CZ285005B6 - Farmaceutický prostředek pro minimalizaci a zvládnutí ischemického a reperfusního poškození - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití sloučeniny obecného vzorce I pro přípravu farmaceutického prostředku k minimalizaci a ke zvládnutí ischemického a reperfusního poškození. Přičemž v obecném vzorci I platí, že případně chirální centrum pro A je DL, s výhodou D, L pro Pro a L pro Arg, Z alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atom vodíku, X NH.sub.2.n., NHZ, terc.-butyloxykarbo- nyl-NH skupinu nebo trifluoracetyl-NH skupinu, R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu NO.sub.2 .n.nebo NH.sub.2 .n.a q skupinu CH.sub.2 .n.nebo CO.ŕ

Description

(57) Anotace:

Řešeni se týká použití sloučeniny obecného vzorce I pro přípravu farmaceutického prostředku k minimalizaci a ke zvládnutí ischemického a reperfusního poškození. Použití sloučeniny obecného vzorce I jako léčiva Je zvláště vhodné k minimalizaci a ošetření poškození srdce při vývoji myokardiálního infarktu. Přičemž v obecném vzorci I platí, že případně chirální centrum pro A je DL, s výhodou D, L pro Pro a L pro Arg, Z alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atom vodíku, X NH2, NHZ, terc.-butyloxykarbonylNH skupinu nebo trifluoracetyl-NH skupinu, R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, triíluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu NO2 nebo NH2 a q skupinu CH2 nebo CO.

nebQ

C

Použití sloučeniny A-Pro-Arg-H pro přípravu farmaceutického prostředku

Oblast techniky

Vynález se týká použití sloučeniny A-Pro-Arg-H jako léčiva k minimalizaci a ošetření ischemického a reperfusního poškození. Předložený vynález je založen na objevu, že skupina známých tripeptidových derivátů argininu je užitečná pro minimalizaci a ošetření poškození způsobeného v případech, kdy je tkáň podrobena ischemii a reperfusi. Použití sloučenina je io zejména vhodná jako kardioochranný prostředek v případe ischemického poškození, způsobeného v průběhu myokardiálního infarktu a reperfuse.

Dosavadní stav techniky

K ischemii dochází v případě, kdy tok krve do komor je nedostatečný k podpoře normální metabolické aktivity. Jestliže takový stav trvá delší dobu, buňky v ischemické zóně odumírají. Reperfuse je výraz používaný pro popsání jevu znovuobnovení průtoku krve ischemickou tkání. Reperfuse je proto nezbytná pro další přežívání buněk v ischemické oblasti. Je však dobře 20 známo, že samotná reperfuse způsobuje neopravitelné poškození četných buněk, které přežily ischemickou příhodu. Proto sloučeniny schopné minimalizovat a ošetřit ischemické nebo reperfusní poškození představují důležitá terapeutická činidla. Tato činidla jsou zejména užitečná pro přípravu léčiv a farmaceutických prostředků pro ošetřování postižených pacientů.

Reperfusní poškození je v široké míře důsledkem zánětlivých procesů. Reperfusní ischemická tkáň přitahuje leukocyty, které uvolňují proteolytické enzymy a oxidanty, které vzápětí promotují další zánět následovaný případným léčením a zajizvením. Jelikož od leukocytů odvozené proteolytické enzymy a oxidanty jsou neselektivní, odbourávají normální a reverzibilně poškozenou tkáň. Proto tlumení zánětlivé odezvy inhibice nej zhoubnějších činidel při zánětlivém 30 procesu jsou logickým přístupem k minimalizaci a zvládnutí reperfusního poškození.

Rozvinutí myokardiální infrace je pokračující proces, kdy myokardium selhává se zřetelem na přijímání přiměřené dodávky krve k podpoře normální metabolické aktivity a je typicky způsobeno okluzí koronární arterie. Vzhledem ke konstantní, poměrně vysoké metabolické činnosti 35 srdce a vzhledem k četným terapiím pro zmínění koronární arteriové okluze je snad infarkt myokardu nejběžnějším a nej závažnějším reperfusním poškozením.

Četné terapeutické intervence, například angioplasty, chirurgický bupas a trombolytické režimy rekannalizují okludované koronární arterie a vedou k myokardiálnímu reperfusnímu poškození 40 (Luccesi a kol., Leukocytes and Ischemia-induced Myocardial injuiy, Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 36, str. 159 až 163 (1985) a Engler R. L. Free Radical and Granulocyte-Mediatel Injury during Myocardial Ischemia and Reperfusion. Am. J. Cardiol. 63, str. 19E až 23E, 1989.

Jelikož obnovené leukocyty jsou spojeny s rozšířením infarktu myokardu způsobenému okluzí 45 koronárních arterií a repurfusí, je neurofilní intervence logickým přístupem pro minimalizaci a zvládnutí rozvinutí myokardiálního infarktu. Takové neurofilní intervence zahrnují navození neutropenia, protiadhezní molekulové monoklonální protilátky a oxidační „čističe“ (Romson a kol., Reduction of the Extent of Inschemic Myocardial Injury by Neutrophil Depletion in the Dog, Circulation 67, str. 1016 až 1023, 1983; Mullane a kol., Kole of Leukocytes in Acute 50 Myocardial Infarction in Anasthetized Dogs: Relationship to myocardial Salvage by Antiinflammatory Drug, J. Pharmacol. Exp. Ther. 228, str. 510 až 522, 1984; Mitsos a kol., Protective Effects of N-2-Mercaptoprpionyl Glycine againts Myocardial Reperfusion Injury after Neutrophil Depletion in the Dog: Evidence for the Role of Infracellular-derived Free Radicals, Circulation 73, str. 1077 až 1086, 1986; Mitsos a kol., Canine Myocardial Reperfusion

- 1 CZ 285005 B6

Injury: Protection by a Free Radial Scavenger N-2-Mercaptopropionyl Glycine, J. Cardiovasc. Pharmacol., 8, str. 978 až 988, 1986; Jolly a kol., Canine Myocardial Reperfusion Injury: Its Reduction by the Combined Administration of Seuperoxide Dismutase and Catalase, Circ. Res. 5E, str. 227 až 285, 1984; Simpson a kol., Reduction of Experimental Canine Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury by a Monoclonal Antibody (Anti-Mol) that Inhibits Leukocyte Adhesion of Myocardial Infarct Size by Neurophil Depletion: Effect of Duration of Occlusion, Am. Heart J. 112, str. 682 až 690, 1986.

Nyní se s překvapením zjistilo, že skupina známých sloučenin, které inhibují působení četných poteas, je schopna ovládnout a minimalizovat poškození tkání způsobení ischemií a reperfusí. Sloučeniny jsou obzvláště užitečné při novém způsobu minimalizace nepříznivých vlivů na srdce v důsledku infarktu myokardu a reperfuse, přičemž se případně podává savcům účinné, netoxické množství účinné látky.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití pro přípravu farmaceutického prostředku k minimalizaci a ke zvládnutí ischemického a reperfusního poškození obecného vzorce I

A-Pro-Arg-H (I) kde znamená

A nebo 2 o

nebo

a chirální centrum pro A je DL, s výhodou D, L pro Pro a L pro Arg,

Z alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atom vodíku,

-2 CZ 285005 B6

X NH₂, NHZ, terc.-butyloxykarbonyl-NH skupinu, acytyl-NH skupinu při trifluoracetyl-NH skupinu,

R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu NO₂ nebo NH₂a q skupinu CH₂ nebo CO.

Sloučeniny, užitečné podle vynálezu, jsou v oboru obecně známy. Jsou popsány například v americkém patentovém spise číslo 4 703036 a v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo EP-A-O číslo 479489 a v publikaci Bejusz a kol., Highly Active and Selective Anticoagulants: D-Phe-Pro-Arg-H, a Free Tripeptide Aldehyde Prone to Spontaneous Inactivation, and Its Stable N-Methyl Derivative, D-MePhe-Pro-Arg-H, J. Med. Chem. 33, str, 1729 až 1735, 1990.

α-Uhlíkové atomy prolinového a argininového zbytku jsou v konfiguraci L a α-uhlíkové atomy substituentu A jsou v konfiguraci DL, především D.

Farmaceuticky vhodné soli sloučenin obecného vzorce I jsou užitečné pro přípravu farmaceutických prostředků. Vynález se také týká adičních solí sloučenin obecného vzorce I s farmaceuticky vhodnými minerálními nebo karboxylovými kyselinami. Jakožto příklady anorganických kyselin, vytvářejících soli, se uvádějí halogenovodíkové kyseliny, zvláště kyselina chlorovodíková a bromovodíková, fosforečná a sírová kyselina. Pro přípravu solí s karboxylovými kyselinami se příkladně uvádějí kyselina octová, propionová, malonová, maleinová, citrónová, jantarová, jablečná, benzoová, fumarová a podobné kyseliny. Adiční soli s kyselinami se připravují o sobě známým způsobem, například neutralizací volné zásady sloučenin obecného vzorce I kyselinou. Výhodnými adičními solemi s kyselinou jsou sulfátové a hydrochloridové soli.

Vynález se tedy také týká farmaceutických prostředků pro minimalizaci a zvládnutí ischemického a reperfusního poškození, které obsahují jakožto účinnou látku sloučeninu obecného vzorce I spolu s farmaceuticky vhodnými nosiči.

Pro orální podání se sloučeniny obecného vzorce I zpracovávají na želatinové kapsle nebo se lisují na tablety, které mohou obsahovat farmaceuticky vhodné excipienty, jako jsou například nosiče, mazadla, rozptylovací a podobné činidla. Sloučeniny obecného vzorce I se také mohou zpracovávat na farmaceutické prostředky s pozdrženým uvolňováním účinné látky. Například se sloučenina obecného vzorce I může zpracovávat na hydrogelovou matrici, přičemž se pak účinná látka uvolňuje po proměnlivou dobu. Pro parenterální podání se sloučenina může zpracovávat s farmaceuticky vhodným ředidlem, například s fyziologickým solankovým roztokem (0,9%), s 5% dextrózou, nebo s Ringerovým roztokem.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou připravovat o sobě známým způsobem kopulace peptidů. (Obecný popis je například v publikaci Dugas a Penney, Bioorganic Chemistry, str. 13 až 82, 1981). Při takovém způsobu se kyselina obecného vzorce ACOOH, kde A má význam uvedený u obecného vzorce I, kopuluje s prolinem s chráněnou karboxyskupinou za získání dipeptidu (v případě, kdy A znamená aminokyselinu) nebo N-acylprolinesteru (v případě, kdy A neznamená aminokyselinu). Chránící estrová skupina karboxyskupiny se z prolinového podílu produktu odstraňuje a forma volné kyseliny dipeptidu se pak kopuluje s laktamovou formou argininu. Tento reakční sled znázorňuje následující reakční schéma:

ACOOH + prolinestor deester i f i kace

O

> A-C-N

COOester (a) > A CC=0)-Pro-OH <b) <a)

> A-CC—OJ-Pro-ArgCP)laktam

Cc) kde znamená

P skupinu, chránící aminoskupinu.

Kopulovaný Arg(P) laktamový produkt (c) se pak redukuje lithiumaluminiumhydridem v inertním rozpouštědle k ošetření laktamového kruhu a získá se tripeptid v argininaldehydové formě 10 obecného vzorce

A-(C=O)-Pro-Arg(P)-H kde znamená Arg(P)-H argininaldehyd s chráněnu aminoskupinou.

Laktamová forma argininu se získá intramolekulámí kopulací argininu s chráněnou aminoskupinou (Arg-OH). Například Boc-Arg-(Cbz)OH obecného vzorce

Boc-NH-CHJCH₂)₃-NH-C(=NH)-NHCbz |

COOH kde znamená Boc terc.-butyloxykarbonylovou skupinu a Cbz benzyloxykarbonylovou skupinu, se nejdříve převádí na formu aktivního esteru, jako je například aktivní směsný anhydrid 25 chloroformátovým esterem například ethylchlorfomát na isobutylchlorformát. Vytváření esteru se provádí v přítomnosti terciárního aminu, jako například N-methylmorfolinu. Přidáním silnější terciární aminové zásady dochází k vnitřní acylaci, čímž se získá laktamová forma di-amino chráněného argininu, jak je dále uvedeno.

-4 CZ 285005 B6

C = NH

I

NH - CBz

Před použitím při kopulaci s A(C=O)-Pro-OH, jak je zřejmé ze schéma, se chránící skupina Boc selektivně odstraní kyselinou trifluoroctovou, čímž se získá žádaná volná aminoskupina.

Kopulace ACOOH sloučeniny s prolinesterem, kde znamená A zbytek aminokyseliny se provádí nejprve chráněním aminoskupiny aminokyseliny. Používá se běžných chránících skupin pro aminokyseliny pro dočasnou ochranu nebo blokování aminoskupiny. Jakožto příklady takových chránících skupin se uvádění alkoxyskupina, alkenyloxyskupina, cykloalkoxyskupina a aryloxykarbonylová skupina, jako jsou například skupina ethoxykarbonylová, terc.-butyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová, adamantyloxykarbonylová, trichlorethoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová a difenylmethoxykarbonylová skupina.

Esterová skupina, používaná k ochraně karboxylové skupiny prolinu v průběhu kopulační reakce může být jakoukoliv běžně používanou, snadno odstranitelnou esterovou skupinou, jako je například skupina terc.-butylová, benzylová, p-nitrobenzylová, p-methoxybenzylová, difenylmethylová, trichlorethylová, fenacylová nebo trialkylsilylová skupina. Při provádění kopulační reakce se používá esterové skupiny pro prolin, která je odstranitelná za podmínek, za kterých chránící skupina na aminoskupině zůstává neporušená. Skupina, chránící aminoskupinu acylační kyseliny A-COOH, zůstává na místě pro chránění aminoskupiny v průběhu následující kopulace s argininlaktamovou sloučeninou za vytvoření A-(C=O)-Pro-Arg(P)laktamu.

Shora popisované kopulační reakce se provádějí za chladu, s výhodou při teplotě přibližně -20 až 15 °C. Kopulační reakce se provádí v inertním organickém rozpouštědle, jako jsou například dimethylformamid, dimethylacetamid, tetrahydrofuran, methylenchlorid a chloroform. Obecně se pracuje za bezvodých podmínek pokud se při kopulační reakci používá aktivního esteru acylační kyseliny.

Sloučeniny podle vynálezu se s výhodou izolují ve formě adičních solí s kyselinami. Soli sloučenin obecného vzorce I, vytvářené s kyselinou, například shora uvedené, jsou užitečné jakožto farmaceuticky vhodné soli pro podávání činidel minimalizujících reperfusní poškození a pro přípravu farmaceutických prostředků na bázi těchto činidel. Jiné adiční soli s kyselinami se mohou připravovat a používat při izolaci a čištění peptidů. Například se mohou používat soli vytvořené se sulfonovými kyselinami, například s kyselinou methansulfonovou, n-butalsulfonovou, p-toluensulfonovou a s kyselinou naftalensulfonovou.

Způsoby izolace a čištění sloučenin obecného vzorce I za současné přípravy žádoucí stálé formy soli, jsou o sobě známé. Podle takových způsobů se připravují stálé soli anorganických kyselin včetně sulfátových a hydrochloridových solí preparativním čištěním na Cis reverzní fázovou chromatografii. Vodná fáze zahrnuje kyselinu sírovou nebo kyselinu chlorovodíkovou v koncentraci přibližně 0,01 až přibližně 0,05 % a acetonitril, tetrahydrofuran, methanol nebo jiná vhodná rozpouštědla slouží jakožto organická složka. Hodnota pH kyselého elučního činidla se nastavuje přibližně na 4 až přibližně 6. Přesná hodnota pH je závislá na určitém peptidu se zásaditou

- 5 CZ 285005 B6 pryskyřicí (jako je například Bio-Rad AG-1X8) v hydroxylové formě. Po nastavení hodnoty pH se roztok tripeptidové soli, například sulfát nebo hydrochlorid, lyofilizuje za získání čištěné soli v suché práškové formě.

Nejvýhodnějšími sloučeninami obecného vzorce I, které jsou zvláště vhodné podle vynálezu jsou následující:

Sloučenina 1: D-3-Piq-L-prolyl-L-arginal (sulfátová sůl) io

Sloučenina 2: D-7-hydroxyl-l,2,3,4-Tiq-3-karbonyloxy-L-prolyl-L-arginaI (dihydrochloridová sůl)

Sloučenina 3: D-3-Tiq-L-prolyl-L-arginal (sulfátová sůl)

Sloučenina 4: D-l,2,3,4-Tiq-3-karbonyl-L-prolyl-L-arginal (sůl)

-6CZ 285005 B6

Sloučenina 5: N-Methyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginal (sůl)

Sloučenina 6: N^a-terc.-Butyloxykarbonyl-D-fenyIalanyl-L-prolyl-L-arginal (sůl)

O

II

Podle vynálezu se sloučenina obecného vzorce I podává savcům tak, aby byla účinná koncentrace sloučeniny v krvi při obnovování toku krve v ischemické zóně buněk. S výhodou má být účinné množství sloučeniny obecného vzorce I v toku krve, když se obnovuje dostatečný tok krve do ischemické oblasti. Avšak dosažení účinné hladiny v krvi sloučeniny právě po reperfiisi ischemické oblasti je také součástí způsobu.

Sloučenina obecného vzorce I se může podávat orálně, parenterálně, například intravenozní infuzí nebo vstřikováním nebo spojením vstřikování a infuze (iv), intramuskulámě (im) nebo subkutanně (sc). S výhodou se sloučenina obecného vzorce I podává infuzí. Účinná koncentrace v krvi se má udržovat alespoň ještě jednu hodinu po reperfusi až po několik dní v závislosti na relativní síle sloučeniny a na velikosti ischemické zóny. Účinná dávka sloučeniny obecného vzorce I je přibližně 5 mg až přibližně 1000 mg a dávkovači režim značně závisí na cestě podání. Orální, intramuskulámí a subkutánní cesta vyžaduje podání sloučeniny obecného vzorce I před obnovením toku krve do ischemické tkáně k umožnění vstupu sloučeniny do toku krve.

Podle výhodného provedení je infuzní rychlost přibližně 0,2 až přibližně 5,0 mg/kg/h po dobu jedné až deseti hodin. Nejvýhodnější je infuzní rychlost 0,5 až 2,0 mg/kg/h po dobu jedné až deseti hodin. V případě infarktu myokardu, způsobeného okluzí trombu se může sloučenina obecného vzorce I současně podávat nebo bezprostředně podat po trombolytickém ošetření.

Vynález se také týká současného podávání sloučeniny obecného vzorce I s oxidačním činidlem. Jakožto příkladné oxidační činidlo se uvádí bez záměru o jakékoliv omezení superoxiddismutasa a N-merkaptopropionylglycin. Současným podáváním se zde vždy míní podání v krátké době před nebo po podání sloučeniny obecného vzorce I. Současným podáním se také míní, že účinné množství současně podávané sloučeniny působí v krvi spolu s účinným množstvím sloučeniny obecného vzorce I.

Vynález se také týká současného podávání sloučeniny obecného vzorce I s β-blokujícím činidlem. Jakožto příkladné β-blokující činidlo se uvádí bez záměru o jakékoliv omezení Propranolol, Metoprolol a Atenolol. Vynález se také týká současného podávání slučeniny obecného vzorce I s aspirinem. Vynález se také týká současného podávání slučeniny obecného vzorce I s oxidačním činidle, s β-blokujícím činidlem nebo s aspirinem.

- 7 CZ 285005 B6

Následující příklady vynálezu blíže objasňují, nejsou však míněny jako jakékoliv omezení vynálezu. Používané zkratky mají tento význam:

Aminokyseliny: Arg = arginin, Pro = prolin

BOC terc.-butyloxykarbonyl

Bzl benzyl

Cbz benzyloxykarbonyl

DCC dicyklohexylkarbodiimid

DMF dimethylformamid

DMSO dimethylsulfoxid

FAB-MS hmotové spektrum při bombardování rychlým atomem

FD-MS desorpční hmotové spektrum

THF tetrahydrofuran

TLC chromatografie v tenké vrstvě

Tiq tetrahydroisochinolin

D-l-Tiq D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-karboxylová kyselina

D-3-Tiq D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylová kyselina

D-3-Piq D-l ,2,3,4,5,6,7,8-perhydroisochinolin-3-karboxylová kyselina Arg-H arginální =

C-H

HN

CCHz >3NHC(NHa >2

Hodnoty Rf v následujících příkladech se stanovují silikagelovou chromatografii v tenké vrstvě (Kieselgel 60 F-254) v následujících systémech:

(A) chloroform-methanol-octová kyselina 135:15:1 (B) ethylacetát-kyselina octová-absolutní alkohol 90:10:10 (C) chloroform-methanol-octová kyselina 90:30:5

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-arginalu

DL-l,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-l-karboxylová kyselina (1)

Roztok 1-isochinolin-l-karboxylové kyseliny (12,5 g, 0,072 mmol) v ledové kyselině octové (185 ml) se nechává reagovat s vodíkem na platinovém katalyzátoru (2 g) za tlaku 414 kPa v třepací aparatuře Parr při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Reakční směs se pak zfiltruje přes vrstvu Celitu a filtrát se zkoncentruje ve vakuu. Pevný podíl se trituruje s vodou, zfiltruje se a vysuší se, čímž se získá čistá DL-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-karboxylová kyselina (8 g, 63 % teorie), FD-MS 178 (MÚ), *HNMR (DMSO), δ 2,80-3,00 (m, 3H), 3,10-3,20 (m, 1H), 3,30-3,40 (m, 2H), 7,05-7,25 (m, 4H), 7,65-7,75 (m, 1H).

- 8 CZ 285005 B6 terc.-Butyloxykarbonyl-DL-l,2,3,4-tetrahydro-l-isochinolinkarboxylová kyselina DCHA (2)

Roztok 1,2,3,4-tetrahydro-l-isochinolinkarboxylové kyseliny (1) (7,08 g, 0,040 mol) se rozpustí 5 ve 2N roztoku hydroxidu sodného (40 ml, 0,080 mol) a terc.-butylalkoholu (40 ml). Do reakční směsi se přidá di-terc.-butyldikarbonát (10,5 g, 0,048 mol). Po 24 hodinách při teplotě místnosti se veškerý terc.-butylalkohol odpaří a získaný vodný roztok se extrahuje jednou diethyletherem. Vodná vrstva se oddělí a okyselí se 2N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 2 a extrahuje se ethylacetátem. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. 10 Získaný olej se rozpustí v diethyletheru a do roztoku se přidá dicyklohexylamin (7,9 ml,

0,040 mol). Nechá se stát při teplotě 4 °C (po dobu 4 hodin), sraženina se odfiltruje, promyje se diethyletherem a vysuší se ve vakuu, čímž se získá čistý produkt (15,7 g, 86 % teorie), FD-MS 459 (ΜΡΓ).

Analýza pro C27H42N2O4 vypočteno: C 70,71 H 9,23 N 6,11 nalezeno: C 71,07 H 9,37 N 5,87

Boc-D-l-Tiq-Pro-OH (3)

Boc-DL-l-Tiq-ODCHA (2) (73,4 g, 160 mmol) se suspenduje v ethylacetátu (200 ml), promyje se 1,5N kyselinou citrónovou, pak vodou a vysuší se síranem hořečnatým. Ethylacetátový roztok se odpaří ve vakuu k suchu. Olej se rozpustí v ethylacetátu, ochladí se na teplotu 0 °C a přidá se 2,4,5-trichlorfenol (31,6 g, 160 Mmol), načež se přidá DCC (33 g, 160 mmol). Reakční směs se 25 míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0 °C a ohřeje se na teplotu místnosti a míchá se po dobu 1,5 hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu 0 °C a sraženina se odfiltruje. Matečný louh se odpaří k suchu ve vakuu. Získaný olej se rozpustí v pyridinu (100 ml). Do reakční směsi se přidá prolin (18,42g, 160 mmol) a triethylamin (22,3 ml, 160 mmol). Po 24 hodinách při teplotě místnosti se roztok odpaří k suchu ve vakuu. Získaný zbytek se rozpustí v systému ethyl30 acetát/voda a hodnota pH se nastaví na 9,5 2N roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva se oddělí a okyselí se 2N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 2,0. Okyselená vodná vrstva se pak extrahuje ethylacetátem. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. Získaný olej se rozpustí v methylenchloridu a v ethylacetátu. Roztok se udržuje na teplotě 4 °C po dobu čtyř hodin a sraženina se odfiltruje, promyje se ethylacetátem a překrysta35 luje na jednu ze systému methylenchlorid/ethylacetát. Pevná látka se vysuší ve vakuu za získání čistého Boc-D-l-Tiq-Pro-OH (19,6 g, 33 % teorie), TLC R_f (A) 0,44, FAB-MS 375 (MFT)·

Analýza pro C20H26N2O5 vypočteno: C 64,15 H 7,00 N 7,48 nalezeno: C 63,26 H 6,98 N 7,52 [oc]d = +43,14° c = 0,5 methanol

Boc-Arg(CBZ)-OH (4)

Rozpustí se Boc-Arg(HCL)-OH (82,1 g, 250 mmol) v 5 N roztoku hydroxidu sodného (240 mi) v tříhrdlé baňce s kulatým dnem. Reakční směs se rychle ochladí na -5 °C a hodnota pH se pak udržuje na 13,2 až 13,5 použitím 5N roztoku hydroxidu sodného (250 ml) za přidávání po kapkách benzylchlorformátu (143 ml, 1,0 mol, 4 ekvivalenty) v průběhu 55 min. Reakční směs se 50 míchá po dobu další jedné hodiny při teplotě -5 °C. Pak se zředí 100 ml vody a přidá se 500 ml ethyletheru. Vodná vrstva se oddělí a extrahuje se dvakrát ethyletherem (500 ml). Vodná vrstva se okyselí na hodnotu pH 3,0 3N kyselinou sírovou (560 ml) a extrahuje se ethylacetátem (550 ml). Vodná vrstva se oddělí a extrahuje se jednou ethylacetátem. Spojené organické vrstvy

- 9 CZ 285005 B6 se promyjí vodou a vysuší se síranem hořečnatým. Organické vrstvy se odpaří k suchu ve vakuu, čímž se získá 66,1 g (65 % teorie), Boc-Arg(CBZ)-OH. TLC R, (C) 0,43, FD-MS 405 (NT). 'HNMR (CDCIj), δ 1,42 (s, 9H), 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H), 7,30-7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H).

Boc-Arg(Z)-laktam (5)

Boc-Arg(Z)-OH (4) (66,0 g, 0,162 mol) se rozpustí v suchém tetrahydrofuranu (230 ml) a ochladí se na teplotu -10 °C v lázni ledu a acetonu. Do roztoku se přidá triethylamin (23,5 ml, 1,05 ekvivalentu) a pak isobutylchloroformát (22,5 ml, 1 ekvivalent). Reakční směs se míchá po dobu 5 minut při teplotě -10 °C, načež se přidá N-methylmorfolin (18,7 ml, 1,05 ekvivalentů). Reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě -10 °C a pak po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se vlije do směsi ledu a vody (1 litr), sraženina se odfiltruje, promyje se studenou vodou a vysuší se ve vakuu. Produkt se překrystaluje z ethylacetátu, čímž se získá 38,05 g (60 % teorie) Boc-Arg(Z)-laktamu. TLC Rf (A) 0,77, FD-MS 391 (MH⁺), ’HNMR (CDClj), δ 1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H).

TFA.Arg(Z)-laktam (6)

Boc-Arg(Z)-laktam (5) (38,0 g, 0,097 mol) se vnese do baňky s kulatým dnem obsahující směs trifluoroctové kyseliny (200 ml) a anisolu (20 ml). Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny. Reakční směs se zkoncentruje ve vakuu bez zahřívání. Přidá se diethylether (400 ml) a získaná pevná látka se odfiltruje, promyje se diethyletherem, vysuší se ve vakuu, čímž se získá 40,5 g (103 % teorie) TFA.Arg(Z)-laktamu. TLC Rf (C) 0,29, FD-MS 291 (MET).

Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-Laktam (7)

V první baňce se rozpustí Boc-D-l-Tiq-Pro-OH (3) (17,8 g, 47,5 Mmol) v dimethylformamidu (100 ml) a ochladí se na teplotu -15 °C. Přidá se N-methylmorfolin (5,3 ml, 52,3 mmol) a potom isobutylchlorformát (6,2 ml, 47,5 mmol). Reakční směs se míchá při teplotě -15 °C po dobu dvou minut.

Ve druhé baňce se rozpustí TFA.Arg(Z)-laktam (6) (19,2 g, 47,5 mmol) v dimethylformamidu (40 ml) a ochladí se na teplotu 0 °C. Do roztoku se pak přidá N-methylmorfolin (5,3 ml, 52,3 mmol). Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu dvou minut.

Obsah druhé baňky se vnese do první baňky a reakční směs se míchá při teplotě -15 °C po dobu čtyř hodin. Reakční směs se nechá pomalu přes noc ohřát na teplotu místnosti a přidá se 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Reakční rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a do oleje se přidá roztok ethylacetátu (175 ml) ve vodě (150 ml). Organická vrstva se oddělí a postupně se promyje 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 0,lN kyselinou chlorovodíkovou a opět vodou. Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu, čímž se získá amorfní Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-laktam ve formě pevné látky (24,3 g, 97 % teorie). TLC R_f (A) 0,71, FAB-MS 647 (Mff).

[a]_D = -21,8° c = 0,5 chloroform

Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H (8)

Rozpustí se Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-laktam (7) (23,4 g, 36,2 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (300 ml) a vnese se do baňky s kulatým dnem v prostředí dusíku. Reakční směs se ochladí na teplotu -70 °C. Po kapkách se přidá lithiumaluminiumhydrid v 1M tetrahydrofuranu (37 ml,

-10CZ 285005 B6 mmol) do reakční směsi v průběhu 30 minut. Reakční směs se pak míchá při teplotě -70 °C po dobu 30 minut. Do reakční směsi se přidá po kapkách roztok tetrahydrofuranu (20 ml) a 0,5N kyseliny sírové (20 ml) v průběhu 10 minut. Reakční směs se zředí roztokem ethylacetátu (400 ml) ve vodě (400 ml). Ethylacetátová vrstva se oddělí, promyje se dvakrát vodou (150 ml). Organický roztok se vysuší síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu, čímž se získá Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H (21 g, 89 % teorie) v formě amorfní pevné látky. TLC Rf (A) 0,28.

D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H Sulfát (9)

Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H (8) (17,1 g, 27,9 mmol) se rozpustí v tetrahydrofuranu (200 ml) a ve vodě (80 ml). Do reakční směsi se přidá IN kyselina sírová (28 ml) a 5% palladium na uhlí (3,0 g). Reakční směs se hydrogenuje za teploty a tlaku okolí po dobu pěti hodin. Reakční směs se promyje dusíkem Katalyzátor se odfiltruje přes vrstvu hyflo. Filtrát se zkoncentruje na objem 100 ml ve vakuu a do koncentrátu se přidá n-BuOH (200 ml). Organická vrstva se oddělí a extrahuje se třikrát n-BuOH (100 ml). Extrahované organické vrstvy se spojí a odpaří se ve vakuu. Zbytek se trituruje se systémem diethylether/isopropylether (1 : 1), pevná látka se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 11,08 g surového produktu.

Surový produkt (10,8 g, 19,2 mmol) se rozpustí v roztoku vody (20 ml) a 10N kyseliny sírové (20 ml). Reakční směs se zahříváním udržuje na teplotě 50 °C po dobu 25 minut. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a hodnota pH roztoku se nastaví na 4,0 pryskyřicí BioRad AG1X8 (hydroxidová forma). Pryskyřice se odfiltruje a roztok se lyofilizuje, čímž se získá 8,44 g surového D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H sulfátu.

Vzorek surového produktu (4,2 g) se rozpustí v 0,01% kyseliny sírové a vnese se do dvou sloupců v řadě 5 x 25 cm pryskyřice Vydac C]_g. K eluování peptidu ze sloupce se používá lineárního gradientu 2 až 10 % methylkyanidu. Frakce ze sloupce se shromažďují a spojují se na základě analytických RP-HPLC profilů. Hodnota pH spojených frakcí se upravuje na 4,0 g anexovou pryskyřicí AG1-X8 (Bio-Rad analytická anexová pryskyřice 50 až 100 mesh (průměr ok síta 150 až 300 mikrometrů) v hydroxidové formě. Získaný roztok se zfiltruje a filtrát se lyofilizuje k suchu, čímž se získá 2,4 g (57 % teorie) vyčištěného pepidu. FAB-MS 415 (MH⁺). Aminokyselinové složení: Pro P,92, Tiq 1,00.

[a]_D = - 76,12° c = 0,5/0m01 N kyselina sírová

Analýza pro C₂₁H₃₂N₆O7S vypočteno: C 49,21 H 6,29 N 16,29 S 6,26 nalezeno: C 51,20 H 6,17 N 16,88 S 5,37

Příklad 2

Příprava D-3-Piq-L-Pro-L-Arg-J

D-l,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (1)

Nechává se reagovat D-fenylalanin (50 g, 302 mmol) s 37% roztokem formaldehydu (120 ml) a s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (380 ml) při teplotě zpětného toku. Zahříváním se udržuje na teplotě zpětného toku po dobu 30 minut, přidá se dalších 50 ml formaldehydu a reakční směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu dalších tří hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu -10 °C a sraženina se odfiltruje. Pevný podíl se vysuší ve vakuu, čímž se získá čistá D-l,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (24,2 g, 45% teorie), FDMS 178 (MET).

-11CZ 285005 B6

D-l,2,3,4,6,7,8-Perhydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (2)

Roztok E>-l,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxylové kyseliny (1) (17 g, 96 mmol) ve vodě (200 ml) a ve 20 ml 5N kyseliny chlorovodíkové se nechává reagovat s 5% Rh na oxidu hlinitém (8,5 g) za tlaku 13800 kPa ve vysokotlaké aparatuře při teplotě 120 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se zfiltruje přes vrstvu Celitu a filtrát se vysuší vymrazováním, čímž se získá čistá D-l,2,3,4,6,7,8-perhydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (21 g, 100 % teorie), FD-MS 184 (MFf).

Cbz-D-l,2,3,4,6,7,8-Perhydro-3-isochonolinkarboxyová kyselina (3)

D-3-Piq-OH (2) (21 g, 95,8 mmol) se rozpustí v tetrahydrofuranu (75 ml) a ve vodě (50 ml). Hodnota pH roztoku se upraví 5N roztokem hydroxidu sodného na 10,0. Po kapkách se přidá benzylchlorformát (16,4 ml, 115 mmol) a hodnota pH roztoku se udržuje 5N roztokem hydroxidu sodného na 9,5. Reakční směs se míchá po dobu další jedné hodiny při teplotě místnosti. Organické rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získaný zbytek se rozpustí v diethyletheru (100 ml) a ve vodě (50 ml). Vodná vrstva se oddělí a upraví na 3N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 3,0. Do vodného roztoku se přidá ethylacetát, organická vrstva se oddělí a vysuší se síranem hořečnatým a filtrát se zkoncentruje ve vakuu za získání čisté Cbz-D-l,2,3,4,6,7,8-perhydro-3isochinolinkarboxylové kyseliny (25,8 g, 85 % teorie) ve formě čirého oleje. FD-MS 318 (MFf).

[a]_D = -5,1° c = 0,5 methanol

Cbz-D-l,2,3,4,6,7,8-Perhydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolyl-terc.-butylester (4)

Rozpustí se Cbz-D-3-Piq (3) (17,2 g, 54 mmol) se rozpustí v imethylformamidu (50 ml) a ochladí se na teplotu 0 °C. Do roztoku se přidá prolin-terc-butylester (9,2 g, 54 mmol), 1hydroxybenzotriazol (7,3 g, 54 mmol) a DCC (11,1 g, 54 mmol). Reakční směs se míchá po dobu tří hodin při teplotě 0 °C a pak po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Vytvořená sraženina se odfiltruje a filtrát se ve vakuu zkoncentruje za získání oleje. Olej se rozpustí v ethylacetátu (200 ml) a ve vodě (100 ml). Organická vrstva se oddělí a promyje se postupně IN roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 1,5 N kyselinou citrónovou a opět vodou. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým a filtrát se odpaří za získání oleje, který se pak vysuší, čímž se získá 23,8 g (94% teorie) Cbz-D-l,2,3,4,6,7,8-perhydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolylterc.-butylesteru. Fab-MS 471 (MFf). TLC Rf (A) 0,73.

[a]_D = —40,0° c = 0,5 methanol

CBZ-D-1,2,3,4,6,7,8-Perhydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolin (5)

Cbz-D-3-Piq-Pro-O-t-Bu (4) (31,2 g, 66,3 mmol) se vnese do baňky s kulatým dnem obsahující směs trifluoroctové kyseliny (100 ml) a anisolu (5 ml) a reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs se zkoncentruje ve vakuu bez zahřívání. Přidá se diethylether (150 ml) a voda (100 ml). Hodnota pH roztoku se upraví na 9,8 5N roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva se oddělí a její hodnota pH se 3N kyselinou chlorovodíkovou upraví na 3. Do vodného roztoku se přidá ethylacetát (200 ml), organická vrstva se oddělí, vysuší se síranem hořečnatým a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čirý olej. Olej se rozpustí v diethyletheru (300 ml) a roztok se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Získaná pevná látka se odfiltruje, promyje se diethyletherem a vysuší se, čímž se získá Cbz-D-l,2,3,4,6,7,8-perhydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolin (13,5 g, 49% teorie). FAB-MS 415 (MHj.

-12CZ 285005 B6 [a]_D = -57° c = 0,5 methanol

Analýza pro C23H3ON2O5 vypočteno: C 66,65 H 7,29 N 6,76 nalezeno: C 66,90 H 7,33 N 6,81

Příklad 3

Příprava D-3-T iq-L-Pro-L-Arg-aldehydu

D-l,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolinkarboxyová kyselina (1)

Nechává se reagovat D-fenylalanin (50 g, 302 mmol) s 37% roztokem formaldehydu (120 ml) a s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (380 ml) při teplotě zpětného toku. Zahříváním se udržuje na teplotě zpětného toku po dobu 30 minut, přidá se dalších 50 ml formaldehydu a reakční směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu dalších tří hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu -10 °C a sraženina se odfiltruje. Pevný podíl se vysuší ve vakuu, čímž se získá čistá D-l,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (24,2 g, 45% teorie), FDMS 178 (MFf).

Analýza pro CioHhN0₂ vypočteno: C 67,78 H 6,26 N 7,90 nalezeno: C 68,05 H 6,42 N 7,88

Cbz-D-l,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolinkarboxylová kyselina (2)

Rozpustí se D-3-Tiq-OH (1) (40 g, 225 mmol) v tetrahydrofuranu (200 ml) a ve vodě (200 ml). Hodnota pH roztoku se upraví 5N roztokem hydroxidu sodného na 9,5. Po kapkách se přidá benzylchlorformát (35,4 ml, 248q-OH (1) (40 g, 225 mmol) v tetrahydrofuranu (200 ml) a ve vodě (200 ml). Hodnota pH roztoku se upraví 5N roztokem hydroxidu sodného na 9,5. Po kapkách se přidá benzylchlorformát (35,4 ml, 248 mmol) a hodnota pH roztoku se udržuje 5N roztokem hydroxidu sodného na 9,5. Reakční směs se míchá po dobu delší jedné hodiny při teplotě místnosti. Organické rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získaný zbytek se rozpustí v diethyletheru (200 ml) a ve vodě (50 ml). Vodná vrstva se oddělí a upraví se 5N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 2,8. Do vodného roztoku se přidá ethylacetát (250 ml), organická vrstva se oddělí a vysuší se síranem hořečnatým a filtrát se zkoncentruje ve vakuu za získání čisté Cbz-D-l,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxylové kyseliny (70,0 g, 100% teorie) ve formě čirého oleje. FD-MS 312 (MH⁺).

Cbz-D-l,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolyl-terc.-butylester (3)

Rozpustí se Cbz-D-3-Tiq-OH (3) (70,0 g, 225 mmol) v dimethylformamidu (150 ml) a ochladí se na teplotu 0 °C. Do roztoku se přidá prolin-terc.-butylester (38,5 g, 225 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (30,4 g, 225 mmol) a DCC (46,4 g, 225 mmol). Reakční směs se míchá po dobu tří hodin při teplotě 0 °C a pak po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Vytvořená sraženina se odfiltruje a filtrát se ve vakuu zkoncentruje za získání oleje. Olej se rozpustí v ethylacetátu (250 ml) a ve vodě (125 ml). Organická vrstva se oddělí a promyje se postupně IN roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 1,5 N kyselinou citrónovou a opět vodou. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým a filtrát se odpaří za získání oleje, který se pak vysuší, čímž se získá 93,8 g (89% teorie) Cbz-D-l,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolyl-terc. -butylesteru. Fab-MS 464 (ΜΙΓ). TLC R_f (A) 0,76.

-13CZ 285005 B6 [a]_D - -30,4° c = 0,5 methanol

Cbz-D-1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolinkarboxyl-L-prolin (4)

Cbz-D-3-Tiq-Pro-O-t-Bu (3) (93,6 g, 200 mmol) se vnese do baňky s kulatým dnem obsahující směs trifluoroctové kyseliny (150 ml) a anisolu (7,5 ml) a reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs se zkoncentruje ve vakuu bez zahřívání. Přidá se diethylether (150 ml) a voda (200 ml). Hodnota pH roztoku se upraví na 9,8 5N roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva se oddělí a její hodnota pH se 5N kyselinou chlorovodíkovou upraví na 2,5. Do vodného roztoku se přidá ethylacetát (250 ml), organická vrstva se oddělí, vysuší se síranem hořečnatým a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čirý olej. Olej se rozpustí v diethyletheru (300 ml) a přidá se dicyklohexylamin (40 ml, 200 mmol) do roztoku. Získaný roztok se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Pevný podíl se odfiltruje, promyje se diethyletherem a vysuší se, čímž se získá DCHA sůl Cbz-D-1,2,3,4-tetrahydro-3isochinolinkarboxyl-L-prolinu (103,7 g, 88 % teorie). FAB-MS 409 (MFT).

[a]o = -24,5° c = 0,5 methanol

Konečná syntéza se provádí v podstatě kopulačními reakcemi, popsanými v příkladu 1, čímž se získá D-l-Tiq-L-Pro-L-Arg-aldehyd. FAB-MS 415 (MFT).

[a]_D - -13° c = 0,5 methanol.

Analýza pro C₂iH₃₀N₆O₃. H₂SO₄.2 H₂O vypočteno: C 46,03 H 6,62 N 15,33 nalezeno: C 46,33 H 6,04 N 15,04

Příklad 5

Zkouška in vivo

Dospělí samci psa beagle o hmotnosti přibližně 9 až 14 kg se uspí pentobarbitalem sodným (30 mg/kg živé hmotnosti). Zavedou se trachenové trubičky a psům se přivádí vzduch z místnosti Harvardovým respirátorem (rychlost ventilace 16 cyklů/min., objem 25 ml/kg). Tělesná teplota se udržuje na 37 až 38 °C vyhřívací poduškou. Do levé femorální arterie se zavede katetr k měření phasického tepenného tlaku krve (snímačem Statham P23ID) a do žíly se zavede katetr k infuzi roztoků drogy. Střední arteriální tlak krve se vypočte jako diastolický krevní tlak plus tlak 1/3 pulzu. Srdeční rychlost se sleduje karbiotachometrem řízeným pulzem systolického tlaku, přičemž součin tlaku a rychlosti se monitoruje jakožto myokardiální potřeba kyslíku, (viz Gobel a kol.: The rate pressure product as an indx of myocardial oxygen consumption during axercise in patients with angína pectoris (Součin rychlosti a tlaku jakožto ukazatel myokardiální spotřeby kyslíku při zkouškách u pacientů s angínou pectoris), Circulation 57, str. 549 až 556 (1978)). K zaznamenávání elektrokardiogramu vodiče II k posouzení změn ST segmentu a k určení počátku a trvání arytmie se použije subdemích elektrod. Přímo měřené parametry se zaznamenávají plynule na vícekanálovém oscilografu (Becman Instruments, lne., Fulleron CA; model R611).

Na levé straně se otevře hrudník v pátém mezižebemím prostoru, srdce se zavěsí do perikardiální kolébky a levá obtoková koronární tepna (LCX) se izoluje vzdáleně od její tepenné větve a blíže ke kterékoli komorové větvi. Cejchovanou sondou se měří základní průtok krve obtokovou koronární tepnou (Carolina Medical Electronics, 6 mm I.C.) ve spojení s průtokoměrem Carolina (model FM501). Napřed se u každého psa vyvolá kritická koronární stenóza podvázáním LCX

-14CZ 285005 B6 a vložením jehly č. 18-19 a pak se po odstranění jehly nechá vytékat krev průměrem velikosti jehly. Kritická stenóza se nastaví k utlumení více než 70% vrchlovového přírůstku vytvořeného 10 vteřinovou úplnou okluzí LCX, aniž se změní základní průtok krve. Použití kritické stenózy tímto způsobem popsali Sheehan, F. a Epstein. S: Determinants of arrythmic deth due to Coronary artery spasm: Effect of preexisting coronary artery stenosis on the incidence of reperfusion arrythmia (Určující podmínky arytmické smrti způsobené křečí koronární tepny. Vliv původně existujícího zúžení koronární tepny na vyvolání reperfusní arytmie) Circ. Res. 65, str. 259 až 264, 1982, komezování reperfusní hyperemie a sní spojené srdeční arytmie a potenciálu pro fibrilaci komor. Koronární průtoková sonda se odejme po navození kritického zúžení.

Po navození kritického zúžení (stenózy) a po vyrovnávací periodě se zaznamenávají základní parametry a LCX se úplně stáhne svorkou. Totální okluze LCX se ponechá po dobu jedné hodiny a po ní následuje pětihodinová reperfuse po odejmutí svorky. Kritické zúžení se udržuje po počátečních 30 minut reperfuse. Periodicky se měří odchylka ST segmentu po dobu hodiny okluze LCX, přičemž se intenzita a trvání srdeční arytmie po hodinách posuzuje podle polokvantitativní stupnice 1 = minimální, 2 = střední, 3 = těžká. Pokusy se konají buď pomocí předběžného ošetření, nebo pomocí reperfusního ošetřovacího protokolu. Při protokolu předběžného ošetření se započne s infuzí i.v. sodného nebo drogového roztoku 15 minut před okluzí LCX a pokračuje se až do konce pětihodinové reperfusní periody. Při reperfusním protokolu se započne s kontinuální pětihodinovou i.v. infuzí solanky nebo roztoku drogy v době reperfuse, následující po jednohodinové okluzi LCX.

Po reperfusi se srdce rychle vyřízne k měření infarktu pomocí zabarvení systémem trifenyltetrazolium/Evansova modř (Shea a kol.: The beneficial effects of nafazatrom (Bay g 6575) on experimental coronary trombosis (Blahodárné účinky nafazatromu na experimentální srdeční trombózu), Am. Heart J. 107, str. 629 až 637, 1984 a Shea a kol.: Beneficial effects of nafazatrom on ischemic reperfused myocardium (Blahodárné účinky nafazatromu na ischemický reperfusovaný myokard) Eur. J. Pharmacol 102, str. 63 až 70, 1984, podle úpravy Hahna (Hahn a kol.: Antagonism of leukotriene B₄ receptors does not limit canine myocardial infarct size (Antagonismus receptorů leukotrienu B₄ neomezuje rozsah infarktu myokardu u králíků. J. Pharmacol. Exp. Ther. 253, str. 58 až 66, 1990). Zavedou se kanyly do aorty nad koronární ostia a do LCX v místě dřívější okluze. Lůžko LCX se zaplaví 1,5% roztokem trifenyltetrazolia ve 20 mM pufru fosforečnanu draselného (hodnota pH 7,4, 38 °C), zatímco zbytek srdce se současně zaplatí aortou 0,1% Evansovou modří v solance. Perfusní tlak se udržuje konstantní 13332,2 Pa a trvání myokardiální perfuse je přibližně 5 minut. Srdce se pak rozřeže kolmo k ose hrot-báze na šest plátků o přibližné tloušťce 1 cm. Myokardium, zaplavené koronárními arteriemi jinými než obtokovou, se zbarví modře, životaschopná levá komora v rámci distribuce obtokovou arterií (riziková hmota) se zbarvi cihlově červeně, zatímco infarktovaná levá komora se zbaví pravého komorového svalu a chlopňové a tukové tkáně, odsaje se do sucha a pak se rozloží na čirou plastovou podložku k planimetrickému měření velikosti příslušných ploch. Každá plocha myokardu se také rozpitvá a zváží ke gravimetrické kvantifikaci. Rezové a kumulativní velikosti infarktu se vyjádří v procentu hmoty levé komory vystavené riziku.

-15CZ 285005 B6

Tabulka I

Vliv zkoušených sloučenin na velikost infarktu myokardu následující po kluži koronární arterie

a reperfusi Ošetření*	Protokol	Míra infuze (mg/kg (h))	Velikost infarktu v jednotkách a
Solanka		—	42,4 ± 4,0b
Sloučenina 6	předběžně	2,0	25,1 ±5,9C
Solanka		—	40,1 ±4,1
Sloučenina 6	reperfuse	2,0	26,5 ± 4,7C
Solanka		—	38,4 ± 3,4
Sloučenina 5	reperfuse	0,5	24,1 ±6,3C
Solanka		—	48,3 ± 5,8
Sloučenina 5	reperfuse	1,0	28,9 ±3,5°
Solanka		—	38,4 ±3,4
Sloučenina 3	reperfuse	1,0	19,0 ± 2,6C
Solanka		—	48,3 ± 5,8
Sloučenina 4	reperfuse	1,0	26,0 ± 5,5C
Solanka		—	48,3 ± 5,8
Sloučenina 1	reperfuse	1,0	17,5 ±2,7°
Solanka		—	45,9 ± 6,6
Sloučenina 2	reperfuse	1,0	21,8 ± 4,3C

* vzorec a jméno sloučeniny 1 až 6 je na straně popisu 6 a 10 ^a jednotky velikosti infarktu = % infarktové hmoty/hmota vystavená riziku ^b střední hodnota 8 až 9 psů ^c statisticky významné z kontroly solanky (P < 0,5)

Údaje v tabulce I ukazují, že každá ze zkoušených pokusných sloučenin je schopna obsáhnout velikost infarktu myokardu vyplývající z okluze koronární arterie a reperfuse, jsou-li podávány v klinicky relevantním protokolu. Jelikož okluze koronární arterie a reperfuse bylo dosaženo mechanickým sevřením, nebyla účinnost rozsahu infarktu způsobena prevencí velkého okluzního trombu uvnitř infarktem postižené arterie. K. záchraně ventrikulámí tkáně každou z těchto sloučenin došlo s nepatrnými nebo vůbec žádnými kardiovaskulárními, elektrokardiografickými náchylnostmi nebo krvácivostí.

Mechanizmus, jakým sloučeniny podle vzorce I omezují ischemické poškození, není znám. Toto biologické působení může souviset s vlastnostmi těchto sloučenin inhibovat proteázu. Bylo prokázáno, že aprotinin, inhibitor serinové proteázy, schopný působit proti alespoň plasminu, tripsinu a kallikreinu, omezuje ischemické poškození myokardu spojené se zúžením koronární arterie (Diaz a kol.: Effect of Kallikrein Inhibitor Aprotinin on Myocardial Ischemic Injury Following Coronary Artery Occlusion in the Dog [Účinek aprotininu, inhibitoru kallikreinu, na ischemické poškození myokardu následující po okluzi koronární arterie u psů] Am.J. Cardiol. 40, str. 541 až 549, 1977). Také zde bylo prokázáno, že aprotinin významně redukuje velikost myokardiálního infarktu, k němuž dochází po zúžení koronární arterie a reperfusi; velikost infarktu byla 37,9 ± 5,4 % hmoty levé komory při riziku nekrosy u kontrolních psů a 24,8 ± 2,4 %

-16CZ 285005 B6 (P < 0,05) u psů s infuzí aprotininu. Není známo, zda mechanizmy jimiž působí aprotinin a sloučeniny podle vzorce I jsou podobné.

Uvedené studie obsahovaly také vyhodnocení dispozice leukocytů (neuthrophil) při započetí vývoje infarktu myokardu. Žádná ze zkoušených sloučenin podle vzorce I neměnila významně vývoj systemické leukocytosy v odezvě na ischemické poškození, nebo akumulaci leukocytů uvnitř ischemického a infarktového myokardu.

Souhrnně řečeno, prokázaly všechny sloučeniny podle vzorce reprezentativního vzorku schopnost minimalizovat a zvládnout poškození tkání vyvolané ischemií a reperfusí. Tato významná terapeutická vlastnost byla prokázána předvedením, že všechny zkoušené sloučeniny zvládly infarkt myokardu plynoucí z okluze a reperfuse koronární artérie. Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I se hodí k minimalizaci a zvládání reperfusního poškozování tkání a především k ošetřování infarktu myokardu u lidí.

Průmyslová využitelnost

Určité tripeptidové deriváty arginových sloučenin jsou vhodné ke zvládání infarktu myokardu plynoucího z okluze a reperfuse koronární artérie a především k ošetřování infarktu myokardu u lidí.

Claims (3)

PATENTOVÉ NÁROKY

1- nebo 2II o

R

-17CZ 285005 B6 nebo a chirální centrum pro A je DL, s výhodou D, L pro Pro a L pro Arg,

Z alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atom vodíku,

X NH₂, NHZ, terč-butyloxy karbony I-NH skupinu, acetyl-NH skupinu nebo trifluoracetylNH skupinu,

R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, trifluormethylovou skupinu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu NO₂ nebo NH₂; a q skupinu CH₂ nebo CO, pro přípravu farmaceutického prostředku určeného k ošetřování reperfusního poškození.

1. Použití sloučeniny obecného vzorce I

A-Pro-Arg-H (I) kde znamená

2. Použití sloučeniny podle nároku 1, obecného vzorce I, kde jednotlivé symboly mají v nároku 1 uvedený význam, pro přípravu prostředku pro ošetřování reperfusního poškození, kterým je myokardiální infarkt.

3. Použití sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I ze souboru zahrnujícího D-3-Piq-LproIyl-L-arginal, D-7-hydroxyl-l ,2,3,4-Tiq-3-karbonyloxy-L-prolyl-L-arginal, D-3-Tiq-Lprolyl-L-arginal, D-l,2,3,4-Tiq-l-karbonyl-L-prolyl-arginal, N-methyl-D-fenylalanyl-Lprolyl-L-arginal a N^a-terc.-butyloxykarbonyl-D-fenylanyl-L-prolyl-arginal pro přípravu prostředku k minimalizaci a k ošetření reperfusního poškození.