994
- 1994-07-26 IT ITMI941594A patent/IT1271001B/it active IP Right Grant
-
1995
- 1995-07-24 EP EP95111587A patent/EP0694616A3/en not_active Withdrawn
- 1995-08-23 JP JP7250023A patent/JPH0956394A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0694616A2 (en) | 1996-01-31 |
| IT1271001B (it) | 1997-05-26 |
| JPH0956394A (ja) | 1997-03-04 |
| ITMI941594A0 (it) | 1994-07-26 |
| EP0694616A3 (en) | 1998-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ITMI941594A1 (it) | Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus | |
| DK173681B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af hyaluronsyre ud fra en hyaluronsyreproducerende streptococbakterie | |
| DE69129118T2 (de) | Produktion von hyaluronsäure | |
| JPS60251898A (ja) | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 | |
| ITPD930164A1 (it) | Processo per la preparazione e purificazione di acido ialuronico ad alto peso molecolare | |
| US6489467B1 (en) | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| CN110592163A (zh) | 一种改善透明质酸钠色度的生产方法 | |
| NO318552B1 (no) | Hydroksyprolinrike proteiner og farmasoytiske og kosmetiske formuleringer inneholdende dem | |
| JPH02234689A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| RU2180002C2 (ru) | Способ получения коллагеназы | |
| Cooper et al. | Enzyme formation and polysaccharide synthesis by bacteria | |
| JPS6394988A (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| DE3885438T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von mikrobieller Cellulose. | |
| JP2009284826A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| RU2687973C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА КОЛЛАЛИЗИН&αχιρχ;, ЛИОФИЛИЗАТА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ МЕСТНОГО И ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | |
| KR101627014B1 (ko) | 히알루론산의 정제 방법 | |
| JPS62257393A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| JPS62257382A (ja) | 新規なストレプトコツカス・ズ−エピデミカス | |
| JPH0746992A (ja) | ヒアルロン酸の製造方法 | |
| JPH0443637B2 (it) | ||
| JPS61219394A (ja) | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 | |
| KR880001947B1 (ko) | 재순환식 세포 배양법에 의한 히아론산 제조방법 | |
| JPH02103203A (ja) | ヒアルロン酸の精製法 | |
| CN118547020A (zh) | 一种化妆品级聚谷氨酸的制备方法 | |
| KR890003677B1 (ko) | 고농도의 히아론산을 얻기 위한 미생물 배양방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19970729 |