CZ23396A3

CZ23396A3 - Antagonists and agonists of human interleukin-10

Info

Publication number: CZ23396A3
Application number: CZ96233A
Authority: CZ
Inventors: Chuan-Chu Chou; Xia-Yan Cai
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1996-05-15
Also published as: SK150596A3; SG43798A1; AU681178B2; WO1995003411A1; CN1127529A; JPH08507930A; NO960309L; NZ269663A; SK8396A3; FI960353A; KR960704041A; AU7399694A; NO960309D0; CA2168110A1; FI960353A0; HU9503983D0; PL312718A1; ZA945434B; IL110413A0; EP0711346A1

Description

Antagonisté a agonisté lidského intenleú.K^ig¹-₍li i

Oblast techniky

—o o

CT,

Tento vynález se týká antagonistů a agonistů lidského interleukinu-10, a prostředků a způsobů jejich přípravy a použití. Tito agonisté a antagonisté se tvoří zavedením aminokyselinových substitucí nebo delecí v karboxy- nebo aminokonci maturního lidského interleukinu-10.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 10 (IL-10) je cytokin schopný zprostředkovávat řadu působení nebo účinků. IL-10 byl izolován jak z myších, tak lidských buněk, a je zapojen do řízení imunitní odezvy různých tříd nebo souborů CD4⁺ T pomocných (Th) buněk. Tyto Th buňky mohou být rozděleny na různé soubory, jež se liší svými profily tvorby cytokinů. Dva z těchto souborů se nazývají Thi a Th2 buňky.

Klony T buněk Thi tvoří interleukin-2 (IL-2) a gama interferon (IFN-y'), zatímco klony T buněk Th2 secernují IL-10, interleukin-4 (IL-4) a interleukin-5 (IL-5), obecně po aktivaci antigeny a mitotickými lektiny. Obě třídy Th buněčných klonů produkují cytokiny jako je faktor nekrózy nádorů-α (TNF-a), interleukin-3 (IL-3) a faktor stimulace kolonií granulocytůmakrofágů (GM-CSF). Třetí kategorie Th buněk (ThO) tvoří současně IL-2, IFN-Q*', IL-4, IL-5, TNF-α, IL-3 a GM-CSF.

Rozdílné typy produkce cytokinů Thi a Th2 odrážejí jejich role v odezvě na různé patogeny.

v úspěšných buněčných odezvách k řadě patogenů. Jsou zapojeny také v hypersenzitivitních reakcích opožděného typu. Th2 buňky jsou spojeny s humorálními odezvami, jež jsou charakterizované tvorbou protilátek. U většiny situací vyvine imunitní systém Th odezvu, buňkami zčásti Thi buňky jsou například zapojeny intracelulárních jež je k eliminaci konkrétního antigenu nebo patogenu ale není tomu tak pokaždé.

Například: Leishmaniasa je charakterizována defektní odezvou Thi. Tento defekt může být demonstrován s použitím in vitro * testů, jako je test popsaný Clericim et al. [<7. Clin. Invest. 84\ 1983 (1989)]. S použitím jednoho takovéhoto in vitro testu bylo ukázáno, že defekt Th 1 odezvy lze připsat endogenním hladinám IL-10, protože funkci Thi lze napravit přidáním neutralizujících protilátek proti IL-10.

Protože leishmaniasa a jiné choroby jsou charakterizovány ^efektní odezvou Thi, kterou lze připsat nepatřičnému působení endogenního IL-10, nastává potřeba agonistů a antagonistů IL-10 pro léčbu takovýchto chorob.

Podstata vynálezu

Tento vynález naplňuje tuto potřebu tím, že poskytuje prostředky a způsoby pro poskytnutí nebo inhibování biologické aktivity lidského IL-10.

Konkrétněji tento vynález poskytuje antagonisty lidského IL-10, které zahrnují maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo deleci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující asi 12 karboxyterminálních zbytků.

Aminokyselinové sekvence tří takovýchto provedení jsou definovány následujícími sekvencemi I, II a III:

Ser

Pro

^Giy

Gin

Gly Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

Pro

1

5

10

15

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

20

25

-

30

Val

Lys

Thr

Phe

Phe Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

50

55

60

Leu

Ser Glu

Met

Ile

Gin

Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala

Ί55

70

75

80-

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu '

·· - -· -

100

- -

105

— - ·

... .......

110=:

- --- ·

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe ⁷

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Glu

Ile

Arg

Asn

145

150

155

•“A

160 (I)

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

Pro

1

5

10

15

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

50

55

60

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

145 150 155 (II)

Ser Pro Gly	Gin	Gly	Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys	Thr His	Phe	Pro
1		5	10		15
Gly Asn Leu	Pro	Asn	Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp	Ala Phe	Ser	Arg
	20		25	30
Val Lys Thr	Phe	Phe	Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp	Asn Leu	Leu	Leu
35			40	45
Lys Glu Ser	Leu	Leu	Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu	Gly Cys	Gin	Ala
50			55 60
Leu Ser Glu	Met	Ile	Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val	Met Pro	Gin	Ala
65			70 75			80
Glu Asn Gin	Asp	Pro	Asp Ile Lys Ala His Val Asn	Ser Leu	Gly'	Glu—
		85	90		95
Asn Leu Lys	Thr	Leu	Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys	His Arg	Phe	Leu
	100		105	110
Pro Cys Glu	Asn	Lys	Ser Lys Ala Val Glu Gin Val	Lys Asn	Ala	Phe
115			120	125
Asn Lys Leu	Gin	Glu	Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met	Ser Glu	Phe	Asp
130			135 140
Ile Phe Ile	Asn	Tyr	Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met
145			150 155	(III)
Tento	vynález	dále poskytuje nukleovou	kyselinu	l kódující

antagonistů lidského IL-10, zahrnujícího maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující asi 12 karboxyterminálních zbytků. Rekombinantní vektory obsahující takovouto nukleovou kyselinu a hostitelské buňky obsahující takovýto rekombinantní vektor jsou tímto vynálezem také poskytnuty.

Tento vynález ještě dále poskytuje způsob výroby antagonisty lidského IL-10, zahrnujícího maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující asi 12 karboxyterminálních zbytků, přičemž tento způsob zahrnuje kultivaci jedněch shora zmíněných hostitelských buněk za podmínek, kdy je nukleová kyselina j í”cí~tbfioto~ ántagonistu^ exprimovánaT

Tento vynález ještě dále poskytuje způsob pro inhibici biologické aktivity IL-10, jenž zahrnuje uvedení buněk nesoucích receptory pro IL-10 do kontaktu s účinným množstvím antagonisty . , ..lidského IL-10, zahrnujícího . maturní lidskýIL-10, modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující asi 12 karboxyterminálnich zbytků.

Tento vynález ještě dále poskytuje agonistu lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný delecí od jednoho do jedenácti aminoterminálních aminokyselinových zbytků.

Nukleové kyseliny kódující takovéto agonisty, rekombinantní vektory a transformované hostitelské buňky obsahující takovéto nukleové kyseliny, způsoby pro přípravu amtagonistů a farmaceutické prostředky obsahující jeden nebo více IL-10 agonistů nebo antagonistů a farmaceuticky přijatelné nosiče jsou tímto vynálezem také poskytnuty.

Podrobný popis vynálezu

Všechny odkazy zde citované jsou sem v jejich úplnosti začleněny odkazem.

Antagonisté podle tohoto vynálezu jsou užiteční k léčbě chorob jako je leishmaniasa, jež jsou charakterizovány defektní odezvou Thl, kterou lze připsat endogennímu IL-10. Mohou být užitečné také k léčbě chorob spojených s imunosupresí zprostředkovanou IL-10 nebo s nadprodukcí IL-10, jako jsou B-buňkové lymfomy. Navíc jsou antagonisté užiteční pro studie osvětlující mechanismus působení ÍL-ÍÓ a pro ráoionáXni^navrhyléků, protože vykazují silnou vazbu k receptoru, která je oddělena od efektorové funkce. Po imobilizaci na pevné podložce mohou být antagonisté použiti na afinitní čištění rozpustných forem IL-10 receptoru, v nichž je deletována transmembránová oblast.

- 6 «SSB^^ÍÍSS,'.i2ííSSa^SSag^»i3?KaSB=:a5--««waweBSSž &38waabatee

Virová IL-10 bílkovina (BCRFI, nebo vIL-10) Epsteinova --------Barova--viru----(EBVj má tež bióTogičkóu aktivitu---------IL-10--------a předpokládané se váže k IL-10 receptorům. Exprese vIL-10 aktivity EBV předpokládané dává viru určité výhody k přežití, ve smyslu jeho schopnosti infekce, replikace a udržování se v hostitelském organismu. Schopnost vIL-10 negativně regulovat tvorbu IFN-^¹ jak T buňkami, tak NK buňkami, spolu s jeho posilujícím účinkem na životaschopnost B-buněk, napovídá, že vIL-10 může potlačovat protivirovou imunitu a současně podporovat potenciál EBV transformovat lidské B buňky.

------------------Antagonisté—IL-10—podle tohoto—vynálezu mohou proto byt užiteční k účinné podpoře protivirové imunity proti EBV, a možná dalším virům. Více o potenciálním použití IL-10 antagonistů viz např. v Howard et al. J. Clin. Inuaunol. 12'. 239 (1992).

,_x Tři reprezentativní provedení antagonistů, mutantních IL-10, podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v Příkladech níže. V jednom provedení je lysinový zbytek v poloze 157 sekvence maturního lidského IL-10 nahrazen zbytkem kyseliny glutamové (sekvence I).

V jiných provedeních jsou z karboxylového konce lidského IL-10 deletovány tři (sekvence II) nebo čtyři (sekvence III) aminokyselinové zbytky. Na tyto antagonisty se níže odkazuje jako na antagonisty K157E, C/\3 resp. C/\4.

Jak se zde používá, výraz maturní lidský IL-10 je definován jako bílkovina bez zaváděcí sekvence, která (a) má aminokyselinovou sekvenci v podstatě shodnou se sekvencí IV, definovanou zde níže

Ser Pro Gly 1

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15 .

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

20

25

30

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

Leu

35

40

45

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

50

55

60'

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

65

70

75

80

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

85 Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

90 Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

100

105

110

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

115

120

125

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

130

135

140

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

145

150

155

160 (IV);

a (b) má biologickou aktivitu, která je běžná u nativního IL-10. Toto zahrnuje přirozené alelické varianty a jiné varianty, mající jednu nebo více konzervativních aminokyselinových substitucí [Grantham, Science 185: 862 (1974)], které v podstatě nenarušují biologickou aktivitu. Takovéto konzervativní substituce zahrnují skupiny synonymních aminokyselin, např. jak je popsáno v U.S. patentu číslo 5 017 691 pro Leeho et al.

Bude se rozumět, že i když se v současnosti dává přednost následujícím provedením, lze k vytvoření jiných antagonistů provést jiné modifikace karboxylového konce lidského IL-10_oNapříklad by bylo možné vytvořit účinného antagonistů náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyseliny asparagové, místo zbytkem kyseliny glutamové. Jak ze zde používá, výraz zbytek kyselé aminokyseliny je tedy definován tak, že zahrnuje jak zbytek kyseliny asparagové, tak zbytek kyseliny glutamové.

Mohou být prováděny také více nebo méně rozsáhlé delece.

Deletovany mohou byt jeden nebo zahrnujících asi 12 karboxyterminálních zbytků. S výhodu se deletuje asi 8 terminálních zbytků, a s větší výhodou 3 nebo 4 ‘ těfiniftalhf “zbytky T“““““

Překvapivě bylo nalezeno, že může být deletováno až 11 aminokyselinových zbytků z aminokonce maturního lidského IL-10. Tyto zkrácené varianty, jež mohou mít ve srovnání s IL-10 samotným odlišné farmakokinetické vlastnosti, mají biologickou aktivitu maturního lidského IL-10, jak se změřila pomocí testu stimulace MC/9 žírných buněk. Jsou proto užitečné v léčbě veškerých indikací vnímavých k léčbě IL-1O samotným. Jsou také _už itečjjé pro některé—účele -popsané—shora pro antagonisty podle vynálezu, jako je afinitní čištění.

Protože mají biologickou aktivitu lidského IL-10, ale mají zkrácenou aminokyselinovou sekvenci, odkazuje se zde na tyto varianty také jako na agonisty lidského IL-10.

Má se ale za to, že cysteinový zbytek v poloze 12 je esenciální pro biologickou aktivitu. Skutečně: Deleci prvních 12 zbytků, včetně tohoto cysteinového zbytku, vznikla varianta, jež neměla žádnou biologickou aktivitu. Proto jsou delece ____________ v aminokonci___omezenyna delecijednohonebo více—z prvních 11----zbytků.

Tyto aminoterminální delece mohou být kombinovány se shora zmíněnými karboxyterminálními modifikacemi pro vytvoření antagonistů majících charakteristiky popsané níže, ale možná jiné farmakokinetické vlastnosti. Tito antagonisté jsou také součástí tohoto vynálezu.

Nukleové kyseliny kódující agonisty a antagonisty IL-10 jsou také součástí tohoto vynálezu. Ti, co jsou zběhlí v oboru, jsou si samozřejmě dobře vědomi, že v důsledku degenerace genetického kódu existuje mnoho různých nukleových kyselin, jež mohou kódovat každého z agonistů a antagonistů. Konkrétní použité kodony mohou být vybrány na základě pohodlné konstrukce a optimální exprese v prokaryotických a eukaryotických systémech.

S výhodou se nukleové kyseliny kódující agonisty a antagonisty připravují s použitím polymerásové řetězové reakce (PCR) [Saiki et al., Science 239'. 487 (1988)], jak se podává v příkladu Daughertyho et al. [Nucleic Acid Res. 19'. 2471 (1991)], k modifikaci cDNA kódující lidský IL-10. Takováto cDNA jé dobře známá v oboru a lze ji připravovat s použitím standardních metod, jak jsou popsány např. v publikaci mezinárodní patentové přihlášky číslo WO 91/00349. Klony obsahující sekvence kódující lidský IL-10 jsou také deponovány v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, pod přístupovými čísly 68191 a 68192.

Alternativně může být DNA modifikována s použitím dobře známých technik řízené mutagenese. Viz např. Gillman et al.,

Gene 5: 81 (1979); Roberts et al., Nátuře 328'. 731 (1987) nebo Innis CedTj ;—1990>-—PCR—Protocols: A ~ Guide to Methods and Applications, Academie Press, New York, NY.

Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být také syntetizovány chemicky s použitím např. fosfoamiditové metody na pevné fázi podle Matteucciho et al. [J. Am. Chem. Soc. 103'. 3185 (1981)], metody Yoo et al. [«7. Biol. Chem. 764'. 17078 (1989)] nebo jiných dobře známých metod.

Rekombinantní vektory obsahující předešlé nukleové kyseliny jsou také součástí tohoto vynálezu, jakož i hostitelské buňky transformované takovýmito vektory, a metody pro přípravu agonistů a antagonistů.

Inzerce DNA kódující jednoho z agonistů a antagonistů do jednoho z mnoha známých vektorů exprese se snadno provede, když konce jak této DNA, tak vektoru, obsahují kompatibilní restrikční místa. Pokud toto nelze provést, může být zapotřebí modifikovat konce těchto DNA a/nebo vektoru zpětnou digescí přečnívajících úseků jednovláknové DNA, vytvořených štěpením restrikční endonukleasou, k vytvoření tupého konce, nebo k dosažení téhož výsledku, zaplněním jednovláknových konců patřičnou DNA polymerasou.

Alternativně, jakékoli žádoucí místo může být vytvořeno ligací nukleotidových sekvencí (spojek) k těmto koncům. Takovéto spojky mohou obsahovat specifické oligonukleotidové sekvence, jež definují žádoucí restrikční místo. Štěpený vektor a fragmenty DNA mohou být, je-li to zapotřebí, také modifikovány homopolymerním prodloužením nebo PCR.

Antagonisté podle tohoto vynálezu jsou charakterizováni vazebnými afinitami k lidskému IL-10 receptoru, jež jsou podobné jako u lidského IL-10 samotného, ale jsou v podstatě zbaveni biologické aktivity. Š výhodou budou laít mene^než“ 10 ^'biologické aktivity lidského IL-10 ve standardním testu, výhodněji méně než 1 %.

Antagonisté typicky produkují přinejmenším asi 25 % inhibice biologické aktivity IL-10 v buňkách nesoucích IL-10 receptory. S výhodou bude stupeň inhibice přinejmenším asi 50 %, a výhodněji přinejmenším 75 %. Skutečný stupeň inhibice se může lišit podle konkrétnl^měrěne^brológícké aktivity.

Agonisté a antagonisté mohou být také chemicky syntetizováni vhodnou metodou, jako je syntéza výhradně na pevné fázi, metodami částečně na pevné fázi, kondenzací fragmentů nebo klasickou syntézou v roztoku. Chemicky syntetizované polypeptidy jsou s výhodou připravovány peptidovou syntézou na pevné fázi, jak je popsána např. Merrifieldem [<7. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Science 232'. 341 (1986)] a Athertonem et al., (Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxf ord ).-------------------At se připraví jakkoli, agonisty a antagonisty lze čistit např. s použitím HPLC, gelové filtrace, iontoměničové a partiční chromátografie, protiproudého rozdělování nebo jiných dobře známých způsobů.

·*· Farmaceutické prostředky mohou být připraveny smícháním jednoho nebo více agonistů nebo antagonistů IL-10, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, a farmaceuticky přijatelného nosiče.

Užitečnými farmaceutickými nosiči mohou být jakékoli kompatibilní netoxické látky vhodné pro dodávání prostředků podle vynálezu pacientovi. V nosiči mohou být obsaženy voda, alkohol, tuky, vosky a inertní pevné látky. Do farmaceutického prostředku mohou být také začleněna farmaceuticky přijatelná adjuvans (pufrační činidlo, dispergační činidlo). Obecně jsou prostředky užitečné pro parentrální podávání takovýchto léků dobře známy; např. Remington's Pharmaceutical Science, 18. vydání (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990). Balení v jednotlivých dávkách je často výhodné, např. ve sterilní formě. , ₅. ₌ . _ ₌ .

Podávání agonistů a antagonistů je s výhodou parenterální, pomocí intraperitoneálních, intravenózních, subkutánních nebo intramuskulárních injekcí nebo infuzí, nebo pomocí jakéhokoli jiného přijatelného systémového způsobu. Alternativně může být antagonista podáván implantovatelným nebo injikovatelným systémem dodávání léku [viz např. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984); Lewis, ed., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, 1981, Plenům Press, New York, v kombinaci s k léčbě stavů

New York; U.S. patenty číslo 3 773 991 a 3 270 960]. Lze provádět i orální podávání, s podáváni dobře známých přípravkúy^kteře' chrání antagonistu před gastrointestinálními proteasami. Viz též

Langer, Science 249: 1527 (1990).

Agonisté a antagonisté mohou být podáváni také standardními technikami^ .genovém terapie, ^včetně.např.--přímé injekce .nukleoyé kyseliny do tkání, použití rekombinantních virových vektorů nebo liposomů a implantace transfekovaných buněk. Viz např. Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10: 180 (1992).

Agonisté a antagonisté mohou být podáváni samotní nebo jedním nebo více jinými činidly běžně používanými charakterizovaných defektní Th odezvou. Například léky jako interleukin-12 (IL-12) nebo gama interferon (IFN-^j mohou být podávány spolu s antagonistou. Insulin, cyklosporin, prednison nebo azathioprin mohou být podávány spolu s agonistou, např. když se používají náhradou za IL-10 k léčbě nebo prevenci na insulinu závislého diabetes mellitus (viz současně podanou U.S. přihlášku, číslo 07/955 523 z 1. října 1992).

Takovéto společné podávání jednoho nebo více činidel může být souběžné (spolu s) nebo posloupné (před nebo po) vzhledem k podání agonisty nebo antagonisty. Všechna podávaná činidla musí být v pacientovi přítomna v dostatečných hladinách, aby byla farmaceuticky účinná. Typicky: Pokud se druhé činidlo podá během asi poločasu prvního činidla, považuje se podání těchto dvou činidel za společné.

Stanovení patřičného dávkování agonisty nebo antagonisty pro konkrétní situaci spadá pod znalosti v oboru. Obecně se léčba začíná menšími dávkami než je optimum. Potom se dávkování zvyšuje s malými inkrementy dokud se nedosáhne optimální účinek za daných podmínek. Když je to žádoucí, může být vhodné rozdělit celkovou denní dávku a podávat ji po částech.

Účinné množství budě dávka, která Vede k prokazatelnému zlepšení jednoho nebo více klinických parametrů nebo ke statisticky významnému zlepšení odezvy v jedné nebo více známých

Th funkcí; některé z nich, jako tvorba IL-2, jsou popsány výše.

Tato odezva může být měřena in vitro s použitím krevních buněk odebraných pacientovi, např. jak je popsáno v Clerici et al., jako výše. Takovýto in vitro test lze provést před začátkem léčby k poskytnutí—referenční—základní-—hodnoty,—se—kterou se může zlepšená odezva porovnávat.

Skutečné množství a četnost podávání agonistů a antagonistů a jejich farmaceuticky přijatelných solí konkrétnímu pacientovi bude regulováno podle posouzení ošetřujícího lékaře, s přihlédnutím k takovým faktorům, jako jsou věk, stav a velikost pacienta a stupeň symptomu(ů), který se léčí.

Příklady proveden í—vynále zu----------------------------------- ----------------------------------------Tento vynález může být vysvětlen následujícími příklady. Pokud není specifikováno jinak, procenta udaná níže pro pevné látky v pevných látkách, kapaliny v kapalinách resp. pevné látky v kapalinách jsou založena na poměrech hmotnost/hmotnost, objem/objem resp. hmotnost/objem.

Reagencie a obecné metody , Restrikční endonukleasy byly získány od Boehringer Mannheim (Indianopolis, IN), zatímco souprava pro ligaci DNA byla pořízena od Takara Biochem., Inc. (Berkley, CA). Taq polymerasa a Pfu polymerasa byly získány ze Stratagene (La Jolla, CA). Rekombinantní lidský IL-10 (hIL-10) byl připravován standardním způsobem v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO), v podstatě jak je popsáno v Tsujimoto et al. [J. Biochem. 106·. 23 (1989)]. Médium pro tkáňové kultury, fetální bovinní sérum a glutamin byly pořízeny od Gibco-BRL (Gaithesburg, MD). Oligonukleotidové primery byly syntetizovány standardními metodami s použitím DNA syntetizátoru Applied Biosystems 380A, 380B nebo 394 (Foster City, CA).

Standardní metody rekombinantní DNA se prováděly v podstatě jek je popisuje Sambrook et al. v Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 2. vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Plainview, New York.

------Transfekce-------------------------------------------------------------------Transientní exprese se prováděla jak následuje. Buňky COS (ATCC CRL 1651) byly udržovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10 % fetálního bovinního séra, β mM glutaminem a penicilinem/streptomycinem. Transfekce se provedla elektroporací s použitím Bio-Rad GENE PULSER^R (Richmond, CA).

Buňky byly uvolněny z kultivačních misek působením trypsinu-EDTA a suspendovány v čerstvém kultivačním médiu. Asi 5 x 10⁶ buněk v objemu 250 μΐ bylo smícháno s 5 plasmidové DNA a pak elektroporováno s napětím a kapacitou nastavenými na 0,2 voltu resp. 960 mFD.

Po elektroporací byly buňky přeneseny do 10 cm kultivačních misek a kultivovány v 5 % CO₂ při 37’C po 6 hodin v 10 ml sérum obsahujícího DMEM. Když se buňky přichytily k miskám, médium bylo odstraněno odsátím a nahrazeno bezsérovým médiem. Po 72 hodinách bylo kondicionované médium sebráno k analýze.

Příprava antagonistů

Rekonstrukce cDNA lidského IL-10 divokého typu, a vektorů exprese

K umožnění exprese a manipulace, byla kódující oblast hIL-10 cDNA generována PCR s použitím hIL-10 vektoru založeného na pCDSRa[Viera et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 55: 1172 (l-gg-l^Z—^sekvence—deponovaná^^GenBank—pod^přístupovým—číslem M57627] jako templátu, i když by bylo možné použít jiných známých zdrojů této cDNA.

Kozákové konsentní obratlovčí iniciátor translace [Kozák, Nucleic Acid Res. 20. 8125 (1987)] byl zaveden do 5' primeru nazvaného B1789CC (sekvence V):

GTCGACTGCA GCCGCCACCA TGCACAGCTC AGCACTGCTC TGTTGCCTGG TCCTCCTGAC 60 (V) .

Pstl místo resp. EcoRI místo byly přidány k 5' primeru B1789CC resp. 3' primeru nazvanému A1715CC (sekvence VI):

ACGTCGAATT CTCAGTTTCG TATCTTCATT GTCATGTAGG C 41 (VI).

----------- S použitím-----shora zmíněných primerů-----byla hTL-10 cDNA podrobena PCR v reakční směsi objemu 50 μΐ, s převrstvením 50 μΐ parafínového oleje, v 0,5 ml Eppendorfově zkumavce. Reakční směs typicky obsahovala 26,5 μΐ H₂O, 5 μΐ DNA polymerasového pufru [finální koncentrace v reakci: 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KC1, •1,5 mM MgCl2, 0,001 % želatina], 200 μΜ dNTP, 60 ng templátové DNA, po 10 pmol 5' primeru B1789CC a 3' primeru nazvanému A1715CC, a 0,5 μΐ Taq polymerasy (2 jednotky).

Reakce se prováděla v termocykleru PHC-1 (Techne, Princeton,

NJ) s 30 cykly 95°C, 2 minuty k denaturaci; 42°C, 2 minuty k tvorbě duplexu [annealing]; a 70°C, 1 minuta k syntéze. Na konci třicátého cyklu byla reakční směs inkubována dalších 9 minut při 72°C k prodloužení.

PCR směs byla podrobena elektoforéze v 1,2 % agarosovém

Tris-acetátovém gelu obsahujícím 0,5 μ9/πι1 ethidiumbromidu. DNA fragmenty mající očekávané velikosti byly vyříznuty z gelu a purifikovány s použitím soupravy GENECLEAN^R (La Jolla, CA). Po získání z gelu byl DNA produkt digerován Pstl a EcoRI, izolován pomocí zpracování gelovou elektoforézou a GENECLEAN^R, a klonován jako Pstl/EcoRI restrikční fragment do vektoru exprese pDSRG (ATCC 68233) a následně přenesen do vektoru exprese pSC.Sport (Gibco-BRL, Gaithesburg, MD).

Vektory obsahující hIL-10 cDNA byly namnoženy v E. coli kmene DH5a (Gibco-BRL) a sekvence DNA byla ověřena sekvenováním DNA. Vektor exprese hIL-10 založený na pSC.Sport byl použit k transfekci COS buněk, jakož i ke konstrukci vektorů s mutantním hIL-10.

Resyntetizovaná hIL-10 cDNA si podržela unikátní KgrlII místo

-----a~~urrikátn í~ Ks tE Ií-.....mí sto,—je-ž—jsou—obě přítomna v CDNA ϋ ivokého typu. Tato dvě vnitřní restrikční místa, jejichž relativní pozice jsou ukázány schematicky níže, byla potom použita ke generování mutantních hIL-10 CDNA pomocí náhrady kazet.

Pstl ------BglII------KstEII —------------------EcoRI

Karboxyterminální modifikace

K vytvoření C-koncového mutantního antagonisty hIL-10 byly pomocí PCR syntetizovány mutantní cDNA fragmenty, odpovídající BstEII/EcóRI oblasti hIL-10 cDNA divokého typu, a použity k náhradě odpovídající oblasti v pSV.Sport hIL-10 DNA popsané shora.

Mutantní K157E, C/\3 a C/\4 antagonisté lidského IL-10 byly připraveni PCR s použitím oligonukleotidových primerů komplementárních k sekvenci resyntetizované hIL-10 cDNA popsané shora, s navrženými mutacemi předem zavedenými do primerů 3'-konce.

K vytvoření tří mutantních antagonistů byl použit 5’ primer nazvaný B3351CC, mající aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí VII:

GGACTTTAAG GGTTACCTGG GTTGCCAAGC CTTGTCTGAG ATGATCCAGT TTTATCTAGA 60 GGAGGTGATG CCCCAAGCTG AGAAC 85 /17TT \ \ V J. Λ. / .

Sekvence tohoto 5' primerů byla komplementární k interní sekvenci lidské ÍL-10 cĎNÁ, zahrnující unikátní KstEII restrikční místo -lrrL-±o^cDNA-^dlVokélio'“typůT“3^“^p'rIa'éřy““j>brcrž'i'té^k’'''“'vytv'6ř'e‘řrí‘’ antagonistů měly sekvence komplementární k 3'-koncové sekvenci CDNA kódující hIL-10. Tyto primery, následované číslem sekvence definujícím jejich sekvenci, byly jak následuje

Mutant:	Primer:	Číslo sekvence
Κ157Ε	C3481CC	VIII
CA3	C3482CC	IX
C/\4	B3350CC	X

AGCTGAATTC AGTTTCGTAT CTCCATTGTC ATGTAGGCTT CTATGTAGT 49 (VIII)

AGCTGAATTC ACTTCATTGT CATGTAGGCT TCTATGTAGT 40

--------------------------------------- (ix)

AGCTGAATTC ACATTGTCAT GTÁGGCTTCT ATGTAGT 37 (X).

S použitím shora zmíněných primerů byla cDNA lidského IL-10 podrobena PCR v reakční směsi objemu 50 μΐ, s převrstvením 50 μΐ parafínového oleje, v 0,5 ml Eppendorfově zkumavce. Reakční směs typicky obsahovala 26,5 μΐ H₂O, 5 μΐ pfu DNA polymerasového pufru [finální koncentrace v reakci: 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 6 mM (NH₄)₂SO₄ , 0,1 % Triton X-100 a 10 μg/ml bovinního sérového albuminu (BSA) prostého nukleasy], 200 μΜ dNTP, 40 ng templátové DNA, po 10 pmol 5' primeru B3351CC a jednoho z 3' primerů, a 0,5 μΐ pfu polymerasy (2,5 jednotky).

Reakce se prováděla v termocykleru PHC-1 (Techne, Princeton, NJ) s 22 cykly: 94’C, 2 minuty k denaturaci; 50°C, 2 minuty k tvorbě duplexu; a 72’C, 1 minuta k syntéze. Na konci 22. cyklu byla reakční směs inkubována dalších 7,5 minuty při 72’C k prodloužení.

*· PCR’ směs byla zpracována extrakcífěňolěm-CHCr₃ , sražením ethanolem a pak postupně digerována EstEII a EcoRI. Produkty restrikční digesce byly podrobeny elektoforéze v 1 % agarosovém/ Tris-acetátovém gelu obsahujícím 0,5 μg/ml ethidiumbromidu. DNA fragmenty mající očekávané velikosti byly vyříznuty z gelu a získány extrakcí fenolem-CHCl₃ a sražením ethanolem.

Po získání z gelu byly BsťEII/EcoRI fragmenty hIL-10 mutantů použity k náhradě odpovídající oblasti hIL-10 DNA divokého typu v pSV.Sport vektoru. hIL-10 mutantní cDNA ve vektoru založeném na pSV. Sport byly namnoženy v E. coli kmene DH5a a ověřeny sekvenováním DNA. Tytéž vektory exprese byly použity k transfekci

COS buněk, jak je popsána shora.

Aminoterminální modifikace

K vytvoření N-koncových variant lidského IL-10 byly pomocí PCR syntetizovány modifikované cDNA fragmenty odpovídající Pstl/BglII oblasti hIL-10 cDNA divokého typu, s použitím párů primerů bez DNA templátu. Výsledné fragmenty byly použity k náhradě odpovídající oblasti hIL-10 DNA divokého typu ve vektoru pSV.Sport. Takto byly vytvořeny varianty, v nichž bylo z N-konce hIL-10 divokého typu deletováno 7 (variant N/\7). 10 (variant N/\10). 11 (variant N/\ll) a 12 (variant N/\12) aminokyselin. Páry primerů použité k vytvoření každého variantu, následované čísly sekvencí definujících jejich sekvence, byly jak následuje

Mutant:	Primer (konec):	Číslo sekvence
ΝΔ7	C3352CC (5’)	XI
	C3355CC (3')	XII
N/\1O	C3353CC (5’)	XIII
	C3354CC (3')	XIV
ΝΔ11	C3483CC (5')	XV
	C3485CC (3’)	XVI
N/\i2	C3484CC (5*)	XVII
	C3486CC (3')	XVIII

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGACTGGG GTGAGGGCCT CTGAGAACAG C 91 (XI)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGTT 60 CTCAGAGGCC CTCACCCCAG TCAGGAGGAC 90 (XII)

- 18 GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60-------------CCTGACTGGG GTGAGGGCCA GC 82 (XIII)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGCAGCTGGC 60 CCTCACCCCA GTCAGGAGGA C 81 (XIV)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGACTGGG GTGAGGGCCT GC 82 ___________________________. _________ (XV)__________________ ___________________________________. ___________

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG ŤGCAGGCCCT 60 CACCCCAGTC AGGAGGAC 78 (XVI)

GACGACGGTG GCTGCAGCCG CCACCATGCA CAGCTCAGCA CTGCTCTGTT GCCTGGTCCT 60 CCTGACTGGG GTGAGGGCCA C 81 (XVII)

GGCATCTCGG AGATCTCGAA GCATGTTAGG CAGGTTGCCT GGGAAGTGGG TGGCCCTCAC 60 CCCAGTCAGG AGGAC 75 (XVIII).

PCR se prováděla s použitím 10 pmol každého primeru z ukázaných příměrových párů, jak je popsáno výše pro syntézu C-terminálních mutantních antagonistů. PCR směs byla zpracována extrakcí fenolem-CHCl₃, sražením ethanolem a pak postupně digerována BgllJ. a Pstl. Produkty restrikční digesce byly podrobeny elektoforéze v agarosovém gelu jak je popsáno výše aDNA fragmenty mající očekávané velikosti byly vyříznuty z gelu a získány extrakcí fenolem-CHCl₃ a sražením ethanolem.

Po získání z gelu byly Pstl/Bglll restrikční fragmenty hIL-10 variantů použity k náhradě odpovídající oblasti hIL-10 DNA divokého typu v pSV.Sport vektoru, po vyštěpení této oblasti Pstl/Bglll digescí a ligaci nahrazujícího fragmentu. hIL-10 mutantní cDNA ve vektoru založeném na pSV.Sport byly namnoženy, ověřeny a použity jak je popsáno shora.

L-methioninu a provedlo 30 minutové vyhánění značky. Značené -kondicionované - médium. _ bylo_js_ebráno _a _ podrobeno elektrof oréze ~na polyakrylamidovém gelu s dodečylsulfátem sodným [SDS PAGE; Laemmli, Nátuře 227: 680 (1970)] v 10 - 20 % gelech za neredukujících podmínek, a gely byly vysušeny a autoradiografovány s použitím standardních metod a filmu Kodak XAR.

Autoradiografie ukázala distinktní značené pruhy pro lidský IL-10; antagonisty K157E, C/\3 a C/\4; a pro agonisty N/\7 a N/\10. kteří všichni migrovaly se zdánlivými molekulovými hmotnostmi asi 16 až 18 kilodaltonů. Za identických podmínek transfekce a kultivování buněk byly všichni tři antagonisté, karboxyterminální mutanty lidského IL-10, exprimováni v poněkud snížené úrovni - asi 2-4 krát méně než IL-10. Exprese aminoterminální agonistové varianty N/\7 byla srovnatelná s IL-10 zatímco N/\10 varianta byla exprimována v úrovni asi čtyřikrát nižší než IL-10. Exprese variant N/\ll a N/\12 byla příliš nízká na to, aby byla detegována touto metodou.

Analýzy ELISA

K další kvantifikaci hladin mutantních antagonistů lidského IL-10 v kondicionovaných médiích COS buněk se prováděla stanovení imunosorpční analýzou spojenou s enzymem (ELISA), v podstatě jak je popsáno Abramsem et al. [Immunol. Rev. 127: 5 (1992)]. Dvě monoklonální protilátky specifické pro různé epitopy lidského IL-10, označené 9D7 a 12G8. byly připraveny standardními metodami a použity jako zachycovací resp. detekční činidlo. Seriálně ředěná kondicionovaná media bylá testdvářTa v těchto stáno ven ích s-použit-ím—purif ikovaného^lidského^^I-L-lO^jako^standardm—Hranice“ detekce v tomto stanovení byla asi 1 ng/ml, a v kultivačních médiích po 72 hodinách inkubace byly typicky měřeny hladiny IL-10 v rozmezí 100 až 300 ng/ml.

Takto bylo nalezeno, že relativní hladiny IL-10 a antagonistů dobře korelují s výsledky získanými metabolickým značením, což napovídá, že epitopy rozeznávané použitými monoklonálními protilátkami nejsou v mutovaných oblastech.

V typickém stanovení byly pro lidský—IL-10, K157E,.... C/\3.______C/\4 ,__________

N/\7. ΝΔΙΟ, N/\ll resp. N/\12 hladiny exprese 133, 80, 63, 48,

139, 28, 23 resp. 6,5 ng/ml.

Biologické testy

Lidský IL-10 a reprezentativní IL-10 mutantní antagonisté byly zkoušeni na aktivitu s použitím myších žírných buněk a lidských periferních mononukleárních buněk (PBMC). ______________________________

Test na stimulaci žírných buněk byl prováděn v podstatě jak je popsán O'Garrou et al. (Int. Immunol. 2z 821 (1990)] a Thompson-Snipesem et al. [ď. Exp. Med. 173: 507 (1991)]. Ve stručnosti: Na 5 x 10³ MC/9 buněk (ATCC CRL 8306) na jamku ve _;100 μΐ testovacího média [RPMI-1640 obsahující 10 % fetálního bovinního séra (FBS), 50 μΜ β-merkaptoethanol, 2 mM glutamin a penicilin/streptomycin] v 96-jamkové mikrotitrační destičce se působilo po 48 hodin různým množstvím IL-10 nebo jednoho z IL-10 antagonistů. Pak se přidalo 25 mikrolitrů 5 mg/ml MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu] (Sigma, St. Louis, MO) do každé jamky a destička byla inkubována po 3 - 5 hodin. Buňky pak byly lyžovány s použitím 10 % SDS s 10 mM HCI a měřila se absorbance při 570 nm.

Lidský IL-10 a varianty N/\7. N/\l° a ^ΝΔΠ byly aktivní v tomto testu, ale žádná aktivita nebyla pozorována pro variant N/\12. Žádný z karboxyterminálně mutantních antagonistů nebyl aktivní, ani když se testoval v koncentraci až do 375 ng/ml (asi 100 násobek množství IL-10, jež vykazuje silnou aktivitu).

K měřeni jak IL-10 antagonisté inhibují syntézu cytokinú indukovanou lipopolysacharidem (LPS) byly získány lidské periferní mononukleární buňky (PBMC) od zdravých dárců a izolovány centrifugací na gradientu FICOLLu^R [Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl: 77 (1966)]. Alikvoty PBMC byly přeneseny do jamek (10⁵ buněk na jamku v 200 μΐ RPMI-1640 média obsahujícího 5 % FBS, penicilin/streptomycin, neesenciální kondicionovaného COS exprimujícím IL-10 resp. kontrolní kondicionované aminokyseliny, pyruvát sodný a 2 mM glutamin) 96-jamkových mikrot-itračniclr destičekv-------------- -------------------------- ----------------------Lidský XL-10 byl přidán do některých jamek v konstantní 100 pM koncentraci, s nebo bez 100-násobného molárního nadbytku (10 nM) IL-10 antagonisty (jak je změřeno pomocí ELISA). Potom okamžité následovalo přidání LPS (Sigma) do každé jamky na finální koncentraci 80 nglml. Pozitivní a negativní IL-10 kontroly byly inkubovány paralelně s použitím média buňkami transfekovánými vektorem plasmidem pSV.Sport. Poslední zmíněné médium se používalo k ředění všech vzorků. Všechna stanovení se prováděla v duplikátech a ověřovala se v následných testech, s použitím jiných šarží buněk.

Destičky byly inkubovány ve zvlhčované atmosféře 5 % CO₂ při 37°C po 24 hodin, po čemž se supernatantové kapaliny sebraly a uschovaly při -20°C k pozdější analýze. Hladiny IL-6, IL-la a TNFa byly v sebraných vzorcích měřeny s použitím souprav ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) podle instrukcí výrobce.

U všech antagonistů bylo nalezeno, že v tomto testu zvrátí inhibiční aktivitu IL-10 na syntézu cytokinů, jak ukazuje Tabulka 1.

Tabulka 1

	Procento	reziduální	aktivitv IL
Vzorek	IL-6	IL-la	TNF-a
Pufr	100	100	100
Protilátka	0	0	0
K157E	21	27	- · 51
C/\3	____________________________1 2 ___________	.,_________________________13	39
CA4	19	27	61

Inhibiční účinek lidského IL-10 na syntézu vyznačených cytokinů byl měřen v přítomnosti kontrolního pufru, saturačního množství neutralizující anti-IL-10 monoklonální protilátky, a 100 násobného molárního přebytku tří IL-10 antagonistů.

- 23 Podobné testy provedené s různými množstvími IL-10 “mutantních antagonistů v. nepřítomnosti IL-10 _ukázaly, že žádný z antagonistů nemá inhibiční aktivitu na syntézu cytokinů. Žádnou inhibiční aktivitu nebylo možné detegovat s žádným z antagonistů při koncentracích do 100 pM, včetně.

Ke zkoušení účinku IL-10 antagonistů na aktivitu T buněk byl prováděn test se smíšenou lymfocytovou odezvou (MLR, mixed lymphocyte response). Lidské PBMC byly izolovány jak je popsáno shora. Stimulátorové PBMC byly připraveny působením 50 mg/ml mitomycinu C (Sigma, St. Louis, MO) na tyto buňky po 20 minut při 37°C. .. - ____________. ·.________________________-_______ -- ---- ---- ------- ------------------Po 1 x 10® odpovídajících PMBC a stimulátorových buněk bylo smícháno v každé jamce 96-jamkové mikrotitrační destičky, spolu s různými množstvími lidského IL-10 nebo jednoho z K157E, C/\3 nebo C/\4 antagonistů, v celkovém objemu 200 μΐ (v triplikátech). Buňky byly inkubovány s 5 % C0₂ při 37’C po 6 dní, po čemž kultury dostaly puls 1 μϋί triciovaného thymidinu ([³H]-TdR; 15,6 Ci/mmol, NEN, Boston, MA) na jamku po 16 hodin. Lyzáty byly sebrány na filtr s použitím zařízení pro 96 jamek (Skatron, lne., Sterline, VA) a měřeny v β-počitači (Pharmacia LKB Nuclear lne., Gaithesburg, MD).

Bylo nalezeno, že antagonisté nemají schopnost inhibovat MLR při koncentraci 1 ng/ml. Naproti tomu, lidský IL-10 při této koncentraci 'vykazoval 8 2 % inhibice MLR.

Testy vazby k receptoru

Čištěný lidský IL-10 (asi z 99 % čistý) byl radiojódován metodou ENZYMOBEAD^R (Bio-Rad, Richmond, CA) podle instrukcí výrobce. Přibližně 4 χ 10⁵ transfekovaných COS buněk exprimujících cDNA lidského IL-10 receptoru bylo peletováno centrifugací při 200 x g po 10 minut, promyto ve vazebném pufru (PBS, 10 % fetálního bovinního séra, 0,1 % NaN₃) a resuspenďováno v 200 μΐ vazebného pufru obsahujícího [¹²⁵I]-lidský IL-10 (specifická radioaktivita 225 μCi/μg) v 150 pM koncentraci, se seriálně ředěným kondicionovaným médiem z COS buněk exprimujících cDNA kódující lidský IL-10 nebo jednoho z mutantních antagonistů

-----------podle .vynálezu.----------------------------------------------------------------------------Po inkubaci při 4’C po 2 hodiny byly buňky centrifugovány při 200 x g po 10 minut, každá buněčná peleta byla resuspendována v 100 μΐ vazebného pufru bez značeného IL-10, navrstvena nad

200 μϊ 10 % glycerolu ve vazebném pufru v prodloužených centrifugačních zkumavkách, centrifugována při 200 x g po 10 minut při 4’C a zkumavky rychle zamraženy v kapalném dusíku. Buněčné pelety pak byly odstřiženy do měřících zkumavek a měřeny v počítači CLINGAMMA^r 1272 (Pharmacia LKB). Nespecifická vazba byla stanovena provedením . vazby v přítomnosti 500 až 1000 násobného molárního přebytku neznačeného lidského IL-10.

Výsledky jsou ukázány v Tabulce 2, kde lze vidět, že všichni IL-10 antagonisté byly v kompetici vazby k receptorů skoro tak účinní jako IL-10 samotný.

Tabulka 2

Inhibice vazby radioaktivitně značeného IL-10’

Vzorek

IC (PM)

Lidský IL-10

K157E

C/\3

C/\4

100

136 + 65 17z 21 ^zo120 + 9

Ukázaná data, jež jsou průměry ze 2 nezávislých testu, jsou koncentrace neznačeného lidského IL-10 nebo uvedeného IL-10 antagonisty, které produkovaly 50 % inhibici vazby radioaktivně značeného IL-10 k buněčným receptorům.

- 25 Mnohé modifikace a obměny tohoto patentu se mohou provést bez odklonu od jeho ducha a rozsahu, jak bude zřejmé_těm, co jsou zběhlí v oboru. Konkrétní provedení popsaná zde jsou poskytnuta pouze cestou příkladů a vynález je omezen pouze podmínkami připojených nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY “O

ZO o

S C -< π

- & o O <

ΠΜ ze o

cn cO·

CD c? 3 cn ό ~

C/X eie*

S

1. Antagonista lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí jednoho nebo více aminokyselinovýchzbytků v oblasti obsahující 12 karboxyterminálních zbytků.
2. Antagonista podle nároku 1, u néj ž bylo z aminokonce deletováno 1 až 11 aminokyselinových zbytků.

3. Antagonista podle nároku 1, jenž má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III

Ser 1 Pro Gly Gin Gly 5 Thr Gin Ser Gly Asn Leu Pro 20 Asn Met Leu Arg Val Lys Thr 35 Phe Phe Gin Met Lys 40 Lys Glu 50 Ser Leu Leu Glu Asp 55 Phe Leu 65 Ser Glu Met Ile Gin 70 Phe Tyr Glu Asn Gin Asp Pro 85 Asp Ile Lys Asn Leu Lys Thr ί nn v v Leu Arg Leu Arg Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala 115 Lys 120 Asn Lys 130 Leu Gin Glu~ Gly- 135 Ile Ile 145 Phe Ile Asn Tyr Ile 150 Glu Ala

Glu Asn 10 Ser Cys Thr His Phe 15 Pro Asp 25 Leu Arg Asp Ala Phe 30 Ser Arg Asp Gin Leu Asp Asn ⁴⁵ Leu Leu Leu Lys Gly Tyr Leu 60 Gly Cys Gin Ala Leu Glu Glu 75 Val Met Pro Gin Ais. 80 Ala His 90 Val Asn Ser Leu Gly 95 Glu Leu 1 HR A w Arg Arg Cys His Arg 110 Phe Leu Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe 125 - ......- ···· ... Tyr Lys- -Ala- -Met- 140 Ser Glu Phe “ASP“ Tyr Met Thr Met Glu Ile Arg Asn

155

60 (I),

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 - 5 -10- _____________ ____ . 15 - Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala 65 70 75 80 Glu. Asn Gin. .Asp. Pro. Asp Ile Lys. Ala His Val Asn .Ser Leu. Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys 145 150 155 (II),

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gin Met Lys Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gin Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gin Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gin Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gin Val Lys Asn Ala Phe 115 -120 125 __________— - · ·-- - ----- ----, ----- . — -------- ___________ . Asn Lys Leu Gin Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met 145 150 155 (III) •

4. Nukleová kyselina kódující antagonistů lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo deleci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující 12 karboxyterminálních zbytků.
5. Nukleová kyselina podle nároku 4, kódující antagonistů lidského IL-10, u nějž bylo z aminokonce deletováno 1 až 11 aminokyselinových zbytků.

(
6. Nukleová kyselina podle nároku 4, kódující antagonistů lidského IL-10, který má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III, uvedenou v nároku 3.
7. Rekombinantní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 4, jenž je schopný řídit expresi této nukleové kyseliny.

Hostitelská buňka obsahující rekombinantní vektor podle
9. Způsob přípravy antagonisty lidského IL-10, zahrnujícího j ednoho nebo obsahující vyznačuj hostitelských nukleová kyselina exprimuje, maturní^lidský^IL^lO^modif ikovaný^=snáhradou“‘lysinového“zbytku’ v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo deleci více aminokyselinových zbytků v oblasti

12 karboxyterminálních zbytků, ící setím, že zahrnuje kultivaci buněk podle nároku 8 za podmínek, kdy se
10.
11.

Způsob podle—nároku 9, v y z n a č u j ící___________setím že nukleová kyselina kóduje antagonistů lidského IL-10, u nějž bylo z aminokonce deletováno 1 až 11 aminokyselinových zbytků.

Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje antagonistů lidského IL-10, který má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III, uvedenou v nároku 3.
12.

Způsob inhibice biologické vyznačující se tím buněk nesoucích receptory pro IL-10 aktivity že zahrnuje do kontaktu s množstvím antagonisty lidského IL-10, zahrnujícího lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytkem kyselé aminokyseliny nebo více aminokyselinových zbytků v v poloze 157 j ednoho nebo

IL-10, uvedení účinným maturní zbytku delecí oblasti obsahující 12 karboxyterminálních zbytků.
13.
14.

Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že u antagonisty bylo z aminokonce deletováno 1 až 11 aminokyselinových zbytků.

Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že antagonista má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III, uvedenou v nároku 3.

Agonista lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný delecí od jednoho do jedenácti z aminoterminálních aminokyselinových zbytků.

Antagonista podle nároku 15, u nějž bylo deletováno 7, 10 nebo 11 aminokyselinových zbytků.
15.
16.
17. Nukleová kyselina kódující agonistů lidského IL-10, který

.........zahrnuje ma turní.....lidský IL-10 modifikovaný delecí-od jednoho do jedenácti z aminoterminálních aminokyselinových zbytků.
18. Nukleová kyselina podle nároku 17, kódující agonistů lidského IL-10, u nějž bylo deletováno 7, 10 nebo 11 aminokyselinových zbytků.
19. Rekombinantní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle

nároku 17, kyseliny. jenž je schopný řídit expresi této nukleové 20. Hostitelská buňka obsahující rekombinantní vektor podle nároku 19. 21. Způsob přípravy agonisty lidského IL-10, zahrnuj ícího

maturní lidský IL-10 modifikovaný delecí od jednoho do jedenácti z aminoterminálních aminokyselinových zbytků, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 20 za podmínek, kdy se nukleová kyselina exprimuje.
22. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje agonistů lidského IL-10, u nějž bylo deletováno 7, 10 nebo 11 aminokyselinových zbytků.
23. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a účinné množství (a) agonisty lidského IL-10, zahrnujícího maturní lidský IL-10 modifikovaný delecí ód jednoho dó~ jedenácti “=—“—_z=—--_amx_not_ermináiních“—-aminokyselinových“-“—zbytkůr“==“neto© (b) antagonisty lidského IL-10, zahrnujícího maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku v poloze 157 zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v oblasti obsahující 12 karboxyterminálních zbytků.
24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačuj íc í s e t í_.m_.,_______že u _antagonisty bylo z aminokonce deletováno 1 až 11 aminokyselinových zbytků.
25. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačující se tím, že antagonista má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III, uvedenou v nároku 3.‘
26. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, vyznačuj í c í s e_____t í m , že antagonista má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí I, II nebo III, uvedenou v nároku 3.
27. Použití antagonisty lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí více aminokyselinových zbytků v oblasti 12 karboxyterminálních zbytků, ící s e tím, že se inhibuje v poloze 157 j ednoho nebo obsahující vyznačuj biologická aktivita IL-10.
28. Použití antagonisty lidského IL-10, který zahrnuje maturní lidský IL-10 modifikovaný náhradou lysinového zbytku zbytkem kyselé aminokyseliny nebo delecí více aminokyselinových zbytků v oblasti 12 karboxyterminálních zbytků, ící se tím, že se vyrobí medikament v poloze 157 jednoho nebo obsahující vyznačuj pro inhibici biologické aktivity IL-10.