HUT65789A - Process for producing pharmaceutical compisitions for minimizing containing ischemic and reperfuzion injury - Google Patents

Description

A találmány ismert tripeptid csoport arginin származékainak felfedezésére vonatkozik, amelyek ischaemiás és reperfúziós szöveti károsodás minimalizálására, vagy megszüntetésére alkalmasak. Az eljárás főként a kifejlődő szívinfarktus és reperfúzió okozta ischaemiás károsodás megszüntetésére és így a szív védelmére szolgál.

Ischaemia, azaz helyi vértelenség akkor lép fel, mikor egy adott sejtcsoporthoz áramló vér nem elegendő a normál anyagcsere tevékenység ellátására. Ha ez az állapot tartósan fönnáll, az ischaemiás zóna sejtjei elhalnak. A reperfúzió meghatározás az ischaemiás szövetekben történő véráramlás helyreállításának műveletét jelenti. Ennélfogva a reperfúzió elengedhetetlen az ischaemiás terület sejtjeinek életben maradásához. Mindamellett jól ismert, hogy a reperfúzió maga sok, az ischaemiás történést túlélt sejtben helyrehozhatatlan károsodást okoz. Ezért az ischaemiás, vagy reperfúziós károsodás minimalizálására, vagy megszüntetésére alkalmas vegyületek igen nagy jelentőségűek. Ezek a hatóanyagok gyógyszerek vagy gyógyszerkészítmények formájában kerülnek alkalmazásra az ilyen jellegű megbetegedésben szenvedő pacienseknél.

A reperfúziós károsodás főként gyulladásos folyamatok következménye. A reperfúziónak kitett ischaemiás szövetek vonzzák a proteolitikus enzimeket és oxidánsokat termelő fehérvérsejteket, amelynek következtében a gyulladás tovább fokozódik, minek következménye a teljes gyógyulás és hegesedés. Mivel a fehérvérsejtek által szállított proteolitikus enzimek és oxidánsok nem szelektívek, leépítik az egészséges és reverzibilisen sérült szöveteket is. A reperfúziós sérülés minimalizálásának vagy megszüntetésének problémájához mindezek alapján logikusan úgy közelíthetünk, hogy a gyulladás okát szüntetjük meg, vagy gátoljuk a gyulladásért leginkább felelős kóroki tényezőket.

A szívizom infarktus kialakulása során a szívizom vérellátása elégtelenné válik a normális anyagcsere tevékenység ellátásához, amelyet jellegzetesen a szív koszorús ereinek elzáródása okoz. A szív állandó, viszonylag nagyfokú anyagcsere tevékenysége miatt a szívizom infarktus kialakulása valószínűleg a leggyakoribb és legkomolyabb fellépő reperfúziós sérülés, ezt mutatja és a szív koszorúér elzáródás csökkentésére kidolgozott és akalmazott sokféle terápia is.

Számos gyógyászati célú beavatkozás, mint például az érplasztika, bypass sebészet és a thrombolyticus beavatkozások esetében, sor kerül az elzáródott szív koszorús ereinek újra átjárhatóvá tételére és ez a szívizom reperfúziós sérüléshez vezet. Ez a jelenség kerül ismertetésre a Lucchesi et al.: 'Fehérvérsejtek és ischaemia okozta szívizom sérülés' Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol. 36: 159-163 (1985), valamint az Engler, R. L.: Ά szívizom ischaemia és reperfúzió során fellépő szabad gyökök és granulocyták által közvetített sérülés' Am. J. Cardiol. 63: 19E-23E (1989) irodalmi helyeken.

Miután a szív koszorús ereinek elzáródása és reperfúziója okozta kiterjedt szívizom infarktus esetében fehérvérsejt felfrissítésre kerül sor, logikus megoldásnak látszik neutrofil fehérvérsejtek számát csökkentő beavatkozás végrehajtása a szív izom infarktus hatásainak minimalizálására és megszűntetésére. Ez a neutrofil beavatkozás neutropénia indukciót, anti-adhéziós monoclonalis antitest molekulák és oxidáns tisztítók alkalmazását jelenti.

Erre vonatkozik a Romson et alKitérjedt ischaemiás szívizom sérülések csökkentése neutrofil fehérvérsejtek eltávolításával kutyákban' Circulation 67: 1016-1023 (1983); a Mullane et al.: 'Fehérvérsejtek szerepe heveny szívizom infarktus esetén altatott kutyákban: Gyulladás ellenes gyógyszerek szerepe a szívizom megmentésében' J. Pharmacol. Exp. Ther. 228: 510-522 (1984); a Mitsos et al.:'Az Ν-2-merkapto-propionil glicin védő hatásai szívizom reperfúziós sérüléssel szemben neutrofil fehérvérsejtek kiürítést követően kutyákban: Sejten kívüli szabadgyökök szerepének bizonyítéka' Circulation 73: 1077-1086 (1986); a Mitsos et al.:'Kutyák szívizmának reperfúziós sérülései: Szívizom védelem Ν-2-merkapto-propionil glicin szabadgyök tisztító anyaggal' J. Cardiovasc. Pharmacol. 8: 978-988 (1986); a Jolly et al.:'Kutyák szívizmának reperfúziós sérülései: A sérülés szuperoxid diszmutáz és szuperoxid kataláz kombinált adagolásával történő csökkentése' Circ. Rés. 54: 277-285 (1984); a Simpson et al.:'Kutyák szívizmának ischaemiás és reperfúziós kísérleti sérülésének csökkentése monoclonális test (Anti-Mol) segítségével, amelyek a fehérvérsejt adhéziót gátolják' Circulation 76: A0799 (1987); valamint Jolly et al.:'Szívizom infarktus mértékének csökkentése neutrophil fehérvérsejtek eltávolításával: Az elzáródás időtartamának hatása' Am. Heart J. 112: 682-690 (1986).

Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy egy adott fehérjeműködést gátló hatású, önmagában ismert vegyületcsoport alkalmas az ischaemia és a reperfúzió által okozott szöveti károsodás megszüntetésére, illetve minimálisra csökkentésére. A találmány szerinti vegyületek különösen a szívizom infarktus és a reperfúzió során a szívet ért káros hatások minimálisra csökkentését célzó új eljárásban alkalmazhatók eredményesen.

A találmány szerinti, reperfúziós sérülés megszüntetésére és minimalizálására szolgáló eljárás során valamennyi kezelésre szoruló emlősnek az 1 általános képletű vegyületet adjuk be nem toxikus hatásos mennyiségben, mely képletben

A jelentése 1 vagy 2R1 R2--R3R4 vagy'Ró és az A királis központi atomja DL, előnyösen D, a Pro esetében L, valamint az Arg esetében L;

Z csoport jelentése Cl - C4 szénatomos alkil csoport vagy hidrogénatom;

X csoport jeletése NH2, NHZ, t-butiloxi-karbonil-NH, acetil-NH vagy trifluor-acetil-NH;

R csoport jelentése hidrogénatom, OH csoport, halogénatom, C1-C4 alkoxi csoport, CF3, C1-C4 alkilcsoport, N02 vagy NH2 csoport, valamint q jelentése CH2 vagy CO csoport.

A jelen találmány szerinti eljárásban felhasználásra kerülő vegyületek a technika állásából általánosan ismertek. A 4 703 036 lajstromszámú amarikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az EP-A-0 479 489 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentésben, továbbá a Bajusz et al.: 'Nagy aktivitású és szelektív véralvadásgátlók: D-Phe-Pro-Arg-H, valamely spontán inaktiválásra alkalmas szabad tripeptid aldehid Prone gyök és annak stabil N-metil származéka, D-metil-fenil-Pro-Arg-H' J. Med. Chem. 33:

1729-1735 (1990) irodalmi helyen ismertetésre kerül.

A prolin és arginin gyökök 'a' szénatomjai L konfigurációban helyezkednek el, az A szubsztituens 'a' szénatomja pedig DL, előnyösen pedig D konfigurációjú.

Az 1 általános képletű vegyületek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói szintén alkalmasak készítmények és gyógyszerek előállítására instant módon, ideértve azok szervetlen vagy szerves savakkal képzett savaddíciós sóit is. A sóképzésre alkalmas szervetlen savak közül a hidrogén-halogenideket, elsősorban a hidrogénkloridot és a hidrogénbromidot, valamint a foszforsavat és a kénsavat említjük. Karbonsav sókat olyan savak hozzáadásával állítunk elő, mint például az ecetsav, propionsav, malonsav, malénsav, citromsav, borostyákősav, almasav, benzoesav, fumársav és ehhez hasonló szerves savak. A savaddíciós sókat hagyományos módon, így például az 1 általános képletű vegyület szabad bázis formájának savval történő reagáltatásával állítjuk elő. A savaddíciós sók közül a szulfátok és a hidrogénkloriddal képzett sók előnyösek.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben említett gyógyászati eljárás során felhasznált gyógyszerészeti készítmények is.

A találmány szerinti készítmények az 1 általános képletű vegyület reperfúziós sérülés minimálisra csökkentéséhez szükséges hatásos mennyiségét és valamely gyógyszerészetileg elfogadott hordozóanyagot tartalmaznak. A szájon át adható készítmények esetében az 1 általános képletű vegyület zselatin kapszulákban vagy tabletták formájában kerülhet kiszerelésre, melyek gyógyszerészetileg elfogadott egyéb összetevőket, mint például kötő anyagokat, síkosító szereket, porlasztó anyagokat és ehhez hasonlókat tartalmaznak. A vegyületek kiszerelhetők hosszantartó hatású készítmények alakjában is. így például a vegyület valamely hidrogél mátrix formájában is kiszerelhető, amely a hatóanyag leadását különböző hosszúságú ideig teszi lehetővé. A parenterális (gyomor-bélrendszert elkerülő) adagolás céljaira a vegyület kiszerelhető valamely gyógyszerészetileg elfogadható hígítószerben, így például fiziológiás sóoldatban (0.9 tömeg%), 5 tömeg %os dextrózban, Ringer oldatban és ehhez hasonlókban.

Az 1 általános képletű vegyületek az önmagában jól ismert fehérje kapcsolási eljárással állíthatók elő, amely többek között a Dugas and Penny, Bioorganic Chemistry 13-82 (1981) irodalmi helyen is ismertetésre kerül. E szerint az eljárás szerint az ACOOH savat, amely képletében A jelentése azonos az 1 képlet esetében megadottakkal, kapcsoljuk egy karboxi csoporttal védett prolinnal, amelynek eredményeként egy dipeptidet (amennyiben A jelentése aminosav) vagy egy N-acil-prolin észtert (amennyiben A jelentése amino csoporttól eltérő) kapunk. A termék prolin gyökének karboxivédő észter csoportját eltávolítjuk és a szabad dipeptid savat az arginin laktám formájával kapcsoljuk. Ezt az említett reakciósort szemléltei a mellékelt I. reakcivázlat, ahol P jelentése valamely aminovédő csoport.

A reakciósor harmadik lépésében kapott (c)-vel jelölt Arg(P) laktám terméket valamely inért oldószerben litium-aluminiumhidráttal redukáljuk ily módon hasítva a laktám gyűrűt és A(C=O)-Pro-Arg(P)-H képlettel leírható arginin-aldehid formájú tripeptidet hozva létre, ez utóbbi képletben Arg(P)-H csoport aminovédő csoportot tartalmazó arginin-aldehidet jelent.

A laktam formájú aldehidet, védett aminocsoportot tartalmazó argininek (Arg-OH) intramolekuláris összekapcsolásával állítunk elő. Például a 2 általános képlettel szemléltetett Boc-Arg(Cbz)OH vegyületet, ahol Boc jelentése T-butiloxi-karbonil csoport és Cbz jelentése benziloxi-karbonil csoport, először aktív észterré alakítjuk, így például kloroformát észterrel, például etilkloroformáttal vagy izobutil-kloroformáttal kevert aktív anhidriddé alakítjuk. Az észter előállítását tercier-amin, így például N-metil-morfolin, jelenlétében hajtjuk végre. Erősebb tercier-amin bázis, mint például trietil-amin hatására belső acilezés megy végbe és a 3 általános képletű két aminovédő csoportot tartalmazó laktám vegyületet eredményez. A fent említett I. reakciósorral szemléltetett A(C=O)-Pro-OH vegyülettel végrehajtott kapcsolási reakciót megelőzően a Boc védőcsoportot trifluor-acetáttal szelektív módon eltávolítjuk és szabad aminocsoportokat alakítunk ki.

Az ACOOH általános képletű vegyület, amelyben A jelentése aminosav gyök, prolin észterrel történő összekapcsolása során első lépésben az aminosav aminocsoportjához védőcsoportot kapcsolunk. Aminovédő csoportként hagyományos, általánosan használt aminovédő csoportot alkalmazunk az aminocsoport időszakos védelmére, vagy blokkolására. Ezek közé a védőcsoportok közé tartoznak például az alkoxi, az alkeniloxi, a cikloalkoxi és ariloxi-karbonil csoportok, így az etoxikarbonil, a t-butiloxi-karbonil, ciklohexiloxikarbonil, adamantiloxi-karbonil, triklór-etoxi-karbonil, benziloxi-karbonil, difenil-metoxi-karbonil és ehhez hasonló csoportok.

A kapcsolási reakció során a prolin karboxi csoportja védelmére észter csoportot alkalmazunk, amely lehet bármely, általánosan használt észtercsoport, így például t-butil, benzil, p-nitrobenzil, p-metoxibenzil, difenil-metil, triklór-etil, fenacil vagy trialkil-szilil észter. A kapcsolási reakció végrehajtása során a prolin karboxi csoportjának védelmére csak olyan észtercsoport alkalmazható, amelynek eltávolításához szükséges reakciókörülmények között a védett csoport sértetlen marad. Ily módon az acilezett A-COOH sav aminovédő csoportja a helyén marad az aminocsoport védelmére miközben összekapcsoljuk azt az arginin laktám vegyülettel az A-(C=0)-Pro-arg(P)laktám vegyületet állítva elő.

A fentiekben ismertetésre került kapcsolási reakciókat alacsony hőmérsékleten, előnyösen -20 °C és 15 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A kapcsolási reakciókat olyan inért szerves oldószerben végezzük, mint például dimetil-formamid, dimetilacetamid, tetrahidrofurán, metilénklorid, kloroform és ehhez hasonló átalánosan használt oldószerek. A kapcsolási reakciók során általában vízmentes körülmémyek között dolgozunk, az acilező sav aktív észterét alkalmazva.

A találmány szerinti vegyületeket előnyösen savaddíciós sók formájában választjuk el. Az 1. általános képletű vegyületek sói, amelyeket a fentiekben említett savakkal képzünk, gyógyszerészetileg elfogadott sók, melyek reperfúziós sérülések minimalizálására szolgáló hatóanyagok és kiindulási anyagai ezeket a hatóanyagokat tartalmazó készítményeknek. Egyéb savaddíciós sók is előállíthatok, melyek fehérjék tisztítására és elválasztására • · * *

- 10 szolgálnak. Például a szulfonsawal képzett sók, mint például a metaszulfonsav, n-butánszulfonsav, p-toluolszulfonsav és a naftalinszulfonsav, használhatóak e célra.

Az 1. általános képletű vegyületek elválasztására és tisztítására szolgáló eljárások a kívánt stabilitású sók előállítási eljárásával együtt, a technika állásából jól ismertek. Ezen eljárások egyike szerint a stabil szervetlen sók, értve ezalatt szulfát és hidroklorid sókat, C18 ellenfázisú kromatográfiás úton kerülnek tisztításra. A vizes fázis körülbelül 0.01 tömeg % és 0.05 tömeg % közötti koncentrációban tartalmaz kénsavat vagy sósavat, továbbá szerves komponensként acetonitrilt, tetrahidrofuránt, metanolt vagy egyéb megfelelő oldószert. A savas eluens pH értékét körülbelül pH 4 és pH 6 értékek közé állítjuk be. A pontos pH érték a fehérje és a lúgos hidroxil formájú gyanta (pl. Bio-Rad AG-1X8) típusának függvénye. A tripeptid só, így például szulfát vagy hidroklorid, oldata pH értékének beállítását követően liofilizáljuk azt, ily módon a tisztított sót száraz por alakjában nyerjük ki.

A jelen találmány szerinti leginkább előnyös 1. általános képletű vegyületek közül főként az alábbiak kerülnek alkalmazásra:

1. számú vegyület: D-3-Piq-L-Prolil-L-Arginal (szulfát só), Id.

4. képlet;

2. számú vegyület: D-7-hidroxil-1,2,3,4-Tiq-3-karboniloxi-LProlil-L-Arginal (dihidroklorid só) ld. 5. képlet;

3. számú vegyület: D-3-Tiq-L-Prolil-L-Arginal (szulfát só) ld.

6. képlet;

4. számú vegyület: D-1,2,3,4-Tiq-l-karbonil-L-Prolil-L-Arginal (só) ld. 7. képlet;

5. számú vegyület: N-metil-D-Fenilalanil-L-Prolil-Arginal (só) ld. 8. képlet;

6. számú vegyület:

Na-t-butiloxikarbonil-D-Fenilalanil-L-Prolil-L-Arginal (só) ld.

9. képlet.

A jelen találmány gyakorlati megvalósítása során az 1 általános képletű vegyületet emlősöknek adjuk be oly módon, hogy a vegyület hatásos koncentrációban legyen jelen a véráramban körülbelül abban az időben, amikor a . megfelelő véráramlás az ischaemiás zóna sejtjeiben helyreállításra kerül. Az eljárás szerint előnyösen a véráramban akkor van hatásos mennyiségű vegyület jelen, amikor megfelelő véráramlás helyreállításra kerül a ischaemiás területen. Mindamellett az, hogy az ischaemiás terület újraáramoltatását, reperfuzióját követően kell, hogy a találmány szerinti vegyület mennyisége a vérben megfelelő szintet érjen el, összhangban van az instant eljárással is.

A gyógyhatású vegyület beadagolható szájon át, parenteralisan, például intravénás infúzióval vagy injekcióval vagy injekció és intravénás infúzió kombinált alkalmazásával, intramuscularisan vagy bőr alá. Előnyösen a hatóanyag beadását intravénás infúzióval végezzük. A találmány szerinti vegyület vérbeni hatásos koncentráció szintjét a reperfúziót követően legalább egy napig fenn kell tartani a vegyület viszonylagos potenciáljától és a károsodott ischaemiás zóna méretétől függően.

A vegyület tényleges dózisa körülbelül 5 mg és 1000 mg közötti tartományba esik, és az adagolás mennyisége a választott • · I· · * · · · « · · • · · · ·· ·· • · · · · ·

- 12 - .......

adagolási mód függvényében változik. Jóval azelőtt, hogy az ischaemiás szövetekben a véráramlás helyreállításra kerül meg kell kezdeni a vegyület szájon át, intramuscularisan vagy bőr alá történő adagolását, hogy megfelelő koncentrációt érjen el a keringő vérben.

A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módja szerint az alkalmazott infúzió mennyisége 1 és 10 óra közötti időtartamon keresztül körülbelül 0,2 - 5,0 mg/kg/óra. Az 1 és 10 óra közötti időtartamon keresztül alkalmazott infúzió mennyiség legelőnyösebben 0,5 - 2,0 mg/kg/óra közötti. Egy érelzáródást okozó vérrög hatására bekövetkező szívizom infarktus esetében a találmány szerinti vegyület a vérrög oldását célzó kezeléssel egyidejűleg vagy közvetlenül azt követően kerülhet beadásra.

A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja szerint az 1 általános képletű vegyület valamely oxidáns vegyülettel együttesen kerül adagolásra. A találmány oltalmi körének korlátozása nélkül az oxidáns vegyületek közül példaként a szuperoxid dismutázt és az N-merkapto-propionil-glicint említjük. Annak érdekében, hogy jelen leírásban egyértelmű legyen, együttes adagolás” fogalma alatt azt értjük, hogy röviddel az 1 általános képletű vegyület szervezetbe juttatása előtt vagy azt követően alkalmazzuk azt. Az együttes adagolás egyúttal azt is jelenti, hogy az adott gyógyszer hatásos mennyiségben van jelen a vérben az 1 általános képletű vegyület hatásos mennyiségével egyidejűleg.

A jelen találmány szerinti megoldás egy újabb megvalósítási módja szerint az 1 áltaános képletű vegyületet a béta receptor blokkoló készítményekkel együtt adagoljuk be. Anélkül, hogy a találmány oltalmi körét valamiképpen is korlátoznánk a béta blokkoló vegyületek közül példaként említjük a propranololt, a metoprolol és az atenololt.

A találmány egy másik megvalósítási módja értelmében az 1 általános képletű vegyületet aszpirinnel együtt juttatjuk a szervezetbe. A találmány magában foglalja továbbá az 1 általános képletű vegyület oxidáns, béta blokkoló vegyület vagy aszpirin valamely kombinációjával együttesen történő adagolását is.

Az alábbi kiviteli példák a találmány tárgyát képező megoldás gyakorlati megvalósítását segítik és szemléltetik a szabadalmi igénypontokban megfogalmazott eljárásból adódó előnyöket. A kiviteli példák semmi esetre sem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását.

A kiviteli példákban használt rövidítések jelentését az alábbiakban foglaljuk össze:

Aminosavak: Arg = arginin, Pro = proline

Boc = t-butiloxi-karbonil

Bzl = benzil

Cbz - benziloxi-karbonil

DCC = diciklohexil-karbodiimide

DMF = dimetil-formamid

DMSO = dimetil-szulfoxid

FAB-MS = fást atom bombardment mass spectrum

FD-MS = field desorption mass spectrum

THF = tetrahidrofurán

TLC = vékonyréteg kromatográfia (thin Layer chromatography)

Tiq = tetrahidro-izokinolin • · < ♦ · · ·♦* · ·· ·« · · · · · ·· · ·· ··

D-l-Tiq = D-l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-karbonsav

D-3-Tiq = D-l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karbonsav

D-3-Piq = D-1,2,3,4,5,6,7,8-perhidro-izokinolin-3-karbonsav Arg-H = arginal (Id. 10. képlet).

A kiviteli példákban szereplő vékonyréteg kromatográfiás méréssel szilikagélen (Kieselgel 60 F-254) meghatározott Rf értékeket az alábbi rendszerek felhasználásával mértük:

(A) Kloroform-metanol-ecetsav 135:15:1 (B) Etilacetát-ecetsav- absz. alkohol 90:10:10 (C) Kloroform-metanol-ecetsav 90:30:5

Kiviteli példák

1. Példa

D-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-1-karbonil-L-prolii-L-arginal

DL-1,2,3,4-tetrahidro-1-izokinolin-karbonsav (1)

12,5 g (0,072 mól) 1-izokinolin-ecetsavból és 185 ml jégecetbol oldatot készítettünk, amelyet 2 g platinium-oxid katalizátor felhasználásával 24 órán keresztül 4.138x105 psi nyomáson Parr-féle rázóedényben hidrogénnel reagáltattunk. A reakcióelegyet celit tölteten át szűrtük és a szűrletet vákumban betöményitettük. A kapott szilárd anyagot víz hozzáadásával porrá zúztuk, majd szűrtük, végül szárítottuk, ily módon 8 g címbeli vegyületet kaptunk, amely 63 %-os kitermelésnek felel meg. FD-MS 178 ·* **·» ·· «· * · * < · · · ··» * ♦· ·» * * · · · · - 15 - .......

(ΜΗ+); 1NMR (DMSO) d 2.80-3.00 (m,3H), 3.10-3.20 (m, 1H) , 3.303.40 (m,2H), 7.05-7.25 (m,4H), 7.65-7.75 (m, 1H) .

t-Butiloxicarbonil-DL-1,2,3,4-terahidro-l-izokinolinkarbonsav DCHA (2)

7,08 g (0,040 mól) (l)-el jelzett DL-1,2,3,4-tetrahidro-1-izokinolin-karbonsavat 40 ml (0,080 mól) 2 N-os NaOH oldatban és 40 ml t-butil-alkoholban oldottunk. Ezt követően 10,5 g (0,048) di-terc-butil-dikarbonátot adtunk a reakcióelegyhez. 24 óra elteltével a t-butil alkohol nagy részét szobahőmérsékleten elpárologtattuk, majd a maradék vizes oldatot dietil-éterrel egyszer extraháltuk. A vizes fázist elválasztottuk, majd 2 N-os sósavval 2,0 pH érték eléréséig savanyítottuk és etil-acetáttal extraháltuk. A szerves oldatot magnézium-szulfáton szárítottuk, és vákuum segítségével a teljes száradásig töményítettük. Az eljárás eredményeként kapott olajat dietil-éterben oldottuk, ezt követően 7,9 ml (0,04 mól) diciklohexil-amint adtunk az oldathoz. Az elegyet 4 órán keresztül 4 °C-on állni hagytuk, a’kivált csapadékot leszűrtük, dietil-éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk, ily módon 15,7 g tiszta terméket állítva elő, amely 86 %-os kitermelésnek felel meg. FD-MS 459 (MH+); Az C27H42N2O4 esetében analitikilag számított : C, 70.71; H, 9.23; N, 6.11. Talált: C, 71.07; H, 9.37; N, 5.87.

Boc-D-1-Tiq-Pro-OH (3)

73,4 g (160 mmol) (2)-vei jelzett Boc-DL-1-Tiq-ODCHA-t

200 ml etil-acetátban szuszpendáltattunk, 1.5 N-os citromsavval, majd vízzel mostuk és magnézium-szulfát fölött szárítottuk. Az etil-acetátot vákuum segítségével eltávolítva a teljes száradásig töményítettük az oldatot. A így kapott olajat etil-acetátban oldottuk, 0 °C-ra hűtöttük, ezt követően 31,6 g (160 mmol)

2,4,5-triklór-fenolt, 33 g (160 mmol) DCC-t adtunk hozzá. A reakciókeveréket 1 órán keresztül, 0 °C-os hőmérsékleten kevertettük, majd szobahőmérsékletre melegítettük és további 1,5 órán át kevertettük. A reakciókeveréket 0 °C-ra hűtöttük és a kiváló csapadékot szűrtük. Az anyalúgot vákuum segítségével a teljes száradásig töményítettük. A kapott olajat 100 ml piridinben oldottuk. Ezt követően 18,42 g (160 mmol) prolint és 22,3 ml (160 mmol) trietil-amint adtunk a reakcióelegyhez. 24 óra elteltével szobahőmérsékleten az oldószert vákuum segítségével eltávolítottuk. A kapott maradékot etil-acetát/víz elegyben oldottuk és az oldat pH értékét 2 N-os NaOH-al 9,5-re állítottuk be. A vizes fázist ezután etil-acetáttal extraháltuk. A szerves oldatot magnézium-szulfáton szárítottuk és vákuum segítségével száradásig betöményítettük. A kapott olajat metil-kloridban és etil-acetátban oldottuk. Az oldatot 4 órán keresztül 4°C-os hőmérsékleten állni hagytuk, a kivált csapadékot szűrtük, etilacetáttal mostuk, majd metilén-klorid/etil-acetát elegyből egyszer átkristályosítottuk. Vákuumos szárítással 19,6 g tiszta terméket kaptunk, amely 33%-os kitermelésnek felel meg. TLC Rf (A) 0.44; FAB-MS 375 (MH+); Az C20H26N2O5 esetében analitikilag számított : C, 64.15; H, 7.00; N, 7.48. Talált: C, 63.26; H, 6.98; N, 7.52; [a]D = + 43.14 °C; C = 0.5 MeOH.

Boc-Arg(CBZ)-OH (4)

82,1 g (250 mmol) Boc-Arg(HCL)-OH vegyületet 240 ml 5 N-os NaOH-ban oldottuk 3 nyakú R. B. lombikban. A reakcióelegyet -5 °C-ra hűtöttük és annak pH-ját 13,2 és 13,5 közötti értéken tartottuk 250 ml 5 N-os NaOH felhasználásával, miközben 143 ml (1,0 mól, 4 eqvivalens) benzil-kloroformátot csepegtettünk hozzá 55 perc alatt. A reakcióelegyet további 1 órán át -5°C-on kevertettük. Ezt követően 100 ml vízzel és 500 ml dietil-éterrel hígítottuk. A vizes fázist elválasztottuk, majd kétszer egymás után 500 ml dietil-éterrel extraháltuk. A vizes fázist 560 ml 3 N-os kénsavoldattal pH 3.0 kémhatásúra savanyítottuk, majd 550 ml etil-acetáttal extraháltuk. A vizes fázist elválasztottuk, majd etilacetáttal egyszer extraháltuk. Az összetett szerves fázist vízzel mostuk, majd magnézium-szulfáton szárítottuk. A szerves fázisokat vákuum segítségével teljes száradásig töményítettük. Az eljárás eredményeként 66.1 g címben megadott vegyületet kaptunk, mely 65 %-os kitermelésnek felel meg. TLC Rf (C) 0.43;

FD-MS 408	(M+)	; 1NMR (CDCL3)	d 1.42 (s, 9H), 1.61-1.	.91	(m, 4H)
3.23-3.41	(m,	2H), 4.17 (d,	1H) , 5.21 (s, 2H) , 5.62	(d,	1H) ,
7.30-7.42	(m,	6H) , 8.37 (m,	1H) .

Boc-Arg(Z)-Lactam (5)

66,0 g (0,162 mól) (4)-el jelzett Boc-Arg(Z)-OH vegyületet

230 ml száraz THF-ben oldottunk, majd az oldatot jeges aceton fürdőben -10 °C-ra hűtöttük le. Az elegyhez ezt követően 32,5 ml ·· ···· «· „ • · ♦ * · · * . · ί · · · · ·· · ·· .· (1,05 ekvivalens) trietil-amint és 22,5 ml (1,05 ekvivalens) izobutil-kloroformátot adtunk. A reakció elegyet 5 percen át -10 °C-os hőmérsékleten kevertettük, majd 18,7 ml (1,05 ekvivalens) N-metil-morfolint adtunk hozzá. A reakció keveréket ezután 1 órán keresztül -10 °C-on, majd további 1 órán át szobahőmérsékleten kevertettük. A reakció elegyet 1 liter jeges vízre öntöttük és az ily módon kapott csapadékot leszűrtük, hideg vízzel mostuk és vákuumban szárítottuk. A terméket etil-acetátból átkristályosítottuk és 38,05 g címbeli terméket kaptunk, amely az elméleti kitermelésnek 60 %-a. TLC Rf (A) 0.77; FD-MS 391 (MH+); 1NMR (CDCL3) d 1.48 (s, 9H) , 1.78-1.98 (m, 2H), 2.50 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 4.43 (m, 1H) , 4.90 (m, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.27 (m, 1H), 7.28-7.45 (m, 6H), 9.41 (m, 1H), 9.68 (m, 1H).

TFA.Arg(Z)-Laktam (6)

200 ml trifluor ecetsav és 20 ml anizol elegyét tartalmazó

R.B. lombikba 38,0 g (0.097 mól) (5)-el jelölt Boc-Arg(Z)-Laktámot adagoltunk. A reakcióelegyet 0 °C -on egy órán keresztül kevertettük. A reakcióelegyet ezt követően melegítés nélkül, vákuumban betöményítettük. A kapott anyaghoz 400 ml dietil-étert öntöttünk és a szilárd anyagot leszűrtük, majd dietil-éterrel mostuk és vákuumban szárítottuk. Az eljárás eredményeként

40,5 g cím szerinti vegyületet kaptunk, amely a számított mennyiségnek 103 %-a. TLC Rf (C) 0.29; FD-MS 291 (MH+).

Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-Lactam (7)

Az 1-es számú lombikba 17,8 g (47.5 mmol) (3)-al jelzett Boc-D-l-Tiq-Pro vegyületet 100 ml DMF-ben oldottunk és -15 °C-ra hűtöttünk. 5,3 ml (52,3 mmol) N-metil-morfolint adtunk hozzá, amelyet 6,2 ml (47,5 mmol) izobutil-klórformát hozzáadása követett. A reakcióelegyet 2 percig -15 °C-on kevertettük. A 2-es számú lombikba 19,2 g (47,5 mmol) (6)-al jelzett TFA.Arg(Z)-Lactam vegyületet 40 ml DMF-ben oldottunk, majd az oldatot 0 °C-ra hűtöttük. Az oldathoz 5,3 ml (52,3 mmol) N-metil-morfolint adtunk. A 0 °C-os reakciókeveréket 2 percig kevertettük.

A 2-es számú lombik tartalmát az 1-es számú lombikba töltöttük és az így kapott elegyet -15 °C-on 4 órán keresztül kevertettük. A reakcióelegyet hagytuk egy éjszakán át lassan szobahőmérsékletre melegedni, majd 5 ml 5 tömeg%-os NaHCO3 oldatot adtunk hozzá. Az oldószert vákuum segítségével eltávolítottuk, majd a kapott olaj szerű anyagból, 175 ml etil-acetátból és 150 ml vízből oldatot készítettünk. A elváló szerves fázist elkülönítettük, majd egymást követően 5 tömeg%-os NaHCO3 oldattal, vízzel, 0,1 N-os sósav oldattal és ismételten vízzel mostuk. A kapott szerves oldatot magnézium-szulfáton szárítottuk és végül vákuum segítségével száradásig töményítettük. Az eljárás eredményeként

24,3 g amorf, szilárd halmazállapotú, cím szerinti vegyületet kaptunk, amely a számított mennyiségnek 79%-a.

TLC Rf (A) 0.71; FAB-MS 647 (MH+); [a]D = - 32.8 °C = 0.5 CHC13.

Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H (8)

23,4 g (36,2 mmol) (7)-el jelzett Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)

Lactam vegyületet 300 ml száraz THF-ben oldottunk, majd az oldatot R.B. lombikban nitrogén atmoszférába helyeztük. A reakcióelegyet ezt követően -70 °C-ra hűtöttük. 1 mól 37 ml (37 mmol) THFben oldott lítium-aluminium-hidridet csöpögtettünk az elegybe, amely mintegy 30 percet vett igénybe. A reakciőelegyet ezt követően -70 °C-os hőmérsékleten 30 percig kevertettük. A reakciókeverékhez 20 ml THF-ból és 20 ml 0,5 N-os kénsavból álló oldatot csepegtettünk hozzá 10 percen keresztül. A reakciőelegyet ezután 400 ml vízben oldott 400 ml etil-acetáttal hígítottuk. Az etil-acetátos szerves fázist elválasztottuk, mad 2 ízben 150 ml vízzel mostuk. A szerves oldatot magnézium-szulfáton szárítottuk és végül vákuum segítségével száradásig töményítettük. Az eljárás eredményeként 21 g amorf, szilárd halmazállapotú, cím szerinti vegyületet kaptunk, amely a számított mennyiségnek 89 %-a. TLC Rf (A) 0.28.

D-l-Tiq-Pro-Arg-H szulfát (9)

18,1 g (27.9 mmol) (8)-al jelzett Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg(Z)-H vegyületet 200 ml THF és 80 ml víz elegyében oldottunk. A reakcióelegyhez 28 ml 1 N-os kénsav oldatot és 3,0 g 5 tömeg % palládium tartalmú szén katalizátort adtunk. A hidrogénezési reakciót környezeti hőmérsékleten és nyomáson 5 órán keresztül végeztük. A reakcióelegyen nitrogéngázt áramoltattunk keresztül és a katalizátort hyflo rétegen történő szűréssel eltávolítottuk. A szűrletet vákuum bepárlással 100 ml össztérfogatúra töményítettük, majd a kapott koncentrált oldathoz 200 ml n-butil alkoholt adtunk. A szerves fázis elválasztottuk, a vizes fázist 3x100 ml n-butil alkohollal mostuk. Az extrahált szerves fázisokat ezt követően egyesítettük és vákuumban betöményítettük. A maradékot dietil-éter/diizopropil-éter 1:1 térfogat arányú elegyének hozzáadásával péppé őröltük. A szilárd anyagot leszűrtük és vákuumban szárítottuk. Az eljárás eredményeként 11,08 g nyers anyagot kaptunk.

A kapott szilárd vegyület 10.8 g-ját (19.2 mól) 20 ml víz és 20 ml 10 N-os kénsav oldat elegyében oldottuk. A reakcióelegyet 50 °C-ra melegítettük és 25 percig ezen a hőfokon tartottuk. A reakciókeveréket hagytuk szobahőmérsékletre hűlni és annak pH értékét hidroxi formájú BioRad AG1-X8 gyanta felhasználásával 4,0 értékre állítottuk be. A gyantát ezt követően leszűrtük, majd az oldatot liofilizáltuk és ily módon 8,44 g nyers, címben megadott vegyülethez jutottunk.

A nyers cím szerinti vegyület 4,2 g mennyiségű mintáját ezt követően 0,01 tömeg %-os kénsavban oldottuk fel, majd az oldatot két egymás utáni 5x25 cm méretű Vydac C18 gyantát tartalmazó kollonára vittük. 2 % és 10 % közötti lineáris gradiensű CH3CN-ot használtunk fel a peptid kolonnáról történő eluálására. A kollonáról lejött frakciókat analitikai RP-HPLC profilok szerint gyűjtöttük össze. Az elegyített fázisok pH értékét ezt követően hidroxid formájú AG1-X8 gyanta (50-100 mesh szemcseméretű Bio.Rád analitikai anioncserélő gyanta) alkalmazásával 4,0-ra állítottuk be. A kapott oldatot szűrtük, majd az oldatot liofilizáltuk és az eljárás eredményeként 2,4 g tisztított fehérjét kaptunk, amely a számított elméleti értéknek 57 %-a. FAB-MS 415 (MH+); Aminosav analízis: Pro, 0.92; Tiq, 1.00; [a]D - -76.12 °C= 0.5 /

0.01 N H2SO4; ΕΑ: (számított) C21H32N6O7S C, 49.21; Η, 6.29; Ν, 16.29; S, 6.26. Talált: C, 51.20; Η, 6.17; Ν, 16.88; S, 5.37.

2. Példa

D-3-Piq-L-Pro-L-Arg-H előállítása

D-1,2,3,4-tetrahidro-3-izokinolin-karbonsav (1) g (302 mmol) D-fenil-alanint 120 ml 37 tömeg %-os formaldehid oldattal és 380 ml tömény sósav oldattal reagáltattunk reflux hőmérsékleten. Az elegyet 30 percig visszfolyóhűtő alatt melegítettük, majd további 50 ml formaldehidet adtunk hozzá. Az így kapott oldatot további 3 órán keresztül melegítettük visszafolyóhűtő alatt. Ezután a reakcióelegyet -10 °C-ra hűtöttük le és a keletkezett csapadékot szűréssel eltávolítottuk. A szilárd terméket vákuumban szárítottuk, ily módon 24,2 g cím szerinti vegyülethez jutva, amely a számított mennyiség 45 %-a. FD-MS 178 (MH+).

D-1,2,3,4,5,6,7,8-Perhidro-3-izokinolin-karbonsav (2) g (96 mmol) (l)-el jelzett D-1,2,3,4-tetrahidro-3izokinolin-karbonsavból, 200 ml vízből és 20 ml 5 N-os sósavból oldatot készítettünk. Ezt követően nyomásálló edényben 1.379x106 • · » *··♦<**··*··

- 23 - ^: *”*

Pa nyomáson, 120 °C-on 16 órán keresztül 8.5 g mennyiségű 5 tömeg % ródiumot tartalmazó A12O3-al reagáltattuk azt. A reakcióelegyet Celite földön át szűrtük és a szűrlet fagyasztásos szárításával 21 g tiszta címbeli vegyületet kaptunk, amely a számítotthoz viszonyított érték 100 %-a. FD-MS 184 (MH+).

Cbz-D-1,2,3,4,6,7,8-Perhidro-3-izokinolin-karbonsav (3)

21,0 g (95.8 mmol) a (2)-vei jelzett D-3-Piq-OH vegyületet 75 ml THF és 50 ml víz elegyében oldottuk. Az oldat pH étékét 5 N-os nátrium-hidroxiddal 10,0-re állítottuk be. 16, ml (115 mmol) benzil-kloroformátot csepegtettünk hozzá, miközben az oldat pH értékét 2 N-os nátrium-hidroxiddal 9,5 értéken tartottuk. A reakcióelegyet további 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettük. A szerves oldószert vákuum segítségével elpárologtattuk és a kapott maradékot 100 ml dietil-éterben és 50 ml vízben oldottuk. A vizes fázist extraháltuk és az oldat pH-ját 3 N-os sósav felhasználásával 3,-ra állítottuk be. A vizes oldathoz ezt követően 250 ml etil-acetátot adtunk, majd a szerves fázist elválasztottuk és magnézium-szulfáton szárítottuk. A leszűrt anyagot vákuumban betöményítettük. Az eljárás eredményeként a címbeli vegyületet áttetsző olaj formájában nyertük ki 25, g mennyiségben, mely a számított érték 85 %-a. FD-MS 318 (MH+) [a]D = -5.1 °C= 0.5 MeOH.

Cbz-D-1,2,3,4,6,7,8-Perhidro-3 -izokinolin-karboxil-L-Prolii-1butilészter (4) • ·

17,2 g (54 mmol) a (3)-al jelzett Cbz-D-3-Piq vegyületet 50 ml THF-ban oldottuk és az oldatot 0 °C-ra hűtöttük le. Ezt követően az oldathoz 9,2 garmm (54 mmol) Prolin-t-butilésztert, 7,3 g (54 mmol) 1-hidroxi-benzotiazolt és 11,1 g (54 mmol)

DCC-t adtunk. A reakcióelegyet 0 °C-on 3 órán keresztül kevertettük, majd a keverést 24 órán át szobahőmérsékleten tovább folytattuk. A keletkezett csapadékot leszűrtük és a szűrletet vákuum segítségével olaj formájúvá töményítettük. Ezután az olajat 200 ml etil-acetátban és 100 ml vízben oldottuk. A szerves fázist elválasztottuk, majd 1 N-os NaHC03-al, 1.5 N-os citromsavval és ismételten vízzel mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítottuk. A szűrt anyagot bepárlással olaj szerű termékké alakítottuk, majd megszárítottuk. Az eljárás eredményeként a címbeli vegyületet 23,8 g mennyiségben állítottuk elő, mely a számított érték 94 %-a. FAB-MS 471 (MH+); TLC Rf (A) 0.73; [a]D = - 40.0 °C = 0.5 MeOH.

Cbz-D-1,2,3,4,6,7,8-Perhidro-3-izokinolin-karboxil-L-Prolin (5)

A 31,2 g (66,3 mmol) (4)-el jelzett Cbz-D-3-Piq-Pro-O-t-Bu vegyületet 100 ml trifluor-ecetsavat és 5 ml anizolt tartalmazó R.B. lombikba töltünk és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül kevertettük. Ezt követően a reakcióelegyet melegítés nélkül vákuum segítségével betöményítettük, amelyet követően 150 ml dietil-étert és 100 ml vizet adtunk hozzá. Az oldat pH értékét 5 N-os nátrium-hidroxid oldattal 9,8-re állítottuk be. A vizes fázist elválasztottuk és annak pH-ját 3 N-os sósavval 2,8-re állítottuk be. A vizes oldathoz ezt követően 200 ml etil-acetátot

adtunk és a szerves fázist elválasztottuk, majd magnéziumszulfáton szárítottuk. A leszűrt anyagot vákuum segítségével betöményítve áttetsző olajat kaptunk. Az olajat 300 ml dietiléterben oldottuk, majd az oldatot szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagytuk. A kivált szilárd anyagot leszűrtük, dietil-éterrel mostuk és megszárítottuk. Az eljárás eredményeként 13,5 g címben megadott vegyületet kaptunk, amely 49 %-os kitermeiének felel meg. FAB-MS 415 (MH+); [a]D = - 57 °C = 0.5 MeOH; elemi analízis (elméleti) C23H33N2O5: C, 66.65; H, 7.29; N, 6.76; Talált: C, 69.90; H 7.33; N, 6.81.

3. Példa

D-3-Tiq-L-Pro-L-Arg-aldehid előállítása

D-1,2,3,4-tetrahidro-3-izokinolin-karbonsav (1) g (302 mmol) D-fenil-alanint 120 ml 37 tömeg %-os formaldehid oldattal és 380 ml tömény sósav oldattal reagáltattunk reflux hőmérsékleten. Az elegy 30 perces visszfolyóhűtő alatti melegítését követően, további 50 ml formaldehidet adtunk hozzá. Az így kapott oldatot további 3 órán keresztül melegítettük visszafolyóhűtő alatt. Ezután a reakcióelegyet -10 °C-ra hűtöttük le és a keletkezett csapadékot szűréssel eltávolítottuk. A szilárd terméket vákuumban szárítottuk, ily módon 24,2 g cím szerinti tiszta vegyülethez jutva, amely a számított mennyiség 45 %-a. FD-MS 178 (MH+); elemi analízis (elméleti) C10H11NO2: C,

67.78; Η, 6.26; Ν, 7.90. Talált: C, 68.05, Η 6.42, Ν, 7.88.

Cbz-D-1,2,3,4-tetrahidro-3-izokinolin-karbonsav (2) g (225 mmol) (l)-el jelzett D-3-Tiq-OH vegyületet 200 ml tetrahidrofuránban és 200 ml vízben oldottunk. Az oldat pH étékét 5 N-os nátrium-hidroxiddal 9,5-re állítottuk be. 35,4 ml (248 mmol) benzil-kloroformátot csepegtettünk hozzá, miközben az oldat pH értékét 2 N-os nátrium-hidroxiddal 9,5 értéken tartottuk. A reakcióelegyet további 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettük. A szerves oldószert vákuum segítségével elpárologtattuk és a kapott maradékhoz 200 ml dietil étert és 50 ml vizet adtunk. A vizes fázist elválasztottuk és az oldat pH-ját 5 N-os sósav felhasználásával 2.8-ra állítottuk be. A vizes oldathoz ezt követően 250 ml etil-acetátot adtunk, majd a szerves fázist elválasztottuk és magnézium-szulfáton szárítottuk. A leszűrt anyagot vákuumban betöményítettük. Az eljárás eredményeként a címbeli vegyületet áttetsző olaj formájában nyertük ki 70.0 g mennyiségben, mely a számított érték 100 %-a. FD-MS 312 (MH+).

Cbz-D-1,2,3,4,6,7,8-Tertahidro-3-izokinolin-karboxil-L-Prolii-tbutilészter (3)

70.0 g (225 mmol) a (3)-al jelzett Cbz-D-3-Tiq-OH vegyületet 150 ml DMF-ban oldottuk és az oldatot 0 °C-ra hűtöttük le. Ezt követően az oldathoz 38,5 g (225 mmol) Prolin-t-butiiésztert,

30,4 g (225 mmol) 1-hidroxi-benzotiazolt és 46,4 g (225 • · ··♦· · · ··₉ *··· · ·· ·* • · · · · · «· · ♦· ··

- 27 mmol) DCC-t adtunk. A reakcióelegyet 0 °C-on 3 órán keresztül kevertettük, majd a keverést 24 órán át szobahőmérsékleten tovább folytattuk. A keletkezett csapadékot leszűrtük és a szűrletet vákuum segítségével olaj formájúvá töményítettük. Ezután az olajat 250 ml etil-acetátban és 125 ml vízben oldottuk. A szerves fázist elválasztottuk, majd 1 N-os NaHCO3-al, 1.5 N-os citromsavval és ismételten vízzel mostuk. A szerves fázist magnéziumszulfáton szárítottuk. A szűrt anyagot bepárlással olaj szerű termékké alakítottuk, majd megszárítottuk. Az eljárás eredményeként a címbeli vegyületet 93,8 g mennyiségben állítottuk elő, mely a számított érték 89 %-a. FAB-MS 464 (MH+); TLC Rf (A) 0.76; [a]D = - 30.4 °C = 0.5 MeOH.

Cbz-D-1,2,3,4-Tetrahidro-3-izokinolin-karboxil-L-Prolin (4)

93,6 g (200 romol) (3)-el jelzett Cbz-D-3-Tiq-Pro-O-t-Bu vegyületet 150 ml trifluor-ecetsavat, 7,5 ml anizolt tartalmazó R.B. lombikba töltöttünk és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül kevertettük. Ezt követően a reakcióelegyet melegítés nélkül vákuum segítségével betöményítettük, amelyet követően 150 ml dietil-étert és 200 ml vizet adtunk hozzá. Az oldat pH értékét 5 N-os nátrium-hidroxid oldattal 9,8-re állítottuk be. A vizes fázist elválasztottuk és annak pH-ját 5 N-os sósavval 2,5-re állítottuk be. A vizes oldathoz ezt követően 250 ml etil-acetátot adtunk és a szerves fázist elválasztottuk, majd magnéziumszulfáton szárítottuk. A leszűrt anyagot vákuum segítségével betöményítve áttetsző olajat kaptunk. Az olajat 300 ml dietiléterben és 40 ml (200 mmol) diciklohexil-aminban oldottuk, majd az oldatot szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagytuk. A kivált szilárd anyagot leszűrtük, dietil-éterrel mostuk és megszárítottuk. Az eljárás eredményeként 103,7 g címben megadott DCHA , sót kaptunk, amely 88 %-os kitermelésnek felel meg. FAB-MS 409 ι (MH+); [a]D = - 24.5 °C = 0.5 MeOH.

A végső reakció lényegében az 1. kiviteli példában ismertetett kapcsolási reakciónak megfelelően került végrehajtásra. FAB-MS 415 (MH+); [a]D = - 13 °C; elemi analízis (elméleti) C21H30N6O3.H2SO4.2H2O: C, 46.03; H, 6.62; N, 15.33; Talált: C, 46.33; H 6.04; N, 15.04.

4. Példa

D-3-Tiq(7-OH) Pro-Arg-H. HC1 előállítása

H-D-3-Tiq(7-OH)-OH vegyületet a nemzetközi Fehérje katalógus alapján beszereztük (Catalog # ADX-5026-PI; Loiusville, KY) és a címben szereplő vegyület előállításának kiindulási anyagaként használtuk fel. Az eljárás során lényegében a 3. kiviteli példában ismertetésre került műveleti lépéseket hajtottuk végre. FAB-MS 431 (MH+); [a]D = - 1.2 °C; elemi analízis (elméleti) C21H30N6O4.2HC1.H2O: C, 48.37; H, 6.52; N, 16.12; Talált: C, 48.28; H 6.14; N, 15.53.

5. Példa

In vivő vizsgálat «··· ·« • « · · · • * · «4 ·*

- 29 Kb. 9-14 kg testsúlyú felnőtt hím vadászkutyákat 30 mg/testsúly kg intravénásán adagolt pentabarbital-nátriummal elaltattunk. A kutyákon légcsövön keresztüli intubációt hajtottunk végre és Harvard respirátor segítségével szállított szobalevegővel lélegeztettük azokat: lélegeztetési arány 16 ciklus/perc, ki- és belélegeztetett levegő térfogata 25 ml/kg. Melegítő párnák segítségével a kutyák testhőmérsékletét 37-38 °C között tartottuk. A baloldali femoralis artériába és vénába katétereket helyeztünk a fázisos artériás vérnyomás mérésére (Statham transducer, P23ID) és a gyógyszer oldatot intravénásán adagoltuk. Az artériás vérnyomás középér.tékét úgy számítottuk ki, hogy a diasztolés vérnyomás és a pulzusnyomás 1/3-át összegeztük. A szisztolés pulzus nyomás által előidézett szívfrekvenciát kardiotachométerrel ellenőriztük, miközben a nyomás értékét, mint a szívizom oxigénigényét jelző mutatót nyomonkövettük. Lásd Gobel et al.: 'Heveny szíveredetű mellkasi fájdalomban szenvedő betegek esetében végzett kísérletek során mért nyomásérték, mint a szívizom oxigén felhasználásának mutatója' Circulation 57: 549-556, (1978). Bor alatti elektródákat használtunk fel az elektrokardiogram felvételére, mely az ST-szakasz változásainak kimutatására szolgál és arra, hogy megbecsüljük a szabálytalan szívműködés (aritmia) előfordulási gyakoriságát és időtartamát. A közvetlenül mért parmétereket többcsatornás oszcillográfon (Beckman Instruments, Inc., Fullerton CA; R611 modell) folyamatosan regisztrálásra kerültek.

A bal mellkasfelet az ötödik borda között felnyitottuk, a szívet a szívburok ágyban felfüggesztettük, majd a baloldali circumflexus koszorú artériát (LCX) disztálisan izoláltuk annak szívpitvari ágától és proximálisan izoláltuk annak valamely fő szívkamrai ágától. A mérési alapvonalat jelentő circumflexus koszorú artéria vérnyomását Carolina áramlásmérőhöz csatlakoztatott kalibrált áramlásmérő katéter alkalmazásával megmértük. Első lépésben valamennyi kutya esetében kritikus koszorúér szűkületet idéztünk elő az LCX-nek érlekötő fonallal történő lekötésével, továbbá egy közbeiktatott 18-19-es méretű tű segítségével. Ezt kővetően a tűt eltávolítottuk és hagytuk, hogy a vér a tűvel azonos nagyságú átmérőn áramoljon keresztül.

Az LCX 10 másodperces, teljes elzárásával létrejövő véráram növekedés csúcsértékének több, mint 70 %-al történő csökkentése érdekében a kritikus szűkületet módosítottuk, és tettük mindezt anélkül, hogy az alap véráramlást jelentősen módosítottuk volna. A kritikus szűkület módszerének ily módon történő alkalmazása reperfúziós hiperémia és ehhez kapcsolódó szív aritmiák korlátozására és szívkamrai fibrilláció potenciális lehetőségének csökkentésére, az irodalomból ismert. Például Sheehan, F. and Epstein, S.: 'Koszorú artéria görcs következményeként fellépő szabálytalan szívműködés okozta halál befolyásoló tényezői: Előzetesen létező koszorú artéria szűkület hatása a reperfúziós aritmia előfordulási gyakoriságára.' Circ. Rés. 65: 259-264, 1982). A kritikus szűkület létrehozását követően a koszorúérben levő áramlásmérő katétert eltávolítottuk. A kritikus szűkület létrehozása után és egy adott kiegyensúlyozási periódust követően az alap paramétereket felvettük, majd az LCX-et hurokkal teljes egészében elzártuk. Az LCX-et 1 órán keresztül teljes egészében elzárva tartottuk, majd a hurok eltávolítását követően 5 órás ·«· ···· /% .··· • ·< ·♦ « 4 9 · · ·* *·

- 31 reperfúziót hajtottunk végre. A reperfúzió kezdetén 30 percig fenntartottuk a kritikus szűkületet. Az LCX 1 órán keresztül történő elzárása során az ST-szakasz eltéréseit periodikusan mértük, miközben a szívaritmia intenzitását és időtartamát óránként értékeltük egy félig kvantitatív minősítő skála segítségével: 1 = minimális, 2 = mérsékelt, 3 = erős. A kísérleteket vagy gyógyszeres előkezelési eljárással vagy reperfúziós gyógyszeres kezeléssel hajtottuk végre. Az előkezelési eljárás során salina oldat vagy gyógyszer oldat intravénás adagolását 15 perccel az LCX elzárását megelőzően kezdtük meg és egészen a reperfúzió 5 órás időtartamának leteltéig folytattuk. A reperfúziós eljárásban a salina oldat vagy a gyógyszer oldat folyamatos 5 órán keresztül történő infúziója a reperfúzió idején kezdődött, 1 órával az LCX elzárást követően.

A reperfúziót követően a szívet gyorsan kimetszettük az infarktus mértékének Shea módszer szerinti 'trifenil-tetrazolium/ Evans kék' festési eljárással történő meghatározása céljából.

(Shea et al.: 'Nafazatrom (Bay 6575 g) kedvező hatásai kísérleti koszorúér trombózis esetében' Am Heart J. 107: 629-637, 1984; és Shea et al.: 'Nafazatrom kedvező hatásai ischaemiás reperfúziós szívizomra' Eur. J. Pharmacol 102: 63-70, 1984), ahogy az módosításra került: Hahn et al.: ’Leukotrien B4 receptorok antagonizmusa nem korlátozza a kutyafélék szívizom infarktusának kiterjedését.' J. Pharmacol. Exp. Ther. 253: 58-66, 1990. Kanült vezettünk be az aortába a koszorúér nyílás fölött és az LCX-be a korábbi elzáródás helyén. Az LCX ágyat 1.5 térfogat % trifenil-tetrazolium tartalmú kálium-foszfát puffer oldattal (pH =7,4, 38 °C) áramoltattuk át, miközben ezzel egyidejűleg a szív maradék részét az aortán keresztül 0,1 %-os Evans kék-tartalmú salina oldattal áramoltattuk át. A perfúziós nyomást 1,333x104 Pa-os állandó értéken tartottuk és a szívizom átáramoltatás időtartama megközelítőleg 5 perc volt. A szívet ezt követően merőlegesen az apex-bázis tengelyre 6, megközelítően 1 cm vastagságú szeletre vágtuk. A circumflexustól eltérő koszorú artériák által átáramoltatott szívizmot kékre festettük, az életképes balkamrát a circumf lexus artéria disztribúcióján belül téglavörösre festettük, míg az infarktus által súlytott balkamra veszélyeztetett része testetlen maradt. A jobbkamra izomzatából levágott összes harántirányú szeletet, billentyűt és zsírszövetet szárazra ittatunk, majd tiszta műanyag lapra vittük a kérdéses terület planimetrikus mérésének céljából. A szívizom valamennyi területét felboncoltuk és gravimetrikus meghatározás céljából lemértük. A szekcionális és kumulatív infarktus méretét a veszélynek kitett balkamra tömegének százalékában fejeztük ki.

1. Táblázat

A vizsgált vegyületek hatása a koszorús artéria elzáródás következtében létrejött és reperfúziót követően megmaradt szívizom infarktus által súlytott terület nagyságára

Alkalmazott	Kezelési	Infúzió	Infarktus
vegyület	élj árás	mennyiség	által káro-
		(mg/kg/óra)	sított terület

Salina	-		42.4	+ /-	4.0b
(6) vegyület	előkezelés	2.0	25.1	+ /-	5.9c
Salina	-	-	40.1	+/-	4.1
(6) vegyület	reperfúzió	2.0	26.5	+ /-	4.7c
Salina	-	-	38.4	+ /-	3.4
(5) vegyület	reperfúzió	0.5	24.1	+ /-	6.3c
Salina	-	-	48.3	+ /-	5.8
(5) vegyület	reperfúzió	1.0	28.9	+/-	3.5c
Salina	-	-	38.4	+ /-	3.4
(3) vegyület	reperfúzió	1.0	19.0	+ /-	2.6c
Salina	-	-	48.3	+/-	5.8
(4) vegyület	reperfúzió	1.0	26.0	+ /-	5.5c

Salina	-	44.0	+ /-	4.4b
(1) vegyület	reperfúzió	1.0 17.5	+/-	2.7c

Salina	-	45.9	+ /-	6.6
(2) vegyület	reperfúzió	1.0 21.8	+/-	4.3c

a: Infarktus kiterjedésének egysége = Infarktus súlytotta tömeg/veszélyeztetett tömeg (%) b: 8-9 kutya esetében mért középérték c: statisztikusan szignifikáns eltérés a salina kontrol oldattól (P<0.05) .

Az 1. táblázatban szereplő adatok azt szemléltetik, hogy a vizsgált, kipróbálás alatt álló vegyületek mindegyike képes volt csökkenteni a koszorús artéria elzáródás eredményeként előállt és a reperfúziót követően fennmaradt szívizom infarktus területi nagyságát, mikor klinikailag releváns eljárással kutyáknak beadtuk azokat. Miután a koszorús artéria elzáródást és reperfúziót mesterségesen, mechanikai úton egy hurok segítségével hoztuk létre az infarktus megfékezésének hatékonysága szempontjából kizárt, hogy az infarktusban érintett artéria nagymértékű elzáródását trombózis okozta volna, illetve az a trombózis megelőzésének lenne tulajdonítható. A szívkamra szöveteinek valamennyi találmány szerinti vegyület révén történő tisztítása során csak csekély vagy kézzelfoghatóan nem kimutatható kardiovascularis, elektrokardiografikus és vérzésbeli eltérés volt.

Az, hogy az 1 általános képletű vegyületek pontosan milyen mechanizmusok útján korlátozzák az ichaemiás sérülést, nem ismert. Ez a biológiai aktivitás talán összefügg a vegyületek proteáz inhibíciós sajátságaival. A szerin proteáz inhibitor aprotnin amely plazmin, tripszin és kallikrein antagonista tulajdonsága közismert - koszorús artéria elzáródással összefüggő szívizom ischaemiás sérülést mérséklő tulajdonságot mutat. Diaz et al.: ' A kallikrein inhibitor aprotinin hatása koszorús artéria elzáródást követő szívizom ischaemiás sérülésre kutyákban' Am. J. Cardiol.

40: 541-549, 1977). Leírásunkban mi is bemutattuk, hogy az aprotinin jelentősen csökkenti, a koszorús artéria elzáródás okozta és a reperfúziót követően fennmaradt szívizom infarktus kiterjedésének méretét. Az infarktus súlytotta terület mérete 37,9 +/- 5,4 tömeg %-a volt a bal kamra veszélyeztetett tömegének a kontrol kutyákban, és 28,8 +/- 2,4 tömeg %-a (P < 0,05) volt az aprotinin infúzióval kezelt kutyákban. Arra a kérdésre, hogy vajon az aprotinin esetében működő mechanizmus hasonló-e az 1 általános képletű vegyületek hatásmechanizmusaival, vagy azok egyediek lennének, a választ nem ismerjük.

A fent említett tanulmányok szintén tartalmaznak értékelést a neutrofil fehérvérsejtek szerepére vonatkozóan kifejlődő szívizom infarktus esetében. A vizsgált 1 általános képletű vegyületek egyike sem módosította lényegesen az általános fehérvérsejtszám emelkedést, amely válasz az ischaemiás sérülésre és nem befolyásolta a leukociták akkumulációját sem az ischaemiás és infarktusos szívizom részen.

Összegezve, a szemléltető példák mindegyike azt bizonyítja, hogy az 1 általános képletű vegyületek képesek az ischaemia és re perfúzió okozta szöveti károsodások minimalizálására és csökkentésére. Ez a fontos gyógyító tulajdonság került megállapításra és bemutatásra. Valamennyi vizsgált vegyület csökkenti a koszorúér elzáródás és reperfúzió által eredményezett szívizom infarktust. Az 1 általános képletű vegyületek alkalmasak a reperfúziós szöveti károsodás csökkentésére és annak minimalizálását szolgáló új eljárásokban felhasználhatóak. A találmány fontosságát leginkább az jelzi, hogy az 1 általános képletű vegyületek elsősorban szívinfarktust szenvedett emberek kezelésében bírnak nagy jelentőséggel.

Claims (6)

1. Eljárás reperfúziós sérülések kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállításra önmagában ismert módon megfelelő inért hordozók felhasználásával azzal jellemezve, hogy az 1 általános képletű vegyületet keverjük be, mely képletben

JA 9 r, A

A jelentése 1 vagy 2 R1 R2 R3 R4 vagyARS és az A királis központi atomja DL, előnyösen D, a Pro esetében L, valamint az Arg esetében L;

Z csoport jelentése Cl - C4 szénatomos alkil csoport vagy hidrogénatom;

X csoport jeletése NH2, NHZ, t-butiloxi-karbonil-NH, acetil-NH vagy trifluor-acetil-NH;

R csoport jelentése hidrogénatom, OH csoport, halogénatom, C1-C4 alkoxi csoport, CF3, C1-C4 alkilcsoport, N02 vagy NH2 csoport, valamint q jelentése CH2 vagy CO csoport.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reperfúziós sérülés szívizom infarktus kezelése során jelentkezik .

3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely oxidáns tisztítóanyag alkalmazásával kapcsoljuk össze.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely béta blokkoló anyag alkalmazásával kapcsoljuk össze.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aszpirin alkalmazásával kapcsoljuk össze.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az alábbi vegyületek valamelyike kerül alkalmazásra: D-3-Piq-L-Prolil-L-Arginal, D-7hidroxil-1,2,3,4-Tiq-3-karboniloxi-L-Prolil-L-Arginal,

D-3-Tiq-L-Prolii-L-Arginal, D-l,2,3,4-Tiq-l-karbonil-L-Prolii-LArginal, N-metil-D-Fenilalanil-L-Prolil-L Arginal és Na-tbutiloxi-karbonil-D-Fenilalanil-L-Prolii-L-Arginal.