HUT73463A

HUT73463A - Agonists and antagonists of human interleukin-10

Info

Publication number: HUT73463A
Application number: HU9503983A
Authority: HU
Inventors: Xia-Yan Cai; Chuan-Chu Chou
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1996-08-28
Also published as: NO960309D0; JPH08507930A; EP0711346A1; SK8396A3; CN1127529A; AU681178B2; KR960704041A; SK150596A3; WO1995003411A1; IL110413A0; CA2168110A1; CZ23396A3; AU7399694A; NZ269663A; NO960309L; FI960353A; ZA945434B; HU9503983D0; PL312718A1; FI960353A0

Description

A találmány humán interleukin-10 agonistákra és antagonistákra vonatkozik, továbbá az ezekből előállított készítményekre és felhasználásuk módszereire. Ezeket az agonistákat és antagonistákat úgy állítjuk elő, hogy az érett humán interleukin-10 karboxil- és/vagy amino-terminális végén aminosav szubsztitúciókat vagy deléciókat vezetünk be.

Az interleukin-10 (IL-10) egy olyan citokin, amely számos akciót és hatást közvetít. Az IL-10-et egér sejtekből és humán sejtekből izolálták. Szerepet játszik a különböző osztályú immunválaszoknak vagy a CD4⁺ T helper (Th) sejtek alcsoportjai immunválaszának a szabályozásában. A Th sejtek különböző alcsoportokra oszthatók, és ezeket citokin termelő profiljuk alapján különböztethetjük meg. Két ilyen alcsoportot képviselnek a Thl és Th2 sejtek.

A Thl T sejt kiónok interleukin-2-t (IL-2-t) és gamma-interferont (IFN-Y-t) termelnek, míg a Th2 T sejt kiónok IL-10et, interleukin-4-et (IL-4-et) és interleukin-5-öt (IL-5-öt) szekretálnak, általában antigénnel vagy mitogén lektinekkel való aktiválás után. Mindkét Th sejt klón még a következő citokineket is termeli: tumor nekrózis faktor (TNF-α), interleukin-3 (IL-3) és granulocita-makrofág telep stimuláló faktor (GM-CSF) . A Th sejtek harmadik csoportja (TO) IL-2-t, IFN-'Y-t, IL-4-et, IL-5-öt, TNF-a-t, IL-3-at és GM-CSF-et termel egyidejűleg.

A TH1 és Th2 sejtek eltérő citokin termelési tulajdonságai részben visszatükröződnek a különböző patogénekre adott válaszban játszott szerepükben. Ahl sejteknek például részük van • · * «

- 3 - ..........

a legkülönbözőbb intracelluláris patogénekre adott eredményes sejt-közvetített válaszokban. Ugyancsak résztvesznek a késői típusú túlérzékenységi reakciókban. A Th2 sejtek a humorális válaszokkal vannak kapcsolatban, amelyekre az antitest termelés a jellemző. Az immunrendszer a legtöbb esetben kifejleszti a Th választ, ezzel küszöböli ki a legeredményesebben az adott antigént vagy patogént, de ez nem minden esetben történik meg.

Például a leishmaniasist fogyatékos Thl válasz jellemzi. Ez a fogyatékosság in vitro vizsgálatokkal — például a Clerici és munkatársai által leírt vizsgálattal [J.Clin. Invest., 84, 1892 (1989)] — mutatható ki. Egy ilyen in vitro vizsgálatban kimutatták, hogy a Thl válasz defektusa az IL-10 endogén szintjeinek tulajdonítható, mivel in vitro vizsgálatban a Thl funkció IL-10 elleni neutralizáló antitestek hozzáadásával helyreállítható.

Minthogy a leishmaniasist és más betegségeket is a fogyatékos Th válaszok jellemzik, amely az endogén IL-10 nem megfelelő hatásának tulajdonítható, igény merült fel az ilyen betegségek gyógyítására alkalmas IL-10 agonisták és antagonisták iránt.

A találmány révén úgy elégítjük ki ezt az igényt, hogy olyan készítményeket és módszereket bocsátunk rendelkezésre, amelyek elősegítik vagy gátolják a humán IL-10 biológiai aktivitását .

Pontosabban, a találmány olyan humán IL-10 antagonistákra vonatkozik, amelyek módosított, érett humán IL-10-et tartalmaznak. A módosítás abból áll, hogy a 157. pozícióban lévő • · · ·

- 4 lizin maradékot savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítjük, vagy pedig a mintegy 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszban egy vagy több aminosavmaradékot törlünk.

Három ilyen kiviteli alak aminosavszekvenciáját a szekvencia jegyzék 1., 2. és 3. számú szekvenciája határozza meg.

A találmány tárgyát képezik azon nukleinsavak is, amelyek egy olyan humán IL-10 antagonistát kódolnak, amely módosított érett humán IL-10-et tartalmaz, és a módosítás abból áll, hogy 157. pozícióban lévő lizin maradékot savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítjük, vagy pedig a mintegy 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszban egy vagy több aminosavmaradékot törlünk. Az ilyen nukleinsavakat tartalmazó rekombináns vektorok és az ilyen rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek szintén a találmány részét képezik.

Vonatkozik a találmány humán IL-10 antagonista előállítására szolgáló eljárásokra is. Az említett humán IL-10 antagonista olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíciójában a lizin maradékot savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszban egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk. Az eljárás szerint egy fent említett gazdasejtet olyan feltételek mellett tenyésztünk, hogy az antagonistát kódoló nukleinsav kifejeződjék.

A találmány az IL-10 biológiai aktivitásának gátlására alkalmas módszerekre is vonatkozik. E módszerek szerint az IL-10 receptorokat hordozó sejteket egy olyan érett humán IL-10-et tartalmazó humán IL-10 antagonistával hozunk össze, a• · ··♦· ·· · · • · · · · « · • · · · · · •••••· · ··

- 5 - ..........

melyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíciójában a lizin maradékot savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszban egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk.

A találmány a továbbiakban olyan humán IL-10 agonistákra is vonatkozik, amelyek módosított érett humán IL-10-et tartalmaznak, és ez a módosítás abból áll, hogy az érett humán IL-10-ben 1-11 amino-terminális aminosavmaradék deletált.

Az ilyen agonistákat kódoló nukleinsavak és az ilyen nukleinsavakat tartalmazó rekombináns vektorok és transzformált gazdasejtek, az agonisták előállításának módszerei, továbbá egy vagy több IL-10 agonistát vagy antagonistát, valamint a gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Minden, a találmányi leírásban idézett közleményt teljes egészében referenciaként tekintünk.

A találmány szerinti antagonisták olyan betegségek kezelésére használhatók, amelyeket — mint a leishmaniasist — az endogén IL-10-nek tulajdonítható fogyatékos Thl válasz jellemez. Az antagonisták hasznosak lehetnek IL-10-közvetített immunszuppresszióval vagy túlzott IL-10 termeléssel kapcsolatos betegségek — ilyenek a B sejt limfómák — kezelésében. Az antagonistákat ezenfelül felhasználhatjuk az IL-10 hatásmechanizmusát tisztázó kutatásokban és az ésszerű drog tervezésben, mivel erős receptor-kötő hatásuk van, ami nem kapcsolódik effektor funkcióhoz. A szilárd hordozón immobilizált antagonistákat felhasználhatjuk az IL-10 receptor azon oldható formái-

nak affinitás tisztítására, amelyekben a transzmembrán szakasz deletált.

Az Epstein-Barr vírus (EBV) eredetű virális IL-10 protein (BCRFI vagy vIL-10) szintén IL-10 biológiai aktivitással rendelkezik, és valószínűleg kötődik IL-10 receptorokhoz. Az EBV által kifejezett vIL-10 a vírusnak feltehetően bizonyos túlélési előnyt ad abból a szempontból, hogy fertőzni és replikálódni és/vagy magát fenntartani képes egy gazdasejten belül. Minthogy a vIL-10 mind a T sejtek, mind az NK sejtek IFN-'Y termelését és ezzel együtt ennek B-sejt életképesség fokozó hatását képes csökkenteni, mindebből arra a következtetésre juthatunk, hogy a vIL-10 elnyomhatja az antivirális immunitást, ezzel egyidőben pedig fokozhatja az EBVnek a humán B sejtek transzformálására irányuló potenciálját.

A találmány szerinti IL-10 antagonisták tehát hasznosak lehetnek az EBV és feltehetően más vírusok elleni antivirális immunitás hatékony fokozásában is. Az IL-10 antagonisták potenciális használatáról bővebbet tartalmaz Howard és munkatársai közleménye: J. Cl in. Immunoi. , 12 , 239 (1992).

A találmány szerinti mutáns IL-10 antagonisták három jellegzetes képviselőjét az alábbi példákban ismertetjük. Az egyik kiviteli alakban az érett humán IL-10 szekvencia 157. helyén lévő lizin maradékot glutaminsav maradékkal helyettesítettük (1. számú szekvencia). A további kiviteli alakokban a humán IL-10 karboxi-terminális végéről három (2. számú szekvencia) vagy négy (3. számú szekvencia) aminosavmaradékot töröltünk. Ezekre az antagonistákra alább a K157E, CŰ3, illetve ···· ··

CA4 elnevezéseket használjuk.

A találmányi leírásban az érett humán IL-10 kifejezés egy olyan proteinre vonatkozik, amelyből hiányzik egy olyan vezérszekvencia, amelynek (a) az aminosavszekvenciája lényegében azonos a 4. számú szekvencia által meghatározott szekvenciával, és (b) biológiai aktivitása egyezik a natív IL-10ével. Ide tartoznak a természetes alléi variánsok és más olyan variánsok is, amelyek egy vagy több olyan konzervatív aminosav szubsztitúciót tartalmaznak [Grantham, Science, 185, 862 (1974)], amelyek lényegében nem gyengítik a biológiai aktivitást. Az ilyen konzervatív szubsztitúciókat rokon aminosavcsoportok alkotják, lásd az 5,017,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Lee és munkatársai közlését.

Magától értetődik, hogy bár jelenleg előnyben részesítjük az előzőekben említett kiviteli alakokat, a humán IL-10 karboxi-terminális vége másképpen is módosítható, más antagonisták előállítása céljából. Például, úgy is előállíthatunk hatásos antagonistát, ha a 157. pozícióban lévő lizin maradékot glutaminsav maradék helyett aszparaginsav maradékkal helyettesítjük. A találmányi leírásban használt savas jellegű aminosavmaradék kifejezés tehát mind aszparaginsav, mind glutaminsav maradékra vonatkozik.

Nagyobb és kisebb kiterjedésű deléciók szintén kivitelezhetek. Törölhetünk egy vagy több aminosavmaradékot, beleértve a 12 karboxi-terminális maradékot. Előnyös, ha 8 terminális maradékot törlünk, még előnyösebb 3 vagy 4 terminális maradék deléciój a.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az érett humán IL-10 amino-terminális végéből még 11 aminosavmaradék is törölhető. Ezek a csonkított variánsok — amelyeknek magával az IL-10-zel összehasonlításban más farmakokinetikai tulajdonságaik lehetnek — az érett humán IL-10 biológiai aktivitásával rendelkeznek egy alábbiakban leírt MC/9 hízósejt stimulációs vizsgálat mérései szerint. Ennélfogva ezek felhasználhatók minden olyan indikációs terület kezelésére, amelyek érzékenyek magára az IL-10-zel való kezelésre. Ugyancsak felhasználhatók a találmány szerinti antagonistákkal összefüggésben fent leírt néhány olyan célra, mint például az affinitás tisztítás.

Minthogy ezek a variánsok humán IL-10 biológiai aktivitással rendelkeznek, csak aminosavszekvenciájuk rövidebb, a találmányi leírásban humán IL-10 agonisták elnevezéssel szerepelnek .

Úgy gondoljuk azonban, hogy a 12. pozícióban lévő cisztein maradék lényeges biológiai aktivitás szempontjából. Tény, hogy az első 12 csoportnak — beleértve a cisztein csoportot — a deléciója olyan variánst eredményezett, amelynek nem volt biológiai aktivitása. Ezért az amino-terminális végi deléciók az első 11 csoportból való egy vagy több csoport törlésére korlátozódnak.

Az ilyen amino-terminális deléciókat a fent említett karboxi-terminális módosításokba kombinálhatjuk, hogy olyan antagonistákat állítsunk elő, amelyek az alábbiakban leírt jellemzőkkel, de valószínűleg más farmakokinetikai tulajdonságokkal rendelkeznek. Ezek az antagonisták is a találmány részét al- 9 kotj ák.

Az IL-10 agonistákat és antagonistákat kódoló nukleinsavak szintén e találmány részét képezik. Természetesen azok, akik ezen a szakterületen jártasak, tudatában vannak annak, hogy a genetikai kód degeneráltsága következtében több különböző olyan nukleinsav létezik, amelyek az egyes agonistákat és antagonistákat kódolhatják. A használt konkrét kodonokat a szerkesztéshez való alkalmasságuknak és a prokarióta vagy eukarióta rendszereknek való optimális expressziójuknak megfelelően választhatjuk ki.

Előnyös, ha az agonistákat és antagonistákat kódoló nukleinsavakat a polimeráz láncreakció (PCR) [Saiki et al., Science, 239, 487 (1988)] használatával készítjük el, például úgy, hogy Daugherty és munkatársai [Nucl.Acids Rés., 19., 2471 (1991)] a humán IL-10-et kódoló cDNS-t módosították. Ezt a cDNS-t, amely jól ismert ezen a szakterületen, standard módszerek használatával állíthatjuk elő, például a WO 91/00349 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint. Humán IL-10-et kódoló szekvenciákat tartalmazó kiónokat is letétbe helyeztek az American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland, USA) intézményben, 68191 és 68192 letéti számokon.

Módosíthatjuk a DNS-t a helyre irányuló mutagenezis jól ismert technikái segítségével is. Lásd például: Gillman et al., Gene, 8, 81 (1979); Roberts et al., Natúré, 328, 731 (1987); Innis (szerk.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, N.Y. (1990).

- 10 • ···· · · * · · • · · · ···· · · • · · ·«

A találmány szerinti nukleinsavak kémiai úton is szintetizálhatok, például a Matteucci és munkatársai [J.Am.Chem. Soc., 103, 3185 (1981)] szerinti foszforamidit szilárd fázisú módszerrel, a Yoo és munkatársai [J.Biol.Chem., 764, 17078 (1989)] által leírt módszerrel vagy más jól ismert módszerek használatával.

A találmány a fent említett nukleinsavakat tartalmazó rekombináns vektorokra is vonatkozik, valamint az ezen vektorokkal transzformált gazdasejtekre, továbbá az agonisták és antagonisták előállítására szolgáló eljárásokra.

Egy agonistát vagy egy antagonistát kódoló DNS-nek a számos ismert expressziós vektorok egyikébe való beépítését könynyen kivitelezhetjük, ha mind a DNS-ek, mind a vektor végei kompatibilis restriciós helyeket tartalmaznak. Ha ez nem megoldható, szükség lehet a DNS-ek és/vagy vektor végeinek a módosítására oly módon, hogy leemésztjük az egyszálú DNS túlnyúló részeit — amelyek a restrikciós endonukleázos hasítás során keletkeztek — tompa végekhez való jutás végett, vagy ugyanezen eredmény elérése végett úgy járunk el, hogy az egyszálú végeket egy megfelelő DNS polimeráz segítségével betöltjük.

Egyébként bármilyen kívánt hely előállítható úgy, hogy nukleotid szekvenciákat (linkereket) ligálunk a végekhez. Az ilyen linkerek olyan specifikus oligonukleotid szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek meghatározzák a kívánt restriciós helyeket. A hasított vektort és a DNS fragmentumokat — kívánt esetben — homopolimer farok-rákapcsolással vagy PCR eljárás*·«4

- 11 - ......

sál is módosíthatjuk.

A találmány szerinti antagonistákra jellemző, hogy humán IL-10 receptor-kötő affinitásuk hasonló magához a humán IL-10éhez, de lényegében nincs biológiai aktivitásuk. Előnyös, ha a humán IL-10 biológiai aktivitásának körülbelül 10 %-ánál kisebb aktivitásúak egy standard vizsgálatban, még előnyösebben, ha ez az aktivitás kisebb, mint körülbelül 1%.

Az IL-10 receptorokat viselő sejtekben az antagonisták az IL-10 biológiai aktivitását rendszerint legalább körülbelül 25 %-ban gátolják. Előnyös, ha a gátlás foka legalább körülbelül 50 %-os és még előnyösebb, ha legalább körülbelül 75 %-os. A gátlás aktuális foka a mért konkrét biológiai aktivitásnak megfelelően változhat.

Az agonisták és antagonisták kémiai úton is szintetizálhatok megfelelő módszerekkel, ilyen a kizárólag szilárd fázisú szintézis, a részleges szilárd fázisú módszerek, a fragmentum kondenzáció vagy a klasszikus oldatban végzett szintézis. Előnyös, ha a kémiailag szintetizált polipeptideket szilárd fázisú peptid szintézissel állíthatjuk elő, ahogyan például Merrifield [ J. Am. Chem. Soc . , 8.5, 2149 (1963); Science, 232 , 341 (1986)] és Atherton és munkatársai [Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1989)] leírták .

Akárhogyan állítottuk is elő az agonistákat és antagonistákat, ezek a következő módszerek használatával tisztíthatok: HPLC, gélszűrés, ioncserés és elválasztásos kromatográfia ellenáramú szétválasztás és/vagy más ismert módszerek.

A gyógyszerkészítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy egy vagy több IL-10 agonistát vagy.antagonistát vagy ezek gyógyszerészet ileg elfogadható sóját és egy fiziológiailag elfogadható vivőanyagot keverünk.

Használható gyógyszerészeti vivőanyag lehet bármilyen kompatibilis, nem toxikus anyag, amely alkalmas arra, hogy a találmány szerinti készítményeket a betegnek beadhassuk. Vivőanyag lehet a steril víz, alkohol, zsírok, gyanták és inért szilárd anyagok. Gyógyszerészetileg elfogadható adjuvánsokat (puftérhatású szerek, diszpergáló szerek) is bevihetünk a gyógyszerkészítményekbe. Általánosan jól ismertek az ilyen drogok parenterális alkalmzásához használt készítmények; lásd például: Remington's Pharmaceutical Science, 18. kiadás (Mack Publishing Company, Easton, PA., USA, 1990). Gyakran előnyben részesítik az egyadagos kiszerelést, például steril formában.

Az agonisták és antagonisták alkalmazása előnyösen parenterálisan történik, intraperitoneális, intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban vagy infúzióban, vagy bármely más, elfogadható általános módszerrel. Az antagonistákat implantálható vagy injektálható hatóanyag leadó rendszerrel is bejuttathatjuk [lásd például: Urguhart et al., Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol. , 24 , 199 (1984); Lewis (szerk.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York, N.Y. (1981); 3,773,919 és 3,270,960 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások]. A szájon át (orális) való alkalmazás is kivitelezhető olyan jól ismert formulázások révén, amelyek megvédik az antagonistákat a gyo- 13 mor-bél traktus proteázaival szemben [lásd például: Langer, Science, 249, 1527 (1990)].

Az agonisták és antagonisták standard génterápiás technikákkal is beadhatók, így például a nukleinsav szövetekbe velő közvetlen injekciójával, rekombináns virális vektorok vagy liposzómák használatával vagy transzfektált sejtek implantációjával [lásd például: Rosenberg, J.Clin.Oncol., 10, 180 (1992)] .

Az agonistákat és antagonistákat egyedül vay egy vagy több más olyan szerrel kombinálva alkalmazhatjuk, amelyeket általánosan használnak a hiányos Th válasszal jellemzett állapotok kezelésére. Olyan hatóanyagok, mint például az interleukin-12 (IL-12) vagy a gamma-interferon (IFN-γ), az antagonistákkal együtt adhatók be. Az inzulin, ciklosporin, prednizon vagy azatioprin az agonistákkal együtt alkalmazható, például, ha ezeken az IL-10 helyettesítésére használják inzulin-függő diabetes mellitus kezelésére vagy megelőzésére (lásd a 07/955,523 számon nyilvánosságra hozott, 1992. október 1-én benyújtott, függő, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést).

Az egy vagy több más szerrel együtt való beadás azt jelenti , hogy az agonistát vagy antagonistát ezekkel együtt (egyszerre) alkalmazzuk.

vagy egymást követően (előtte vagy utána)

Mindegyik beadott szer szintjének elégségesnek kell lennie ahhoz, hogy a betegben terápiásán hatékony legyen.

Általában, ha egy másik szert adunk be az előző szer felezési idején belül, akkor úgy tekintjük, hogy a két szert együtt ···· alkalmaztuk .

Egy adott helyzetben egy agonista vagy antagonista helyes adagolásának a megállapítása a szakterületen való jártassághoz tartozik. A kezelést általában kisebb adagokkal, azaz az optimálisnál kisebb adaggal kezdjük. Az adagolást ezután kicsinyenként emeljük, amíg a körülményeknek megfelelő optimális hatást el nem érjük. Kényelmi szempontokból a teljes napi adagot — kívánt esetben — szétoszthatjuk és részletekben alkalmazzuk .

Hatékony mennyiségű az a dózis, amely egy vagy több klinikai paraméterben kimutatható javulást eredményez, és/vagy statisztikailag szignifikánsan jobb választ kapunk egy vagy több ismert Th funkcióbna, mint például a fent leírt IL-2 termelésben. Ezt a választ in vitro mérhetjük, a betegtől levett vérsejtek használatával, például Clerici és munkatársai (lásd előbb) leírása szerint. Helyes, ha egy ilyen in vitro vizsgálatot a terápia megindítása előtt is elvégzünk, hogy viszonyítási alapot kapjunk, amelyhez egy javított választ hasonlíthatunk .

Az agonisták és antagonisták és ezek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói alkalmazásának gyakoriságát és aktuális mennyis-égét egy adott betegnél a kezelő orvos megítélése szerint szabályozza, amikoris tekintetbe vesz olyan faktorokat, mint a kor, a beteg erőnléte és méretei és a kezelendő tünetek súlyossága.

A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük. Ha másként nem határozzuk meg, úgy a szilárd anyagokban a szilárd <··· • « anyagok, oldatban az oldatok és oldatban a szilárd anyagok százalékos arányát tömeg/tömeg, térf./térf., illetve tömeg/térf. alapon adjuk meg.

Reagensek és általános módszerek.

A restrikciós endonukleázokat a Boehringer-Mannheim cégtől (Indianapolis, IN., USA) szereztük be, egy DNS ligációs készletet pedig a Takara Biochem.Inc., cégtől (Berkeley, CA., USA) vettünk. A Tag polimerázt és a Pfu polimerázt a Stratagene cégtől (La Jolla, CA., USA) kaptuk. A rekombináns humán IL-10-et (hIL-10) standard módszerekkel állítottuk elő, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben, lényegében Tsujimoto és munkatársai [J.Biochem., 106, 23 (1989)] leírása szerint. A szövettenyésztő táptalajt, a fetális marha szérumot és a glutamint a Gibco-BRL cégtől (Gaithersburg, MD., USA) szeteztük be. Az oligonukleotid primereket standard módszerekkel szintetizáltuk az Applied Biosystems féle 380A, 380B vagy 394 típusú DNS szintetizátorral (Foster City, CA., USA).

A standard rekombináns DNS módszerek kivitelezésénél lényegében Sambrook és munkatársai leírásait [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)] követtük.

Transzfekció.

A tranziens expressziót a következőképpen hajtottuk végre. A COS sejteket (ATCC CRL 1651) Dulbecco által módosított, 10% fetális marha szérummal, 6 mM glutaminnal és penicil«’·»<» »» · · · lin/sztreptomicinnel kiegészített Eagle táptalajon (DNEM) tartottuk fenn. A transzfekciót elektroporációval végeztük, BioRad féle GENEPULSER (Richmond, CA., USA) használatával.

A sejteket tripszin-EDTA kezeléssel választottuk le a tenyésztő csészékről, és friss táptalajban szuszpendáltuk. Körülbelül 5x10® sejthez — 250 μΐ térfogatban — 5 mg plazmád DNS-t kevertünk, és az elektroporációt egy kondenzátor készlet segítségével, 0,2 V és 960 μΕ mellett végeztük.

Az elektroporáció után a sejteket 10 cm-es tenyésztő csészékbe vittük át, és 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben tenyésztettük 6 órán át 10 ml szérum tartalmú DNEMben. Miután a sejtek a csészékhez tapadtak, a táptalajt leszívással távolítottuk el, és szérum-mentes táptalajjal helyettesítettük. A kondicionált táptalajt 72 órával később arattuk le analízishez.

Antagonisták előállítása.

Vad típusú humán IL-10 cDNS és expressziós vektorok szerkesztése .

Az expresszió és a manipuláció megkönnyítése érdekében a hIL-10 cDNS kódoló szakaszát PCR módszerrel állítottuk elő, egy pCDSRu-alapú hIL-10 vektor [Vieira et al., Proc.Natl.Acad. Sci., 88, 1172 (1991); a szekvenciát, a GenBank-ban helyeztük letétbe M57627 letéti szám alatt], mint templát használatával. Azonban más ismert cDNS források is felhasználhatók.

Egy Kozák féle, gerincesekre általánosan elfogadott •ti • · · · · • · · · • · • · <

- 17 transzlációs indítót [Kozák, Nucleic Acids Rés., 2.0, 8125 (1987)] vezettünk be egy B1789CC jelű 5' primerbe (5. számú szekvencia). A B1789CC 5' primerhez, illetve az A1715CC jelű 3' primerhez (6. számú szekvencia) egy PstI helyet és egy EcoRI helyet adtunk.

A fent említett primereket használva, a hIL-10 cDNS-sel PCR-t végeztünk 50 μΐ reakcióelegyben, 50 μΐ paraffinolaj rárétegezéssel, 0,5 ml-es Eppendorf fiolában. A reakcióelegy a következőket tartalmazta: 26,5 μΐ víz, 5 μΐ Taq (Thermus aquaticus) DNS polimeráz puffer (végső koncentrációk a reakcióban: 10 mM trisz. Ha, pH 8,8, 50 mM kálium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid, 0,001% (tömeg/férf.) zselatin), 200 μΜ a dNTP-kből, 60 ng DNS templát, 10-10 pM B1789CC 5' primer, illetve A1715CC 3' primer, 0,5 μΐ Taq polimeráz (2 egység).

A reakciót a PHC-1 Thermocycler (Techne, Princeton, NJ., USA) készülékben végeztük, 30 ciklusban, ciklusonként: denaturáláshoz 95°C, 2 perc; anelláláshoz 42°C, 2 perc; szintézishez 70°C, 1 perc használatával. A 30. ciklus végén a reakcióelegyet további 9 percig 72 °C-on inkubáltuk az extenzió végett .

A PCR elegyet 0,5 μg/ml etidium-bromidot tartalmazó, 1,2 %-os agaróz/trisz-acetát gélben elektroforetizáltuk. A várt méretű DNS fragmentumokat a gélből kimetszettük, és GENECLEAN kit (La Jolla, CA., USA) használatával tisztítottuk. Miután a DNS terméket a gélből izoláltuk, Pstl-gyel és EcoRIgyel emésztettük, majd gélelektroforézissel és GENECLEAN kezeléssel izoláltuk. A Pstl/EcoRI restrikciós fragmentumot a • · ·

- 18 pDSRG expressziós vektorbe klónoztuk (ATCC 68233), és ezután átvittük a pSV.Sport expressziós vektorba (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD. , USA).

A hIL-10 cDNS-t tartalmazó vektorokat a DH5cz E.coli törzsben (Gibco-BRL) szaporítottuk, és a DNS szekvenciát DNS szekvenálással ellenőriztük. A pSV.Sport-alapú hIL-10 expreszsziós vektort használtuk COS transzfekcióhoz, valamint mutáns hIL-10 vektorok szerkesztéséhez.

Az újonnan szintetizált hIL-10 cDNS egyetlen BglII helyet és egyetlen BstEII helyet tartott meg, mindkettő jelen volt a vad típusú cDNS-ben is. Ezt a két belső restrikciós helyet — amelyeknek egymáshoz viszonyított helyzetét alább sematikusan ábrázoljuk — használtuk később mutáns hIL-10 cDNS-ek készítésére, kazetta helyettesítéssel.

PstI --------BglII -------BstEII ---------------------EcoRI

Karboxi-terminális módosítások.

C-terminális mutáns hIL-10 antagonisták készítése céljából a vad típusú hIL-10 cDNS BstEIl/EcoRI szakaszának megfelelő mutáns cDNS fragmentumokat szintetizáltunk PCR-rel, és ezeket használtuk a fent leírt pSV.Sport hIL-10 DNS-ben a megfelelő szakasz helyettesítésére.

A humán IL-10 K157E, CA3 és 0Δ4 mutáns antagonistákat PCR-rel állítottuk elő úgy, hogy a fent leírt, újonnan szintetizált, a 3'-vég primerekbe előzőleg bevezetett, megnevezett mutációkat tartalmazó hIL-10 cDNS szekvenciával komplementer oligonukleotid primereket használtuk.

A B3351CC elnevezésű 5' prímért — aminosavszekvenciáját a 7. számú szekvencia határozza meg — használtuk fel három mutáns antagonista előállítására. Ezen 5' primer szekvenciája komplementer a humán IL-10 cDNS egy belső szekvenciájával, amely a vad típusú hIL-10 cDNS egyetlen BstEII restrikciós helyét foglalja magába. Az antagonisták készítéséhez használt 3' primereknek a szekvenciája a HIL-10-et kódoló cDNS szekvencia 3' végével komplementer. A primerek az alábbi szekvenciaszámokat viselő szekvenciákat határozzák meg.

Mutáns

Primer

Szekvencia száma

K157E C3481CC8

CÁ3 C3482CC9

CA4 B3350CC10

A fent említett primereket használva sel PCR-t végeztünk 50 μΐ reakcióelegyben a humán IL-10 cDNS50 μΐ paraffinolaj rárétegezésével, 0,5 ml-es Eppendorf fiolában. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 26,5 μΐ víz, 5 μΐ Pfu DNS polimeráz puffer [végső koncentrációk a reakcióban: 20 mM trisz. HC1, pH 8,2, 10 mM kálium-klorid, 2 mM magnézium-klorid, 6 mM ammónium-szulfát, 0,1% Triton X-100 és 10 gg/ml nukleáz-mentes marha szérum albumin (BSA)], 200-200 μΜ a dNTP-kből, 40 ng templát DNS, 10-10 pM B3351CC 5' primer és egy a 3' primerek közül, továbbá 0,5 μΐ Pfu polimeráz (2,5 egység).

A reakciót PHC-1 Thermocycler (Techne, Princeton, NJ.,

USA) készülékben végeztük 22 ciklusban, ciklusonként denaturáláshoz 94°C, 2 perc; anelláláshoz 50°C, 2 perc,; szintézis-

hez 72°C, 2 perc használatával. A 22. ciklus végén a reakcióelegyet további 7,5 percig 72 °C-on inkubáltuk az extenzió végett.

A PCR elegyet fenol-kloroformos extrahálás után etanollal csaptuk ki, majd egymás után BstEII-vel és EcoRI-gyel emésztettük. A restrikciós emésztéssel kapott termékeket 0,5 gg/ml etidium-bromidot tartalmazó 1 %-os agaróz/trisz-acetát gélben elektroforetizáltuk. A várt méretű DNS fragmentumokat kimetszettük a gélből, ahonnan fenol-kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással izoláltuk.

A gélből való izolálás után a hIL-10 mutánsok BstEIl/EcoRI restrikciós fragmentumait használtuk fel a pSV. Sport vektorban a vad típusú hIL-10 DNS megfelelő szakaszának cseréjéhez. A pSV-Sport alapú hIL-10 mutáns cDNS-eket DH5oí E.coli törzsben szaporítottuk, és DNS szekvenálással vizsgáltuk. Ugyanezen expressziós vektorokat használtuk COS sejtek transzfektálására, mint leírtuk.

Amino-terminális módosítások.

Humán IL-10 N-terminális variánsok előállításához a vad típusú hIL-10 cDNS Pstl/BglII szakaszának megfelelő, módosított cDNS fragmentumokat szintetizáltunk PCR-rel, primer párok használatával, DNS templát nélkül. A pSV.Sport vektorban a kapott fragmentumokkal cseréltük ki a vad típusú hIL-10 DNS megfelelő szakaszát. Ilyen módon olyan variánsokat állítottunk elő, amelyekben a vad típusú hIL-10 N-terminális végéből 7 (NΛ 7 variáns), 10 (N&10 variáns), 11 (ΝΔ11 variáns) vagy 12 (ΝΔ 12 variáns) maradék törlődött. A variánsok készítéséhez használt primer párok az alábbi szekvenciaszámokkal ellátott szekvenciákat határozzák meg.

Variáns	Primer (vég)	Szekvencia
ΝΔ 7	C3352CC (5')	11
	C3355CC (3¹)	12
ΝΔ10	C3353CC (5¹)	13
	C3354CC (3¹)	14
ΝΔ11	C3483CC (5¹)	15
	C3485CC (3¹)	16
ΝΔ12	C3484CC (5')	17
	C3486CC (3')	18

A C-terminális mutáns antagonisták szintéziséhez az említett primer párok egy-egy primeréből 10-10 pM használatával végeztünk PCR-t, mint fent leírtuk. A PCR elegyet fenol-kloroformos extrahálás után BglII-vel és Pstl-gyel emésztettük. A restrikciós emésztéssel kapott termékeket agaróz gélben elektroforetizáltuk, mint fent. A várt méretű DNS fragmentumokat kimetszettük a gélből, és fenol-kloroformos extrahálással és etanolos kicsapással izoláltuk.

A gélből való izolálás után a hIL-10 variánsok Pstl/BglII restrikciós fragmentumait használtuk a pSV.Sport vektorban a vad típusú hIL-10 DNS megfelelő szakaszának helyettesítésére úgy, hogy ezt a szakaszt Pstl/BglII emésztéssel kimetszettük, és a csere fragmentumot ligáltuk. A pSV.Sport-alapú hIL-10 mutáns cDNS-eket elszaporítottuk, vizsgáltuk, és úgy használtuk,

···· ·· ·· • · · · • · ·

- 22 mint fent leírtuk.

A kapott ΝΔ.7, N/\.1O, ΝΔ11 és ΝΔ12 variánsok aminosavszekvenciáit a 4. számú szekvencia 8-160, 11-160, 12-160, illetve

13-160 maradékai határozzák meg.

N-terminális módosításokat tartalmazó humán IL-10 antagonisták.

Olyan antagonisták, amelyek mind amino-terminális, mind karboxi-terminális végükön módosításokat tartalmaznak, könnyen előállíthatok az előbbiekben ismertetett módszerek kombinálásával. Például az ΝΔ7/Κ157Ε antagonistát úgy készíthetjük el, hogy a K157E antagonistát kódoló cDNS-t tartalmazó pSV.Sportot olyan módon állítjuk elő, hogy PCR-t végzünk a B3351CC 5' primer és a C3481CC 3' primer használatával, mint fent leírtuk. Miután a C3352CC 5' primer és a C3355CC 3' primer fentiek szerinti használatával elkészítettük és izoláltuk az N 7 variáns fragmentumot, a variáns Pstl/BglII restrikciós fragmentumát használtuk a K157E mutáns DNS megfelelő szakaszának helyettesítésére úgy, hogy a pSV.Sport vektorban ezt a szakaszt Pstl/BglII emésztéssel kimetszettük, és a csere fragmentumot ligáltuk.

Metabolikus jelzés.

COS sejteket transzfektáltunk a fent leírtak szerint olyan pSV.Sport expressziós vektorral, amely humán IL-10-et, K157E, Cá3 vagy CA4 antagonistát vagy NA.7 , ΝΔ10, NA 11 vagy ΝΔ12 agonista variánsokat kódoló cDNS inszertumot tartalmazott

• · · · · ·

A sejteket ezután 10 cm-es tenyésztő csészékben, szérum tartalmú táptalajban tenyésztettük 48-72 órán át. Inkubálás után a csészéket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal (PBS), és 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben inkubáltuk 30 percig csészénként 8 ml dializált FBS-sel és glutaminnal kiegészített metionin-mentes DNEM táptalajban. Ezután minden csészéből leszívtuk a táptalajt, és 500 μΐ 250-300 μύί ³⁵S-metionint (DuPont NEN; Boston, MA., USA; specifikus aktivitás: 43,3 ^Ci/ml) tartalmazó metionin-mentes táptalajjal helyettesítettük.

A sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid tartalmú légtérben inkubáltuk 5 órán át, majd ezután 10 μΐ 1,5 mg/ml L-metionin törzsoldatot adtunk a csészékhez, és ezzel 30 percet reagáltattuk. A jelzett, kondicionált táptalajt összegyűjtöttük és nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézist [SDS-PAGE; Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970)] végeztünk, 10-20 %-os gélben, nem-redukáló körülmények mellett. A géleket ezután szárítottuk, majd standard módszerekkel autoradiografáltuk, Kodak XAR filmet használva.

Az autoradiográfia megkülönböztethető, jelzett sávokat mutatott humán IL-10-re, a K157E, CA3 és CA4 antagonistákra és az NA7 és N^IO agonistákra, és ezek mind körülbelül 16-18 kD molekulatömegnek megfelelően vándoroltak. Azonos transzfekciós és sejt tenyésztési körülmények mellett mindegyik humán IL-10 karboxi-terminális mutáns antagonista kissé alacsonyabb szinten fejeződött ki: körülbelül 2-4-szer alacsonyabban, mint az IL-10. Az NA.7 aminoterminális agonista variáns expressziója • β

- 24 hasonlítható volt az IL-10-éhez, míg az NA10 variáns expreszsziójának a szintje 4-szer alacsonyabb volt, mint az IL-10 szintje. Az N^H és N412 variánsok expressziója túl alacsony volt ahhoz, hogy ezzel a módszerrel ki lehessen mutatni.

ELISA analízis.

Annak érdekében, hogy behatóbban vizsgáljuk a mutáns antagonisták és a humán IL-10 mennyiségét a COS sejtek által kondicionált táptalajban, enzim-immunassay-t (enzyme-linked immunosorbent assay = ELISA) végeztünk, lényegében Abrams és munkatársai [Immun.Rév., 127, 5 (1992)] leírása szerint. Két, a humán IL-10 különböző epitópjaira specifikus, monoklonális antitestet állítottunk elő — jelük: 9D7 és 12G8 — standard módszerekkel, amelyeket kötéshez, illetve kimutatáshoz szolgáló reagensekként használtunk. A vizsgálatban sorozathigított kondicionált táptalajokat teszteltünk, standardként tisztított, rekombináns humán IL-10-et használva. A kimutatási határ ebben a vizsgálatban körülbelül 1 ng/ml volt, és a táptalajban 72 órás inkubálás után általában 100-300 ng/ml tartományba estek a mért IL-10 szintek.

Azt találtuk, hogy az IL-10 és az antagonisták viszonyított értékei jó egyezést mutattak a metabolikus jelzésnél kapott eredményekkel, ami arra utal, hogy a használt monoklonális antitestek által felismert epitópok nem a mutagenizált szakaszban voltak. Egy jellemző vizsgálatban a humán IL-10, K157E, CA3, C£4, N&7, N^IO, N^ll és N/\ 12 esetén mért expressziós szintek a következők voltak: 133, 80, 63, 48, 139,

28, 23 illetve 6,5 ng/ml.

Bioassay-k.

Humán IL-10 és jellemző IL-10 mutáns antagonisták aktivitását vizsgáltuk egér hízósejtek és humán perifériás mononukleáris sejtek (PBMC) segítségével.

A hízósejt stimulációs vizsgálatot lényegében 0'Garra és munkatársai [Int. Immunoi. , 2., 821 (1990)] és Thompson-Snipes és munkatársai [J.Exp.Med., 173, 507 (1991)] szerint végeztük. Röviden kifejtve: 96 tartályos mikrotitráló lemezen, tartályonként 100 μΐ táptalajban [RPMI-1640, amely 10% fetális marha szérumot (FBS), 50 μΜ β-merkapto-etanolt, 2 mM glutamint és penicillin/sztreptomicint tartalmaz] 5x10^ MC/9 sejtet (ATCC CRL 8306) kezeltünk 48 órán át humán IL-10 vagy egy IL-10 antagonista különböző mennyiségeivel. Ezután 5 mg/ml MTT [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid;

Sigma, St.Louis, MO., USA] tartalmú oldatból 25 μΐ-eket mértünk minden tartályba, és a lemezt 3-5 órán át inkubáltuk. A sejteket ezután 10 mM sósavban 10% SDS-sel lizáltuk, és az abszorpciót 570 nm-en mértük.

Ebben a vizsgálatban a humán IL-10-nek és az ΝΔ7, N/\10 és N/jll variánsoknak volt aktivitásuk, de nem észleltünk aktivitást az ΝΔ12 variánsnál. A karboxi-terminális mutáns antagonisták közül egy sem volt aktív, még 375 ng/ml-ig (ez körülbelül 100-szorosa annak az IL-10 mennyiségnek, amely erős aktivitást fejt ki) terjedő koncentrációkban való tesztelés esetén sem.

• · ·

- 26 A lipopoliszacharid (LPS) indukált citokin szintézis IL-10 antagonisták által történő gátlásának mérése céljából humán perifériás mononukleáris sejteket (PBMC) vettünk le egészséges donoroktól, majd a sejteket FICOLL grádiens centrifugálással izoláltuk [Boyum, Scand.J.Láb.Invest., 77. kiegészítés (1966)] . A PBMC-k alikvot mennyiségeit 96 tartályos mikrotitráló lemezek tartályaiba mértük (10⁵ sejt/tartály; tartályonként 200 μΐ 5% FBS-t, penicillin/sztreptomicint, nem-esszenciális aminosavakat, nátrium-piruvátot és 2 mM glutamint tartalmazó RPMI-1640 táptalaj).

Néhány tartályhoz humán IL-10-et adtunk állandó, 100 pM koncentrációban, és ehhez vagy hozzámértünk egy IL-10 antagonistát 100-szoros moláris túlsúllyal (10 nM; ELISA meghatározással) vagy nem. Ezután rögtön következett az LPS (Sigma) hozzáadása minden tartályhoz 80 ng/ml végső koncentrációig. A pozitív és negatív IL-10 kontrollokat párhuzamos vizsgálatban inkubáltuk IL-10 expressziós vektorral, illetve pSV.Sport plazmiddal transzfektált COS sejtekkel kondicionált táptalajt használva. Ez utóbbi kontroll kondicionált táptalajt használtuk az összes minta hígításához. Minden meghatározást két párhuzamos vizsgálatban végeztünk, és az eredményeket utánvizsgálatokban, különböző sejt-tételek használatával ellenőriztük.

A lemezeket 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves légtérben inkubáltuk 24 órán át, ezután a felülúszó folyadékokat összegyűjtöttük és -20 °C-on tároltuk a későbbi analízisekhez. Az összegyűjtött mintákban az IL-6, IL-Ια és TNF-a szinteket ELISA kitekkel (R and D Systems, Minneapolis, MN.,

···· Λ

USA), a gyártó cég előírásai szerint mértük.

Úgy találtuk, hogy ebben a vizsgálatban mindegyik antagonista képes megsemmisíteni az IL-10 citokin szintézisre gyakorolt gátló aktivitását. Lásd az 1. táblázatot.

1. táblázat

Maradék IL-10 aktivitás %-ban⁺

Minta	IL-6	IL-la	TNF-i
Puffer	100	100	100
Antitest	0	0	0
K157E	21	27	51
CÁ3	12	13	39
cM	19	27	61

⁺A humán IL-10-nek az említett citokinek szintézisére gyakorolt gátló hatását kontroll puffer, egy neutralizáló anti-IL-10 monoklonális antitest telítési mennyisége és három IL-10 antagonista 100-szoros moláris túlsúlya jelenlétében mértük.

IL-10 mutáns antagonisták változó mennyiségeivel IL-10 távollétében végzett hasonló vizsgálatokkal kimutattuk, hogy egyetlen antagonistának sem volt citokin szintézis gátló aktivitása, és 100 pM koncentrációig — beleértve magát a 100 pM koncentrációt — egyetlen antagonistánál sem tudtunk kimutatni gátló aktivitást.

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az IL-10 antagonisták

T sejtekre kifejtett aktivitását, kevert limfocita válasz (mixed lymphocyte response = MLR) assay-t végeztünk. Humán PBMC-ket izoláltunk, mint fent leírtuk. Stimulátor PBMC-ket készítettünk olyan módon, hogy a sejteket 50 mg/ml mitomicin C-vel (Sigma, St.Louis, MO. , USA) kezeltük 20 percig, 37 °C-on.

Egy 96 tartályos mikrotitráló lemez minden tartályában a válaszoló PBMC-kből körülbelül lxlO³ sejtet és a stimulátor PBMC-kből is körülbelül lxlO⁵ sejtet kevertünk össze a humán IL-10 vagy a K157E, C 3 vagy C 4 antagonisták egyikének különböző mennyiségeivel, 200 μΐ összmennyiségben (három párhuzamos vizsgálatban). A sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid tartalmú légtérben inkubáltuk 6 napon át. Ezután a tenyészeteket tartályonként 1 pCi tríciummal jelzett timidinnel ( [³H]-Tdr; 15,6 Ci/mM; NEN, Boston, MA., USA) pulzáltuk 16 órán át. A lizátumokat egy szűrőn gyűjtöttük össze 96-tartályhoz való sejt-arató készülék (96-well cell harvester; Skatron, Inc., Sterline, VA., USA) segítségével, majd β-számlálóban (Pharmacia LKB Nuclear Inc., Gaithersburg, MD., USA) számláltuk.

Azt találtuk, hogy az antagonisták 1 /xg/ml koncentráció mellett nem voltak képesek gátolni az MLR-t. Ezzel szemben a humán IL-10 ennél a koncentrációnál az MLR 82 %-os gátlását idézte elő.

Receptor kötési vizsgálatok.

Tisztított humán IL-10-et (körülbelül 99 %-os tisztaságú) jódizotóppal jeleztünk ENZYMOBEAD módszerrel (BioRad, Richmond, CA., USA) a gyártó cég előírásai szerint. Megközelítőleg 4xl0³ transzfektált olyan COS sejtet, amelyet humán IL-10 receptor cDNS-t fejeznek ki, centrifugáltunk 200 g mellett 10 percig. A kapott üledéket kötő-pufferrel (10% fetális borjú szérumot és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS) mostuk, és 200 μΐ olyan kötő-pufferben reszuszpendáltuk, amely 150 pM [125-humán IL-10-et (specifikus radioaktivitás: 225 ^Ci/ug) tartalmazott és/vagy humán IL-10-et kódoló cDNS-t kifejező COS sejtekről származó sorozathigítású kondicionált táptalajt vagy egy találmány szerinti mutáns antagonistát.

A sejteket 4 °C-on 2 órán át inkubáltuk, majd 200 g mellett 10 percig centrifugáltuk azonos hőmérsékleten. A felülúszókat eltávolítottuk, és mindegyik sejt-üledéket 100 μΐ kötő-pufferben — jelzett IL-10 — reszuszpendáltuk. A szuszpenziőkat meghosszabbítottuk mikrocentrifugacsövekben 200 μΐ 10% glicerint tartalmazó kötő-pufferrel felülrétegezve, 200 g mellett 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk, majd folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztottuk. A sejtüledéket ezután számláláshoz való csövekbe vágtuk, és CLINIGAMMA 1272 számlálóban (Pharmacia-LKB) számláltuk. A nem specifikus kötést úgy határoztuk meg, hogy a kötést jelzetlen humán IL-10 500-1000-szeres moláris túlsúlyának jelenlétében viteleztük ki.

Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be, melyből látható, hogy mindegyik IL-10 antagonista csaknem olyan hatásos volt a receptor kötésért folyó versenyben, mint maga az

IL-10.

• · ·· • ···· · · · • · * « * · · • · · · ·

- 30 2 . táblázat

Rádiójelzett IL-10 kötődés gátlása.⁺

Minta	^IC50	(pM)
Humán IL-10	100
K157E	136 ±	65
Cd 3	172 ±	28
CM	120 ±	9

⁺Az adatok — amelyek két független vizsgálat középértékét jelentik — a jelzetlen humán IL-10-nek vagy a feltüntetett IL-10 antagonistáknak azt a koncentrációját jelentik, amelyeket a radiojelzett humán IL-10 sejt-receptorokhoz való kötődésének 50 %-os gátlása hozott létre.

A gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmányt számos módosítással és változtatással is kivitelezhetik anélkül, hogy a találmány szellemétől és tartalmától eltérnének. A találmányi leírásban szereplő kiviteli alakok csak a szemléltetést szolgálják, és a találmányt csak a csatolt igénypontok kikötései korlátozzák.

A szekvenciák jegyzéke:

Az 1.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 160 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Az 1.számú szekvencia leírása:

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alá

Phe

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

50

55

60

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Alá

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Alá

Phe

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Met

Glu

Ile

Arg

Asn

145

150

155

160

A 2.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 157 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid

(ix) A 2.számú szekvencia leírása:

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser Glu

Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alá

Phe

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

50

55

60

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Alá

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Alá

Phe

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

145

150

155

A 3.számú szekvencia:

Hosszúság: 156 aminosav

Típus: aminosav

Topológia: lineáris (B) (D)

(ü

) A

molekula típusa;

: peptid

(ix

:) A

3.számú

szekvencia .

leírása:

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser

Glu Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro 20

Asn

Met

Leu

Arg

Asp Leu 25

Arg

Asp

Alá

Phe 30

Ser

Arg

Val

Lys

Thr 35

Phe

Gin

Met

Lys 40

Asp Gin

Leu

Asp

Asn 45

Leu

Lys

Glu 50

Ser

Leu

Glu Asp 55

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu 60

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Alá

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Alá

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Alá

Phe

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Met

145 150 155

A 4.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai
(A)	Hosszúság: 160 aminosav
(B)	Típus: aminosav
(D)	Topológia: lineáris

(ii) A molekula típusa: peptid (ix) A 4.számú szekvencia leírása:

Ser

Pro

Gly

Gin Gly 5

Thr Gin

Ser

Glu

Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alá

Phe

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Alá

50

55

60

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Alá

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Alá

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu 115

Asn

Lys

Ser

Lys Alá 120

Val

Glu Gin

Val

Lys 125

Asn

Alá

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Alá

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Alá

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

145

150

155

160

Az 5.számú szekvencia:

(i)	A szekvencia jellemző adatai:
	(A)	Hosszúság: 60 bázispár
	(B)	Típus: nukleinsav
	(c)	Száltípus: egyszálú
	(D)	Topológia: lineáris
(ix)	Az 5	.számú szekvencia leírása

GTCGACTGCA GCCGCCACCA TGCACAGCTC AGCACTGCTC TGTTGCCTGG TCCTCCTGAC

A 6.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 41 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 6.számú szekvencia leírása:

ACGTCGAATT CTCAGTTTCG TATCTTCATT GTCATGTAGG C 41

A 7.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 85 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris

(ix) A 7.számú szekvencia leírása:

GGACTTTAAG GGTTACCTGG GTTGCCAAGC CTTGTCTGAG ATGATCCAGT TTTATCTAGA 60

GGAGGTGATG CCCCAAGCTG AGAAC 85

A 8.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 49 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 8.számú szekvencia leírása:

AGCTGAATTC AGTTTCGTAT CTCCATTGTC ATGTAGGCTT CTATGTAGT

A 9.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 40 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 9.számú szekvencia leírása:

AGCTGAATTC ACTTCATTGT CATGTAGGCT TCTATGTAGT 40

A 10.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 37 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris

(ix) A 10.számú szekvencia leírása:

AGCTGAATTC ACATTGTCAT GTAGGCTTCT ATGTAGT 37

A 11.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 91 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 11.számú szekvencia leírása:

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCT CTGAGAACAG C 91

A 12.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 90 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 12.számú szekvencia leírása:

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60

CTCAGAGGCC CTCACCCCAG TCAGGAGGAC 90

A 13.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 82 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris

(ix) A 13.számú szekvencia leírása:

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60

CCTGACTGGG GTGAGGGCCA GC 82

A 14.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 81 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 14.számú szekvencia leírása:

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGGC 60

CCTCACCCCA GTCAGGCGGA C 81

A 15.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 82 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 15.számú szekvencia leírása:

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT

CCTGACTGGG GTGAGGGCCT GC

A 16.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 78 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris ···· (ix) A 16.számú szekvencia leírása:

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGGCCCT

CACCCCAGTC AGGAGGAC 78

A 17.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 81 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 17.számú szekvencia leírása:

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT

CCTGACTGGG GTGAGGGCCA C

A 18.számú szekvencia:

(i) A szekvencia jellemző adatai:

(A) Hosszúság: 75 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ix) A 18.számú szekvencia leírása:

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGGCCCTCAC

CCCAGTCAGG AGGAC

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Humán. IL-10 antagonista, azzal jellemezve, hogy olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíziójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük vagy a mintegy 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszában egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk.
2. Az 1. igénypont szerinti antagonista, azzal jellemezve, hogy amino-terminális végéből 1-11 aminsavmaradékot töröltünk .
3. Az 1. igénypont szerinti antagonista, azzal jellemezve, hogy aminosavszekvenciáját az 1., 2. vagy 3. számú szekvencia határozza meg.
4. Nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy olyn érett humán IL-10-et kódol, amelyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíciójában egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük a lizin maradékot és a 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszban egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk.
5. A 4. igénypont szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy olyan antagonistát kódol, amelynek aminoterminális végéből 1-11 aminosavmaradék deletált.
6. A 4. igénypont szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy olyan humán IL-10 antagonistát kódol, amelynek az aminosavszekvenciáját az 1., 2. vagy a 3. számú szekvencia határozza meg.

····
7. A 4. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmazó rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav expresszióját képes irányítani.
8. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti rekombináns vektort tartalmazza.
9. Eljárás humán IL-10 antagonista előállítására, azzal jellemezve, hogy az illető antagonista olyan érett humán IL-10et tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíciójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a mintegy 12 karboxi-terminális maradékot tartalmazó szakaszában egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk, továbbá, hogy a 8. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek a nukleinsav kifejeződését biztosítják.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan antagonistát kódol, amelynek amino-terminális végén 1-11 aminosavmaradék deletált.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan antagonistát kódol, amely az 1., 2. vagy a 3. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza.
12. Eljárás humán IL-10 biológiai aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a humán IL-10 receptorokat hordozó sejteket olyan humán IL-10 antagonista hatékony mennyiségével hozzuk össze, amelyet úgy módosítottunk, hogy 157. pozíciójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a 12 karboxi-terminális maradékot tártál·· ··

- 41 mazó szakaszában egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk.
13. A 12. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az antagonista aminoterminális végéből 1-11 aminosavmaradékot töröltünk.
14. A 12. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az antagonista az 1., 2. vagy 3. számú szekvencia által meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza.
15. Humán IL-10 agonista, azzal jellemezve, hogy olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyből 1-11 amino-terminális aminosavmaradékot töröltünk.
16. A 15. igénypont szerinti agonista, azzal jellemezve, hogy belőle a 7., 10. vagy a 11. aminosavmaradékot töröltük.
17. Nukleinsav, azzal jellemezve, hogy az általa kódolt humán IL-10 agonista egy olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy belőle 1-11 amino-terminális aminosavmaradékot töröltünk.
18. A 17. igénypont szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy olyan agonistát kódol, amelyben a 7., 10. vagy a 11. aminosavmaradék deletált.
19. A 17. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmazó rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav expreszszióját képes irányítani.
20. A 19. igénypont szerinti rekombináns vektort tartalmazó gazdasejt.
21. Eljárás humán IL-10 agonista előállítására, amely olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyet úgy módosítottunk, hogy 1-11 amino-terminális aminosavmaradékát töröltük, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerinti gazdasejteket olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek a nukleinsav kifejeződését biztosítják.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan agonistát kódol, amelyben a 7., 10. vagy a 11. aminosavmaradék deletált.
23. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot tartalmaz és (a) olyan humán IL-10 agonistát, amely olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelyet 1-11 amino-terminális aminosavmaradékának törlésével módosítottunk, vagy (b) olyan humán IL-10 antagonistát, amely olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelynek 157. pozíciójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal cseréltük ki, vagy a mintegy 12 karboxi-terminális maradékból álló szakaszból egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk.
24. A 23. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az antagonista amino-terminális végéből 1-11 aminosavmaradék deletált.
25. A 23. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az antagonista aminosavszekvenciáját az 1., 2. vagy a 3. számú szekvencia határozza meg.
26. A 23. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az agonista 7., 10. vagy 11. aminosavmaradéka deletált.
27. Humán IL-10 antagonista — amely olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelynek 157. pozíciójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a mintegy 12 karboxi-terminális maradékból álló szakaszából egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk — felhasználása az IL-10 biológiai aktivitásának gátlására.
28. Humán IL-10 antagonista — amely olyan érett humán IL-10-et tartalmaz, amelynek 157. pozíciójában a lizin maradékot egy savas jellegű aminosavmaradékkal helyettesítettük, vagy a mintegy 12 karboxi-terminális maradékból álló szakaszából egy vagy több aminosavmaradékot töröltünk — felhasználása az IL-10 biológiai aktivitásának gátlására alkalmas gyógyszer készítmény előállításához.