CN1092780A - 减少和抑制局部缺血和再灌注损伤的方法 - Google Patents

减少和抑制局部缺血和再灌注损伤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种减少和抑制当组织遭到局部缺 血和再灌注时引起的损伤的方法。本方法包括当重 新建立血流流向局部缺血组织的同时或其后立即用 某些衍生的三肽精氨醛化合物给药。该方法特别有 用于减少和抑制发展中的心肌梗塞形成期间对心脏 的损伤。

Description

本发明涉及发现了一组已知的三肽精氨醛衍生物可用于减少和抑制由于组织遭到局部缺血和再灌注而引起的损伤。作为抑制在发展中的心肌梗塞形成和再灌注时引起的局部缺血损伤的心脏保护剂，本方法特别有用。
当某细胞区域的血流不足以支持正常的新陈代谢活动时即出现局部缺血。假如这种情况持续了一段时间，局部缺血区域内的细胞就会死亡。再灌注是用于描述对局部缺血组织重新建立血流行为所使用的术语。因此，再灌注对于局部缺血区域内的细胞继续存活是十分重要的。但是众所周知，再灌注本身对许多幸免于局部缺血的细胞会引起不可弥补的损伤。因此，能够减少和抑制局部缺血和再灌注损伤的化合物是十分重要的治疗剂。这些化合物特别有用于制备药物和药物制剂以便治疗受折磨的病人。
再灌注损伤主要是炎症过程的结果，再灌注的局部缺血组织吸引能释放蛋白水解酶和氧化剂的白细胞，这又促进了进一步发炎并带来最终治愈和疤痕。因为白细胞衍生的蛋白水解酶和氧化剂是非选择性的，它们能够降解正常的组织及可逆转的损伤组织。因此，在炎症过程中减弱炎症反应或抑制最有害的物质对于减小和抑制再灌注损伤是合理的方法。
发展中的心肌梗塞形成是一种进行性过程，此时心肌层不能接受足够的血液供应以便支持正常的新陈代谢活动，并且一般是由冠状动脉闭塞引起的。因为心脏稳定的、相对高的新陈代谢活动及许多缓解冠状动脉闭塞的疗法，发展中的心肌梗塞形成对于再灌注损伤大概是最通常并且是最严重的后果。
许多治疗措施如血管成形术，外科分流术及溶解血栓的方法能使闭塞的冠状动脉通畅并导致心肌和再灌注损伤。参见Lucchesi等人：“白细胞和局部缺血引发的心肌损伤”（Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：159-163，1985）及Engler，R.L，：“自由基和在心肌局部缺血及再灌注期间的粒性白细胞介导的损伤”（Am.J.Cardiol.63：19E-23E，1989）。
因为恢复的白细胞是和由冠状动脉闭塞及再灌注引起的扩展中的心肌梗塞形成有关的，因此中性白细胞的介入对于减少和抑制进展中的心肌梗塞形成是一种合乎逻辑的方法。这种中性白细胞的介入包括中性白细胞减少诱导、抗粘连分子单克隆抗体及氧化剂清除剂。参见Romson等人：“在狗体内由于中性白细胞排除导致的局部缺血性心肌损伤程度的降低”（Circulation  67：1016-1023，1983）;Mullane等人;“在已麻醉的狗体内在急性心肌梗塞形成中白细胞的作用：与使用抗炎药对心肌抢救的关系（J.Pharmacol.Exp.Ther.228：510-522，1984）;Mitson等人：“在狗体内中性白细胞排除后N-2-巯基丙酰基甘氨酸对心肌再灌注损伤的保护作用：细胞内衍生的自由基作用的证实”（Circulation  73：1077-1086，1986）;Mitson等人：“犬的心肌再灌注损伤：自由基清除剂N-2-巯基丙酰基甘氨酸的保护作用（J.Cardiovasc.Pharmacol.8：978-988，1986）;Jolly等人：“犬心肌再灌注损伤：超氧化物歧化酶和过氧化氢酶联合用药引起的损伤降低（Circ.Res.54：277-285，1984）;Simpson等人;“通过抑制白细胞粘连的单克隆抗体（Anti-Mol）使实验的犬心肌局部缺血和再灌注损伤的减少（Circulation  76：AO799，1987）及Jolly等人：”中性白细胞排除使心肌梗塞大小减小：闭合时间效应（Am.Heart  J.112：682-690，1986）。
现在惊异地发现，一组已知抑制几种蛋白酶活性的化合物能够抑制并减少由于局部缺血和再灌注引起的组织损伤。在一种新的方法中，这些化合物对于减少在心肌梗塞形成和再灌注期间引起的心脏损伤效应是特别有用的。
本发明是一种减少和抑制再灌注损伤的方法，它包括对需要这种治疗的哺乳动物给有效无毒量的如下通式的化合物：
其中
A是1或2个
Figure 93112994X_IMG2
并且对A，其手性中心为DL，优选D;对于Pro，手性中心为L;对于Arg，手性中心是L;
Z是C1-C4烷基或H;
X是NH2、NHZ、叔丁氧羰基-NH、乙酰基-NH或三氟乙酰基-NH;
R是H、OH、卤素、C1-C4烷氧基、CF3、C1-C4烷基、NO2或NH2以及
q是CH2或CO。
用于本发明方法中的化合物一般是本技术领域公知的。参见U.S.4703036及其参考文献以及EP-A-0479489，以及Bajusz等人“高活性及选择性抗凝血剂：D-Phe-Pro-Arg-H，易于自发失活的游离三肽醛及其稳定的N-甲基衍生物D-MePhe-Pro-Arg-H（J.Med.Chem.33：1729-1735，1990）。
脯氨酸和精氨酸残基的α-碳原子是L-构型以及取代基A的α-碳原子是DL构型，优选D。
在本方法中，式Ⅰ化合物的可药用的盐也可用于制备药剂及药物，包括和无机酸及羧酸形成的酸加成盐。形成盐的无机酸例如是氢卤酸，特别是盐酸和氢溴酸，磷酸及硫酸。使用如醋酸、丙酸、丙二酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯甲酸、富马酸等羧酸形成羧酸盐。酸加成盐按常规的方法制备，例如用酸来中和游离碱形式的式Ⅰ化合物。优选的酸加成盐是硫酸盐和盐酸盐。
本发明还提供了在上述治疗方法中使用的药物。本发明的药物制剂包括再灌注损伤减少有效量的以式Ⅰ表示的化合物及可药用的载体。对于口服给药，可将式Ⅰ化合物配制成明胶胶囊剂或压成片剂，它们可以含有可药用的赋形剂如粘合剂、润滑剂、崩解剂等。该化合物也可制备成持续释放的制剂。例如，该化合物可在各种水凝胶基质的任何一种中制备成药剂，以便在不同时间周期内释放该化合物。对于非肠道给药，本化合物能在例如生理食盐水（0.9%）、5%葡萄糖及Ringer′s溶液等可药用的稀释剂中配制。
式Ⅰ表示的化合物可以用已知的肽偶联法制备，参见一般文献及Dugas和Penney：Bioorganic  Chemistry  13-82（1981）。按照上述的一个方法，使羧酸AcooH（其中A有和式Ⅰ定义中的相同含意）和羧基已保护的脯氨酸偶联形成二肽（当A是氨基酸时）或形成N-酰基脯氨酸酯（当A不是氨基酸时）。产品中脯氨酸部分中的保护羧基的酯基被除去后，其游离酸形式的二肽再和内酰胺形式的精氨酸偶联，上述反应过程可用以下反应流程说明：
Figure 93112994X_IMG4
其中P代表氨基保护基。
已偶联的Arg（P）内酰胺产品（C）在惰性溶剂中与氢化锂铝反应以打开内酰胺环，得到以下式表示的精氨酸醛形式的三肽：
其中Arg（P）-H表示氨基已被保护的精氨酸醛。
内酰胺形式的精氨酸可通过氨基已被保护的精氨酸（Agr-OH）的分子内偶联得到。例如，以下式：
表示的Boc-Arg（Cbz）OH，其中Boc为叔丁氧羰基及Cbz为苄氧羰基，被首先用氯甲酸酯如氯甲酸乙酯至氯甲酸异丁酯转化成活性酯形式，例如活性混合酸酐。酯的形成在叔胺例如N-甲基吗啉存在下进行。加入更强的叔胺碱如三乙胺可完成内酰化反应，得到内酰胺形式的双氨基已被保护的精氨酸，如下所示：
Figure 93112994X_IMG6
在用于与A（C＝0）-Pro-OH偶联之前（如上面反应流程所示），用三氟乙酸选择性地除去Boc保护基，以便得到必要的游离氨基基团。
当A是氨基酸残基时，ACOOH化合物和脯氨酸酯的偶联首先要保护该氨基酸的氨基。可采用通常用于暂时保护或阻碍氨基时所使用的常规氨基保护基。这种保护基的例子包括烷氧基、链烯氧基、环烷氧基及芳氧羰基如乙氧羰基、叔丁氧羰基、环己氧羰基、金刚烷氧羰基、三氯乙氧羰基、苄氧羰基、二苯基甲氧羰基等。
在偶联反应过程中保护脯氨酸羧基所采用的酯基可以是任何通常使用的易于除去的酯基，如叔丁基、苄基、对硝基苄基、对甲氧苄基、二苯甲基、三氯乙基、苯甲酰甲基或三烷基甲硅烷基酯，在完成偶联反应中，对于脯氨酸我们采用在氨基保护基能够保留的条件下而易于除去的酯基。因此在其后的与精氨酸内酰胺化合物偶联形成A-（C＝0）-Pro-Arg（P）内酰胺的反应过程中，酰化酸A-COOH的氨基保护基可以保留在氨基保护的位置。
上述偶联反应在较低的温度下优选在-20°-15℃之间进行。偶联反应在惰性有机溶剂中进行，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿等普通溶剂。一般来说，当使用酰化酸的活性酯时，在偶联反应中应采用无水操作条件。
本发明化合物优选以酸加成盐形式分离出来。式Ⅰ化合物和酸（例如上面提到的酸）所形成的盐可用作可药用的盐，它们可用作再灌注损伤减少剂给药及用于制备这些药物制剂。在分离和纯化上述肽时，也可以制备和使用其它酸加成盐，例如和磺酸如甲磺酸、正丁磺酸、对甲苯磺酸及萘磺酸形成的盐也可被采用。
在制备所需的稳定的盐形式的同时，分离和纯化式Ⅰ表示的化合物的方法是本技术领域公知的。按照一种这样的方法，通过用C18反相色谱法制备提纯，可得到稳定的无机酸盐，包括硫酸盐和盐酸盐。水相含有硫酸或盐酸，其浓度约为0.01%-0.05%，并且含有乙腈、THF（四氢呋喃）、甲醇或其它适当溶剂作为有机组份。酸洗脱液的pH值调节在约pH4-pH6之间，精确的pH值和具体的肽及羟基形式的碱性树脂（如Bio-Rad  AG-1×8）有关。调节pH后，将三肽盐溶液（例如硫酸盐或盐酸盐）冷冻干燥，即可得到干粉形式的纯净的盐。
在本发明中特别有用的最优选的式Ⅰ化合物是：
化合物1：D-3-Piq-L-脯氨酰-L-精氨醛（硫酸盐）
Figure 93112994X_IMG7
化合物2：D-7-羟基-1，2，3，4-Tiq-3-羰氧基-L-脯氨酰-L-精氨醛（双盐酸盐）
Figure 93112994X_IMG8
化合物3：D-3-Tiq-L-脯氨酰-L-精氨醛（硫酸盐）
Figure 93112994X_IMG9
化合物4：D-1，2，3，4-Tiq-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛（盐）
Figure 93112994X_IMG10
化合物5：N-甲基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛（盐）
Figure 93112994X_IMG11
化合物6：Na-叔丁氧羰基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛（盐）
Figure 93112994X_IMG12
通过对哺乳动物给药式Ⅰ化合物，以便大约在重新建立足够的血流流向细胞局部缺血区域时血流中含有有效浓度的该化合物，由此实现了本发明。尤其是，在重新建立令人满意的血流流向局部缺血区域时，血流中应当含有有效量的该化合物。但在局部缺血区域被再灌注之后即获得本化合物有效的血药水平也是同本方法一致的。
本化合物可口服、非肠道给药，例如静脉输注或注射或者将注射和输注（iv）结合给药，也可肌内给药（im）或皮下给药（sc）。优选静脉输注。依赖于本化合物的相对效力及局部缺血区域的范围，本化合物的有效血药浓度应在再灌注后维持至少1小时至数天。
有效剂量范围从约5mg至约1000mg，该剂量依给药方式而有所不同。对于口服，im及sc方式，最好需要在重新建立血流达到局部缺血组织之前给药，以便使本化合物进到血液中。
在一优选的方式中，输注速度范围为约0.2-5.0mg/kg/小时维持1-10小时，更优选1-10小时内约0.5-2.0mg/kg/小时。在闭塞性血栓引起的心肌梗塞情况下，本发明化合物可以和血栓溶解治疗一起施用或者随后立即进行血栓溶解治疗。
在本发明的另一方式中，式Ⅰ化合物可以和氧化剂清除剂一起给药。不以任何方式限制本发明的范围的氧化剂清除剂的具体例子包括超氧化物歧化酶及N-巯基丙酰基甘氨酸。对于本发明的目的，联合给药是包括在用式Ⅰ化合物给药之前或之后的短时间内给药。联合给药还意味着，在血液中含有有效量的联合给药的化合物，也含有有效量的式Ⅰ化合物。
在本发明的又一方式中，式Ⅰ化合物与β-阻断剂一起给药。不以任何方式限制本发明范围的β-阻断剂的具体实例包括心得安、甲氧乙心安和氨酰心安。本发明的另一方式包括式Ⅰ化合物和阿斯匹林一起给药。本发明还包括将式Ⅰ化合物和氧化剂清除剂，β-阻断剂或阿斯匹林以某种结合方式联合给药。
提供下述实施例以便有助于说明如何实现本发明以及说明所请求保护的方法的预期优点。实施例不以任何方式限制本发明的范围。
在实施例中使用的缩写字有以下含意：
氨基酸：Arg＝精氨酸;Pro＝脯氨酸
Boc＝叔丁氧羰基
Bzl＝苄基
Cbz＝苄氧羰基
DCC＝二环己基碳二亚胺
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
FAB-MS＝快原子轰击质谱
FD-MS＝场解吸质谱
THF＝四氢呋喃
TLC＝薄层色谱
Tiq＝四氢异喹啉
D-1-Tiq＝D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸
D-3-Tiq＝D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸
D-3-Tiq＝D-1，2，3，4，5，6，7，8-全氢异喹啉-3-羧酸Arg-H＝精氨醛＝
下述实施例中的Rf值用硅胶薄层色谱法测定（Kieselgel  60F-254），使用以下体系：
（A）氯仿-甲醇-乙酸，135∶15∶1
（B）乙酸乙酯-乙酸-无水乙醇，90∶10∶10
（C）氯仿-甲醇-乙酸，90∶30∶5
实施例1
D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛的合成
DL-1，2，3，4-四氢-1-异喹啉羧酸（1）
于60psi下在帕尔振荡器中使1-异喹啉羧酸（12.5g，0.072mol）在冰醋酸（185ml）中的溶液和氢气在氧化铂（2g）上室温反应24小时，反应混合物用硅藻土垫过滤，真空浓缩滤液，固体用水研制，过滤，干燥得纯的标题化合物（8g，63%）。FD-MS
178（MH+）;1HNMR（DMSO）δ2.80-3.00（m，3H），3.10-3.20（m，1H），3.30-3.40（m，2H），7.05-7.25（m，4H），7.65-7.75（m，1H）。
叔丁氧羰基-DL-1，2，3，4-四氢-1-异喹啉羧酸DCHA（2）
将1，2，3，4-四氢-1-异喹啉羧酸（1）（7.08g，0.040mol）的溶液溶于2N NaOH（40ml，0.080mol）及叔丁醇（40ml）中，然后往该反应混合物中加重碳酸二叔丁基酯（10.5g，0.048mol）。于室温反应24小时之后，蒸掉大部分叔丁醇，所得水溶液用乙醚萃取一次，分离水层并用2N HCl酸化至pH2.0，再用乙酸乙酯萃取，有机溶液用硫酸镁干燥并真空浓缩至干，将所得油状物溶在乙醚中，随后往该溶液中加二环己基胺（7.9ml，0.040mol），于4℃静置4小时后，过滤沉淀，用乙醚洗，真空干燥，得纯产品（15.7g，86%）。FD-MS 459（MH+）;元素分析：计算值C27H42N2O4：C，70.71;H，9.23;N，6.11。
测定值：C，71.07;H，9.37;N，5.87.
Boc-D-1-Tiq-Pro-OH  （3）
将Boc-DL-1-Tiq-ODCHA（2）（73.4g，160mmol）悬浮于EtOAc（200ml）中，用1.5N柠檬酸洗，再用水洗，然后用硫酸镁干燥。于真空中将EtOAc浓缩至干。油状物溶于EtOAc中，冷至0℃，加2，4，5-三氯苯酚（31.6g，160mmol），再加DCC（33g，160mmol）。反应混合物于0℃搅拌1小时后温热至室温并再搅拌1.5小时。反应混合物被冷至0℃，过滤沉淀，真空下将母液浓缩至干，所得油状物溶于吡啶（100ml）中。将脯氨酸（18.42g，160mmol）和三乙胺（22.3ml，160mmol）加到反应混合物中，室温反应24小时后，真空中将溶剂浓缩至干。将所得残留物溶在EtOAc/水中，用2N NaOH把pH调到9.5，分离水层，用2N HCl酸化至pH2.0。将己酸化的水层用乙酸乙酯萃取，有机溶液用硫酸镁干燥并真空浓缩至干，所得油状物溶于二氯甲烷及EtOAc中，该溶液于4℃放置4小时。过滤沉淀，用EtOAc洗涤，从二氯甲烷/EtOAc中重结晶一次，固体于真空中干燥，得纯产品（19.6g，33%）。TLC Rf（A）0.44;FAB-MS，375（MH+）;元素分析：计算值：C20H26N2O5：C，64.15;H，7.00;N，7.48。
测定值：C，63.26;H，6.98;N，7.52;[a]D＝+43.140  C＝0.5  MeOH
Boc-Arg（CBZ）-OH  （4）
在3颈圆底烧瓶中，将Boc-Arg（HCl）-OH（82.1g，250mmol）溶于5N NaOH（240ml）中。反应物被冷至-5℃，当在55分钟内滴加氯甲酸苄酯（143ml，1.0mol，4eq）时，用5N NaOH（250ml）使pH维持在13.2-13.5之间。于-5℃再搅拌反应1小时，用100ml水和500ml Et2O稀释。分离水层并用Et2O（500ml）萃取两次，水层用3N H2SO4（560ml）酸化至ph3.0，再用EtOAc（550ml）萃取。分离水层，用EtOAc萃取一次。合并的有机层用水洗涤后用硫酸镁干燥，有机层于真空中浓缩至干，得66.1g标题化合物（理论产量的65%）。TLCRf（C）0.43;FD-MS 408（M+）;1HNMR（CDCl3）δ1.42（s，9H），1.61-1.91（m，4H），3.23-3.41（m，2H），4.17（d，1H），5.21（s，2H），5.62（d，1H），7.30-7.42（m，6H），8.37（m，1H）。
Boc-Arg（z）-内酰胺（5）
将Boc-Arg（Z）-OH（4）（66.0g，0.162mol）溶于无水THF（230ml）中并在冰-丙酮浴上冷至-10℃。往溶液中加三乙胺（23.5ml，1.05eq），再加氯甲酸异丁酯（22.5ml，1.05eq）。于-10℃将反应搅拌5分钟，随后加入N-甲基吗啉（18.7ml，1.05eq）。于-10℃搅拌反应1小时，再于室温搅拌1小时，将反应物倒入冰水（1L）中，过滤所得沉淀，用冷水洗，然后真空中干燥。产品从EtOAc中重结晶，得到38.05g（理论量的60%）标题化合物。TLC  Rf
（A）0.77;FD-MS 391（MH+）;1HNMR（CDCl3）δ1.48（s，9H），1.78-1.98（m，2H），2.50（m，1H），3.41（m，1H），4.43（m，1H），4.90（m，1H），5.16（s，2H），5.27（m，1H），7.28-7.45（m，6H），9.41（m，1H），9.68（m，1H）。
TFA·Arg（Z）-内酰胺（6）
将Boc-Arg（Z）-内酰胺（5）（38.0g，0.097mol）加到含三氟乙酸（200ml）和苯甲醚（20ml）混合物的圆底烧瓶中，于0℃搅拌反应混合物1小时，不加热而在真空中浓缩反应物，加乙醚（400ml），过滤所得固体，用乙醚洗涤，然后真空干燥得40.5g标题化合物（理论量的103%）。TLC Rf（C）0.29;FD-MS 291（MH+）
Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg（Z）-内酰胺（7）
在烧瓶1中，将Boc-D-1-Tiq-Pro（3）（17.8g，47.5mmol）溶解于DMF（100ml）中，冷至-15℃。然后加N-甲基吗啉（5.3ml，52.3mmol），再加氯甲酸异丁基酯（6.2ml，47.5mmol），于-15℃将反应混合物搅拌2分钟。
在烧瓶2中，将TFA·Arg（Z）-内酰胺（6）（19.2g，47.5mmol）溶于DMF（40ml）中，并冷却至0℃。往该溶液中加N-甲基吗啉（5.3ml，52.3mmol），反应混合物于0℃搅拌2分钟。
将烧瓶2中的反应物加到烧瓶1中，将反应混合物于-15℃搅拌4小时，反应混合物被慢慢温热至室温过夜，随后加5%NaHCO3（5ml）。真空中除去反应溶剂并将EtOAc（175ml）在水（150ml）中的溶液加到油状物中。分离出有机层，然后连续用5% NaHCO3、水、0.1N HCl及水洗涤。有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩至干，得到标题化合物的无定形固体（24.3g，理论量的79%）。
TLC Rf（A）0.71;FAB-MS 647（MH+）;[a]D＝-32.80 C＝0.5 CHCl3
Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg（Z）-H  （8）
在氮气氛下将Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg（Z）-内酰胺（7）（23.4g，36.2mmol）溶解于无水THF（300ml）中并置之于圆底烧瓶中。反应被冷至-70℃。在30分钟内将于THF（37ml，37mmol）中的氢化锂铝（1M）滴加到反应物中，然后于-70℃搅拌反应30分钟。在10分钟内将THF（20ml）和0.5N H2SO4（20ml）的溶液滴加到反应混合物中。反应用在水（400ml）中的EtOAc（400ml）溶液稀释。分离EtOAc层，用水（150ml）洗2次，有机溶液用硫酸镁干燥，真空浓缩至干，得21g无定形固体状的标题化合物（理论量的89%）。TLC（Rf（A）0.28。
D-1-Tiq-Pro-Arg-H硫酸盐（9）
将Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg（Z）-H（8）（18.1g，27.9mmol）溶于THF（200ml）和水（80ml）的溶液中。然后向反应中加入1N H2SO4（28ml）和5% Pd/C（3.0g），于环境温度及压力下使反应氢化5小时，反应用氮气流冲洗并用Hyflo垫过滤除去催化剂。于真空中将滤液浓缩至100ml，随后将正丁醇（200ml）加到浓缩液中。分离有机层，水层用正丁醇（100ml）萃取3次，合并萃取的有机层并于真空中浓缩，残留物用Et2O/二异丙醚（1∶1）研制，过滤固体，真空干燥，得11.08g粗产品。
将上述固体（10.8g，19.2mmol）溶于水（20ml）和10N H2SO4（20ml）的溶液中，反应被加热到50℃并保持25分钟。将反应冷至室温，用BioRad AG1-X8树脂（羟基型）调溶液的pH值至4.0。滤去树脂，将溶液冻干，得8.44g粗品标题化合物。
将上述粗品标题化合物试样（4.2g）溶在0.01% H2SO4中并上样至两支串联在一起的5×25cm Vydac C18树脂柱中。用2%-10% CH3CN进行线性梯度洗脱，以便从柱上洗下肽。根据分析RP-HPLC图型分段收集柱级份，用羟基型的AG1-X8树脂（Bio-Rad分析用阴离子交换树脂50-100目）将合并的级份调至pH4.0。过滤所得溶液，将滤液冻干，得2.4g纯的肽（理论量的57%）。FAB-MS 415（MH+）;氨基酸分析：Pro，0.92;Tiq，1.00;[α]D＝-76.12°C＝0.5/0.01N H2SO4;元素分析：计算值C21H32N6O7S C，49.21;H，6.29;N，16.29;S，
测定值：C，51.20;H，6.17;N，16.88;S，5.37。
实施例2
D-3-Piq-L-Pro-L-Arg-H的合成
D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧酸（1）
将D-苯基丙氨酸（50g，302mmol）和37%甲醛溶液（120ml）及浓HCl（380ml）于回流温度下反应。回流30分钟后，再加50ml甲醛。再使反应回流3小时。反应冷却至-10℃，滤出沉淀，真空干燥固体，得纯的标题化合物（24.2g，45%）。FD-MS 178（MH+）。
D-1，2，3，4，6，7，8-全氢-3-异喹啉羧酸（2）
于2000psi及120℃时，使D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧酸（1）（17g，96mmol）在水（200ml）及20ml 5N HCl中的溶液中用5%R h/Al2O3（8.5g）在高压釜中反应16小时，用硅藻土垫过滤反应混合物，将滤液冻干，得纯的标题化合物（21g，100%）。FD-MS 184（MH+）。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氢-3-异喹啉羧酸（3）
将D-3-Piq-OH（2）（21.0g，95.8mmol）溶于四氢呋喃（75ml）和水（50ml）中，用5N NaOH调溶液至pH 10.0，滴加氯甲酸苄酯（16.4ml，115mmol），并用2N NaOH维持pH在9.5。于室温再搅拌反应混合物1小时，真空蒸发有机溶剂，并将所得残留物溶在乙醚（100ml）和水（50ml）中，萃取水层，用3N HCl调pH至3.0。往水溶液中加乙酸乙酯（250ml），分出有机层，并用硫酸镁干燥，真空浓缩滤液，得澄清油状的纯标题化合物（25.8g，85%），FD-MS 318（MH+），[α]D＝-5.1°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氢-3-异喹啉羧基-L-脯氨酰-叔丁酯（4）
将Cbz-D-3-Piq（3）（17.2g，54mmol）溶于DMF（50ml）中并冷至0℃，然后将脯氨酸叔丁酯（9.2g，54mmol）、1-羟基苯并三唑（7.3g，54mmol）和DDC（11.1g，54mmol）加入到上述溶液中，于0℃搅拌反应3小时，再于室温搅拌24小时，过滤反应沉淀物，真空浓缩滤液得油状物，将该油状物溶在EtOAc（200ml）和水（100ml）中，分离有机层，并连续用1N NaHCO3、水、1.5N柠檬酸及水洗涤。用硫酸镁干燥有机层，蒸发滤液得油状物，干燥得标题化合物（23.8g，94%）。FAB-MS 471（MH+），TLC Rf（A）0.73;[α]D＝-40.0°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4，6，7，8-全氢-3-异喹啉羧基-L-脯氨酸（5）
将Cbz-D-3-Piq-Pro-O-t-Bu（4）（31.2g，66.3mmol）置于含三氟乙酸（100ml）、苯甲醚（5ml）的圆底烧瓶中，并于室温搅拌1小时，不加热而于真空中浓缩反应，随后加入乙醚（150ml）和水（100ml）。用5N NaOH调溶液的pH至9.8。分离水层，用3N HCl调pH至2.8。往水溶液中加乙酸乙酯（200ml），分离有机层，用硫酸镁干燥，真空浓缩滤液得澄清的油状物。将该油状物溶于乙醚（300ml）中，室温静置24小时，过滤所得固体，用乙醚洗涤，干燥，得标题化合物（13.5g，49%）。FAB-MS 415（MH+），[α]D＝-57°C＝0.5 MeOH;元素分析：计算值C23H30N2O5：C，66.65;H，7.29;N，6.76。
测定值：C，66.90，H，7.33，N，6.81。
实施例3
D-3-Tiq-L-Pro-Arg-醛的合成
D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧酸（1）
将D-苯基丙氨酸（50g，302mmol）和37%甲醛溶液（120ml）及浓HCl（380ml）于回流温度下反应。回流30分钟后，再加50ml甲醛，将反应回流3小时。将反应冷至-10℃，过滤沉淀。真空中干燥固体，得纯的标题化合物（24.2g，45%）。FD-MS 178（MH+）;元素分析，计算值C10H11NO2：C，67.78;H，6.26;N，7.90。
测定值：C，68.05，H，6.42，N，7.88。
Cbz-D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧酸（2）
将D-3-Tiq-OH（1）（40.0g，225mmol）溶于四氢呋喃（200ml）和水（200ml）中。用5N NaOH调溶液的pH值至9.5。滴加氯甲酸苄酯（35.4ml，248mmol）同时用2N NaOH维持pH值为9.5。于室再搅拌反应1小时。真空蒸出有机溶剂，随后加入乙醚（200ml）和水（50ml）。分离水层，用5N HCl调节溶液的pH值至2.8。往溶液中加乙酸乙酯（250ml），分离有机层，用硫酸镁干燥。真空浓缩滤液，得澄清油状的纯标题化合物（70.0g，100%），FD-MS 312（MH+）。
Cbz-D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧基-L-脯氨酰-叔丁酯（3）
将Cbz-D-3-Tiq-OH（3）（70.0g，225mmol）溶于DMF（150ml）中并冷至0℃。脯氨酸叔丁酯（38.5g，225mmol）、1-羟基苯并三唑（30.4g，225mmol）及DCC（46.4g，225mmol）被加到反应混合物中，于0℃搅拌反应3小时，再于室温搅拌24小时，过滤反应沉淀物，真空浓缩滤液得到油状物。将该油状物溶于EtOAc（250ml）和水（125ml）中，分出有机层，连续用1N NaHCO3、水、1.5N柠檬酸及水洗涤。用硫酸镁干燥有机层，蒸发滤液得油状物，干燥，得标题化合物（93.8g，89%）。FAB-MS 464（M+）;TLC Rf（A）0.76;[α]D＝-30.4°C＝0.5 MeOH。
Cbz-D-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧基-L-脯氨酸（4）
将Cbz-D-3-Tiq-Pro-O-t-Bu（3）（93.6g，200mmol）放于含三氟乙酸（150ml）和苯甲醚（7.5ml）的圆底烧瓶中，于室温搅拌1小时。不加热而于真空中浓缩反应，加乙醚（150ml）和水（200ml），用5N NaOH调溶液的pH值至9.8，分出水层，用5N HCl调pH至2.5，再加乙酸乙酯（250ml）。分出有机层，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩滤液得澄清的油状物，将该油状物溶在乙醚（300ml）中，然后往该溶液中加二环己基胺（40ml，200mmol），室温静置所得溶液24小时，滤出固体，用乙醚洗涤，干燥，得标题化合物的DCHA盐（103.7g，88%）。FAB-MS 409（MH+）;[α]D＝-24.5°C＝0.5 MeOH。
最终的合成基本按照实施例1所述的偶联反应完成，得到D-1-Tiq-L-Pro-L-Arg-醛。FAB-MS 415（MH+）;［α］
Figure 93112994X_IMG14
＝-13°;元素分析：计算值 C21H30N6O3·H2SO4·2H2O：C，46.03;H，6.62;N，15.33
测定值：C，46.33，H，6.04，N，15.04。
实施例4
D-3-Tiq（7-OH）-Pro-Arg-H·2HCl的合成
从Peptides  International（Catalog  ＃  ADX-5026-PI;Loiusville，KY）购买H-D-3-Tiq（7-OH）-OH，并用作制备标题化合物的原料，合成方法和实施例3的各步骤基本相同。FAB-MS 431（MH+）;［α］ ＝-1.2°;元素分析：计算值C21H30N6O4·2HCl·H2O：C，48.37;H，6.52;N，16.12。
测定值：C，48.28;H，6.14;N，15.53。
实施例5
体内试验
用戊巴比妥钠（30mg/kg，i.v.）麻醉重约9-14kg的成年雄性小腊兔犬。往气管内插管，用Harvard呼吸器提供室内空气给狗换气（通气速度为16次循环/分，一次呼吸进肺部的空气体积为25ml/kg），用加热垫使体温维持在37°-38℃。导管插入左股动脉和静脉，以便分别测定相（phasic）动脉血压（Statham换能器，P23ID）和进行药物溶液的静脉灌注。平均动脉血压以舒张血压加 1/3 的脉冲压计算。心率用以收缩压脉冲触发的心率计监测，而压力和心率的乘积作为心肌氧需求的指数测定。参见Gobel等人“在心绞痛病人运动期间心率压力乘积作为心肌氧消耗指数”（Circulation 57∶549-556，1978）。用真皮下电极记录导联Ⅱ心电图，以便评价ST-段的改变及估计心律失常的发生和持续时间。直接测得的参数被连续记录在多通道示波器（Beckman Instruments，Inc.，Fullerton CA;model R611）上。
在第五肋间处切开左胸，将心脏悬在心包支架上，左弯曲的冠状动脉（LCX）被剥离，远侧至心房分支，近端至任何较大的心室分支。用连接到Carolina流量计（model  FM501）上的有刻度的流量探针（Carolina  Medical  Electronics，6mm.I.C）测量基线弯曲冠状动脉的血流。最初通过在LCX周围结扎及插入18-19表针使每只狗形成临界冠状狭窄（critical  coronary  stenosis），然后拿掉针使血流过针的径面。不改变基线血流，通过由于LCX的10秒完全闭合产生的大于70%的增加将临界狭窄调节减弱。已有报道（Sheehan，F和Epstein，S：“由于冠状动脉痉挛引起的心律失常致死的确定：先有的冠状动脉狭窄对再灌注心律失常发生的效应”Circ.Res.65∶259-264，1982）以这种方式使用临界狭窄，以限制再灌注充血和与之有关的心律失常以及潜在的心室纤维化。设置临界狭窄后移去冠状流探针。
设置临界狭窄并平衡一段时间之后，记录基线参数并使用勒除器使LCX完全闭合。使LCX的完全闭合维持1小时，随即在除去勒除器后再灌注5小时，再灌注的最初30分钟，原位保持临界狭窄，在LCX闭合期间周期性地测量ST-段偏差，同时使用半定量方式每小时评价心律失常的强度和持续时间：1＝最小，2＝适中，3＝严重。使用预处理的或者再灌注药物处理的方式进行试验。在预处理方式中，在LCX闭合之前15分钟开始静脉输注食盐水或药物溶液并持续到5小时的再灌注期间的最后。在再灌注方式中，先LCX闭合1小时，再在再灌注之时，开始连续5小时向静脉输注食盐水或药物溶液。
再灌注后，迅速切除心脏，以便采用Shea提出的、被Hahn改进的三苯基四唑鎓/埃文斯（Evans）蓝二元染料涂污方法测定梗塞。（Shea等人：“萘氧唑酮（B ay g 6575）对于实验的冠状血栓形成的有益效果”，Am Heart.J 107∶629-637，1984;及Shea等人“萘氧唑酮对于局部缺血再灌注的心肌的有益效果”，Eur.J.Pharmacol.102∶63-70，1984）;（Hahn等人：“白三烯B4受体的拮抗作用不能限制犬心肌梗塞范围”，J.Pharmacol.Exp.Ther.253∶58-66，1990）。将套管插进冠状口上方的主动脉内，并在事先闭合的位点处插入LCX内。LCX床用20mM磷酸钾缓冲液（pH7.4，38℃）中的1.5%三苯基四唑鎓溶液灌注，而心脏的其余部分用食盐水中的0.1%  Evans蓝通过主动脉同时灌注;灌注压力维持在100mmHg，心肌灌注的时间约为5分钟。然后将心脏以垂直于心尖轴的方向切成厚约1cm的六片。将被不弯曲的冠状动脉灌注的心肌染成蓝色，弯曲的动脉区域内的活着的左心室（危险区）染成砖红色，而危险区内的梗塞的左心室不染色。每个横切的断面均修整了右心室肌、瓣片及脂肪组织，涂干，然后盖上一透明塑料盖，以便测量各区域的范围。心肌的每一区域也被分割并称重以便进行重量分析。分区的和累积的梗塞范围以处于危险的左心室的量的百分比表示。
表1
冠状动脉闭合和再灌注后受试
化合物对于心肌梗塞范围的影响
治疗  方式  输注速度  梗塞范围a
(mg/kg/hr)
食盐水 - - 42.4±4.0b
化合物6 预处理 2.0 25.1±5.9c
食盐水  -  -  40.1±4.1
化合物6 再灌注 2.0 26.5±4.7c
食盐水  -  -  38.4±3.4
化合物5 再灌注 0.5 24.1±6.3c
食盐水  -  -  48.3±5.8
化合物5 再灌注 1.0 28.9±3.5c
食盐水  -  -  38.4±3.4
化合物3 再灌注 1.0 19.0±2.6c
食盐水  -  -  48.3±5.8
化合物4 再灌注 1.0 26.0±5.5c
食盐水  -  -  44.0±4.4b
化合物1 再灌注 1.0 17.5±2.7c
食盐水 - - 45.9±6.6b
化合物2 再灌注 1.0 21.8±4.3c
a  梗塞范围单位＝%梗塞总量/危险区总量
b  8-9只狗的平均值
c  对于食盐水对照有统计意义（P＜0.5）
表1的数据指出，当以临床相关的方式用药时，每一个受试的试验化合物都能抑制由于冠状动脉闭合及再灌注产生的心肌梗塞的范围。因为冠状动脉闭合和再灌注是用机械的勒除器方式产生的，梗塞抑制效率并不是由于在梗塞有关的动脉内防止了大量闭塞的血栓。用每个上述化合物抢救心室组织几乎不出现或不明显出现心血管的、心电图的及出血的倾向。
式1化合物抑制局部缺血损伤的准确的机理是不清楚的。这种生理活性可能与这些化合物的蛋白酶抑制的性质有关。抑胰肽酶是一种已知的至少拮抗血浆酶、胰蛋白酶和激肽释放酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它显示了能抑制与冠状动脉闭合有关的心肌局部缺血损伤（Diaz等人：“激肽释放酶抑制剂抑胰肽酶对于狗体内由于冠状动脉闭合引起的心肌局部缺血损伤的影响”，Am.J.Cardiol.40：541-549，1977）。我们还指出，抑胰肽酶能明显减少由于冠状动脉闭合和再灌注而引起的心肌梗塞范围。在作为对照的狗中，梗塞范围是坏死危险的左心室总量的37.9±5.4%，在用抑胰肽酶输注的狗中是24.8±2.4%（P＜0.05%）。人们还不清楚抑胰肽酶和式1化合物的作用机理是否是类似的或者是相同的。
上述研究还包括估计在造成发展中的心肌梗塞形成中白细胞（中性白细胞）的分布。没有任何一个式Ⅰ化合物能明显地改变在局部缺血反应中体系白细胞的增多以及在局部缺血及梗塞的心肌内白细胞的累积。
总之，式Ⅰ的有代表性的化合物全都能够减少和抑制由于局部缺血和再灌注引起的组织损伤。由于所有试验化合物都表明能够抑制由于冠状动脉闭合和再灌注引起的心肌梗塞形成，因而确立了这种重要的治疗性质。式Ⅰ化合物在减少和抑制对组织的再灌注损伤的新方法中也是有用的。更重要的是，式Ⅰ化合物特别有用于治疗人的心肌梗塞形成。

Claims (6)

1、用于治疗再灌注损伤的下述通式化合物：
其中
A是1或2个
Figure 93112994X_IMG1
并且对A，其手性中心为DL，优选D；对于Pro，手性中心为L；对于Arg，手性中心是L；
Z是C1-C4烷基或H；
X是NH2、NHZ、叔丁氧羰基-NH、乙酰基-NH或三氟乙酰基-NH；
R是H、OH、卤素、C1-C4烷氧基、CF3、C1-C4烷基、NO2或NH2以及
q是CH2或CO。
2、权利要求1所请求保护的化合物，其中再灌注损伤是心肌梗塞形成。
3、与氧化剂清除剂一起使用的权利要求1-2中任何一项所请求保护的化合物。
4、与β-阻断剂一起使用的权利要求1-3中任何一项所请求保护的化合物。
5、与阿斯匹林一起使用的权利要求1-4中任何一项所请求保护的化合物。
6、权利要求1所规定的化合物，选自：D-3-Piq-L-脯氨酰-L-脯氨醛、D-7-羟基-1，2，3，4-Tiq-3-羰氧基-L-脯氨酰-L-精氨醛、D-3-Tiq-L-脯氨酰-L-精氨醛、D-1，2，3，4-Tiq-1-羰基-L-脯氨酰-L-精氨醛、N-甲基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛以及Na-叔丁氧羰基-D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛，用于减少和抑制再灌注损伤。
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