HUT74901A - Alfa-1-antichymotrypsin analogues having elastase inhibitory activity - Google Patents
Alfa-1-antichymotrypsin analogues having elastase inhibitory activity Download PDFInfo
- Publication number
- HUT74901A HUT74901A HU9602674A HU9602674A HUT74901A HU T74901 A HUT74901 A HU T74901A HU 9602674 A HU9602674 A HU 9602674A HU 9602674 A HU9602674 A HU 9602674A HU T74901 A HUT74901 A HU T74901A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- chymotrypsin
- alpha
- analog
- human alpha
- human
- Prior art date
Links
- 230000002849 elastaseinhibitory effect Effects 0.000 title claims description 4
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 title description 12
- 108010091628 alpha 1-Antichymotrypsin Proteins 0.000 claims description 81
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 17
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 16
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 15
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 14
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 14
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 12
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 12
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 claims description 8
- -1 Val-Arg amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 3
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 claims description 2
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010018366 Glomerulonephritis acute Diseases 0.000 claims 1
- 231100000851 acute glomerulonephritis Toxicity 0.000 claims 1
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 32
- 102000052502 human ELANE Human genes 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 17
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 16
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 12
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000002764 anti-chymotrypsin effect Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 2
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 2
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108010082545 Secretory Leukocyte Peptidase Inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 2
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 2
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- XVGXMXZUJNAGFZ-VOTSOKGWSA-N (e)-1-imidazol-1-yl-3-phenylprop-2-en-1-one Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 XVGXMXZUJNAGFZ-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 0.000 description 1
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 1
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 description 1
- 229940122644 Chymotrypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 206010051392 Diapedesis Diseases 0.000 description 1
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 229940123734 Endonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229940122601 Esterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000004705 High-molecular-weight polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- LJKJVTCIRDCITR-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-His Chemical group CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N LJKJVTCIRDCITR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010008211 N-Formylmethionine Leucyl-Phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000533793 Tipuana tipu Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002329 esterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108010021648 semen liquefaction factor Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
n ELASZTÁZ INHIBITOR AKTIVITÁSSAL RENDELKEZŐ
W ALFA-l-ANTI-KIMOTRIPSZIN ANALÓGOK *
A találmány rekombináns DNS technológiával előállított proteinre vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgya elasztáz gátlására képes proteinek.
Az anti-kimotripszin (ACT) és az alfa-1 proteáz inhibitor (alfa-l-PI) a szerin proteáz inhibitor szupercsalád tagjai, melyek egymással közeli rokonságban álló elsődleges aminosav-szekvenciával és háromdimenziós szerkezettel rendelkeznek. Mindezek ellenére, az anti-kimotripszin inhibitor aktivitása szúkebb spektrumú. Az alfa-l-PI a humán neutrofil elasztáz (HNE) igen hatásos inhibitora, míg az anti-kimotripszin az alfa-l-PI szubsztrátja, s az anti-kimotripszint az alfa-l-PI inaktiválja (Potempa és mtsi., J. Bioi. Chem.. 266. 21482, 1991).
Jól ismert, hogy a humán neutrofil elasztáz jelentős szerepet játszik a gyulladások számos molekuláris és celluláris mechanizmusának közvetítésében (Travis és Fritz, Am. Rév. Resp. Dis., 43. 1412, 1991).
úgy tűnik, a gyulladás néhány mediátorát a proteázok és a proteáz inhibitorok szabályozzák. Az egyik példa a tumor nekrózis faktor (TNF) által fokozott vérlemezke aktiválás, amely a katepszin G (catG) neutrofilekből történő, TNF-közvetitette felszabadulása útján valósul meg; az
84311-7976-GI
• · aktiválást anti-kimotripszinne1 t ACT > blokkolták (Renesto, P. és mtsi., -J. Immunoi.. 2305, 1991). A leukotrién B4 (LTB4) és a vérlemezke-aktiváló faktor (PAF) TNF-stimulálta neutrofilekböl történő felszabadulását alfa-l-proteináz inhibitorral (alfa-ΙΡΙ) és ACT-vel blokkolták, és catG-vel, illetve humán neutrofil elasztázzal (HNE) serkentették (Camussi, G. és mtsi., J. Exp. Med., 168. 1293, 1988; és Camussi, G. és mtsi., Eur. J. Biochem., 182. 661, 1989).
Egy gyulladásos reakció érrendszeri és szöveti mikrokörnyezete az endogén vagy a beadott gyulladáscsökkentő szerek hozzáférhetőségének korlátozásával befolyásolhatja a hatásos reakciót. Például, a szekréciós leukocita proteáz inhibitor (SLPI) (amely egy kisméretű, 11,7 kD-os bázikus polipeptid) képesnek mutatkozik arra, hogy a közvetlenül a tapadó neutrofil alatti mikrokörnyezet számára biztosítsa a hozzáférhetőséget, és megvédje a helyi szövetet a neutrofil elasztáz okozta proteolízistöl. In vitro humán mikrovaszkuláris sérülés modellben egy elasztáz-specifikus klór-metil-keton inhibitor (de nem az alfa-ΙΡΙ) gátolta a neutrofil-közvetítette belhámkárosodást. Náthán kimutatta, hogy a tapadó neutrofilek más kinetikájú szabad oxigéngyököket hoznak létre, mint a szuszpenzióban lévő neutrofilek (Náthán, J. Clin. Invest., 80 . 1550, 1980). Nem tudni, hogy a nagymértékben reaktív szabad oxigéngyökök és termékeik a letapadó neutrofilek és a közvetlenül alattuk lévő szövet között halmozódnak-e fel.
• · • · · · • · · • · · • · · · ·
A humán neutrofilek két szemcséket tartalmaznak, ultrastrukturális citokémiai egymástól (Bainton és mtsi. és Bainton és mtsi., J. azurofil (vagy primer) és mieloperoxidázt (MPO), tartalmaznak. A kisebb, szekunder) szemcsék illetve laktoferrint neutrofileken belül eltérő populációját elasztáz antigénnel különböző osztályba tartozó melyek hisztokémiai és tulajdonságaikban térnek el
J. Cell Bioi., 32, 286, 1968;
Bioi.. 39, 299, 1968). Az rendszerint nagyok, denzek neutrális proteázokat denz specifikus (vagy és lizozimet,
Weinbaum és mtsi. a szemcsék legalább három egyik populáció valamennyi de kis MPO aktivitást
Cell szemcsék illetve kevésbé peroxidáz-negatívak tartalmaznak.
az azurofil írták le. Az rendelkezik.
mutat. Az azurofil szemcsék heterogének és eltérően reagálnak a degranulációs ingerekre. A specifikus szemcsék szintén heterogének; a laktoferrin kalcium-indukálta felszabadulására különböző érzékenységet mutatnak. A protein kináz C szelektív gátlása nem gátolja az azurofil degranulációt, gátolja azonban a specifikus szemcsetartalom felszabadulását. Ilyenformán, a gyulladásos reakcióra jellemző mikrokörnyezetben a humán neutrofil elasztáz, a catG és a proteináz 3 neutrofilekből történő felaszabadulásának stimulálásához összetett és koordinált jelekre lehet szükség. A kötődés és a jelekre történő reagálás kinetikája szintén fontos lehet a gyulladásra adott fiziológiai reakció szabályozásában. Kimutatták, hogy a tüdőben a humán neutrofil elasztáz az alveoláris szövetközi térben szabadul fel, jóval azután, hogy a neutrofil elhagyta
keringési rendszert. A diapedesis folyamat során lejátszódó neutrofíl degranulációról keveset tudunk. A légzőhámseJtek fokozott IL-8 expresszióval· reagálnak a humán neutrofíl elasztázra, az IL-8 viszont a hámsejteken keresztüli migrációt közvetíti. Következésképpen, a HNE felszabadulását dinamikus és ártalmas hatású neutrofíl toborzási ciklus kíséri, amit kiemelt szintű neutrofíl migráció követ.
A neutrofíl proteázok tapadó sejtek által történő felszabadítását nem tanulmányozták részletesen, bár ismert, hogy a neutrofilek forbo1-mirisztát-acetátos (PMA) stimulációja olyan amely megemészti állományt (Campbell 1982; és Weiss és mátrix proteinekhez vitronektin) tapadó felszabadulását alatti Clin.
proteáz a neutrofíl és mtsi.,J.
mtsi., J. Immunoi., (pl. laminin, neutrofileket eredményezi, extracelluláris Invest. , 70, 845 , 636, 1986). A fibronektin vagy stimulálták az olyan fiziológiai jelek, mint pl.
a TNF vagy a granulocita kolóniastimuláló faktor (G-CSF), ezzel szemben, a szuszpendált sejteket ezek a jelek nem serkentették. A tapadó sejtek olyan respirációs burst-öt váltottak ki.
amely 10-50-szer érzékenyebb volt a TNF-re és a G-CSF-re, mint a PMA-ra, és 50-250-szer érzékenyebb volt az fMet-Leu-Phe-re vagy C5a-ra. Ezek a sejtek a szuszpendált sejtekétől Jelentősen eltérő kinetikával reagáltak.
proteolitikus enzimek inhibitorai (kezelésszerűen
| adago iva i | kor látózhatj ák | a gyulladás | molekuláris | és |
| céllulár is f | mechanizmusait, | s ezáltal | csökkenthetik | a |
| szövetek | károsodását. | Következésképpen, klinikai |
felhasználáshoz biztonságos és hatásos elasztáz inhibitorokra van szükség. A multifunkcionális proteáz inhibitorokon alapuló gyógyszerek segíteni fogják az olyan betegségek kezelését. amelyeknél a sérülés mechanizmusában szabad gyökök és proteázok játszanak szerepet; ilyen pl. a felnőttkori respirációs szindróma, a hasnyálmirigy-gyulladás, a gyulladásos börsérülések és a reperfúziós sérülés.
A találmány tárgya humán alfa-1-anti-kimotripszin analógok, melyek a humán neutrofil elasztáz hatékony inhibitorai. A találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analógokat úgy manipuláljuk, hogy a humán neutrofil elasztáz számára ne szubsztrátként, hanem inhibitorként szolgáljanak. A találmány tárgyát képező humán alfa-l-anti-kimotripszin analógokban a 358. helyen lévő leucint metioninnal, izoleucinnal, valinnal, alaninnal, aszparaginsavval, treoninnal vagy glutaminsavval helyettesítjük. A találmány
| szerinti | analógok a 356., 357., 359., 360. és 361. helyek |
| legalább | egyikén prolint tartalmaznak. A találmány szerinti |
| analógok | közé tartozik a humán alfa-l-anti-kimotripszin, |
| amelyben | a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-262. |
aminosavait (Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu; 7. számú szekvencia)
Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro (8. sz.
szekv.) aminosavakkal helyettesítettük, ahol Xxx jelentése metionin, triptofán, alanin. aszparagin. aszparaginsav. glutaminsav, glicin, hisztidin. fenilalanin, prolin, szerin, treonin.
cisztein, glutamin, izoleucin. lizin. tirozin vagy valin.
A találmány további tárgya új alfa-l-anti-kimotripszin polipeptidek. A találmány szerinti új polipeptidet a vad típusú, érett humán alfa-l-anti-kimotripszin teljes aminosav-szekvenciáját kódoló nukleotid-szekvenciából (ld. 1. ábra) állítjuk elő, amely a 356-361. helyek között lévő eredeti aminosavak helyett az Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro (Θ. sz. szekv.) kódolja. ahol Xxx jelentése triptofán, alanin. aszparagin, aszparaginsav. glutamin, glutaminsav, glicin, hisztidin, lizin. fenilalanin. prolin, szerin. treonin, tirozin vagy valin.
szeKvenciat met ionin. cisztein, izoleucin,
A találmány további tárgya vad típusú humán alfa-l-anti-kiaotripszin analógok, amelyekben a 349. és 350. helyen levő két. alanint· glicinnel, illetve treoninnal, a 368. valint pedig treoninnal helyettesítettük. Az alfa-l-anti-kimotripszin új polipeptid analógjai, melyek a fenti szubsztitúciókkal rendelkeznek, szintén a találmány tárgyát képezik.
A 356-161. aminosavakat, valamint. a 349., 350. és 368. aminosavakat érintő szubsztitúciók egyazon nukleotid- és amir.osav-szekvencián belül is előfordulhatnak, ami további új alfa-l-anti-kimotripszin analógokat eredményez.
A találmány szerinti új ρο1ipeptidek N-terminál is toldalékokat foglalnak magukban, mely toldalékok a Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro (5. sz. szekv.) és Met-Ala-Ser szekvenciákból állnak, s amelyek egymástól függetlenül a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszinhez és a találmány szerinti új alfa-1-anti-kimotripszin analógokhoz egyaránt hozzákapcsolhatók. Az N-terminális toldalékokat kódoló nukleotid-szekvenciák, valamint az N-terminális toldalékokkal rendelkező alfa-l-anti-kimotripszinek egyaránt a találmány tárgyát képezik.
A találmány további tárgyai a találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analógot kódoló nukleinsav-szekvenciák; az ilyen nukleinsav-szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok; a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciákat expresszálni képes transzformált gazdasejtek; a találmány szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analógokat expresszálni képes sejttenyészetek: valamint a találmány szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analógokat tartalmazó proteinkészítmények.
A találmány további tárgya eljárások humán alfa-l-anti-kimotripszin analógok előállítására, melyek során humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg expresszálására képes gazdasejtet tenyésztünk, hogy humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot tartalmazó sejteket hozzunk létre. Adott esetben a sejtek és a tápközeg humán alfa-l-anti-kimotripszin analógokat tartalmazó elegyét úgy tisztíthatjuk, hogy a • ··· · · ·· • · · · · · ···· ·· · ·· · ·· ·· — β — humán alfa-1-anti-kimotripszin analógokat tisztított alakban kapjuk.
A találmány további tárgya eljárás neutrofil elasztáz gátlására, melynek során az elasztázt egy találmány szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg gátló hatású mennyiségével hozzuk érintkezésbe.
A találmányt előnyös megvalósítási módjainak bemutatásával és a szabadalmi igénypontok leírásával ismertetjük részletesen.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán a vad típusú humán alfa-l-anti-kimotripszin teljes nukleotid-szekvenciáját és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciáját mutajuk be. A teljes hosszúságú gént az 1-1209. nukleotidok alkotják.
Váratlanul és meglepő módon felfedeztük, hogy a humán alfa-1-anti-kimotripszint kódoló szekvenciában bizonyos aminosavakat kódoló nukleotidok helyettesítése megváltoztatja az alfa-l-anti-kimotripszint, oly módon, hogy a humán neutrofil elasztáz szubszrátja helyett a humán neutrofil elasztáz hatékony inhibitorává válik, miközben kimotripszint gátló képessége fennmarad.
A találmány egyik tárgya a vad típusú humán alfa-l-anti • ·
-kimotripszin nukleotid-szekvenciája (1. ábra·, amelyben a vad típusú alfa-1-anti-kimotripszin 356-361. Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu aminosavait (7. sz. szekv.l kódoló nukleotidokat az Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro aminosavakat (8. sz. szekv.) kódoló nukleotidokkal helyettesítettük. A 356-361. helyen az említett szubsztitúciókkal rendelkező új polipeptid-szekvencia szintén a találmány tárgyát képezi.
A találmány egy másik tárgya a vad típusú humán alfa-l-anti-kimotripszin nukleotid-szekvencia analógja. amely a vad típusú alfa-1-anti-kimotripszin 349., 350. és 368. aminosavainak helyén helyettesített aminosavakat kódol. Az említett, analóg fenti aminosavaknak megfelelő helyein lévő nukleotidok glicint, treonint, illetve ismét treonint kódolnak. Az e szubsztiúciókkal rendelkező polipepid-szekvencia szintén a találmány tárgyát képezi.
A találmány szerinti analóg, melyben a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 349. és 350. helyén lévő két alanint glicin, illetve treonin helyettesíti (KpnI resrikciós endonukleázos helyet képezve), és a vad típusú és 369. helyén lévő valint és arginin helyettesíti (Miül helyet képezve), elasztáz alfa-1-anti-kimotripszin 368. arginint treonin. illetve restrikciós endonukleázos inhibitor aktivitást mutat.
A találmány szerinti új analógokhoz vagy a vad típusú alfa-1-anti-kimotripszinhez
N-terminálisához toldalékok kapcsolhatók. -Az ilyen N-terminál is toldalékok közé tartoznak a Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro (5. sz. szekv.) és
Met-Alá-Ser polipeptid-szekvenciák.
A találmány szerinti analógokat a szerin proteáz inhibitorok és a szerin proteázok közötti interakciók természetének vizsgálatához alkalmaztuk. Az anti-kimotripszin aktív centrumának Pl helyénél és az aktív centrum környékén lévő gyökök az elasztáz és a találmány szerinti alfa-l-antikimotripszin analógok között stabil komplexképződést biztosítottak.
A vad típusú alfa-1-anti-kimotripszin megfelelő szekvenciáját helyettesítő Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro aminosav-szekvenciát (8. sz. szekv.) az alfa-l-proteináz inhibitor megfelelő szakaszából, azaz az alfa-l-proteináz inhibitor aktív centrumának P3 helyétől P3' helyig terjedő szakaszából választottuk ki. Az itt alkalmazott nomenklatúra megfelel a Schechter és Berger által leírtnak (Schechter és Berger, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 27 , 157, 1967; melyet itt hivatkozásul említünk). A vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin kifejezés a humán alfa-l-anti-kimotripszin természetes, érett alakját jelenti.
Az alfa-l-proteináz inhibitor, amelyben a Pl gyök metionin, a Pl' gyök pedig szerin, a HNE-t 10 x 106 M-^-s-1 másodfokú sebességi állandó értékkel gátolja. Az alfa-l-anti-kimotripszin nagymértékű homológiát mutat az
• ··· · · ·· • · · · · · alfa-1-proteináz inhibitorral: azonos helyzetén 44.5 %-ban azonos gyökök találhatók. azonban az aktív centrumban található Pl-Pl' Leu-Ser gyököket szegélyező szekvenciák eltérőek a két molekula esetében. A vad típusú az alfa-l-anti-kimotripszin, bár kiváló inhibitora a kimotripszinnek, nem gátolja hatékonyan a HNE-t. Valójában a HNE az alfa-l-anti-kimotripszint legalább a P4-P3 helyzetben (IIe355-Thr356) hasítja, ami gátló tulajdonságának inaktiválását eredményezi.
Találmányunkban a humán alfa-l-anti-kimotripszin csupán egy kis részének megváltoztatásával úgy módosítjuk specifitását, hogy egy teljesen különböző enzim (nevezetesen az elasztáz) hatékony inhibitorává válik, s közben megmarad az alfa-l-anti-kimotripszin analóg kimotripszint gátló képessége.
A találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analógokat általában gazdasejtekben termeljük, melyeket a szóban forgó proteint kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformáltunk. A transzformált sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik az adott proteint kódoló nukleinsav-szekvencia expresszióját. A protein felhalmozódásához elegendő idő elteltével a proteint megtisztítjuk a transzformált sejtektől.
Alfa-l-anti-kimotripszint kódoló humán gént humán máj c DN S-k ö n y v t á r b ό 1 nyerhetünk.
kereskedelmi forrásokból (pl.
beszerezhetők.
-szekvenálásnak
-kimotripszint
DNS-szekvenálás
Az alkalmas
Clontech, Palo könyvtárak
Alto, CA)
A könyvtárból származó pozitív kiónokat DNSalávetve kódoló
Sanger és meghatározhatjuk az alfa-l-antiDNS-szekvencia jelenlétét. A mtsi. láncterminációs eljárásának könnyen elvégezhető (Sanger és
Natl. Acad. Sói. USA, ΊΑ, 5463.
1977 ) .
Az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló DNS-szekvenciát ezután gazdasej tben expressziós vektorba
A találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analóg az 5,079,336 számú Egyesült Államok-beli szabadalomban (melynek leírását hivatkozásként említjük) leírt alfa-l-anti-kimotripszin kazetta alkalmazásával állítható elő. Például, a 356-361. helyeken lévő Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro (8. sz. szekv.) aminosav-szubsztitúciókat kódoló DNS-szekvenciát a kazettába inszertáljuk. majd az igy kapott kazettát az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló DNS-szekvenciába inszertáljuk. A 356-361. helyeken aminosav-szubsztitúciókat tartalmazó proteint kódoló DNS-szekvencia, illetve a 349., 350. és 368. helyen aminosav-szubsztitúciókat tartalmazó polipeptidet kódoló DNS-szekvencia kazetta vektorral is előállítható. Más lehetőség szerint, az alfa-l-anti-kimotripszin analógot kódoló DNS-szekvencia PCR technikával is előállítható. Végül, az alfa-l-anti-kimotripszin polipeptid-analógja is előállítható.
»· · · · · · • ··· « · · · · · · · · ···· ·· ···· ·· ··
Az expressziós vektorokat és gazdasejteket úgy választjuk ki. hogy az alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógja szintézisére alkalmas expressziós vektort alkossanak. A találmány gyakorlati megvalósításában alkalmazható gazdasejtek közé prokarióta és eukarióta sejtek tartoznak, amelyek úgy transzformálhatok, hogy stabilan beépülve tartalmazzák az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló DNS-t, és expresszálják azt (ld. 5,079,336 számú Egyesült Államok-beli szabadalom, melyet itt hivatkozásul említünk). Például, rekombináns alfa-l-anti-kimotripszint vagy analógot kódoló nukleinsavat prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben (pl. a rekombináns proteinek előállításához legáltalánosabban alkalmazott baktérium gazdasejtben, az E. colí-ban) expresszáljuk. Egyéb baktériumok is alkalmazhatók, pl. a Bacillus subtílis vagy az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok, mint pl. a Salmonella typhimurium vagy a Sorra ti a marcescens. különböző Pseudomonas fajok, illetve egyéb baktérium törzsek.
Az általánosan alkalmazott eukarióta gazdasejt-rendszerek közé tartoznak az élesztők, mint pl. a Saccharomyces cerevisiae; rovarsejtek, pl. Spodoptera frugiperda; baromfi sejtek, pl. E3C/0 és SL-29; emlős sejtek, pl. HeLa, Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek, COS-7 és MDCK sejtek, stb. A fenti gazdasejteket csupán szemléltetésként, és nem a találmány szerinti nukleinsavak expressziójához alkalmas gazdasejt-típusok korlátozásaként soroltuk fel. A leírásban alkalmazott expressziós vektor kifejezés minden olyan
| vektorra | vonatkozik. amely úgy manipulálható. hogy |
rekombináns alfa-1-anti-kimotripszint kódoló nukleinsavat tartalmazzon; ilyenek pl. a plazmid expressziós vektorok és a virusvektorok. Az expressziós vektorok kiválasztása a kívánt gazdasejttel való kompatibilitás alapján történik.
| hogy a | rekombináns alfa-l-anti-kimotripszint kódoló |
| nukleinsav | expressziója bekövetkezzen. A plazmid expressziós |
| vektorok | egy találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát. |
| legalább | egy expressziós szabályozó elemhez, pl. egy |
promoterhez működőképesen kapcsolva tartalmaznak. A plazmidvektorok általában a gazdasejttel kompatibilis fajból származó replikon és kontroll szekvenciákat tartalmaznak. A
| találmány | szerinti nukleinsav-szekvenciákat tartalmazó |
| plazmidok | kiválasztásának elősegítése érdekében a |
plazmidvektorok tartalmazhatnak szelektálható markért, pl.
antibiotikum-rezisztencia gént is. A ilyen gének példáiként
| említhető | az ampicillin-, tetraciklin-, klóramfenikol- vagy |
kanamicin-rezisztenciát kódoló gén.
Az alkalmas expressziós vektorok, promoterek, enhancerek és más expressziós szabályozó elemek jól ismertek, s leírásuk megtalálható: Sambrook és mtsi., Molecular Cloning: A
| Laboratory | Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory |
Press. Cold Spring Harbor, NY, 1989. E. coli-ban végzett expresszióhoz pl. a pBR322, pUC18, pUC19, pZMS, pZM
| plazmidok, | illetve a példákban leírt plazmidok |
alkalmazhatók. A S. cerevisiae-ben végzett expresszióhoz az
YRp7 plazmidok, emlős sejtekben pedig pl. a pMT2 és pMMSG
- 15 plazmid alkalmazható. Az alkalmas virusvektorok közé tartozik a baculovírus. a Vaccinia vírus és az adenovírus.
Az alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógja E. coli-han történő expressziójához a T7 bakteriofág RNS-polimerázon alapuló génexpressziós rendszer alkalmazható (ld. Studier és Moffatt, J. Mól. Bioi., 189. 113. 1986; mely leírás teljes egészét referenciaként tekintjük). E rendszerben a T7 bakteriofág promotert egy kiválasztott terméket kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazó plazmidokkal transzformált E. coli sejteket a T7 RNS-polimerázhoz megfelelő. expresszálható génnel rendelkező lambda fággal fertőzzük. A sejteket azután fertőzzük meg a fággal, hogy a gazdasejtekben elegendő példányban van jelen a plazmid. A protein szintézise röviddel a fertőzés után kezdődik.
Az expressziós vektor előnyösen legalább egy transzkripciós és transzlációs szabályozó elemet tartalmaz, amely működőképesen kapcsolódik a humán alfa-l-anti-kimotripszint kódoló nukleinsav-szekvenciához. Például, 5' irányban a promotert transzlációs iniciációs jel követheti, amely riboszóma kötőhelyből és iniciációs kodonból áll; 3' irányban pedig transzkripciós terminációs jel állhat. A transzkripciós és transzlációs szabályozó elemek bármilyen funkcionális kombinációban vagy sorrendben egymáshoz ligálhatók. A találmány megvalósítási módjaiban alkalmazott transzkripciós és transzlációs szabályozó elemeket annak a sejttípusnak megfelelően válaszjuk ki. amelybe az expressziós vektort be kívánjuk vinni (ami expressziós rendszert eredményez). Az alfa-1-anti-kimotripszint vagy analógját kódoló nukleinsav-szekvenciát magában foglaló expressziós vektort számos ismert módon bevihetjük a gazdasejtbe, pl. kalcium-kloridos vagy litium-kloridos együttes kicsapással vagy elektroporációval.
Az alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógja expressziójához jelenleg az E. coli az előnyös gazdasejt. E. coli-ban a klónozás és az expresszálás gyorsan elvégezhető, a protein termelése pedig az alacsony költségű, nagyüzemi fermentációval és tisztítással könnyen megvalósítható.
A humán alfa-l-anti-kimotripszin analógokat kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó transzformált gazdasejtek megfelelő tápközegben növeszthetek. Indukálható promoter alkalmazása esetén a gazdasejtet nagy denzitás eléréséig tenyésztjük, és a promotert bekapcsoljuk az alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógjának expresszálására. Amennyiben a promoter nem indukálható. a protein termék konstitutív termelődése történik. Az alfa-l-anti-kimotripszin analóg konstitutív termelése olyan expressziós rendszerekben előnyös, amelyek lényegében nem toxikusak a gazdasejtre. A sejeket addig tenyésztjük, amíg a termék felhalmozódása el neméri a kívánt szintet, majd a sejteket összegyűjtjük, és a terméket hagyományos módszerekkel tisztítjuk. Az alkalmas tisztítási eljárások közé tartozik (nem kizárólagos • ··· · · ·· • · · · · · ···· ·· ···· *· ··
- 17 jeHeggel, az ioncserélő kromatografia. a dialízis és más ismert proteintisztítási módszerek.
A fentieknek megfelelően, a találmány egyik tárgya eljárás humán alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógja előállítására, melynek során a humán alfa-l-anti-kimotripszint vagy analógját expresszálni képes gazdasejtet tenyésztünk, hogy humán alfa-l-anti-kimotripszint vagy analógját tartalmazó sejteket kapjunk, és adott esetben tisztítjuk az elegyet, miáltal a humán alfa-l-anti-kimotripszint vagy analógját tisztított alakban kapjuk.
A fentiek szerint, a gazdasejtek által termelt, tisztított vagy tisztítás nélküli, rekombináns alfa-l-anti-kimotripszin analóg protein-készítményeit állítjuk elő, amelyek alfa-l-anti-kimotripszint és (a protein tisztításának mértékétől függően) egyéb anyagokat, pl. gazdasejt komponenseket és/vagy tápközeget tartalmaznak.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciák állapotát Jelző tisztított kifejezés olyan nukleinsav-szekvenciákra vonatkozik, amelyek lényegében mentesek a nem humán alfa-l-anti-kimotripszint kódoló egyéb nukleinsavaktól vagy egyéb. a nem rekombináns sejtekben a nukleinsavval normális esetten (azaz természetes állapotban) kapcsolatban álló anyagiktól.
Az alfa-l-anti-kimotripszin protein vagy analóg protein állapotát jelző tisztított kifejezés olyan alfa-l-anti-kimotripszinre vagy analógra vonatkozik. amely legalább bizonyos mértékig mentes a celluláris anyagtól, illetve a proteinnel normális esetben, természetes állapotban kapcsolatban álló egyéb anyagoktól. Az alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógjának tisztasága (homogenitása) előnyösen legalább 25 %-tól kb. 100 %-ig terjed, előnyösebben legalább 50 %-os.
A találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin. alfa-l-antikimotripszin analógok és protein-készítmények (emlősökben, beleértve az embert) hatásosak a vérmérgezés, a hasnyálmirigy-gyulladás, a véralvadási betegségek, májbetegségek, mikrobiális kimotripszin-szerú enzim feldolgozásával a bőrön áthatolni képes mikroorganizmusok által okozott bizonyos betegségek, valamint a bőrgyulladás kezelésében. A találmány szerinti készítmények különböző módokon adhatók be az emlősöknek (beleértve az embert), pl. intravénásán, intramuszkulárisan és intraperitoneálisan, illetve a bőr érintett területén topikálisan. A találmány szerinti készítmények (nem kizárólagosan) az alábbi betegségek kezelésében alkalmazhatók hatásosan: reumatoid artritis; glomerulonephritis; tüdőbetegségek, pl. felnőttkori légzési fájdalom szindróma és emphysema; a szívós agyszövet reperfúziós sérülései és a transzplantációk miért bekövetkező traumák; öregedés; vérmérgezés; hasnyálmirigy- -gyulladás; kemoterápiás szerekkel, pl. adriamicinnel együttes adagolás: ionizáló sugárzás mellékhatásainak ipl.
borproblémák, nyálkahártyagyulladá
hajhullás) megelőzése.
Ennek megfelelően, a találmány egy további tárgya élj árás az elasztáz gátlására, melynek során az elasztazt a humán alfa-l-anti-kimotripszin analógj ának gátló hatású analógban a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-361.
-Ala-Leu aminosavai (7. sz. szekv.) helyett
11e-Pro-Xxx-Se r-Ile-Pro aminosavak (8.
sz. szekv.) találhatók; vagy az elasztázt egy találmány szerinti proteinkésziménnyel hozzuk érintkezésbe.
A találmány további tárgya eljárás a humán alfa-l-anti-kimotripszin analógjának (melyben a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-361. Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu aminosavai (7. sz. szekv.) helyett Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro aminosavak (8. sz. szekv.) találhatók) alkalmazására elasztáz-aktivitás gátlásában, melynek során az elasztázt az említett alfa-l-anti-kimotripszin analóg elasztáz gátlásához hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe.
A hatásos mennyiség és gátló hatású kifejezés a találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analóg azon koncentrációira vonatkozik, amelyek csökkentik az elasztáz természetes vagy szintetikus szubsztrátokra vonatkozó aktivitását.
találmány érinti
alfa-l-anti-kimotripszin analógok neutrofil elasztázt gátló aktivitással rendelkeznek, és a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszinnel azonos módon alkalmazhatók. Az említett analógok a neutrofil elasztáz hatásos inhibitorai, és hatásosan alkalmazhatók a reperfúziós sérülés, tüdőgyulladás, gyulladásos bélbetegség, bőrgyulladás, hasnyálmirigy-gyulladás, glomerulonephritis és vérmérgezés kezelésében és megelőzésében.
A tüdőgyulladás esetében a gyulladást valamilyen savas anyag, pl. (nem kizárólagosan) gyomortartalom, füst vagy fertőző anyag, pl. patogén (beleértve a gram-negativ baktériumokat, pl. Escherichia és Pseudomonas) belélegzése okozza. A reperfúziós sérülést illetően, a találmány szerinti analógokat az átáramoltatás (perfúzió) során bekövetkező sérülés megelőzése céljából, a vérrögök eltávolítása vagy feloldása érdekében adagolhatjuk.
A találmány szerinti analógok gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal vagy hígitószerrel, pl. sóoldattal vagy egyéb pufferrel együtt adagolhatok. Az alkalmas gyógyszerészeti vivőanyagok jól ismertek, ld. pl.: Gennaro és Alfonso (szeri.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, amely e területen standard referenciának számít. A vivőanyagokat a tervezett beadási módnak és a hagyományos gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelően választhatjuk ki. Az adagolást a kezelt személy testtömegének és klinikai állapotának figyelembevételével ·· · · · · · • ··· · · ·· • · · · · · «··· ·· ··· · ·· ·· aranya
Az aktív összetevő vivoanyagra vonatkoztatott természetesen az analóg kémiai természetétől, oldékonyságátó1 és stabilitásától.
illetve az alkalmazott dózistól függ.
A találmány szerinti analógok önmagukban vagy más vegyületekkel (beleértve, de nem kizárólagosan, a találmány szerinti egyéb analógokat) kombinálva alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. A találmány szerinti eljárás egyéb anyagokkal, például (nem kizárólagos Jelleggel) antitestekkel, toxinokkal és antiszensz oligonukleotidőkkel végzett kezelésekkel együtt is alkalmazható. Az in vivő alkalmazáshoz a beadandó mennyiség szintén olyan tényezőktől függ. mint a kezelt személy kora, testtömege és klinikai állapota. A találmány szerinti analógok bármilyen alkalmas módon, pl. intravénás, orális, intraperitoneális, intramuszkuláris, szubkután vagy topikális oltással és injektálással, illetve hámszöveten vagy bőr-nyálkahártyán keresztüli abszorpcióval, pl. orron, szájon, hüvelyen, végbélen és gyomor-bélrendszeren keresztül is beadhatók.
A találmány szerinti analógok, gyógyszerek és készítmények alakját meghatározza a beadási mód. Például, topikális alkalmazás esetében krémeket, kenőcsöket, géleket, olajokat, emulziókat, pasztákat, borogatóvizeket és hasonlókat használunk. A parenterális beadáshoz az analógokat steril vizes oldatok formájában alkalmazzuk, amelyek tartalmazhatnak egyéb oldott anyagokat, pl. sókat, glükózt vagy dextrózt. melyek az oldatot izotóniássá teszik. Az orális beadáshoz a találmány szerinti készítményeket tabletták. kapszulák, pasztillák, pirulák, porok, szirupok, vizes oldatok és szuszpenziók, stb. formájában alkalmazzuk. A készítményekben különféle lazítószerek, pl. keményítő, illetve sikositó anyagok alkalmazhatók. A kapszula alakjában történő orális beadáshoz diluensként laktózt és nagy molekülatömegú polietilén-glikolokat alkalmazhatunk. Ha az orális alkalmazáshoz vizes szuszpenziókra van szükség, édesítő és/vagy ízesítő szerek is alkalmazhatók.
A találmány további tárgya eljárás a neutrofil elasztáz élj árás bőrgyulladás, tüdőgyulladás.
glomerulonephritis, hasnyáImirigy-gyűl1adás, vérmérgezés, gyulladásos bélbeteeség kezelésére; valamint eljárás reperfúziós sérülés kezelésére és megelőzésére, melyek során kívánt állapotot mutató mintához alfa-l-antikimotripszin analógot adunk, amely a 358. helyen vagy a
358. és 356-161. helyeken a fentebb felsorolt aminosavszubsztitúciókkal rendelkezik;
vagy amelyben a vad típusú humán alfa-l-anti-kimotripszin 356-161. Thr-Leu-Leu-Ser-Ala
-Leu aminosavai helyett Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro aminosavak találhatók.
A találmány további tárgya gyógyszerészeti készítmények, amelyek a találmány szerinti alfa-l-anti-kimotripszin analógot és gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot vagy hígítószert tartalmaznak.
• · · • · · szerinti készítményeket e leőnyösen fiziológiailag elfogadható vivöanyaggal vagy hígítószerrel.
pl·. sóoldattal· pufferrel együtt adjuk be a kezelt emlősnek. Az alkalmas gyógyszerészeti vivőanyagok jól ismertek, s leírásuk megtalálható pl. a Remington's
Pharmaceutical
Sciences-ben (E.W. Martin), amely e területen standard referenciának számít. A bőrgyulladás találmány szerinti készítményeket elfogadható kenőccsel vagy krémmel kombinálva juttatjuk az érintett börfelületre. A találmány szerinti készítmények adott körülmények között alkalmazandó mennyisége a betegség típusától és egyéb tényezőktől, pl. a páciens korától és testtömegétől, illetve a beadás módjától függ. Topikális alkalmazás esetén a találmány szerinti készítményeket a bőrgyulladás súlyosbodásának csökkentésében vagy gátlásában hatásos mennyiségben alkalmazzuk.
1. PÉLDA
Rekombináns alfa-l-anti-kimotripszin analógok előállítása és tisztítása
Anyagok
Kimotripszint a Sigma-tól, illetve a Boehringer-Mannheim-töl kaptunk. Valamennyi kromofór proteáz szubsztrátot., valamint a fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) a Bachem-től kaptuk.
Humán szérum alfa-l-anti-kimotripszint Tsuda és mtsi. munkáján (Tokai, J. Exp. Clin. Med., Z, 201, 1982) alapuló eljárás alkalmazásával állítottunk elő. Ez az eljárás három lépésben (DNS cellulózról szakaszos elúció; G-150 kromatográfia; DNS cellulózról CaCl gradiens elúció) tiszta alfa-l-anti-kimotripszint eredményez.
A plazmidok kialakítását és a DNS-ek manipulálását Sambrook és mtsi. leírása alapján végeztük (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Δ____humán___antl-kímotripszin___géniének___azonosítása___és szekvenálasa
A Mitchell Weiss-től (Department of Humán Genetics, Universiity of Pennysilvania) kapott lambda-gtll expressziós fág vektorban készített humán máj cDNS-könyvtárat Young és Davis eljárása szerint (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74. 5463, 1977) egy rokon szerin proteáz inhibitor, a Cl észteráz inhibitor (DAKO, Santa Barbara, CA) ellen kialakított poliklonális antiszérummal screeneltük. A pozitív kiónokat kivettük, ismételten screeneltük és plakk módszerrel tisztítottuk. A DNS-szekvenálást a Wistar Institute (Philadelphia, PA) Nucleic Acid Synthesis Center-étől kapott oligonukleotid primerek alkalmazásával, Sanger és mtsi. láncterminációs eljárásával (Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 74. 5463, 1977) végeztük.
A pozitív lambda-gtll cDNS kiónok egyikéből származó EcoRI fragment DNS-szekvenciája és az érett humán alfa-l-anti-kimotripszin teljes kódoló régióját tartalmazta (ld. 1. ábra). A konstrukció magában foglalt egy 5' végen elhelyezkedő 21 nukleot-idos, hét aminosavat kódoló szekvenciát is (5'-Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro-; 5. sz.
| szekv.). | Az érett protein az 1. | helyen | lévő Asn | aminosavtó1 |
| kiindulva | 398 aminosavból áll | (M = | 45 031), | és egyetlen |
| c isztein | gyököt tartalmaz iá 236. | . helyen). |
Δ. 355-361, helyeken aminosav helyettesítésekkel rendelkező alfa-l-anti-kimotripszin előállítása PCR reakcióval
| PCR reakc | dióval a 356-361. helyeken szubsztitúcióval |
| rendelkező | alfa-l-anti-kimotripszin analógot állítottunk |
| elő. A | kereskedelemben beszerezhető pKC30 plazmidot |
| BamHI-gyei | hasítottuk, és a ragadós végeket Klenow |
| reakcióval | feltöltöttük. A mindkét felén tompa végűvé |
| alakított., | linearizált plazmidot önmagával ligáltuk, és a |
| ligálási | reakcióeleggyel E. coli N4380-1 sejteket |
transzformáltunk. A transzformánsokból tisztított plazmid pKC30(-BamHI) volt, ami azt jelenti, hogy a pKC30 plazmidból csak a BamHI helyet távolítottuk el. A pKC30(-BamHI)
| plazmidot | Hpal-gyel emésztettük, és a következő ligálási |
lépéshez két tompa véget alakítottunk ki.
A pAR3038, pAR3039 és pAR3040 plazmidból Xbal és EcoRV alkalmazásával egy riboszóma kötőhelyet tartalmazó 0,2 kb-os • ·
- 26 fragmentet távolítottunk el. Az
EcoRV enzimmel végzett hasítás tompa véget eredményezett. Az Xbal által kialakított ragadós véget Klenow reakcióval feltoltöttük. A három 0,2 kb-os fragment.et (mindkét felükön tompa véggel) külön-külön Hpal-gyel emésztett pKC30(-BamHI) plazmidhoz ligáltuk. A három ligálási elegyet egymástól függetlenül N4830-1 sejtek transzformálásához alkalmaztuk.
Az előállított transzformánsokból három vektort kaptunk, melyeket a három leolvasási keretnek megfelelően pZM3038-nak, pZM3039-nek, illetve pZM3040-nek neveztünk el.
Ezek a pZM vektorok pKC30 plazmidból származó pL promotert és pAR vektorokból származó Shine-Delgarno szekvenciákat tartalmaztak. E vektorok egyedüli klónozó helye a BamHI, amely a pAR vektorból származó fragmentben található.
A pZM3038, pZM3039 vagy pZM3040 egyikét Nhel-gyel hasítottuk, miáltal két, kb 5,9 kb-os és kb. 0,75 kb-os fragmentet kaptunk.
Az
5,9 kb-os fragmentet gélkromatográfiával tisztítottuk, és ligálással ismét gyűrűvé zártuk. Ezzel a ligálási reakcióeleggyel N4830-1 sejteket transzformáltunk. A kapott transzformánsokból izolált plazmidot pZMs-nek neveztük el. Ez a plazmid egy Nhel klónozó helyet tartalmaz, amely 3' irányban helyezkedik el a pL promotertöl, a Shine-Delgarno szekvenciától és a start kodontól.
Az I. táblázatban felsorolt 1., 2., 3. és 4. prímért • ·· ···· ·· · • ♦ · · · · · · • · · · · ·
Sambrook és mtsi. kézikönyvében (lei. fentebb) leirt standard eljárásokkal állítottuk elő.. Ezeket a primereket polimeráz láncreakcióban (POR) alkalmaztuk. amelyet annak érdekében végeztünk, hogy az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló szekvenciába P3-P3' aminosavakat kódoló bázisokat építsünk be. A standard PCR eljárások a szakemberek számára ismertek.
I. TÁBLÁZAT
Primer
Szekvencia
Szekv. száma
5'-CCCC
3-3'
' -CCACAGGAATAGACATTGGAATGATTTTGACTGCTGTGG-3' 2 .
3. 5'-CATTCCAATGTCTATTCCTGTGGAGACAAGGACCAT-3' 3.
4. 5'-TTTCATATGGCTAGCGCTCTAGGCTTGC-3
4.
A teljes hosszúságú nukleotid-szekvenciát két részben, A és B fragmentként alakítottuk ki. melyeket egyesítve a teljes hosszúságú nukleotid-szekvenciát kaptuk.
Az A fragment kialakításához két prímért alkalmaztunk. Az 1. primer az alfa-l-anti-kimotripszin kódoló vagy értelmes (szensz) szálának 5' szekvenciáját egy hozzátoldott 5' farokkal (amely Nhel klónozó helyet tartalmaz, és a táblázatban aláhúzással jelöltük) együtt tartalmazza. A 2. primer az N-terminális irányában elhelyezkedő aminosavaknak megfelelő bázisokat tartalmazza. Az 1. és 2. prímért • ·
polimeráz láncreakcióban alkalmaztuk. és az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló szekvencia e szakaszát a pUC19 plazmidba szubklc»noztuk, miáltal az A fragmentet kaptuk.
Az A fragment előállításához standard PCR eljárásokat alkalmaztunk. 10 ng templát DNS-hez (az alfa-l-anti-kimotripszint tartalmazó pUC19 plazmidhoz) 1 ul (100 ng/ul) 1. prímért. 1 ul (100 ng/ul) 2. prímért. 10 ul lOxPCR puffért, 10 ul 2 mM dNP-t és 0,5 ul Taq-polimerázt adunk, majd a reakcióelegy térfogatát desztillált vízzel 100 ul-re egészítettük ki. A PCR-t 30 ciklussal, ciklusonként három lépésben (94 ’C-on 15 másodpercig, 52 °C-on 15 másodpercig és 72 ’C-on 1 másodpercig) végeztük.
A B fragment előállításához két különböző prímért alkalmaztunk. A 3. primer a C-terminális irányában elhelyezkedő aminosavaknak megfelelő bázisokat tartalmazza, míg a 4. primer Nhel klónozó hellyel (melyet az I. táblázatban aláhúzással jelöltünk) rendelkező, meghosszabbított 5' farkat tartalmaz. A 3. és 4. prímért polimeráz láncreakcióban alkalmaztuk, és az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló» szekvencia e részét pUC19 plazmidba szubklónozva a B fragmentet kaptuk. A B fragment előállításához az A fragment előállításával kapcsolatban fentebb leírt PCR eljárást alkalmaztuk.
A teljes hosszúságú szekvenciát az A fragment esetében leírtak szerint állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy
- 29 az A. illetve B fragmentbol 5-10 ng-ot használtunk. A f ragmenteket denaturáltuk és újrahibridlzáltuk. amit azért végeztünk, hogy az A és B fragment — 356-361. aminosavakat kódoló szekvenciánál (melyet a 2. és 3. primer segítségével alakítottunk ki) átfedő — heteroduplexeit hozzuk létre. Az A és B fragment heteroduplexeit Taq DNS-polimeráz alkalmazásával meghosszabbítottuk a primerként szolgáló A és B fragmentek átfedő részeivel, miáltal a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu aminosav-szekvenciája (7. sz. szekv.) helyett Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro szekvenciával (8. sz. szekv.) rendelkező alfa-l-anti-kimotripszint kódoló, teljes hosszúságú szekvenciát hoztunk létre. A teljes hosszúságú szekvenciákat ezután az 1. és 4. primer alkalmazásával amplifikáltuk.
Az amplifikált teljes hosszúságú szekvenciát Nhel-gyel emésztettük, majd Nhel-gyel emésztett pZMs expressziós vektorba inszertáltűk. A teljes hosszúságú gént tartalmazó pZMs expressziós vektorral E. coli sejteket transzformáltunk, melyek a 356-361. helyeken megváltoztatott aminosavakat tartalmazó alfa-l-anti-kimotripszin analógokat expresszáltak. Ezt az analógot rACT-P3-P3'ΡΙ-nek nevezzük. A vad típusú, humán alfa-l-anti-kimotripszin találmány szerinti egyéb analógjai hasonló módon állíthatók elő.
N-terminális toldalékkal rendelkező, rekombináns alfa-1-anti-kimotr ipszin előállítása
Met-Ala-Ser N-terminális toldalékkal rendelkező, vad típusú alfa-l-ant i-kimotr ipszint. vagy analógot kódoló nukleotid-szekvencia előállítása érdekében olyan stabil monomereket expresszáltunk. amelyek a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin és analógja nukleotid-szekvenciája által kódolt N-terminál is Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro szekvencián (5. sz. szekv.) belüli Leu-Cys-His-Pro aminosavakat (6. sz. szekv.) kódoló nukleotidok deléciójának köszönhetően az Nterminális cisztein gyököt nem tartalmazzák. E célból a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin vagy analógja -4-es helytől a -l-es helyig elhelyezkedő leucin. cisztein, hisztidin és prolin aminosavak delécióval eltávo1íthatók. Az N-terminális toldalék a -3-tól -1-ig terjedő helyen metionin-alaninszerin lesz. Az ilyen lánchosszabbítás a teljes kódoló szekvencia PCR amplifikációjával valósítható meg, amihez az 5'-CCCCATAT- -GGCTAGCAACAGCCCACTTG-3' (1. sz. szekv.) Nterminális prímért, alkalmazzuk. C-terminális primerként az 5' -TTTCATATGGCTAGCGCTCTAGGCTTGC-3' (4. sz. szekv.) alkalmazzuk, amelyben az aláhúzással jelölt GCTAGC szekvencia inszerciós helyként szolgál. Az aláhúzott CTA zekvencia a vektor értelmes szálán TAG terminációs kodont hoz létre.
A szekvencia pZMs vektorba klónozható. Az amplifikáit teljes hosszúságú szekvenciát
Nhel-gyel emészthetjük és
Nhel-gyel emésztett pZMs expressziós vektorba inszertálhatjuk.
Az N-terminális toldalékkal
rendeIkez? gént tartalmazó p2Ms vektorral E. ccli-t transzformálhatunk. A fentiek eredményeként, a -4-től -1-ig terjedő helyeken lévő aminosavak megváltoztatásával, azaz a leucin, cisztein, hisztidin és prolin eltávolításával alfa-l-anti-kimotripszin analógokat állíthatunk elő. Hasonlóan, hét nukleotidból álló N-terminális toldalék kialakításához Met-Ala-Ser alkalmazható. A fentebb a MetAla-Ser toldalék előállításához leírt eljárások alkalmazhatók ehhez az N-terminális toldalékhoz is.
A—35.6-361.__helyeken., illetve a 349., 350. és 361, helyen aminosav-szubsztitúciákkal___rendelkező humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg kazetta vektorának előállítása
A humán alfa-l-anti-kimotripszint kódoló nukleinsav-szekvenciát. az 5,079,336 számú Egyesült Államok-beli szabadalomban (melyet, hivatozásul említünk) leírt eljárás szerint állítottuk elő.
alfa-l-anti-kimotripszin alfa-l-anti-kimotripszin
Az említett. szabadalomban leírt kazetta analógból olyan humán analógot állítottunk elő, amelyben a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-361. Thr-Leu-LeuSer-Ala-Leu aminosavai (7. sz. szekv.) helyett
Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro aminosavak (8. sz. szekv.) találhatók.
A kazetta proteint az alfa-l-anti-kimotripszint kódoló DNS-szekvencia helyre irányuló mutagenezisével állítottuk elő. A mutagenezishez kereskedelmi úton beszerezhető
készletét (M13 mutagenezis készlet: BioRad. Richmond, CA) (a gyártó útmutatásai szerint). Miül restrikciós hasítási hely kialakítása érdekében
5'-GTTGAAACGCGTAATGGTCCTT-3'
8Ζ .
szekv.), és KpnI restrikciós hasítási hely kialakítása érdekében
5'-ACTGCTGTGGTACCAGATGCTTC-3' szintetikus prímért (10. sz.
szekv.) alkalmaztunk. A szintetikus primereket standard technikák alkalmazásával szintetizáltuk. A módosított gént
EcoRI-gye 1 kivágtuk kétszálú M13-ból. és Mung bab nukleázzal kezelve tompa végűvé alakítottuk. Ezt a terméket tompa végű pZM vektorba inszertáltuk, miáltal a pACTCAS jelzésű rekombináns vektort kaptuk.
A KpnI és Miül restrikciós hasítási helyek a DNS-szekvenciában egyediek. A helyre irányuló mutagenezissel a 349. és 350. aminosavaknak megfelelő helyen alakítottuk ki a KpnI helyet, miáltal az eredetileg itt található Ala-Ala helyére Gly-Thr került. Az Miül restrikciós helyet a 368. és 369. aminosavaknak megfelelő helyen alakítottuk ki, miáltal az itt található Val-Arg helyére Thr-Arg került. A két restrikciós hely közötti régió, azaz a kazetta, tartalmazza az alfa-l-anti-kimotripszin aktív centrumát, s ez a régió a kívánt DNS-szekvencia beépítése érdekében KpnI-gyel és Mlul-gyel eltávolítható.
A szekvencia kazetta részét KpnI-gyel és Mlul-gyel kivágtuk, és helyére a hagyományos szintéziséé technikával előállított megfelelő kazettát ligáltuk, ami az ATTCCAATGTCTATTCCT tartalmazta. Ez a szekvencia a ·· V» ««···>
• 4 · ···* · 4· • ··· · ··· • · · 9 ·« *··· 99 999 9 ····
vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-361. aminosavai helyén az Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro aminosavakat (8. sz. szekv.) kódolja. A kapott vektort pACT-P3-P3'PI-nek neveztük el.
A pozitív lambda-gtll cDNS kiónok egyikéből származó inszert DNS-szekvenciája és leszármaztatott aminosav-szekvenciája az érett humán alfa-l-anti-kimotripszin teljes kódoló régióját tartalmazta. Az inszert tartalmazott egy 12 nukleotidból álló 5' toldalékot, amely négy aminosavat kódol, melyek az érett protein prekurzorában jelennek meg.
rACTPP3P3JPI expresszálása
E. coli N4830-1 sejteket Sambrook és mtsi. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) által leírt standard kalcium-kloridos eljárással pACT-P3P3'PI vektorral transzformáltunk.
Kis tételben végzett tenyésztés és extrakció
A pACT-P3P3'PI vektorral transzformált N4830-1 E. coli törzs egy éjszakás, friss tenyészeteit ampicillint (Na* só, 0,1 mg/ml) tartalmazó LB táplevesben 1,5 %-ra hígítottuk, és rázó inkubátorban 30 “C-on 0,18-as (600 nm-nél mért) abszorbanciaérték eléréséig növesztettük. A sejteket
- 34 hőmérséklet 42 'JC-ra történő emelésével indukáltuk, további
5-8 óra hosszat növesztettük, majd centrifugáltuk és French présben feltártuk. A transzformált sejtekből tisztított alfa-l-anti-kimotripszint rACTP3P3'Pl-nek nevezzük.
2. PÉLDA
A rekombináns alfa-l-anti-kimotripszin tisztítása és karakterizálása
Az E. cx~>2z. nagy..Xételben_yá£z.e.tt.„tenyésztése
A pACT-P3P3'PI vektorral transzformált N4830-1 E. coli törzset oxigénbuborékoltatóval ellátott 15 literes ballonban, 30 °C-on ampicillint (Na* só, 0,1 mg/ml) tartalmazó LB tápközegben, 0,18 (600 nm-nél mért) abszorbanciaérték eléréséig növesztettük. A sejteket a hőmérséklet 42 °C-ra történő emelésével indukáltuk, majd hozzávetőleg 0,9-1,0 abszorbanciaérték (600 nm-nél) eléréséig további hat óra hosszat növesztettük.
Extrakció és oszlopkromatográfia
Valamennyi tisztítási lépést 4 ’C-on végeztük. Az rACTP3P3'PI egy jellemző előállítási eljárása során a sej tmasszát ml mM kálium-foszfát pufferben (pH = 6,9) diszpergáltuk, és
French présben, 4 °C-on, 6,9316 x 105 kPa (10 000 psi) nyomáson háromszor átpaszírozva lizáltuk. A sejttörmeléket °C-on
000 x g-vel 30 percig végzett töltöttük. melyet
Tris-Cl pufferrel
Tris-Cl pufferben eltárolitottuk.
(Pharmacia) oszlopra (4.9 cm2 x 37 cm) előzetesen 50 mM KCl-ot tartalmazó 50 mM (pH = 7,5) ekvi1ibráltunk. A proteint 50 (pH
7,5) lineáris KC1 gradienssel (két liter térfogatban
50-500 mM) eluáltuk. A frakciókat (15 ml) 280 nm-nél mért abszorbancia alapján ellenőriztük a proteintartalomra, és az alábbiakban leírtak szerint antikimotripszin aktivitásra vizsgáltuk. Az rACTP3P3'PI kb. 200 mM KC1 koncentrációnál eluálódott.
Az rACTP3P3'PI-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, és 48 órán át kétszeres térfogatú (egyenként
2,5 liter) 10 mM kálium-foszfát pufferre 1
6,9) szemben dializáltuk.
A dializált oldatot előzetesen mM KCl-ot tartalmazó mM kálium-foszfát pufferrel (pH
6.9) ekvilibrált
DNS-cellulóz oszlopra (1,7 cm2 cm) vittük. A feltöltés után az az ekvilibráló pufferrel (20 ml) mostuk, majd ugyanebben a pufferben
KC1 lineáris gradiensével (10-500 mM. 300 ml) eluáltuk.
A frakciókat (8 ml) protein jelenlétére és anti-kimotripszin aktivitásra vizsgáltuk (ld.
lentebb). Az rACTP3P3'PI kb.
350 mM KC1 koncentrációnál eluálódott. Az anti-kimotripszin aktivitást mutató frakciók vizsgáltuk, melyet Laemmli leírása szerint végeztünk (Natúré [London], 227. 680, 1970).
Az egyes frakciókat Amicon YM-10 membránok alkalmazásával végzett ultrafiltrációval bekoncentráltuk, majd egy éjszakán át 50 mM Tris-Cl pufferrel (pH
7,5) (500 ml) szemben dializáltuk. Néhány esetben a rekombináns proteint FPLC Mono a n ionosért? io oszlopon.
a fentebb leirt feltételek alkalmazásával tovább tisztítottuk
Anti-kimotripszin aktivitási vizsgálatok
1,0 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, s az anti-kimotripszin aktivitást az
N-suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitro-anilid szubsztrát (90 %-os DMSO-ban készített 0,1 ml 10 mM oldat) hidrolízisének kimotripszin-katalizálta gátlásaként mértük (DeIMar és mtsi.. Anal. Biochem., 99.
316, 1979). A tipikus kimotripszin vizsgálati elegy 1,0 ml térfogatban 100 mM
8,3), 0,005 V/V % Triton Χ-100-at, szarvasmarha hasnyálmirigy kimotripszint (18 kmmól) és az oszlopról származó eluátomot (0,005-0.5 ml) tartalmazott. A vizsgálati elegyet szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd hozzáadtuk a szubsztrátot (90 %-os DMSO-ban készített
0,1 ml 10 mM oldat), és a megmaradt kimotripszin aktivitást a 410 nm-nél mért abszorbancia p-nitro-anilin felszabadulása által kiváltott változásának sebessége alapján határoztuk hőmérsékletű mintatároló rekesszel ellátót Hewlett Packard
8452A spektrofotométer alkalmazásával mértük.
A mintában jelenlévő aktív rACTP3P3'PI mennyiségét ismert koncentrációjú és aktivitású kimotripszin-oldat változó mennyiségű, részlegesen tisztított rACTP3P3'PI frakciókkal végzett titrálásával határoztuk meg. Az inhibitortartalmú oldatokkal végzett inkubálás után jelenlévő aktív kimotripszin mennyiségét kimotripszin vizsgálattal határoztuk meg.
Arclelt és Laskowski aktív
aktivitási
A kimotripszin koncentrációját centrum titrálási eljárásával (Biochemistry, 2A, 5313, 1985) határoztuk meg.
3. PÉLDA
Humán neutrofil elasztáz gátlása
A HNE-t és az alfa-l-PI-t a CalBiochem-tő1, a szubsztrátokat a Sigma Chemical Co.-tól ( £t. Louis, Missouri), az SDS gélekhez való standard proteineket pedig a BioRad-tól kaptuk.
Az inhibitor és a proteáz koncenttrációíának meghatározása
Az rACTP3P3'PI és az alfa-l-PI koncentrációját szarvasmarha kimotripszin alkalmazásával végzett aktív centrum titrálással határoztuk meg. A kimotripszin koncentrációját Shonmaum és mtsi. (J. Bioi. Chem., 236. 2930, 1961) eljárása szerint, aktív titrálószerként N-transz-cinnamoil-imidazol alkalmazásával standardizáltuk. A HNE koncentrációkat standardizált alfa-l-PI alkalmazásával végzett titrálással határoztuk meg. A kapott értéket a HNE specifikus aktivitásának meghatározásához használtuk, az alábbiak szerint: 0,61 nmól termék-perc-1/(standard vizsgálati körülmények között mért) nmól HNE (ld. Nakajima és mtsi., J.
Bioi. Chem., 254. 4027, 1979) (0,1 M HEPES pH = 7,5; 0,5 M
NaCl; 9 % Me2S04; 1 mM N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA). A • · · · • · · · • ··· képződött para-nitro-anl1in mennyiségi meghatározását β4ΐο 8800 M_1cm_T érték alkalmazásával végeztük.
Titrálások és az időbeli lefolyás vizsgálata
A titrálási reakciókat 0,50 ml térfogatban végeztük (0,1 M Tris-HCl, pH = 8.0; 0.1 M NaCl; 0,01 % Triton X-100). A HNE koncentrációja 150-400 nM volt. Az inkubálást rendszerint 25 ’C-on 30 percig végeztük. A maradék aktivitás méréséhez a minta egy részét 1 ml standard pufferben úgy hígítottuk, hogy a klontroll kezdeti hidrolízis-sebessége 410 nm-nél 0,4-0.75 abszorbanciaegység-változás/perc legyen. A hidro1ízis-sebességet három percen át folyamatosan ellenőriztük (Beckman DU vagy Gilford 260 spektrofotométeralkalmazásával). Az időbeli lefolyás vizsgálatát hasonlóan végeztük. azzal a különbséggel, hogy a reakc-iótérfogatot megnöveltük, hogy az idő előrehaladásával ugyanabból a reakcióelegyből ismételten eltávolíthassunk egy-egy részletet.
Az_.fnakt iválási sebességi állandó meghatározása
A sebességi állandókat ál-elsőfckú feltételek mellett
Petersen és □eminensen
Biochem. ·J.
, 123, 121, 1981).
Az előrehaladási görbéket
10-15 percig ellenőriztük, és pillanatnyi másodperces intervallumokkal mértük.
sebességet az egy perces időközökre • · ·· • · · · β · ·· • · · · ··
összegyűjtött abszorbanciáértékek legkisebb négyzetek lineáris illeszkedése alapján határoztuk meg. A szubsztrát jelenlétében a látszólagos sebességi állandót (k') az adatok (sebességi értékek az idő függvényében) exponenciális Ae-1^ görbéhez való legkisebb négyzetek illeszkedése alapján határoztuk meg. A látszólagos sebességi állandót ezután a ktap&sztaiati - k'(Km/Km + S) összefüggés alapján a szubsztrát. koncentrációjával korrigáltuk. A mért Km értékek a 0.1 M NaCl-ot tartalmazó reakcióelégyben 0,40 mM. a 0,5 mM NaCl-ot tartalmazó reakcióelegyben pedig 0,14 mM volt.
Az ionerősség nem befolyásolta jelentősen a tapasztalati k érték alakulását; a megadott. értékek a két. ionerősségnél mért értékek közepes és standard eltérései.
SLS aélelektroforézis
A reakciókat 30 perc elteltével PMSF (0,5 mM végkoncentráció) hozzáadásával állítottuk le. 10 perces inkubálás után az elegyhez 2 % SDS-t és 5 mM DTT-t (24) tartalmazó denaturáló puffért adtunk, és a mintákat tíz percig 90 ’C-on melegítettük. A proteineket 7,5 %-os gélen elektroforizáltuk, és Coomassie Erilliant Blue festéssel tettük láthatóvá.
(rACT ) reakc ió.í a humán
ng.utr.aiil elasztázzál (HNE)
A HNE rekombináns humán melyet
5,079,336 szabadalomban leírtak interakciója nem
alfa-l-anti-kimotripszinnel (rACT;
számú szerint mutatott
Egyesült Államok-beli állítottunk elő) való gátlást.
Nagy inhibitor/elasztáz arányoknál (25-30:1) a hidrolízis kezdeti alacsonyabb volt, és az idő előrehaladtával, illetve a sókoncentráció növekedésével az enzimaktivitási kontrol1 szintre emelkedett.
reakciótermékek idő függvényében végzett
SDS a hasított rACT lassú felhalmozódását mutatta, stabil komplexre utaló bizonyíték nélkül. A kontroll kísérletekben a HNE alfa-l-PI-vel végzett titrálása
1-es gátlási sztöchiometria (Sí; stoichiometry of inhibition) értékig lineáris volt, és 0,15 M NaCl-ot tartalmazó 0,1 M Tris pufferben (pH = 8,0) bármelyik I/E aránynál képződött komplex legalább 24 órán keresztül stabil volt.
Az rAC-TP3P3'PI reakciója HNE-vel és anti-kimotripszinnel
A HNE rACTP3P3'PI által kiváltott gátlásának időbeli lefolyása az aktivitás azonnali elvesztését mutata, majd a szaabad enzim lassú regenerációja következett, ami 0,1 M NaCI koncentrációnál hozzávetőleg 24 órán át tartott. Ez nagyon stabil enzim/inhibitor komplex kialakulását jelzi.
• · · összehasonlításul. 0.4 M NaCl koncentrációnál ez a változat azonos idő alatt teljesen felszabadította a HNE-t. Az Sí független volt az ionerősségtő1. Az rACTP3P3'PI/HNE komplex stabilitását nagy molekulatömegu reakciótermékek SDS-PAGE analízissel történő kimutatásával bizonyítottuk. Ál-elsőfokú feltételek mellett a HNE-re 105 M_1s_1 (n = 6), a kimotripszinre pedig 1.8 x 104 M'^-s-1 másodfokú sebességi állandót. kaptunk, miközben az rACTL358M/kimotripszin interakcióra a sebességi állandó 3.0 x 10e volt (az rACTL358M olyan alfa-l-anti-kimotripszin analóg, amelyben a 358. leucin helyett metionin található). Az rACTP3P3'PI kimotripszinnel mutatott 1:1 arányú titrálása azt jelezte, hogy a P10, P9 és P10' helyeken a kazetta vektor eredményeként létrejött módosítások nem változtatták meg a serpin ezen enzimre vonatkozó Sí értékét. Bár az rACTP3P3'PI egy hatásos HNE inhibitor sok tulajdonságával rendelkezik. nem éri el az alfa-l-PI HNE-vel mutatott sebességi állandóját (kb. 107 M_1s_1), és az általa képzett komplex sem rendelkezik azonos szintű stabilitással.
A találmány leírása nyilvánvalóvá válnak a alapján a szakemberek számára találmány különböző módosításai.
Ezeket a módosításokat.
szintén találmány tárgykörébe tartozónak tekintjük.
SZEKVENCIALISTA
Szekvenciák száma: 11
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZ. SZEKV.:
CCCCATATGG CTAGCAACAG CCCACTTG
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ <i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (i i) MO LEKULA TIPU SA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZ. SZEKV.:
CCACAGGAAT AGACATTGGA ATGATTTTGA CTGCTGTGG
TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 3. SZ. SZEKV.:
CATTCCAATG TCTATTCCTG TGGAGACAAG GACCAT
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav <C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZ. SZEKV.:
TTTCATATGG CTAGCGCTCT AGGCTTGC
TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: protein (C) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZ. SZEKV.:
Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro
TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 4 aminosav • ·
(Ε) TÍPUS: protein (C) ALAK: lineáris < ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZ. SZEKV.:
Leu-Cys-His-Pro
TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: protein (C) ALAK: lineáris iii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEIPÁS: 7. SZ. SZEKV.:
Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu
TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: protein (C) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZ. SZEKV.:
Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro
TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
< C) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZ. SZEKV.:
GTTGAAACGC GTAATGGTCC TT
TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 23 bázispár· (B) TÍPUS: nukleinsav (C) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 10. SZ. SZEKV.:
ACTGCTGTGG TACCAGATGC TTC
TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ <i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZ. SZEKV.:
ATTCCAATGT CTATTCCT
Claims (21)
- Szabadalmi igénypontok1. Humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg, amely a 358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmaz. és amely neutrofil elasztázt gátló aktivitással rendelkezik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti analóg, amely a 356., 357.,359., 360. és 361. helyek legalább egyikén prolint tartalmaz.
- 3. Humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg, amelyben a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 356-361. helyein elhelyezkedő Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu aminosavakat az Ile-Pro-Xxx-Ser-Ile-Pro aminosavakkal helyettesítettük, ahol Xxx jelentése metionin, triptofán, alanin, aszparagin, aszparaginsav, cisztein, glutamin, glutaminsav, glicin, hisztidin, izoleucin, lizin, fenilalanin, prolin, szerin, treonin, tirozin vagy valin; és amely neutrofil elasztázt gátló aktivitással rendelkezik.
- 4. A 3.humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg, amelyben a vad típusú alfa-l-antikimotripszin349. és350. helyeken elhelyezkedő Ala-Ala aminosavaitGly-Thr aminosavakkal, és a vad típusú alfa-l-anti-kimotripszin 368. és 369.helyeken elhelyezkedőVal-Arg aminosavait Thr-Arg aminosavakkal helyettesítettük.• ·
- 5. Tisztított nukleinsav-szekvencia. amely egy 1., 2.. •3. vagy 4. igénypont szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot kódol.
- 6. Expressziós vektor, amely egy 5. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 7. Gazdasejt. azzal jellemezve, hogy képes egy 5. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia expresszálására.
- 8. Sejttenyészet. azzal .jellemezve, hogy képes egy 1.,2., 3. vagy 4. humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg expresszálására.
- 9. Proteinkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 1., 2.,3., vagy 4. igénypont szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot tartalmaz.
- 10. Eljárás neutrofil elasztáz gátlására, azzal jellemezve, hogy az említett neutrofil elasztázt egy 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg gátló hatású mennyiségével hozzuk érintkezésbe.
- 11. Eljárás egy 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg előállítására, azzal Jellemezve, hogy az említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg expresszálására képes gazdasejtet úgy tenyésztjük, hogy a sejtek és a tápközeg említett humán alfa-l-anti--kimotripszin analógot tartalmazó elegyét hozzuk létre.
- 12. Eljárás humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg előállítására, mely analóg metioninból, alaninból és szerinböl álló N-terminális toldalékkal rendelkezik, azzal jellemezve, hogy az említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg expresszálására képes gazdasejtet úgy tenyésztjük, hogy a sejtek és a tápközeg említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot tartalmazó elegyét hozzuk létre.
- 13. Eljárás humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg előállítására, mely analóg Met-Ala-Ser-Leu-Cys-His-Pro aminosavakból álló N-terminális toldalékkal rendelkezik, azzal jellemezve, hogy említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg expresszálására képes gazdasejtet úgy tenyésztjük. hogy a sejtek és a tápközeg említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot tartalmazó elegyét hozzuk létre.
- 14. A 11.. 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy további lépésként az említett elegyet úgy tisztítjuk, hogy az említett humán alfa-l-anti-kimotripszin analógot tisztított alakban állítsuk elő.
- 15. A 358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg a lkaIma gyulladás kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 16. A 358.helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint.alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat. tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg alkalmazása gyulladásos bélbetegség kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 17.358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint·, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin alkalmazása börgyulladás kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 18. A 358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint·, valint, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg alkalmazása hasnyálmirigy-gyulladás kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 19. A 358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg alkalmazása akut glomerulonephritis kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 20. A 358. helyen lévő aminosavként metionint, isoleucint, valint·. alanint. aszparaginsavat. treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg alkalmazása reperfúziós sérülés kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
- 21. A 358. helyen lévő aminosavként metionint, izoleucint, valint, alanint, aszparaginsavat, treonint vagy glutaminsavat tartalmazó humán alfa-l-anti-kimotripszin analóg alkalmazása vérmérgezés kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/221,078 US5674708A (en) | 1989-06-23 | 1994-03-31 | α-1-antichymotrypsin analogues having elastase inhibitory activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602674D0 HU9602674D0 (en) | 1996-11-28 |
| HUT74901A true HUT74901A (en) | 1997-02-28 |
Family
ID=22826247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602674A HUT74901A (en) | 1994-03-31 | 1994-04-29 | Alfa-1-antichymotrypsin analogues having elastase inhibitory activity |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5674708A (hu) |
| EP (1) | EP0754228A4 (hu) |
| JP (1) | JPH09512423A (hu) |
| CN (1) | CN1145637A (hu) |
| AU (1) | AU696995B2 (hu) |
| BG (1) | BG100939A (hu) |
| CA (1) | CA2186908A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ281796A3 (hu) |
| FI (1) | FI963891A0 (hu) |
| HU (1) | HUT74901A (hu) |
| LV (1) | LV11747B (hu) |
| NO (1) | NO964022D0 (hu) |
| NZ (1) | NZ269619A (hu) |
| PL (1) | PL316433A1 (hu) |
| SI (1) | SI9420082A (hu) |
| SK (1) | SK138196A3 (hu) |
| WO (1) | WO1995027055A1 (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5723316A (en) * | 1989-06-23 | 1998-03-03 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | α-1-antichymotrypsin analogues having chymase inhibiting activity |
| US5827662A (en) * | 1989-06-23 | 1998-10-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for detecting genetic mutations resulting in protease inhibitor insufficiencies |
| US6458777B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-10-01 | Mucosal Therapeutics Llc | Methods and compositions for treating and preventing mucositis |
| US6242473B1 (en) * | 1999-01-08 | 2001-06-05 | Maxim Pharmaceuticals, Inc. | Treatment and prevention of reactive oxygen metabolite-mediated cellular damage |
| CA2423423A1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-03-21 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Medecines of ulcerative colitis |
| EP1392354B1 (en) * | 2001-04-30 | 2005-03-09 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Use of alpha-1 antichymotrypsin for the manufacture of a composition for treatment, prevention or diagnosis of poorly healing diabetic wounds |
| DE10121255A1 (de) | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Switch Biotech Ag | Verwendung von alpha 1-Antichymotrypsin Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren, oder einer ein ACT Polypeptid oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle, zur Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen |
| EP1415664A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-05-06 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Use of alpha 1-antichymotrypsin in combination with alpha-1-antitrypsin for treating/preventing diabetes associated or poorly healing arterial wounds |
| CA2623957A1 (en) * | 2005-09-29 | 2007-04-05 | University Of Alberta | Compositions for and methods of granzyme b inhibition |
| US10531655B2 (en) | 2011-12-02 | 2020-01-14 | The Regents Of The University Of California | Reperfusion protection solution and uses thereof |
| WO2021020509A1 (ja) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | 株式会社ステムリム | 間葉系幹細胞の増殖促進または減少抑制のための組成物 |
| CN112425608B (zh) * | 2019-08-23 | 2023-07-21 | 香港科技大学 | 弹性蛋白酶抑制剂、具有抗生物膜活性的抑菌剂 |
| JP2023500182A (ja) | 2019-09-17 | 2023-01-05 | メレオ バイオファーマ ４ リミテッド | 移植片拒絶反応、閉塞性細気管支炎症候群、及び移植片対宿主病の治療に使用するためのアルベレスタット |
| EP4252850A3 (en) | 2020-04-16 | 2023-11-15 | Mereo Biopharma 4 Limited | Methods involving neutrophil elastase inhibitor alvelestat for treating respiratory disease mediated by alpha-1 antitrypsin deficiency |
| WO2023067103A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Mereo Biopharma 4 Limited | Neutrophil elastase inhibitors for use in the treatment of fibrosis |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4732973A (en) * | 1984-06-14 | 1988-03-22 | Chiron Corporation | Active site modified protease α-1-antitrypsin inhibitors |
| US4916117A (en) * | 1986-12-24 | 1990-04-10 | John Lezdey | Treatment of inflammation using alpha 1-antichymotrypsin |
| US5008242A (en) * | 1986-12-24 | 1991-04-16 | John Lezdey | Treatment of inflammation using 1-antichymotrypsin |
| US5079336A (en) * | 1989-06-23 | 1992-01-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production |
| US5723316A (en) * | 1989-06-23 | 1998-03-03 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | α-1-antichymotrypsin analogues having chymase inhibiting activity |
| US5252725A (en) * | 1989-06-23 | 1993-10-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production |
| US5266465A (en) * | 1989-06-23 | 1993-11-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production |
-
1994
- 1994-03-31 US US08/221,078 patent/US5674708A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-29 HU HU9602674A patent/HUT74901A/hu unknown
- 1994-04-29 CZ CZ962817A patent/CZ281796A3/cs unknown
- 1994-04-29 CN CN94195058A patent/CN1145637A/zh active Pending
- 1994-04-29 PL PL94316433A patent/PL316433A1/xx unknown
- 1994-04-29 SI SI9420082A patent/SI9420082A/sl unknown
- 1994-04-29 EP EP94923869A patent/EP0754228A4/en not_active Ceased
- 1994-04-29 WO PCT/US1994/004735 patent/WO1995027055A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-04-29 SK SK1381-96A patent/SK138196A3/sk unknown
- 1994-04-29 JP JP7525637A patent/JPH09512423A/ja active Pending
- 1994-04-29 CA CA002186908A patent/CA2186908A1/en not_active Abandoned
- 1994-04-29 AU AU73936/94A patent/AU696995B2/en not_active Ceased
- 1994-04-29 NZ NZ269619A patent/NZ269619A/en unknown
-
1996
- 1996-09-24 NO NO964022A patent/NO964022D0/no not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 FI FI963891A patent/FI963891A0/fi unknown
- 1996-10-21 LV LVP-96-386A patent/LV11747B/en unknown
- 1996-10-28 BG BG100939A patent/BG100939A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09512423A (ja) | 1997-12-16 |
| EP0754228A4 (en) | 1997-12-10 |
| LV11747A (lv) | 1997-04-20 |
| FI963891A (fi) | 1996-09-27 |
| NZ269619A (en) | 1998-01-26 |
| FI963891A0 (fi) | 1996-09-27 |
| HU9602674D0 (en) | 1996-11-28 |
| WO1995027055A1 (en) | 1995-10-12 |
| PL316433A1 (en) | 1997-01-06 |
| NO964022L (no) | 1996-09-24 |
| AU696995B2 (en) | 1998-09-24 |
| SI9420082A (en) | 1997-06-30 |
| SK138196A3 (en) | 1997-07-09 |
| US5674708A (en) | 1997-10-07 |
| NO964022D0 (no) | 1996-09-24 |
| EP0754228A1 (en) | 1997-01-22 |
| CA2186908A1 (en) | 1995-10-12 |
| BG100939A (en) | 1997-10-31 |
| LV11747B (en) | 1997-10-20 |
| CZ281796A3 (en) | 1997-05-14 |
| AU7393694A (en) | 1995-10-23 |
| CN1145637A (zh) | 1997-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT74901A (en) | Alfa-1-antichymotrypsin analogues having elastase inhibitory activity | |
| CZ284911B6 (cs) | Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu | |
| RO118752B1 (ro) | Polipeptide cu rol de agenţi tensioactivi pulmonari şi compoziţie farmaceutică care le conţine | |
| CZ164494A3 (en) | Human variant of kunitz-type protease inhibitor | |
| JPS637794A (ja) | 組換え宿主から生産されたアプロチニン相同体、それらのための方法、発現ベクタ−および組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 | |
| JPH11504938A (ja) | クニッツ型プロテアーゼ阻害因子 | |
| US5367064A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| HUT70291A (en) | A novel human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof | |
| JPH10501404A (ja) | 有効な組換えセリンプロテアーゼインヒビターの製造方法及びこれらのインヒビターの利用 | |
| CZ164694A3 (en) | Human variant of kunitz-type protease inhibitor | |
| US5079336A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| AU696945B2 (en) | Alpha-1-antichymotrypsin analogues having chymase inhibiting activity | |
| US5451659A (en) | Polypeptide, DNA fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same | |
| US5266465A (en) | α-1-antichymotrypsin, analogues and methods of production | |
| US5827662A (en) | Methods for detecting genetic mutations resulting in protease inhibitor insufficiencies | |
| RU2183214C2 (ru) | Природный и рекомбинантный ингибиторы тромбина, их получение и применение | |
| KR20010052345A (ko) | 인간 항트롬빈 3 및 그에 관련된 방법 | |
| JPH08511948A (ja) | Ｃ４ｂｐ結合活性が不足しているがａｐｃ補因子活性を有するプロテインｓ欠失変異体、組成物及び治療法 | |
| US5679770A (en) | Polypeptide, DNA fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same | |
| JPH05308988A (ja) | 新規ポリペプチド、新規ｄｎａ、新規ベクター、新規形質転換体、新規医薬組成物、および新規ポリペプチドの製造方法 | |
| JP3040781B2 (ja) | 生物学的に活性な殺菌性／透過性増大蛋白質断片 | |
| JPH03123490A (ja) | 新規なセリンプロテアーゼインヒビター蛋白質、これを含む医薬、この蛋白質のためにコードするｄｎａ配列及びこれら蛋白質、医薬及びｄｎａ配列を作り出す方法 | |
| JPH07196688A (ja) | 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途 | |
| JPH03109399A (ja) | ＰＰ４―δ、その調製および使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |