HUT65371A - Immunological diagnostic process - Google Patents

Description

A találmány monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek nagy szelektivitással és affinitással rendelkeznek a szulfonil-karbamid csoportba tartozó herbicidekkel szemben, különösen az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidekkel szemben, mely képletben

X jelentése szénatomon keresztül kapcsolódó, egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált, 1-3 nitrogénatomot tartalmazó 6-tagú heterociklus, előnyösen egy egyenesen vagy kétszeresen szubsztituált s-triazin vagy pirimidin, és n egy 0 és 4 közötti egész szám, előnyösen 1-et jelent, és amelyek ennélfogva különösen alkalmasak immunoassay-ben történő felhasználásra szulfonil-karbamid-herbicidek talaj-, vízvagy levegőmintában vagy növényi kivonatokban történő gyors és hatékony kimutatására. A találmány tárgya a nevezett antitestek előállítási eljárása is.

A találmány továbbá hibridómasejtvonalakra vonatkozik, amelyek a fenti antitesteket termelik, valamint a nevezett antitestek felhasználásával történő immunológiai kimutatási eljárásokra, és ezen eljárások keretében felhasználható teszt-kitekre.

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY ⁵⁵·^728/ΡΛ n’Sw&*‘.

G-o’dJ

65371

Immunológiai diagnosztikai eljárás

CIBA-GEIGY AG, BÁZEL, SVÁJC

Feltalálók: Dr. SCHLAEPPI Jean-Marc, BÁZEL, SVÁJC

Dr. HÜGLIN Dietmar, FREIBURG,

NÉMET SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

A bejelentés napja: 1992. 12. 11.

Elsőbbsége: 1991. 12. 12. (3552/91-6),

SVÁJC

A jelen találmány monok lónál is antitestekre vonatkozik, amelyek nagy szelektivitással és affinitással rendelkeznek a szulfonil-karbamid-csoportba tartozó herbicidekkel szemben, különösen az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidekkel szemben, ahol

X jelentése egy szénatomon keresztül kapcsolódó, egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált, 1-3 nitrogénatomot tartalmazó hattagú heterociklus, előnyösen egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált s-triazin vagy pirimidin, és n egy egész szám 0 és 4 között, előnyösen 1-et jelent, és amelyek ennélfogva előnyös módon felhasználhatók immunoassay-ben az említett szulfoni1-karbamid-herbicidek talaj-, víz- vagy levegőmintában, valamint növényi extraktumokban történő gyors és hatékony kimutatására. A találmány tárgya továbbá eljárás a nevezett monoklonális antitestek előállítására.

A találmány különösen olyan monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek nagy szelektivitással és affinitással rendelkeznek a (I) általános képletű veqyületekkel szemben, ahol

R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, 1-4 szénatomos alkil- vagy halogén-alkil-csoport, 2-4 szénatomos halogén-alkoxi-csoport, 1-4 szénatomos alkiltio- vagy haloqén-alkiltio-csoport, 2-4 szénatomos alkoxi-alki1-csoport, metoxi-, etoxi-csoport vagy -NR^R⁴ képletű csoport, ahol

R³ és R⁴ egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alki[csoportot jelent,

E nitrogénatomot vagy metin-hidat jelent, és n egy 0 és 4 közötti egész szám, különösen 1-et reprezentál.

A fenti definíciókban alki1-csoport alatt egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot értünk, mint például metil-, etil-, η-propil-, i-propil valamint a négy izomer butilcsoport. Előnyösek a metil- és etilcsoport.

Alkoxi-csoportként a következők állhatnak: metoxi-, etoxi-, η-propoxi-, i-propoxi- és a négy izomer butoxi-csoport, különösképpen azonban metoxi-, etoxi- és i-propoxi-csoport.

Alkiltio-csoportok lehetnek például a metiltio-, etiltio-, η-propiltio-, i-propiltio- valamint az n-butiltio-csoport, különösképpen pedig a metiltio- és étiltio-csoport előnyös.

Halogén alatt, függetlenül attól, hogy az önmagában vagy egy ha 1ogén-a1kiI-, halogén-alkoxi- vagy halogén-tio-csoport alkotórészeként áll, fluor-, klór- vagy brómatomot, előnyösen mégis fluor- és klóratomot értünk. Példák halogén-alkilcsoportre a klór-metil-, fluor-metil-, difluor-meti1-, trifluor-metil-, 2-klór-eti1-, 2,2,2-trifluor-etil-, 1,1,2,2-tetrafluor-etil-, pentafluor-etil-, 1,1,2-trifluor-2-klór-etil-, 2,2,2-trifluor-1,1-diklór-eti1-, pentaklór-eti1-, 3,3,3-trifluor-propil-, 2,3-diklór-pr^opil-, 1,1,2,3,3,3,-hexafluor-propil-csoport, különösen pedig a fluor-meti1-, klór-metil-, difluor-metil- és trífluor-meti1-csoport előnyös.

Különösen előnyösek azok a találmány szerinti monoklonális antitestek, amelyek nagy szelektivitással és affinitással rendelkeznek a (II) képletű vegyülettel szemben és ezáltal kiváltképpen alkalmasak immunoassay-ben történő felhasználásra az említett (II) képletű vegyület kimutatásához talaj-, * * *

- 4 víz- vagy levegőmintákban, valamint növényi extraktumokban is, úgyszintén a nevezett monoklonális antitestek előállítási eljárása.

A jelen találmány további tárgyát képezik hibridómasejtvonalak, amelyek a fent említett monoklonális antitestek termelésére képesek, valamint immunológiai eljárások az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidek kimutatására talaj-, víz- vagy levegőmintákban, valamint biológiai anyagokban, mint például növényi extraktumokban, az említett monoklonális antitestek felhasználásával és az ezen kimutatási eljárások keretében felhasználható teszt-kittek.

Λ szulfoni1-karbamidokat tekintve a különösen hatékony herbicidek egy új osztályáról van szó, amelyeket növényvédelem céljaira alkalmaznak, különösképpen gabona-kultúrákban a széleslevelQ gyomnövények szelektív és hatékony leküzdésében.

Ennek az osztálynak egyik képviselője a fent említett (II) képletű vegyület, az M-[2-(3,3,3-trifluor-propil)-feni 1 szülfőni 1]-N’-(4-metoxi-6-meti1-1,3,5-triazin-2-i1)-karbamid, amelyet elsősorban kukorica kultúrákban alkalmaznak a széleslevelu gyomok irtására, mint például az Aramanthus retroflexus vagy a Chenopodium album.

A szulfoni1-karbarnid-csoportba tartozó herbicidek kimutatása talaj- és vízmintákban jelenleg gázkromotográfia (CG) /Ahmad J. és Crawford G.: J. Agric. Food Chem. 33, 138-141 (1990)/ és folyadékkromatográfia, például HPLC /Zahnow EW.: J. Agric. Food Chem. 30, 854-857 (1982), Iwanzik W. et al: Z. PflKrankh. PflSchutz, Suppl. XI. 301-310 (1988)/ segítségével, valamint bioassay-k felhasználásával történik.

Mivel részben ezeknek a herbicideknek a talajban visszamaradó már legcsekélyebb mennyiségei még mindig magas maradékaktivitással rendelkeznek, amely különösképpen a szulfoni1-karbamidokra-érzékeny következő kultúrák számára lehet káros, a mezőgazdák számára különösképpen fontos, hogy egy megbízható és igen nagy mértékben érzékeny kimutatási eljárás álljon rendelkezésre a visszamaradó nyomok analíziséhez.

Bár a szintetikus herbicidek kimutatására szolgáló fent említett eljárás közül a legtöbb a nyománálizishez szükséges érzékenységgel rendelkezik, ezek alkalmazása azonban szabályosan még számos hátránnyal bír. így például a szulfoni 1-karbamid-herbicidek GC vagy HPLC segítségével történő meghatározásánál a tulajdonképpeni kromatográfiás analízis kivitelezése előtt költséges tisztítási- és koncentrálási lépéseket kell közbeiktatni. Ezek az eljárások ezáltal terepkörülmények között nem kivitelezhetők, mivel jelentékeny műszer beruházáshoz kötöttek.

Ezen eljárások további hátránya abban áll, hogy például a gázkromatográfiában csak elem-specifikus detektorokat alkalmaznak, mig a HPLC-nél fotometriás detektorokat használnak, amelyek viszonylag nem-specifikusak. A tömegspektroszkópiai detektálás kivételével a kromatográfiás analízisek a mindenkori anyagok retenciós idejének meghatározásán alapulnak. Ezek az értékek azonban relativok és ezáltal nem szerkezet-specifikusak.

A. korábban ugyancsak említett bioassay-eljárások bár nagy ráfordítás nélkül kivitelezhetők, azonban nagyon csekély specifitást mutatnak.

• ·

Hogy a felvázolt analitikai eljárások előzőkben leirt hátrányait elkerüljék, a legújabb időkben megkíséreltek az agrárszektor számára immunológiai eljárásokat kifejleszteni, - mint amilyeneket a klinikai diagnosztikusban a legkülönfélébb antigének kimutatásához már rutinszerűen alkalmaznak -, különösképpen az agrárkemikáliák talaj-, viz- és levegőmintákban történő kvalitatív és kvantitatív meghatározásához.

így például időközben elkezdtek immunológiai eljárásokat kifejleszteni bizonyos herbicidek mint a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav /Fleeker J.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 874-S73 (1937)/ vagy a klór-szulfuron /Kelley M. et al: J. Agric. Food Chem. 33, 952-965 (1935)/, valamint különböző peszticidek mint a Diflubsnzuron /Vüe S.l. és Hammock 3.D.: J. Agric. Food Chem. 30, 949-957 (1982)/, a ifetalaxyl /Newsome W.H.: 0. Agric. Food Chem. 33_, 523-530 ( 1985)/, az Alachlor /Fenő et al.: J. Agric. Food Chem. 33, 159-153 (1390)/ vagy a Parathion /Ercegovich C.D. et al.: 0. Agric. Food Chem. 29, 559-553 (1931)/ kimutatására.

,A szulfonil-karbamid-csoportba tartozó herbicidek immunológiai kimutatására is ezáltal már leírtak eljárásokat /Kel Ív M. et al. (1985)/, ámde ezek, mint a fent megnevezett metodok is, poliklonális antiszérumok felhasználásán alapulnak, amelyeket olyan állatokból nyertek, amelyeket előzőleg egy megfelelő antigénnel immunizáltak. szulfoni1-karbamid-herbicidek elleni monoklonális antitestek előállítása viszont, amelyek rendkívül nagy affinitással bírnak a célvegyülettel szemben és ezáltal alkalmasak az ismert immunoassay-k egyikében a találmány szerinti felhasználásra, mindezidáig nem járt sikerrel .

• ·« ·

- 7 A poliklonális antiszérumok összetételükben nagyon heterogének, azaz nagyszámú különféle antitestet tartalmaznak, amelyek a mindenkori antigének különböző epitópjaival reagálnak. A poliklonális antiszérumok ezen heterogén összetétele azáltal jön létre, hogy a kísérleti állat egy meghatározott antigénnel történő immunizálásakor mindig több antitestet-termelő sejtklón stimulálódik egyidejűleg, amelyek közül mindegyik az antigén-molekulán egy másik epitópot ismer fel és ezáltal a stimulált sejtklónokból különböző antitestek képződnek. Ebből az okból kifolyólag az immunizált állatok szérumai mindig poliklonálisak és ezáltal heterogének, specifitásuk is és az immunglobulinok egyes osztályaiba sorolásuk is megkérdőjelezhető.

A poliklonális antiszérumok összetételében rejlő heterogenitás ezáltal ahhoz vezethet, hogy a kimutatás érzékenysége az igen csekély affinitás miatt nem kielégítő egy meghatározott célvegyület szelektív kimutatásához, vagy, hogy a strukturálisan közeli rokon vegyületeket, mint például a célvegyületet /(Π) képletű vegyület,/ és annak hidroxilezett származékait, poliklonális antitesteket alkalmazó immunoassay keretében nem lehet kielégítő módon differenciálni.

Acélból, hogy a poliklonális antitestek ezen hátrányait áthidalják, a legutóbbi időben számos erőfeszítést tettek, hogy az agrárszektor számára is monoklonális antitesteket kifejlesszenek. így Schlaeppi J.H. és mtsai atrazin és hidroxi-atraziri elleni monoklonális antitestek előállításáról és felhasználásáról tudósítanak egy enzimhez-kötött immunoassay-ben /J. Agric. Food Chem. 37, 1532-33 (1989(/.

A találmány célja elsősorban egy egyszerű, köny»11» nyen használható, hatékony és nagymértékben szelektív immunoassay kidolgozása az (A) általános képletü szulfoni1-karbamid típusú herbicidek kimutatására, különösképpen az (I) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek, még közelebbről a (II) képletű vegyület kimutatására, talaj-, víz- és levegőmintákban.

Ezt a feladatot a jelen találmány keretében meglepő módon megoldottuk, éspedig az (A) általános képletű szulfoni 1-karbamid-herbicidek elleni, különösképpen pedig a (II) képletü vegyület elleni, nagy specifitással és affinitással rendelkező monoklónál is antitestek előállítása útján az önmagában ismert hibridóma/monoklonális antitest-technológia alkalmazásával .

A hibrid szomatikus sejtvonalak (hibridómák) alkalmazását - forrásként - pontosan meghatározott antigének elleni antitestek termelésére, Köhler és Milstein /Natúré,

256, 495-97 (1957)/ írták le először.

Az antitestek, amelyek az ott leirt eljárással nyerhetők, erősen különböznek azoktól, amelyek a konvencioná lisan immunizált állatok antiszérumaiból kaphatók.

A hibridóma/monoklonális antitest-technológia azon a megfigyelésen alapszik, hogy két szomatikus az egyesítésekor a keletkező hibridsejtek mindkét szülotipus karakterisztikus jellemzőit hordozzák.

A monoklonális antitest-termékek esetében a specifikus antitestek szintézisének képessége egy immunkompetens B-sejtből (szokásosan egy egérsejt) származik, amelyet egy előzőleg immunizált donor-állatból vettek ki, míg a képes ség a folyamatos sejtképződéshez a tenyészetben, a másik főzi* »’ · ···« a · « « «· *«♦»· · * · · * · · ·· ·« *1·· · r>

- J ős partnertől, egy tumor sejtvonaltól (gyakran egy mielóma), származik.

A donor-állatok immunizálására rendszerint konjugátumokat alkalmaznak, melyek a célmolekulából és egy ezzel összekapcsolt nagymolekulatömegű hordozómolekulából állnak.

Ezen hibrid-sejtvonalak mindegyike egy homogén immunglobulint szintetizál, amely a lehetséges nagyszámú antitestből, amelyek egy állatban egy antigénre adott válaszként in vivő szintetizálód’natnak, csak egyetlen képviselőt reprezentál .

Mivel minden egyes immunglobulint-termelő klón az antitestek közül egyetlen típus által jellemezhető, a monoklonális antitest elnevezést kapta. A monoklonális antitestek a poliklonálisokkal szemben számos előnnyel rendelkeznek:

a/ a monoklonális antitestek előállítása homogén tekintettel az antigén-reaktivitásra és ez nem változik az idő folyamán, b/ a monoklonális antitesteket termelő hibridómákat évekig és évtizedekig lehet tárolni, anélkül, hogy eközben specifikus sajátságaikat, azaz a specifikus monoklonális antitest-termelő képességüket elveszítenék, c/ a monoklonális antitestek standard reagensekként való felhasználásra inkább alkalmasak mint a poliklonális antiszérumok, mivel ez utóbbiak a nagyszámú variábilis faktoron keresztül negatív módon befolyásoltak. Ezek közé tartoznak például ct) az immunizált állatok elvéreztetése antiszérumok kinyerése céljából,

p) az utólagos immunizáláshoz használt anyagok állandó felhasználhatóságának problémája, ····

- 10 T) a donor-állatok korlátozott élettartama.

A monoklonális antitestek, amelyeket időközben nagyszámú antigén ellen előállítottak, elsősorban a klinikai diagnosztikában jól beváltak és ebből többé már nem távolíthatók el.

A jelen találmány keretében most először állnak rendelkezésre olyan monoklonális antitestek, amelyek nagy specifitással és affinitással rendelkeznek az (A) általános képlete szulfonil-karbamid-herbicidekkel szemben, különösen pedig a (II) képletű vegyülettel szemben, amelyeket önmagában ismert módon és az előzőkben röviden vázolt hi'oridóma/monoklonál is antitest-technológia alkalmazásával állítottunk elő, és amelyek a célvegyülettel szembeni nagy affinitásuk alapján alkalmasak egy ismert immunoassav-ban a találmány szerinti alkalmazásra.

Az (A) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek elleni monoklonális antitestek előállításánál néhány esetben úgy járunk el, hogy az immunizálásra immunogén előállításánál egy fragmenst alkalmazunk, amely különösen a molekula szulfonamid-részét foglalja magában, és ezt a fragmenst egy, szokásosan alkalmazott, nagymolekulájú hordozómolekuIához kötjük.

A donor-állatban az immunválasz kiváltása után az antitest-termelésért felelős sejteket ezt követően leirt módon a donor-állatból izoláljuk és a hibridómasejtek előállí tásához alkalmas mielómasejtekkel fuzionáljuk.

A fentiek alapján tehát a találmány tárgya eljárás monoklonális antitestek előállítására, amelyek nagy specifitással és affinitással rendelkeznek egy vagy több (A) általá-

nos képletéi szulfoni1-karbamid-herbiciddel szemben, amely abban áll, hogy (a) egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll, egy alkalmas, nagymolekulájú hordozó molekulával konjugálunk, (b) az (a) lépés szerint előállított konjugátummal egy donorállatot immunizálunk, (c) az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, (d) a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fuzionáljuk, (e) a keletkeze fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitesteket termelik, és (f) az említett hibridómasejteket monoklonális antitest termelésére in vitro vagy in vivő tenyésztjük.

Az (I) általános képletű, de különösen a (II) képletű vegyület elleni monoklonális antitest előállítása során is az előzőekben leírt módon lehet eljárni. Ebben az esetben alternatív módon immunogénként a teljes molekula is szolgálhat, amennyiben ezt egy spacer-molekulán keresztül egy, szokásosan alkalmazott, nagymolekulájú hordozó molekulához kapcsoljuk.

A találmány szerinti eljárással kapott monoklonális antitestek képezik a jelen találmány további tárgyát.

Előnyösen ezek a monoklonális antitestek nagy specifitással illetőleg affinitással bírnak az (A) általános képletű szul f on i1-ka rbamid-herbicidekkel szemben, előnyösen pedig a (I) általános képletéi szulfoni1-karbamid-herbicidekkel szemben és még előnyösebben a (II) képletű vegyülettel szemben, és a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel szembeni csekély keresztreaktivitásuk alapján kiváló módon alkalmasak az említett szulfonil-karbamid-herbicidek gyors és megbízható kimutatására immunoassay-ben, és továbbá felhasználhatók a célvegyületek strukturálisan rokon vegyületektől, mint például a hidroxil-származékoktól, mint inaktív métából ltoktól történő differenciálására.

A találmány oltalmi körébe tartozó antitestek közül elsősorban különösen előnyösek azok a monoklonális antitestek és származékaik, amelyek nagy specifitással és aktivitással rendelkeznek a (II) képletű vegyülettel szemben, és lényegében semmilyen keresztreakciót nem mutatnak a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel, mint például a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint az A. jelű vegyület a 2. táblázatban.

Ugyancsak különösen előnyösek azok a monoklonális antitestek, amelyek nagy specifitással és affinitással rendelkeznek a (II) képletű vegyülettel szemben és amelyek számos struktúráiisan rokon vegyülettel <1,0%, különösen pedig <0,4 % és még előnyösebben <0,1 % keresztreaktivitást mutatnak.

Különösen előnyös egy monoklonális antitest, amelyet az ECACC 911 20619 számmal jellemzett hibridőmasejtvonalból kaptunk, valamint ezen monoklonális antitest származékai.

A monoklonális antitestek származékai alatt a jelen találmány keretében például az antitest-fragmenseket értjük, amelyek még nagy specifitással és affinitással rendelkeznek az (A) általános képletü szulfonil-karbamid-herbicidek antigén determinánsai iránt, különösen pedig a (II) képletü vegyület antigén determinánsa iránt, továbbá a radioaktivan jelzett monoklonális antitesteket, amelyeket például radioaktív jóddal ( I, I), szénatommal ( ”C), kénatom*1 tr n mai ( S), triciummal ( H) vagy hasonló módon jeleztünk, továbbá monoklonális antitestek biotinnal vagy avidinnel, vagy enzimmel képzett konjugátumait, mint tormaperoxidázzal, alkálikus foszfatázzal, béta-D-galaktozidázzal, glükózoxidázzal, glükoami lázzal, karbonsavan’nidrázzal, acetilkolinészterázzal, lizozimmal, malátadehidrogenázzal vagy glükóz-5-foszfátdehidrogenázzal, továbbá a monoklonális antitestek biolumir.eszcens (pl. luciferáz), kemolumineszcens (pl. akridin-észter) vagy fluoreszcens (pl. Phycobi1iprotein) ágensekkel képzett konjugátumait. Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartoznak a bispecifikus úgynevezett cross-1inked (keresztkötött) antitestek. A lehetséges antitest-származékok ezen példák szerinti felsorolása csupán a találmány i1lusztrálására szolgál és semmilyen módon sem korlátozódik ezekre.

A lényegében semmilyen keresztreaktivitás kifejezés alatt ezen találmány keretében azt kell érteni, hogy az (A) általános képletü szulfoni1-karbamid-herbicidekre, de különösen a (II) képletü vegyületre specifikus monoklonális antitestek keresztreaktivitása más vegyületek nem-specifikus epitópjaival, különösen a szerkezetileg rokon vegyületek, mint pl. a Triasulfuron, az esetek többségében kisebb, mint 10 %, előnyösen kevesebb mint 1,5 % és még előnyösebben kevesebb mint 0,1 %.

Λ keresztreaktivitás százalékos mértékét a találmány szerinti definíció szerint a következő képlet alapján adtuk meg:

%-os gátlást okozó antioén-koncentráció (I50) —---------- x 100 %-os gátlást előidéző antigénanalóg-konc. (

Az IsQ-értéket lehet például egy kompetitiv ELISA assay segítségével (lásd 8. példa) meghatározni. Ez megfelel ugyanannak az antigén-koncentrációnak, amely a hordozóhoz kötött antigénen az antitestképződés 50 %-os gátlásához vezet.

A találmány továbbá hibridóma sejtvonalakra vonatkozik, amelyek az előzőkben közelebbről jellemzett monoklonális antitesteket szintetizálják és előnyösen a körülvevő médiumba (közegbe) kiválasztják azokat.

A találmány különösen egy olyan hibridóma sejtvonalra vonatkozik, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik az (A) képletű szulfoni1-karbamid-herbicidekkel szemben, előnyösen pedig az (I) képletű szulfonil-karbamid-herbicidekkel szemben, még előnyösebben a (II) képlete vegyülettel szemben, és a csekély keresztreaktivitása alapján kiválóan felhasználható immunoassay-ben az (A) képletű szulfoni1karbamid-herbicicíek gyors és megbízható kimutatására, előnyösebben pedig az (I) képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek, kimutatására és még előnyösebben a (II) képletű vegyület kimutatására és felhasználható a célvegyületeknek a szerkezetileg rokon vegyületektől, mint pl. a hidroxilezett-származékoktól, mint az inaktív métábólitok, történő differenciálására.

Különösen előnyösen a találmány magában foglalja elsősorban azokat a hibridóma sejtvonalakat, amelyek egy olyan monoklonális antitestet termelnek, amely nagy specifitással és affinitással bir a (II) képletű vegyülettel szemben és lényegében semmilyen keresztreakciót nem mutat a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel, mint pl. a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban szereplő ,A. jelű vegyület.

Ugyancsak különösen előnyösek azok a hibricómasejtvonalak, amelyek egy, a (II) képletű vegyület elleni, nagy specifitású és affinitásé monoklonális antitestet termelnek, amelynek keresztreaktivitása a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel, mint pl. a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban szereplő A' jelű vegyület, 1,0 %-nál kisebb, előnyösen 0,4 %-nál kisebb, még előnyösebben 0,1 %-nál kisebb.

Egész különösen előnyös egy hibridómasejtvonal, mely egy találmány szerinti monoklonális antitestet termel és amelyet az ECACC S11 20619 számmal láttunk el, valamint ennek kiónjai és szubklónjai.

Hasonlóképpen a találmány magában foglalja az előzőleg közelebbről jellemzett hibridómasejtvonalak variánsait és mutánsait, amelyek spontán keletkeznek vagy pedig mesterségesen, ismert eljárások segítségével állíthatók elő, és amelyek még rendelkeznek a kiindulási, anyag jellemző tulajdonságaival, azaz még abban a helyzetben vannak, hogy belőlük a találmány szerinti antitesteket vagy ezek származékait elő lehet állítani és ezeket előnyösen a környező közegbe kiválasz tani .

Hasonlóan a találmány magában foglalja a nevezett hibridómasejtvonalak előállítási eljárásait, úgyszintén eljárásokat a nevezett monoklonális antitestek előállítására.

Hibridőmasejtvonalak kiónjai és szubklónjai alatt azokat a hibridómákat kell érteni, amelyek a kiindulási kiónból ismételt klónozás során képződnek és még a kiindulási klón találmány szerinti jellemzőivel rendelkeznek.

A találmány egy további tárgyát képezi egy eljárás, amely az (A) általános képletü szulfoni1-karbamid-herbicidek immunológiai kimutatására szolgál, előnyösen pedig az (I) általános képletü szulfonil-karbamid-herbicidek kimutatására, még előnyösebben a (II) képletü vegyület kimutatására, például talaj-, víz- vagy levegőmintákban, valamint biológiai anyagban, igy pl. növényi vagy állati extraktumban (kivonatban), a találmány szerinti monoklonális antitestek felhasználásával.

Hasonlóképpen a találmány részét képezik azok az eszközök, amelyek az (A) általános képletü szulfonil-karbamid-herbicidek kvalitatív és kvantitatív meghatározására szolgálnak, előnyösen az (I) általános képletü szulfoni 1-karbarnid-herbicidek, még előnyösebben a (II) képletü vegyület meghatározására, fel használásra kész teszt-kittek formájában, amelyek reagensként legalább egy találmány szerinti monoklonális antitestet tartalmaznak. Különösen előnyös az a teszt-kit, amely a nevezett szulfonil-karbamid-herbicidek helyszínen történő gyors és megbízható kimutatására alkalmas.

A találmány szerinti monoklonális antitesteket ismert eljárások segítségével állítjuk elő, amelyek Köhler és Milstein /Natúré, 256, 495-97 (1975)/ által kifejlesztett mód szereken alapulnak.

- 17 Mivel az analizálandó célvegyületeknél /az (A) képletű szulfonil-karbamid-herbicidek/, mint például a (II) képletű vegyület, amelyekre a specifikus monoklonális antitestet ki kellett fejleszteni, viszonylag kicsi és egyszerű molekulákról van szó, amelyek egy kísérleti állatba történő bevitel után önmagukban nem képesek ott immunválasz kiváltására, ezért a tulajdonképpeni immunizálás előtt először előkészítő lépéseket tesznek.

Az ilyen vegyületeket hapténeknek vagy inkomplett antigéneknek nevezik, amelyek nagyságuk és egyszerű struktúrájuk alapján egy immunreakcióban nincsenek olyan helyzetben, hogy indukáljanak, és ezáltal a komplett antigénekkel (=immunogének) szembeállíthatok, amelyek antigénként is hatnak és egy immunválasz kiváltására is képesek. Az ilyen hapténmolekulákat nagymolekulájű vegyietekhez (hordozó molekulák) konjugálják, miáltal tulajdonságaikban a komplett antigénekkel összehasonlíthatók, azaz most már rendelkeznek egy immunválasz kiváltásához szükséges képességgel.

Az immunizáló reakció folyamán képződött antitest közül néhány képes aztán a hapténmolekula specifikus epitópjával reagálni, függetlenül attól, hogy a hapténmolekula önmagában áll-e vagy pedig előzőleg egy hordozó molekulára kötöttek.

A találmány tehát magában foglalja a hapténként ható célvegyületet, amelyet a kísérleti állat immunizálása előtt egy nagymolekulájú hordozóhoz (carrier) kapcsoltunk, amely képes annak egy komplett antigén hatékonyságát kölcsönözni.

Alkalmas hordozómolekulák alatt a találmány keretében elsősorban makromolekül ájű vegyületek értendők, amelyek szabad, hozzáférhető, reaktív csoportokkal rendelkeznek a hapténnel történő kapcsolási reakciók számára és abban a helyzetben vannak, hogy a hapténnel történő kapcsolás során annak egy immunogén képességet kölcsönözzenek vagy pedig annak már meglévő immunogenitását felerősítsék.

A találmány szempontjából különösen előnyösek azok a makromolekulajú vegyületek, amelyek szabad, hozzáférhető, reaktív aminocsoportokat tartalmaznak.

A találmány szerinti felhasználásra különösen előnyösek hordozómolekulaként a 1izinben-gazdag fehérjék, amelvek molekulatömege 10.000 és 1.500.000 közötti, mint pl. a marha szérum albumin (3SA:MG 66 200), humán szérum albumin (HSA:MG 58 000) vagy a keyhole limpet hemocyanin (1<LH:MG ^1 000 000), amelyek a kereskedelemben kaphatók és ezáltal korlátlan mennyiségben rendelkezésre állnak.

Magától értetődően a találmány magában foglalja más makromolekulajú vegyületek felhasználását is hordozó molekulaként, amennyiben azok a fent említett feltételeket kielégítik, mint pl. a sertés tiroglobulin, 82 mikroglobulin, hemocianin, immunglobulin, toxinok (kolera-, tetanusz-, diftéria-toxin, stb.), poliszacharidok, lipopoliszacharidok, természetes vagy szintetikus poliadenil- és poliuridilsavak, polialanil- és polilizin-polipeptidek vagy sejtmembránkomponensek, mint például a formai innal vagy glutáraldehiddel kezelt eritrocita-sejtmembránok.

Hasonlóképpen alkalmazható a találmány szerin19 ti eljárásban hordozó molekulaként például a nyulakból nyert anti-egér IgG (H + L) tisztított IgG frakció, amelyet Kawamura H. és Berzofsky J.A. által leírt eljárással állítottunk elő /J. Immunoi. 135, 58 (1385)/.

A haptén konjugálása a hordozó molekulához vagy direkt módon vagy egy hid-tagon keresztül történhet, amelyet adott esetben előzőleg a hapténmolekulára kapcsoltunk.

kz. analizálandó anyag kapcsolását a hordozó molekulára emellett oly módon kell elvégezni, hogy a célvegyület releváns szerkezeti elemei szabadon hozzáférhetők maradjanak és ezáltal képesek legyenek immunválasz kiváltására, vagyis specifikus antitest-képződés indukálására. Λ szulfoni1-karbamid-származékok előállítása során, különösen pedig a (II) képlettel ábrázolt vegyület előállításánál ezért figyelni kell arra, hogy ezeket a szerkezeti elemeket megőrizzük.

Ezt például azáltal érhetjük el, hogy az egy (A) általános képletu szulfonil-karbamid-herbicidet, különösen pedig egy (II) képletu vegyületet, oly módon deriválizálunk, hogy a hozzákapcsolás a fent megnevezett hordozó molekulák egyikéhez az említett releváns szerkezeti elemeknek a károsodása nélkül menjen végbe.

Különösen előnyös és a találmány oltalmi körébe tartozik a teljes intakt szulfoni1-karbamid molekula molekula-fragmenseinek alkalmazása is. Ezen az úton az (A) általános képletu szulfonil-karbamid-herbicidek, különösen a (II) képletei vegyület elleni, nagy affinitásul és igen szelektív monoklonális antitestek állíthatók elő, oly módon, hogy a komplex teljes molekulának, amely szulfonamid-részből, a karbamid-hidból

- 20 és a heterociklus-részből áll, kizárólag a szulfonamid-részét használjuk kapcsoló-komponensként és azt, mint az előzőekben leírtuk, egy alkalmas hordozó molekulával összekapcsoljuk. Ebben áll a nagy eljárástechnikai előny, mivel a molekülafragmensek kezelése egyszerűbb, mint a sok esetben komplexebb teljes molekulának a kezelése.

Amint a találmány keretében kimutattuk, a donor-állatok immunizálása egy előzőkben leirt konjugátummal, amely egy szokásos módon alkalmazott, nagymolekulájú hordozóból és egy (A) általános képletű szulfonamid-karbamid-herbicici szulfonamid-részéből áll, meglepő módon nagy specifitású antitestek termeléséhez vezetett.

Ezért a találmány egy további tárgya az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidek, különösen az (I) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidek és még előnyösebben a (II) képletű vegyület szulfonamid-részének felhasználása koniugátumok előállításához, amelyeket a donor-állatok immunizálására lehet alkalmazni, ami végülis a nevezett herbicidmolekulák elleni nagy affinitású monoklónál is antitestek termeléséhez vezet.

Az említett szulfonamid-részként előnyösen szóba jön egy szubsztituált ári 1szulfoni1-csoport, ahol az aril-rész előnyösen feni 1-csoport. Az (A) általános képlet alá tartozó szulfonil-karbamid-herbicidek körének egy tipikus képviselőjét leírták például a 0 120 814 sz. európai közrebocsátási iratban.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint tehát nem a teljes szulfoni1-karboni1-molekulát kapcsol• ♦ » » » * * ·« • · · • · · · · · ♦ · ·· ·*· ·

- 21 juk a hordozó molekulához, hanem csak egy kiválasztott részt abból, amely a mindenkori kívánt determináns csoportot egy olyan formában tartalmazza, hogy az egy, nagyon specifikus immunválaszt válthat ki. Különösen előnyös a találmány keretében a (II) képlettel ábrázolt vegyület fragmense, amely a szulfonamid-részre korlátozódik.

Az említett szulfonamid-részt például úgy kaphatjuk meg, hogy a megfelelő szulfoni1-karbamid-herbicidet a szulfonamid-kötésnél önmagában ismert módon hídrólitikusan hasítjuk. Az ilyen módon kapott szulfonamid-kapcsoló-fragmens ezáltal egy végcsoporttal rendelkezik, amelyre most nagyon egyszerűen egy alkalmas kapcsolóhidat kapcsolhatunk, amely a hapténmolekula ezt követő konjugációjához felhasználható. A hidtag kapcsolása például oly módon történhet, hogy az előzőleg említett -SC^-NH ₂ csoportot egy reakcióképes szénsav-származékkal, mint pl. egy borostyánkősav-származékkal vagy előnyösebben egy megfelelő anhidriddel átalakítjuk. Egy borostyánkősav-származék alkalmazásakor eközben a -SO2-NH-C(0)-CH2CÍÍ 2COOH csoport keletkezik. A reakciót előnyösen bázikus közegben folytatjuk le, még előnyösebben egy alkalmas katalizátor, mint pl. az 1.1. példában alkalmazott 1,8-diaza-biciklo 5.4.0 -dodeka-7-en jelenlétében.

A találmány szerinti molekulafragmens magától értetődően az ismert kiindulási anyagokból és reagensekből kiindulva kémiai szintézissel előállítható. A láncvégi karboxiΙο söpört ismert módon, az irodalomban leirt számos eljárás szerint amino- vagy SH-csoporttá alakítható át, amelyek ugyancsak kiemelkedő reaktivitással rendelkeznek a hapténmolekula kapcso lásához.

A hapténmolekulának a hordozó molekulához történő konjugációjához hid-tagként elsősorban azokat a vegyületeket lehet figyelembe venni, amelyek legalább egy vagy több reaktív csoportot tartalmaznak, amelyek a hordozó molekula szabadon hozzáférhető reaktív csoportjával kölcsönhatásba léphetnek.

Különösen előnyös a találmány szempontjából olyan hid-tagok alkalmazása, amelyek 2-10 hidat alkotó szénatomot tartalmaznak, és amelyek reaktív csoport/ok/ként egy vagy több reaktív csoporttal, mint pl. amino-, karboxi- vagy SH-csoport/ok/, rendelkeznek. Ezeket a reaktív csoportokat lehet aztán önmagában ismert módon a haptén- és a hordozó molekula reaktív csoportjaival reakcióba hozni egy haptén-hordoző-konjugátum képződése közben.

Igv példaképpen eg.y hid-kapcsolat (hid-tag) képezhető dialdehidek (pl. glutáraldehid) segítségével egy reaktív aminocsoporton át a hordozó molekula szabad aminocsoportjainak egyikére. Ez a hid egy reaktív SH-csoporttal rendelkezik, igy a haptén konjugációja a hordozó molekulára a hordozó szabad SH-csoportjainak oxidációján keresztül kivitelezhető.

Különösen előnyös a találmány keretében karboxi lcsoportot tartalmazó hid-tagok felhasználása, amelyek vízmegkötő szerek segítségével, mint pl. egy karbociiimid, előnyösen Η,r?-diciklo-hexi1-karbodiimid, a hordozó molekula szabad aminocsoportjaival összekapcsolhatók.

Ahhoz, hogy az antigént a hordozó fehérjére kapcsolhassuk, először erre a kapcsolásra képes származékot kell előállítani.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint ·♦ _ ··*·· • · · **· «♦ · » »· • · Λ · ·« ** ·· ·*4·

- 23 azon konjugátumok előállításához, amelyek a donor-állat immunizálása után egy specifikus immunválasz kiváltásához és végső soron az (A) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidekkel szemben nagy affinitású monoklonális antitestek képződéséhez vezetnek, egv fragmenst alkalmazunk, amely lényegében a nevezett szulfoni1-karbamid-herbicidek szulfonamid-részét foglalja magában. Ezen fragmensből származékot képezve egy igazán ideális kapcsoló komponenst kapunk, amely az (A) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidekkel szembeni nagy affinitású monoklonális antitestek előállítására kiválóan alkalmazható.

Különösen előnyös a (Hl) képletű szulfoni1-karbamid-származék, amely a triazin-amin-csoportnak egy F? -(CH_a)_nf-cs°portra történő kicserélésével hozható létre, és ahol

R jelentése -COOH, -Nii_z vagy -SH-csoport, különösen pedig -COOH-csoport, és n’ egy 1 és 10 közötti egész szám, előnyösen 1 és 6 között, és n egy 0 és 4 közötti egész szám, különösen 1, és ezáltal a szulfonamid-részre korlátozott.

A találmány keretében előnyösek azok a kapcsoló komponensek, ahol R jelentése aminocsoport és n’ egy 2-5 közötti egész szám, különösen pedig 3-t jelent.

Különösen előnyös kapcsoló komponensek, ahol R jelentése karboxilesöpört és n’ egy 2-6 közötti egész szám, különösen pedig 2-t jelent.

Legelőnyösebb a találmány szempontjából a (IV)

- 24 * ·»· · 9··· • « « »4« «» « » * * • · · « · Μ «· ·· ··« · képletű vegyület, amely a triazin-amin-csoportok a —(CH_Z)-(CH₂)C00H-csoportra történő kicserélésével hozható létre és amelyet az 1.1 példában leirt módon állítottunk elő. /Az ebben az eljárásban alkalmazott kiindulási vegyületek és reaktánsok ismertek vagy az ismert, szerkezetileg hasonló vegyületek analógiájára előállíthatok.

Alternatív módon lehet előállítani egy (V) képletű származékot az (I) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek elleni monoklonális antitestek termeléséhez, a teljes, intakt szulfoni1-karbamid-herbicid-molekulából származék képzésével. Az (V) képletű származékban

P,’ , n és E jelentéase az (I) képletnél megadott,

Y jelentése egy, adott esetben a C_x-nél egy oxigénatommal megszakított 1-4 szénatomos alkilén-hid, amely szubsztituálatlan vagy egy vagy több halogénatommal vagy 1-3 szénatomos alkilesöpörttál szubsztituált, és - vagy közvetlenül vagy egy kén- vagy oxigénatomon keresztül - a heterociklus szénatomjához kötődik;

R⁵ jelentése -COOH, ha rn egy 1 és 10 közötti egész szám, előnyösen 1-6; és r’ jelentése -COOH, -N.H₂ vagy -SH-csoport, különösen -ΝΗχ, ha m egy 2 és 10 közötti egész szám, különösen ha 2 és 6 közötti.

Előnyös a (VI) képlet szerinti származék is, ahol a triazin-gyűrű 4-es helyzetébe egy Rⁿ -(CH₂)_rn-O- csoportot vezetünk be, ahol

- 25 ' ·· · ·»** ·* · · ·* • · · · • · · · * k

·· ··

R^H jelentése -COOH-csoport, ha m 1 és 10 közötti egész szám, előnyösen 1 és 6 közötti, és

R^,J jelentése -COOH, -NH₂ vagy -SH-csoport, különösen pedig -NH₂-csoport, 'na m egy 2 és 10 közötti egész szám, előnyösen 2 és 6 közötti.

A kapott, kapcsolásra képes szulfoni1-karbamid-származékok újak és specifikus kapcsoló-képességüknél fogva értékes kiindulási anyagok a találmány szerinti monoklonális antitestek előállításánál. Ezért a találmány fontos részét ké pezik .

A tulajdonképpeni kapcsolási reakciót az alkalmazott szulfonil-karbamid-származéktól függően célszerűen aktivészteres módszer vagy diazónium-eljárás segítségével végezzük /Kelly H. et al:

Agric.

Food

Aktivészteres módszer alkalmazása során a szulfonil-karbamid-származékot először alkalmas oldószerben feloldjuk. Alkalmas oldószerként különösen aprotikus oldószerek jönnek szóba, amelyek magas forrásponttal rendelkeznek, mint pl. az N,N-dimetil-formamid (DMF) vagy dimetilszulfoxid (DMSO).

Ezután a karboxi1-csoportokat aktivészterré alakítjuk úgy, hogy az előzőleg feloldott szulfonil-karbamid-származékot pl. N-hidroxi-szukcinimiddel, N-hidroxi-szulfoszukcinimiddel, Ν,Μ-diciklohexi1-karbodiimiddel vagy N,M^,-karboxi1-diimicl azollal vagy ezek származékaival reagáltatjuk.

Az aktív észtereket ezután a reakciókeverékből kiszűrjük és a BSA-hoz vagy KLH-hoz hozzáadjuk. 0,1-12 óra közötti, előnyös 4-5 órás inkubálás után a csapadékot eltávolítjuk. A felülúszót - adott esetben további tisztítási lépések

- 25 • * · « ·· V · · • · · · · » ·· ·· «·· * közbeiktatása után - a tulajdonképpeni immunizálási reakcióban felhasználjuk.

A találmány keretében előnyösen alkalmazott aktivészteres módszer mellett a haptén hordozó molekulára történő kapcsolásához alternatív eljárásként használhatjuk pl. a vegyesanhidrid-rnódszert is. Ennek során a 'nid-tag karboxi 1csoportját egy szénsavanhidríd vagy az 1-etil-3-(3^J-dimetíl-amino-propi1)-karbodiimid segítségével kötjük a hordozó molekulára.

A származék kapcsolását egy reaktív aminocsoporton keresztül, előnyösen Kelly és mtsai (19G5) által leirt diazónium-eljárás segítségével végezzük.

Ezen eljárás során a megfelelő reaktív aminocsoportot célszerűen alacsony hőmérsékleten, előnyösen 0° Οση, erősen savas közegben nátríum-nítrittel reagáitatjuk. A kapott diazónium-sót aztán lassanként a hordozó molekula pufferolt, bázikus oldatához adjuk. Ezt az oldatot lehet aztán, adott esetben további tisztítási lépések közbeiktatása után, a tényleges immunizáláshoz felhasználni.

A donor-állat immunizálása egy nagymolekulájú hordozó molekulához kapcsolt haptén egyszeri vagy többszöri beadása útján történik. Különösen előnyös egy 2-3-szori beadás, amelyet 7-30 naponként, célszerűen pedig 12-15 naponként végzünk.

A találmány keretében előnyös beadási forma az injekció, amelyet mind intravénásán, intraperitoneálisan mind szubkután beadhatunk. Előnyös a szubkután és intraperitoneális injekció kombinációja.

- 27 Az immunogént (szulfoníl-karbamid-konjugátum) ebben az esetben egy alkalmas pufferben, mint pl. egy PBSpuffer, alkalmazzuk, amely egy szokásosan használt adjuvánst tartalmaz. Λ találmány keretében különösen előnyös a Freund-adjuváns használata.

Egy 0,5-4 hónapi nyugalmi periódus után a haptén-konjugátum ismételt egyszeri beadását (boost) 10 /ug-1000 /uc mennyiségben, különösen 50 /ug-5000 /jg mennyiségben elvégezzük.

A legutolsó dózis utáni 1-5 napos időtartamban a donor-állatokat leöljük, a lépőket kivesszük és egy lépszuszpenzíót készítünk.

Az izolált lépsejteket egy alkalmas pufferben (pl. BSS-puffőrben) szuszpendáljuk és sejtszuszpenzió formájában a megfelelő mielóma-sejtekkel történő fúzióig megőrizzük.

Kezdetben ezeket a fúziókat komplikálta az, hogy a mielóma-sejtvonalak is szintetizáltak monoklonális antitesteket, úgy hogy a hibrid két típusú monoklonális antitestet produkált, egyet, amely a mielórna-sejtből ered, és egy másikat, amely az immunkompetens sejtek genetikai információja által volt definiálva.

A találmány szempontjából ezért előnyös olyan tumorsejteket alkalmazni, amelyek maguk monoklonális antitestet nem tudnak előállítani, mint pl. az SP2/0-Ag14 /Schulman M. et al: Natúré, 275, 269-270 (1978)/, X63-Ag8.653 vagy a ΡΛΙ /Stocker ÓVJ. et al: Hoffmann-La Roche Research Disclosure, 21713, 155-157 (1982)/, miáltal a kapott fűzi

- 23 ős termék analízise nagyon leegyszerűsödik. A fúzió sikere szempontjából előnyős, ha a lépsejtek 2-20-szoros feleslegben vannak a mielómalsejtek'nez viszonyítva.

Az említett fúziósközegként előnyösen olyan puffer-oldat jön szóba, amely egy, a sejtek fúziójához szokásosan alkalmazott fúziósprornotert tartalmaz, mint pl. a Sendai vírusok vagy egyéb paramixo-virusok, adott esetben UV-inaktivált formában, továbbá kalcium-ionok, felülaktiv lipidsk, mint pl. a lizolecitin vagy polietilén-glikol.

Különösen előnyös a találmány szempontjából egy közepes molekulatömegű polietilén-glikol (PEG) alkalmazása 30-50 % koncentrációban, legelőnyösebb a PEG 4000 kb. 50 % koncent rációban. A fúzió optimális hőmérséklete

zött van, különösen előnyös a 37 °C hőmérséklet.

Az immunkompetens lépsejteknek a mielóma-sejtekkel végbement fúziója után a fúzionált antitestet termelő hibridsejteket önmagában ismert eljárások segítségével szelektáljuk.

A két típusú szülősejt sikeres fúziójának, a hibidsejteknek a szelekciójára különböző lehetőségek állnak fenn. Rutinszerűen a fúziós protokollban minden szülőtipusból egy millió vagy több sejtet alkalmazunk. Mivel a fúzió nem 100 %-ban megy végbe, nehéz vállalkozás, hogy a fúziós termékeket a nagyszámú nem fuzionált, illetve önmagával fuzionált szillősejttől elválasszuk.

Mint a fentiekben említettük, a hibridómasejtek a rövid életű, antitestet-termelő (lép) B-sejtek és a hosszúéletű mieloma-sejtek fúziója révén keletkeznek.

- 29 A kívánt eredmény egy hosszúéletű sejtvonal, amely antitestet termel. Mivel a lépsejtek a tenyészetben csak egy korlátozott élettartammal rendelkeznek, ezáltal elvben egyszerűen ki lehet várni, amíg az összes nem-fúzionált illetve minden önmagával fuzionált lépsejt elpusztul. Ekkor azonban még mindig megmarad az a feladat, hogy a hosszúéletű antitestet-termelŐ sejteket a hosszúéletű antitestet-nem-termelö sejtektől elválasszuk.

Egy használatos szelekciós szisztéma azon alapul, hogy a hipoxantin-guanin-foszfo-ribozil-transzferáz enzim (HGPRT) rendelkezésre áll-e vagy sem. Ez az enzim a Salvage Pathway-ben a purin alkotója az emlős sejtekben. Ezek a sejtek képesek ezen túlmenően is a purinokat de novo szintetizálni .

Normál körülmények között valószínűleg mindkét szintézis-öt bizonyos mértékben paralell fut egymás mellett.

Abban az esetben, ha egy sejt mégsem tartalmaz HGPRT-t, a Salvage Patliway blokkolt és a purinoknak nem-purin anyagokból kell képződniük.

A HGPRT-negativ mielóma-sejtek szelekciójára szokásosan az ún. purin-antimetabolitokat alkalmazzák, mint pl. a 8-azaguanin, amely a purin guaninhoz szerkezetileg nagyon hasonló és ezáltal néhány normál reakcióban azt helyettesíteni tudja.

Az azagunin beépülése egy DMS-be, a normál növekedési viselkedés korlátozásához és végül a. sejthalálhoz vezet. Mivel az azaguanint a Salvage Pathway-ben kell kicserélni, minden ugyanilyen sejt, amely semmiféle HGPRT-aktivi

- 30 tással nem rendelkezik, azaguanint nem tud értékesíteni és ezáltal annak jelenlétében növekszik.

Egy szelekciós rendszert ismertetett Littlefield J.W. /Science, 145, 709 (1964)/, amely ugyanezzel az enzimmel, azonban fordított előjellel működik, amelyben ebben az esetben HGPRT-pozitiv sejtek szelektálódnak.

Ez a szelekciós rendszer az ún. HAT-medium felhasználásán alapul, amely hipoxantint, aminopterint és timidint (HAT-medium) tartalmaz alkotórészekként. Az aminopterin egy antimetabolit, amely a de novo purin-szintézist, valamint a dezoxiuridilát timidiláttá történő metilezését gátolja.

A hipoxantin secitö-purinként szolgál arra az esetre, amikor az aminopterin a de novo purin-szintézist blokkolja, mialatt a timidin a dezoxiuridilát metilezését feleslegesen csinálja.

Ezáltal aminopterin jelenlétében minden HGPRT-pozitiv sejt proliferálódik, miközben a HGPRT-negativ sejtek elpusztulnak.

Abban a hibridrendszerben, amelyet a találmány keretében a szelekcióra alkalmazunk, a mi el óma'sejtek célszerűen rezisztensek az azaguaninra és érzékenyek az aminopterinre, azaz HGPRT-negativak. Az antitestet-termelő sejtek ezzel szemben HGPRT-pozitivak.

A sejtek fúziója és HAT-közegben történő tenyésztése során a sikeresen egymással fúzionált sejtek szelektálnátok, mivel a mielóma-sejtek, csak a HGPRT-aktivitás jelenlétében képesek növekedni, és ezzel az aktivitással csak a HGPRT-pozitiv sejtvonalak rendelkeznek.

A HGPRT-pozitiv antitestet-termelő sejtvonalak ebben a közegben alig pusztulnak el. A túlélés azonban egy meghatározott ideig tart, és nem képesek proliferálédni.

Ezáltal, a sejtek fúziójával a HAT-közegben egy olyan rendszer jön létre, amelyben bár a mielóma-sejtek és az antitestet-termelő sejtek egy ideig képesek növekedni, amely idő a hibridsejtek termelésére elegendő, amelyben azonban csak a hibridsejtek képesek túlélésre és sokszorozódásra.

I\ találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a fuzionált hibridsejteket előzőleg kezeletlen, nem-immunizált kísérleti állatok peritcneumából izolált makrofágok, az úgynevezett feeder-sejtek jelenlétében tenyésztjük. A fuzionált hibridsejtek tenyésztésére és szelektálására a sejtszuszpenziót több aliguotra osztjuk és az egyes aliguotokat folyamatosan a hibridsejt-kultúra képződésére, valamint az antitestek képződésére átvizsgáljuk.

Különösen előnyös a találmány keretében a hibridsejtek mikrotiter-lemezeken történő tenyésztése.

Ennek során a fúzió után kapott sejtszuszpenziót a mikrotitér-lemez egyes mélyedéseibe szétosztjuk és 7-30 napon át megfelelő, a hibridsejtek növekedéséhez szükséges körülmények között (pl. HAT-médiun) tenyésztjük.

A növekedő hibridkultúrák felülúszóját folyamatosan vizsgáljuk antitest-képződés szempontjából.

A pozitív hibridsejt-kultúrákat azután ismert eljárások segítségével, előnyösen csökkenő higitási eljárás segítségével elválasztjuk és végül - mint tiszta kultúrát - 32 egy megfelelő tenyésztőközegben klónozzuk.

A megnőtt sejtklónok felülúszóját hasonló módon antitest-képződésre átvizsgáljuk.

Az előzőkben leírtak szerint előállított találmány szerinti hibridóma-sejtklónok sfeenelése a megfelelő monoklonális antitestek képződésére, előnyösen végrehajtható egy szokásosan erre a célra alkalmazott ímmunoassay segítségével, mint pl. egy enzimhez-kapcsolt ímmunoassay vagy egy radioimmunoassay.

Az enzimhez-kötött Ímmunoassay során az előzőleg közelebbről jellemzett haptén-konjugátumot először egy szilárd hordozóra adszorbeáljuk. A visszamaradó szabad kötőhelyeket végül a hordozó molekula hozzáadásával telitjük és ezáltal blokkoljuk.

A monoklonális antitestek kimutatásához a felülúszó aliguotjait, amely a nevezett hibridóma-sejtklónokat a hordozóhoz kötött haptén-konjugátummal együtt tartalmazza, inkubáljuk.

A találmány további tárgya tehát monoklonális antitestek előállítása önmagában ismert

jellemző, hogy az előzőkben közelebbről jellemzett találmány szerinti hibridóma-sejtvonalakat vagy ezek kiónjait vagy szubklónjait, amelyek a találmány szerinti antitesteket szintetizálják és előnyösen a környező médiumba kiválasztják, in vit ro vagy in vivő ismert eljárások segítségével tenyésztjük.

A találmány szerinti hibridőmasejtek in vitro tenyésztését alkalmas tenyésztőközegekben, különösen a szokásosan alkalmazott, standardizált tenyészközegben, mint pl. DMEM közegben (Dulbecco Modified Eagle Médium), vagy RPMI 1540 tápközegben, adott esetben emlős-szérumok hozzáadásával, mint pl. totális borjúszérum vagy a növekedéshez szükséges adalékanyagok és nyomelemek segítségével lehet teljessé tenni.

A monoklonális antitestek izolálása célszerűen a hibridóma kultúra mindenkori fe1ü1 úszójábó1 az immunglobulinfrakció kicsapásával kezdődik. Ehhez további feldolgozási és tisztítási lépések csatlakoznak, amelyek ezen a területen jártas szakember számára ismertek és magukban foglalják pl. a kromatográfiás módszerek alkalmazását, így pl. a gélszűrést, ioncserélő-kromatográfiát, DEAE-cellulóz-kromatográfiát, protein-Avagy immunaffinitás-kromatográfiát.

Nagy mennyiségű' találmány szerinti monoklonális antitestet azonban in vivő eljárások segítségével is lehet nyerni .

Igv például lehetséges az antitestet-termelő hibridöma-sejtklónokat egy alkalmas emlős állatba injektálni, amelyek az antitestet-termelő tumorok kifejlődését indukálják a kezelt állatokban. Egy-három hetes időtartam után az ilymódon

az antitestek izolálhatok.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint nőstény Balb/c egereket melyeket adott esetben egy szénhidrogénnel, mint pl. Pristan-nal kezeltünk, egy találmány szerinti hibridóma-sejtklénnal intraperitoneálisan beoltottunk.

A hibridóma-sejtklón beadása után 3 hétig az aszcitesz-folyadékot gyűjtöttük és további feldolgozásig eltettük.

A monoklonális antitestek izolálását az előzőkben leirt, az in vitro tenyésztett hibridómák felülúszójából történő izolálással pontosan analóg módon végeztük.

A találmány egy további tárgya a találmány szerinti antitestek felhasználására vonatkozik egy, az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicicíek kimutatására szolgáló immunoassay-ben, előnyösen az (I) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidek kimutatására és még előnyösebben a (II) képletű vegyület kimutatására, valamint a szulfoni1-karbamid-herbicidekkel struktúráiisan rokon vegyületek, mint pl. a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban megadott A képletű vegyület differenciálására.

A találmány szerinti monoklonális antitestek tehát minden olyan ismert immunoassay-ben alkalmazhatók, amelyek az antigén és a megfelelő monoklonális antitest közötti kötésre épülnek, így pl. radioimmunoassay-ben (RIA), enzimhez-kaocsolt immunoassay-ben (ELISA), immunfluoreszcens-tesztben, stb.

RIA-tesztben a találmány szerinti monoklonális antitestek önmagukban, vagy még inkább radioaktív jelzett származék formájában alkalmazhatók. Ezáltal a RIA-teszt mai napig ismert minden módosítása a releváns célvegyületek kimutatására ezen találmány keretében felhasználható, így pl. a RIA-teszt homogén vagy szilárd fázisban, a heterogén RIAteszt és az egyszerű RIA-teszt az antigén direkt vagy indirekt (kompetitiv) kimutatásával. Ez hasonlóképpen érvényes az enzimhez-kapcsolt immunoassay felhasználására is.

Előnyös a találmány keretében a találmány szerinti monoklonális antitestek egy kompetitiv immunoassay-ben történő felhasználása az (I) képletű szulfoni1-karbamid-her- bicidek kimutatására, különösen pedig a (II) képletü vegyület kimutatására.

A kompetitiv immunoassay lényege a versengésben van egy jelzett illetőleg egy szilárd hordozóra kötött antigén és egy szabad antigén között az antitestmolekulán lévő releváns kötőhelyekért.

A kompetitiv immunoassay kivitelezéséhez alapvetően két lehetőség közül lehet választani:

a/ Az első eljárás egv szilárd hordozóhoz kötött antigén és egy szabad antigén közötti versengésen alapul az antitestben lévő szabad kötőhelyekért, amely egy markerrel van ellátva. Az antigén kötése a szilárd hordozóhoz vagy közvetlenül vagy egy carrier-molekulán keresztül történik.

A szabad antigén koncentrációiának meghatározását ebben az esetben a jelzett, hordozóhoz-rögzitett antigénen keresztül kötött, antitest eltávolítása által végezzük. Ez az eltávolítás arányos a szabad antigén próbában lévő mennyiségével.

b/ Egy alternatív eljárás azon alapul, hogy a szabad és jelzett antigén konkurrál egymással az antitest releváns kötőhelyeiért, amelyet ebben az esetben egy szilárd hordozóhoz kötöttünk.

A szabad antigén koncentrációjának meghatározását a jelzett antigén eltávolítása által végezzük, amely változik a szabad antigén koncentrációjának függvényében.

Az antigén vagy antitest megkötésére alkalmas szilárd hordozóanyagként szóba jönnek például egy mikrotiterlemez vagy egy tesztcsövecske plasztik mélyedései, amely mélye

- 36 elések felülete polisztirolból, polipropilénből, poliamid-kloridból, üvegből vagy műanyagból van, vagy szűrőpapír, dextrán-cellulóz vagy mikrocellulóz-csikok felülete. Ezeket egy találmány szerinti monoklonális antitesttel vagy antigénnel bevonjuk, amikoris a hordozóanyagra a kötődés egy egyszerű adszorpció réven vagy pedig - adott esetben - a hordozóanyag előzetes aktiválása után, pl. glutáraldehiddel vagy ciano-bromiddal; végbemegy.

Különösen előnyös a találmány keretében a találmány szerinti monoklonális antitest alkalmazása egy enzimhez-kapcsolt immunoassay keretében ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)/.

Ennek során a találmány szerinti monoklonális antitestet önmagában vagy egy enzimhez-kapcsolt származék formájában alkalmazzuk.

Az ELISA-assay vagy a találmány szerinti monoklonális antitest enzimhez-kapcsolt származékának felhasználásán vagy egy önmagában ismert enzimhez-kapcsolt antitesteknek a felhasználásán alapszik, amelyek a találmány szerinti antitest epitópját felismerik és arra kötődnek.

Különösen előnyös a találmány szempontjából azon ELISA-assay alkalmazása, melynek során egy előzőleg leírt hordozóanyagot először az antigénnel bevonunk. A hordozóhoz-kötött antigént ezt követően egy teszt-oldattal inkubáljuk, amely a kimutatandó antigént, valamint a találmány szerinti antitestek egyikét tartalmazza. A kimutatandó antigén ezáltal vagy szabad formában vagy pedig mint egy víz- vagy talajpróba alkotórészeként szerepel.

- 37 Tíz perctől 2 óráig tartó inkubációs idő után az egész réteget egy enzimmel jelzett antitesttel inkubáljuk, amely a találmány szerinti monoklonális antitestet felismeri és ehhez kötődik. Ilyen enzimmel jelzett antitestre példa a foszfatázzal jelzett kecske anti-birka immunglobulin, vagy egy megfelelő kecske anti-egér antitest, amely a kereskedelemben hozzáférhető.

A kötött antitestfehérje mennyiségét aztán egy enzim-szubsztrát reakció, pl. spektroszkópiás eljárás segítségével lehet meghatározni.

Hasonlóképpen előnyös a találmány szempontjából egy ELISA-teszt, amely a jelzett, valamint a szabad antigén egy előzőleg megnevezett hordozóhoz-kötött antitestért folytatott versengésén alapul.

A szabad antigén részét, amelyet a meghatározandó próba tartalmaz, ebben az esetben a jelzett antigén eltávolításán keresztül határozzuk meg, amely annál pontosabb, minél több szabad antigént tartalmaz a próba.

A jelen találmány továbbá olyan eszközökre is vonatkozik, amelyek az (A) általános képletű szulfonil-karbamid-herbicidek, különösen pedig az (I) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek és még előnyösebben a (II) képletű vegyület kvalitatív és kvantitatív meghatározására alkalmasak, teszt-kitek formájában, amelyek a találmány szerinti monok lónál is antitestek és/vagy ezek származékai mellett adott esetben még egyéb monok lónál is vagy poliklónál is antitestet is, különösen pedig jelzett mono- vagy poliklonális antitestet, valamint további adalékokat tartalmazhatnak.

- 38 Különösen előnyösek a találmány keretében azok a teszt-kitek, amelyek a szokásosan alkalmazott immunoassay-ék egyikén nyugszanak, melyet a radioimmunoassay, enzimhez-kapcsolt immunoassay és kemiluemineszcens-assay csoportból választottunk ki. Legelőnyösebb teszt-kitek, melyekben a célvegyület kimutatása egy kompetitiv immunoassay-n, különösen egy enzimhez-kapcsolt immunoassay-n (ELISA) alapszik.

Egy teszt-kit a (II) képletű vegyület radioimmunológiai kimutatására, amely a találmány keretében előnyös, például a következő alkotórészeket tartalmazhatja:

a/ egy alkalmas hordozóanyagot, amely bevonatlan vagy egy találmány szerinti antitesttel vagy egy antigénkoniugátummal lehet bevonva, b/ egy találmány szerinti antitest és/vagy egy radioaktivan jelzett származékának vagy radioaktivan jelzett antigénnek, adott esetben liofilizált vagy koncentrált oldatát, vagy az antigén standardizált oldatát, c/ pufferoldatokat és d/ adott esetben polipeptideket, detergenseket és további adalékokat, amelyek például egy nem-specifikus adszorpciót és aggregációképzödést gátolnak, valamint e/ pipettákat, reakcióedényeket, hitelesítő görbéket, kísérő cédulákat stb.

Egy teszt-kit a (II) képletű vegyület immunológiai kimutatására, amely egy enzimhez-kötött immunoassay-n (ELISA) alapul, például a következő komnponeneseket tartalmazhatja:

a/ egy megfelelő hordozóanyagot, amely bevonatién vagy egy találmány szerinti antitesttel vagy egy antigén-konjugátummal lehet bevonva, b/ egy adott esetben liofilizéit vagy koncentrált oldatát egy találmány szerinti antitestnek és/vagy egy második enzimmel-jelzett monoklonális vagy poliklonális antitestnek, amely a meghatározandó antigén ellen vagy egy antigént felismerő antitest ellen irányul, c/ enzimszubsztrátot szilárd vagy oldott formában, d/ antigént vagy az antigén standardizált oldatát, e/ pufferolciatokat, f/ adott esetben polipeptideket, detergenseket és további adalékokat, amelyek például egy nem-specifikus adszorpciót és aggregációképződést gátolnak, valamint g/ pipettákat, reakcióedényeket, hitelesítő görbéket, festéktáblákat, kísérő cédulákat, stb.

Egy teszt-kit a (II) képletű vegyület kimutatására, amely egy kérni lumineszcens teszten alapul, példaképpen a következő komponenseket tartalmazhatja:

a/ egy alkalmas hordozóanyagot., amely bevonatién vagy egy találmány szerinti antitesttel vagy antigén-konjugátummal lehet bevonva, b/ egy találmány szerinti antitest, adott esetben liofilizált vagy koncentrált oldatát, és egy második poliklonális antitestet, amely képes felismerni a találmány szerinti első antitestet és amely egy kérni lumineszcens jelzéssel van ellátva, c/ oldatokat, amelyek a fény emissziót kiváltják, igy pl. hidrogén-peroxidot és nátrium-hidroxidot,

- 40 d/ pufferőIdátokat, e/ adott esetben polipeptideket, detergenseket és további adalékokat, amelyek a nem-specifikus adszorpciót és aggregációképződést gátolják, valamint f/ pipettákat, reakcióedényeket, kisérő cédulákat stb.

A hordozóanyagok, amelyek a találmány keretében felhasználhatók, magukban foglalják elsősorban az oldhatatlan, polimer anyagokat, kiválasztva a polisztirol, polietilén, polipropilén, poliészter, poliakrilnitri1, polivinilklcrid, poliakrilamid, nitrocellulóz, keresztkötött dextrén, fluorozott gyanta, agaróz, keresztkötött agaróz, poliszacharidok, stb. csoportjából. Ezek mellett azonban egyéb anyagok, így pl. az üveg, fémek, neylon alapú szövetháló, stb. is szóba jöhetnek.

Az előzőkben megnevezett néhány hordozóanyagot nagyon eltérően lehet kidolgozni és a mindenkori kitűzött specifikus felhasználási céltól függően nagyon különféle formában lehet alkalmazni.

tartoznak

tálkák, golyók, lapok, rudacskák, sejtek, üvegecskék, zák az áttetsző plasztik anyagokból készült csövecskék, számikrotiter lemezekét, pl. polivinilkloridból vagy polisztirolból, amelyek bevonat nélküliek vagy egy találmány szerinti antitesttel, egy sza-

bad antigénnel	vagy egy antigén-konjugátummal lehetnek bevonva.
Hasonlóképpen a	lkalmazzák a polisztirolból, valamint poliszti-

rol-latexből készült golyócskákat, csövecskéket, vagy táblákat, amelyekből a bevonó latexanyag a polisztirolrészecskék centri- 41 -

fugálása utján leválasztható.

A találmány szerinti tesztkit-nek egy további alkotórészét képezik a markerek vagy indikátorok, melyek segítségével lehet a komplexképződési reakciónak a létrejöttét, különösképpen az immunreakciót kimutatni, amely előnyösen egy antigén-antitest-komplex'nez vagy egy 1 igand-receptor-komplexhez vezet, melynek segítségével a kimutatandó antigén kvalitatív, adott esetben kvantitatív kimutatása is lehetségessé válik. Markerként és indikátorként tekintetbe vehető néhány atom és molekula, amelyek vagy direkt módon vagy indirekt módon kimutatható szignál létrehozásában vesznek részt. Ezeket a markereket vagy indikátorokat vagy közvetlenül a kimutatandó antigénnel vagy egy találmány szerinti monoklonális antitesttel összekapcsolhatjuk vagy ezekbe beépíthetjük. Ezek lehetnek azonban önálló anyagok is vagy egy szeparált vegyület - amely sem a kimutatandó antigén maca, sem a találmány szerinti monoklonális antitestek egyike - alkotórészei, amelyek képesek a receptormolekulával reagálni, pl. komplexképzés formájában.

Egy ilyen jelenlévő szeparált vegyületként előnyösen szó lehet egy második antitestmolekuláról, amely monoklonális és poliklonális eredetű is lehet, egy komplementer fehérjéről vagy annak fragmenséről, az S. aureus protein A-ról, stb. Ezek a szeparált vegyületek felismerik és specifikusan kötődnek a receptormolekulához, amely pl. a kimutatandó antigén vagy egy találmány szerinti monoklonális antitest lehet, előnyösen azonban egv receptormolekula, egy komplex formájáSok esetben további reagensekre is szükség van,

- 42 amelyek aztán a markerrel együtthatva egy kimutatható szignált (jelet) adnak. Ez különösen akkor érvényes, ha enzimet involválnak.

Azon markerek és indikátorok, amelyek a találmány keretében felhasználhatók, az immunológia és immunkémia területén jártas szakember számára jól ismertek. Ezek közé tartoznak például a radioaktív jelzéssel ellátott elemek vagy vegyületek, enzimek vagy kérni lumineszcens vegyületek. A következőkben felsorolt lehetséges markerek és indikátorok csupán csak arra szolgálnak, hogy a felhasználható anyagok és reagensek sokaságát illusztráljuk, anélkül, hogy a találmány tárgyát ezekre korlátoznánk.

Alkalmas markerek és indikátorok például a radioaktív elemek csoportjában találhatók. Ezek közül azok az elemek különösen előnyösek, amelyek vagy maguk bocsátanak ki

424 425 128 11151 gammasugarakat, igy pl. J, J, ü, J, Cr vagy pedig ezeknek a sugaraknak az emisszióját indukálják, így pl.

4813

C, F, N^!. Hasonlóképpen alkalmasak az un. béta-sugárzók, . ₊ 111_T 14_ .3..

mint a In, C es H.

Továbbá alkalmas markerek a kérnilumineszkáló anyagok, különösen a fluoreszkáló anyagok, amelyek nagyon egyszerűen kémiai úton összekapcsolhatók an antigénnel vagy egy antitesttel anélkül, hogy denaturálnák azokat. A keletkező fluorokrom ezután igen egyszerűen fluorometriás eljárás segítségével kimutatható. A következőkben megnevezünk néhány anyagot, amelyet a fluorokromok csoportjából választottuk ki: fluoreszcein-izocianát, fluoreszcein-izotiocianát, 5-dimetil-amino-l-naftalin-szulfonilklorid, tetrametil-rodamin-izotiocianát,

Lissamin, Rhodamin 8200 Szulfonilklorid, stb.

További fluoreszcens anyagok és az analitikai módszer leírása megtalálható DeLuca-nál /Immunotluorescence Analysis, in: Antibody As a Tód, Marchalonis et al., John V'iley and Sons, Ltd. pp. 189-231 (1932)/.

Különösen előnyös a találmány szempontjából enzimek alkalmazása marker- és indikátor-anyagként, mint pl. a tormaperoxidáz, alkálikus foszfatáz, béta-D-galaktozidáz, glükózoxidáz, glikoamiláz, karbonsavanhidráz, acetilkolinészteráz, lizozim, malátadehidroqenáz, glükóz-5-foszfát-dshidrogenáz, stb. Enzimek markerként történő alkalmazása esetén szükség van további reagensek hozzáadására, amelyek lehetővé teszik, hogy az immunkomplex képződését az enzimaktivitáson keresztül kövessük, valamint egy stop-reakciót adnak, mellyel az enzimreakció befejeződhet.

Különösen előnyösek azok a reagensek, amelyek szín-reakcióhoz vezetnek. A tormaperoxidáz esetében ezen a helyen például a hidroaénperoxidot nevezzük meg, amelyet kombinálva egy további színprekurzorral, mint pl.

diamino-benzidinnel	vagy o-fenilén-diaminnal, barna vagy
sároa szint kapunk.	Glükózoxidáz markerként történő alkalma

zása esetén például a 2,2^,-azino-di(3-etil-benz-tiazolin-6-szulfonsav)-at /ASTS/ lehet mint szuosztrátot alkalmazni.

A találmány egy további tárgya tehát teszt-kitek, amelyek legalább egy találmány szerinti monoklonális antitestet vagy reagenst tartalmaznak, felhasználására vonatkozik az (A) általános képletű szulfoni1-karbamid-herbicidek, különösképpen a (I) általános képletű szulfonil-karbamid-her4

bicidek, még előnyösebben a (II) általános képletű vegyület gyors és hatékony kvalitatív és/vagy kvantitatív kimutatására, valamint ezen vegyületekkel szerkezetileg rokon vegyületektől, mint pl. Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint az A és B jelű vegyület a 2. táblázatban, történő differenciálásra.

A találmány szerinti monoklonális antitestek, ezen túlmenően az un. immun-tisztitásos analízisben alkalmazhatók, amely különösen a maradék-analizisben kerül felhasználásra. Ennek során a találmány szerinti antitestet egy mátrixra kötik kovalensen, előnyösen egy gél-mátrixra, majd ezt követően az ilyen módon kötött formában egy mini oszlopba töltik. Ezt az oszlopot lehet aztán a talajkivonat tisztítására felhasználni.

A találmány egy további tárgya tehát egy találmány szerinti monoklonális antitest immun-tisztitásos eljárásban történő alkalmazása, amely abban áll, hogy a/ a nevezett antitestet egy szilárd hordozóra kötj ük, b/ a nevezett hordozót egy mini oszlopba töltjük, c/ egy pufferoldatot, amely a tisztítandó és analizálandó próbát tartalmazza az oszlopra visszük, d/ adott esetben egy vagy több mosási lépést közbeiktatunk, és e/ az anyagot egy alkalmas eluáló-oldattal az oszlopról eluáljuk.

J ···· ·· 9 9 /κ * • · · · · « ·” ·· »·» *

I. A találmányt az alábbi - nem korlátozó jellegű - kiviteli példákkal mutatjuk be.

1. példa: Haptén-fehérje konjugátum előállítása

1.1. példa: 2-(3,3,3- trifluor-propil-fenil)-N-(j ,4-dikarbonsavamid)-szulfonamid előállítása

A (II) képletű vegyület egy hordozóhoz történő kapcsolásra képes származékának előállítását az 1. reakcióvázlat szerint vifelezhetjük ki. Az egyes reakciólépéseket az alábbiakban ismertetjük.

25,3 g 2-(3,3,3-trifluor-propil)-fenil-szulfonamid és 10,0 g borostyánkősav-anhidrid 250 ml dioxánban képzett oldatához enyhe hűtés mellett, szobahőmérsékleten, 1,5 óra alatt, 31,4 g 1,8-diaza-biciklo[5.4.ö]-dodeka-7-en dioxános oldatát hozzácsepegtetjük.

A kapott szuszpenziót 20^ó és 25 °C közötti szobahőmérsékleten 15 órán át továbbkevertetjük, majd 65 ml 2n sósavval megsavanyitjuk, szűrjük, majd szárítjuk. A kivált terméket ezután egy Kiesel-gél oszlopon toluol/eti1-acetát /3:1/ elegyével, mint eluciós-eleggyel, tisztítjuk. Ilyen'mődon 9,5 g cim szerinti, (IV) képletű vegyületet kapunk, amelyek op.-ja 138-139 °C.

A fent leirt eljárásban alkalmazott kiindulási anyagok és reagensek ismertek vagy az ismert vegyületekkel analóg módon előállíthatok.

« <»

1.2. példa: Haptén-fehérje konjugátum előállítása

A (II) képletű vegyület 1.1. példa szerint előállított származékát aktivészter módszer felhasználásával /Kulkarni

NP. et al: Cancer Rés. 41, 2700-2706 (1981)/ vagy marhaszérum albuminra (BSA, Fluka) vagy Keyhole Limpet Hemocyaninra (KLH, Calbiochem) konjugáljuk.

1.2.1. A (IV) képletű vegyület kapcsolása BSH-ra vagy KLH-ra aktivészteres módszerrel

A (IV) képlettel ábrázolt vegyületet N,N-dimetilformamidban feloldjuk (7,2 mg/200 /ul) szobahőmérsékleten és ezt követően N-hidroxi-szukcinimid 4-szeres feleslegével (9,1 mg/200 /ul), valamint N,M -diciklohexil-karbodiimid-del (16 mg/200 /ul) elegyítjük. A reakcióelegyet először 1 órán keresztül 22 °C-on és azt követően 18 órán át 4 °C-on kever tetjük.

Ezen reakció során képződött csapadékot 3 perces centrifugálással (12 000 g-vel) szobahőmérsékleten eltá volítjuk és a tiszta felülúszót, amely az aktivésztert tar talmazza, 12 mg BSH-hoz vagy 12 mg KLH-hoz adjuk, amelyet előzőleg 3,3 ml foszfáttal-pufferolt sóoldatban (PBS-puffer) oldottunk.

órás 4 °C-on történő inkubálás után a képződött csapadékot 10 perces centrifugálással (2 000 g-vel) °C-on eltávolítjuk és a felülúszót, amely a fehérje konju gáturnot tartalmazza, PBS-sel szemben tartósan diaiIzáljuk, mielőtt azt az immunizálási kísérletekben felhasználnánk.

- 47 A kapcsolási reakció mértékét abszorpciós spektrofotometriával határozzuk meg. A haptén-tartalom a BSA-hoz viszonyítva kb. 20:1 (mol/mol), előnyösen pedig 23:1.

2. példa: Immunizálás

Két csoport, egyenként 5 nőstény, 4-6 hetes BALB/C egér (Tierfarm Sisseln, Svájc) kapott 2 hetes időközönként 3 intraperitoneális illetőleg szubkután injekciót, amely KLH-konjugátumot tartalmazott. Az 1.2.1. példa szerint előállított konjugátum dózisa 25 /jg/injekció.

Az első injekció 0,1 ml konjugátumot tartalmazott PBS-ben, amelyet 1:1 arányban, azaz 0,1 ml Freund-adjuvánssal összekevertünk.

Ebből az injekció-oldatból 50 /il-t intraperitoneális úton adunk be, a maradék 150 /ul-t pedig szubkután.

A második és harmadik injekció sorozatnál, amely

14. és 30. napon történik az első beadás után, a komplett Freund-adjuvánst inkomplett által pótoljuk.

Az utolsó injekció után 1 héttel a kísérleti állatok vérszérumát eltávolítjuk és a vér-titert ELISA-teszt segítségével meghatározzuk, melynél a mikrőliter lemezeket előzőleg BSA-hoz konjugált hapténnel vontuk be (lásd 6. példa).

Egy 2 hónapos nyugalmi periódus után egy további, egyszeri intraperitoneális injekciót, amely KLH-konjugátumot tartalmaz, adunk be 220 /jg/200 /ul PBS dózisban (haptén-fehérje-konjugátum). 3-4 nap múlva az egereket megöljük és az ebből izolált lépsejteket PAI mielómasejtekkel fuzionáljuk /Stocker JW. et al. (1982)/.

«·«·

3. példa: Fúziósprotokoll

3.1. Feeder-sejtek (peritoneális makrofágok) kinyerése

Kezeletlen, kb. 5-8 hetes Balb/c egereket egy nappal a tervezett fúzió előtt megöljük és 70 %-os alkoholba történő bemerítéssel sterilizáljuk.

Majd a szőrt és felső hasi bőrt eltávolítjuk anélkül, hogy a peritoneum sérülne. Majd egy 5 ml-es steril fecskendővel és egy 18-as steril injekciós tűvel 4 ml BSS-puffért (Ca és Mg nélkül) és 1 ml levegőt fecskendezünk a hasüregbe. A hasat gyengén megmaszirozzuk (úgy, hogy a fecskendő és a tű a hasüregben maradjon), majd az előzőleg befecskendezett BSS-puffert a peritoneumból ismét leszívjuk és egy steril Falcon-csövecskébe nyomjuk. Ezt a folyamatot még kétszer megismételjük. Az így kapott makrofágokat jéggel hűtjük, majd 2 x 20 ml BSS-pufferrel mossuk.

A makrofágokat 10 percig 300 g-vel és 5 °C-os hőmérsékleten centrifugáljuk. A pelletet ezután 50 ml HAT-médiumban reszuszpendáljuk és a sejtszuszpenziót 4 Costar-lemezre összesen 24 mélyedésbe (0,5 ml/lyuk) szétosztjuk.

Ezután az igy előkészített makrofágokat 37 °C hőmérsékleten és 6 % széndioxid-koncentrációnál inkubátorban tároljuk.

Minden fúziós lépéshez kb. 4 x 10 makrofág szükséges.

3.2. PAI mielóma-sejtvonalak termelése

A PAI-nek nevezett mielóma-sejtvonalak esetén • Λ··«· * < · ··· ·· · · ·Μ • · · · ·· ·· ·♦ ·<*· ·

- 49 olyan mielóma-sejtvonalakról van szó, amelyek maguk nem képesek antitestek termelésére, amelyeket Stocker et al. (1982) irt le.

Fúziónként szükség van 50 ml jól növekvő tápközegre, amely legalább 10 millió sejtet tartalmaz. A mielóma-sejtek tenyésztését előnyösen T 175 Falcon üvegben (Fa. Beckton és Dickenson) végzik.

A fúzió előtti napon a tenyésztőközeget (RPMI 1640) friss RPMI 1640-közeggel helyettesítjük. A fúzió napján a PAI-sejteket learatjuk, egy steril 50 ml-es plasztik csövecskébe töltjük és 10 percig 300 g-vel 5 °C-on centrifugáljuk (MSE centrifuga, Modell Chilspin, UK). Centrifugálás után a felülúszót leszívjuk és eldobjuk. A sejteket 2 x kb. 30 ml BSS-pufferrel (Ca és Mg -mentes) mossuk (10 perc, 300 g, 5 °C), majd 5 ml BSS-ben reszuszpendáljuk.

A sejt-szuszpenzióból egy aliguot-ot a sejtszám meghatározásához kiveszünk és fluoreszcens indikátorral (FDA) jelöljük. A további felhasználásig a mielóma-sejteket jégen tároljuk.

3.3. Lépsejt-szuszpenzió előállítása

A 2. példa szerint immunizált Balb/c egérből a lépet steril körülmények között és jéghűtés alatt eltávolítjuk.

Az előzőleg immunizált Balb/c egeret nyakszirteltörés útján megöljük és a lépet sterilen eltávolítjuk. Ennek során az egeret 70 %-os alkoholba rövid ideig alámeritjük és steril eszközzel preparáljuk. A lépet óvatosan eltávolítjuk és

- 50 egy finom nylon szitára helyezzük. Ott egy ollóval finoman szétvágjuk és 5 ml-es fecskendő dugattyúja segítségével óvatosan a szitán átnyomkodjuk, anélkül, hogy eközben a sejtek széttörnének. Az egész folyamat alatt a szitát BSS-sel öblögetjük.

Az így nyert sejt-szuszpenziót 50 ml-es plasztik csövecskébe visszük és 10 percig 300 g-vel 5 °C-on centrifugáljuk (MSE centrifuga, Modell Chilspin, UK). A sejteket ezt követően 2x 20 ml BSS-sel mossuk (10 perc, 300 g, 5 °C, MES Chilspin) és a sejt-pelletet a centrifugálás után 10 ml BSS-ben szuszpendáljuk.

A PAI mielóma-sejtekkel történő fúzióig a lépsejteket jégen tároljuk.

3.4. A lépsejtek és PAI mielómasejtek fúziója

A mielómasejtek aránya a lépsejtekben a fúzióhoz 1:10 kell, hogy legyen.

A lépsejteket (BSS-pufferben) és a PAI mielóma-sejteket (BSS-pufferben) a megadott arányban elegyítjük és 10 percig 300 g-vel 5 °C-on centrifugáljuk (MSE centrifuga, Modell Chilspin). A pelletet mégegyszer BSS-pufferben szuszpendáljuk és a szuszpenziót újból centrifugáljuk. Majd 1 ml előmelegített és steril PEG-4000-et (MERCK) 60 másodperc alatt cseppenként a sejtekhez adjuk, mialatt az egész keveréket állandóan mozgásban tartjuk. A sejteket ezt követően még 30 másodpercig tovább rázzuk, mielőtt 5 ml előzőkben említett BSS-puffert (Ca^, Mg²³nélkül) ugyancsak cseppenként, állandó keverés közben, kb. 5 perc alatt hozzáadunk.

A leirt módon fúzionált sejteket aztán centri- 51 fugáljuk (10 perc, 300 g, 20 °C, MSE centrifuga, Modell Chilspin), a felülúszót leszívjuk és elöntjük. A sejt-pelletet 50 ml HAT-médiumban szuszpendáljuk és az igy kapott sejt-szuszpenziót előkészített 4 db Costar-lemezre (mikrotiterlemezek 24 lyukkal, a lyuk átmérője 24 mm, az össz-felület a sejtnövekedéshez 2,0 cm²) szétosztjuk (0,5 ml/lyuk).

A Costar-lemezeket 37 °C-on, 6 % CO^-koncentrációnál inkubáljuk.

4. példa: A hibridsejtek tenyésztése

A sejtfúzió utáni 1. napon a tenyésztőlemez minden mélyedésébe 1 ml HAT-médiumot adunk. A sejtfúzió után 3-4 nappal elvégezzük a fúzionált sejtek mikroszkópikus kontrollját. Egyidejűleg az elhasznált tápközeget leszívjuk és 1 ml friss HAT-tápközeggel helyettesítjük. 3 nappal később (a sejtfúzió után 6-7 nappal) a tenyésztőközeget frissre cseréljük. A sejtfúzió utáni 7-10. napig minden mélyedést mikroszkópikusan hibridre levizsgálunk és 2-3-szor hetente a tápközeget felfrissítjük.

Hamarosan a mélyedésekben a hibridek növekszenek, és általában 2-4 hét után a HAT-médium HT-médiumra cserélhető. A kinőtt hibridkultúra (a mélyedések legalább 10 %-a) felülúszóját egy steril Pasteur-pipettával leszívjuk és az antitestek jelenlétére teszteljük.

Nemsokára a hibrid-kolóniák a lyukakat teljesen benövik, igy ezek új Costar-lemezekre RPMI 1640 médiumba átvihetők, melynek során egy teljesen benőtt mélyedés tartalma 2-3 lyukba szétosztható.

5. példa: Pozitív hibridsejtek klónozása

Egy pozitív mélyedés sejtjeit egy pipetta segítségével oldjuk és egy csövecskébe 1 ml médiumba átvisszük. Ezt követően a sejtszám meghatározásához aliquotot veszünk ki és FDA-val megfestjük (hígítás 1:2 FDA-val: 50 /j1 sejt + 50 yul színezőanyag). Az előnyös sejtszám 10^s - 10⁶sejt/ml. Ezután a hibridsejteket HT-médiummal 1:100 arányban meghigitjuk (pl. 100 /til sejt + 9,9 ml HT-médium).

Két 50 ml-es Falcon-csövecske mindegyikébe ml HT-médiumot teszünk és 5 ml makrofág-szuszpenzióval öszszesen 30 ml-re csövenként feltöltjük. Λ makrofágokat előzőleg egérből izoláltuk és 10 ml HT-médiumban reszuszpendáltuk (lásd 3.1 példa).

Ezekben - a makrofág tartalmú Falcon-csövekben a hibridsejteket hígítjuk, amig a sejtsűrőség (i) 270 sejt/30 ml-t illetve (ii) 90 sejt/30 ml-t eléri. Ezt követően a hibridsejteket Costar-lemezre (96 lyukú mikrotiterlemez) szétosztjuk úgy, hogy minden lyukba 200 /ul-t adunk. Ez megfelel (i) esetben 1,8 sejt/lyuk illetve (ii) esetben 0,6 sejt/lyuk sejtszámnak. Hígításonként ily módon 1,5 mikrotiterlemez szükséges.

Hét nap múlva az egyes mélyedéseket mikroszkopikusan kontrolláljuk és a mélyedések sejtklón tartalmát összegyűjtjük. Azok a mélyedések, amelyeknél kb. 50 % a mélyedés sejtklón tartalma, ELISA-teszthez felhasználhatók. Ezeknek rendszerint 0,6 sejt/lyuk higitásúnak kell lenniük. Kb. 7-10 nap múlva a klóntartalmú pozitív mélyedések felülúszóit ELISAtesztben a monoklonális antitestek jelenlétére levizsgáljuk és a pozitív kiónokat Costar-lemezen (24 lyukú) RPMI 1640-médiumba

- 53 szaporítjuk. Ezen pozitív kiónok aliquotjait folyékony nitrogénben tároljuk.

5. példa: Hibridóma-screenelés (ELISA-teszt)

Először is a mikrotitérlemez egyes mélyedéseihez hozzáadjuk a BSA-val konjugált haptén /2 /jg/ml/ nátriumkarbonát-pufferben (50 mM, pH 9,5) készített oldatának 100 yul-t és ezt az oldatot 4 °C-on nedves kamrában éjszakán át inkubáljuk. Majd a mélyedéseket 5x 0,1 %-os PBS-Tween-pufferrel mossuk. A mikrotiterlemezen a betöltetlen kötőhelyek blokkolására minden mélyedésbe 200 /j1 1 %-os PBS-BSA-oldatot adunk, és 1-2 órán szobahőmérsékleten inkubáljuk, végül 0,1 %os PBS-Tween-pufferrel mossuk.

Ezután a felülúszó 200 /ul-ét adjuk minden mélyedéshez, amelyet 1:2 arányban 0,1 %-os PBS-Tween-pufferrel hígítottunk, és inkubáljuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Végül a mélyedéseket 5x friss 0,1 %-os PBS-Tween-pufferrel átmossuk.

Az inkubálást foszfatázzal konjugált kecske anti-egér antitesttel végezzük /Kirkegaard and Perry Laboratories). Először 100 ul affinitáskromatográfiával tisztított kecskéből nyert anti-egér IgG-t, amelyet 1 %-os PBS-Tween-nel 1:1500 arányban hígítottunk (Kirkegaard and Perry Laboratories) és alkálikus foszfatázzal jeleztünk, adunk minden egyes mélyedéshez.

Az inkubációs idő 1,5 óra szobahőmérsékleten. Ezután az egyes mélyedéseket friss 0,1 %-os PBS-Tween-nel 5x mossuk.

Ezt követően a mélyedésekbe 150 /ul szubsztráttartalmú oldatot (1 mg/ml p-nitrofeni1-foszfát) adunk. 2 órás

- 54 inkubálás után sötétben a spektroszkópiai meghatározást 405 rímnél végezzük. Pozitív híbridóma-sejtek azok, amelyek egy specifikus antitestet felismerve egy erős pozitív jelet adnak a kiválasztott hullámhosszon. Ezeket lehet aztán a csökkenő higitási eljárás segítségével (Godings (1980)/ klónozni. Tiszta monoklonális antitestek a megfelelően kezelt egerek aszcitesz-folyadékából nyerhetők (Campbell AM. Monoclonal Antibody Technology, in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon RH.j Knippenberg PH. (Eds.); Elsevier: Amsterdam, 13, 120-184 (1984)/.

7. példa: Hibridómasejtek szaporítása egérben

Aszcitesz-folyadék aktiválására nőstény Balb/c egereket (20-25 mg) (Tierfarm Sisseln, CH) 0,3 ml Priston olajjal (Aldrich Chemical) kezeltünk, intraperitoneális injekcióval. 1-3 héttel a Pristan beadása után az egerek egy második injekciót kaptak (0,2 ml Pristan - Oel, ip.). A 2. injekcióval egyidejűleg az állatok 2x 10^é hibridómasejtet kaptak 0,2 ml PBSben.

Az ebből a kezelésből származó aszcitesz-folyadékot összegyűjtjük, 800 g-vel centrifugáljuk és -20°C-on tároljuk. Felolvadás után az aszcitesz-folyadékot 1 órán át 30 000 g-vel centrifugáljuk. A felső réteget, amely főként a lipideket tartalmazza, eltávolítjuk. Ezután a fehérjekoncentrációt meghatározzuk és 10 mg/ml értékre PBS hozzáadásával beállítjuk.

Az immunglobulin 6 frakciót (IgG) 0,9 térfogatrész telitett ammónium-szulfát-oldat cseppenkénti hozzáadásával

- 55 0 °C-on kicsapjuk. 1 óra múlva az IgG-frakció pelletizálódik egy órás centrifugálással (22 000 g). A pelletet 20 mM Tris-HCl-pufferben, amely 50 mM NaCl-ot tartalmaz, feloldjuk és ugyanilyen pufferrel szemben egy éjszakán át 4 °C-on diai ízáljuk. Az IgG-frakció további feldolgozása anioncserélő-kromatográfia segítségével DE-52 dietil-amino-etil-cellulóz oszlopon (Whatman) történik. A próbát 1:2 (tf/tf) arányban 20 mM Tris-HCl-pufferral, pH 7,9, hígítjuk, míg a 25 mM végkoncentrációt eléri, majd az oszlopra felvisszük (10 mg fehérje/ml gél). Az eluciót növekvő NaCl-koncentrációval (25 mM-ról 250 mM-ig) végezzük (lineáris grandiens). Általában a monoklonális antitestek 80 mM NaCl koncentrációnál eluálódnak.

A frakciókat éjszakán át 4 °C-on PBS-sel szemben dializáljuk és -70 °C-on tároljuk. A tisztasági fokot nátrium-dodeci1-szulfát poliakri1-amid-gélelektroforézis segítségével (SDS-PAGE) határozzuk meg, valamint izoelektromos fókuszálással.

Jelen esetben a tisztasági fok )>90 7».

8. példa: A (II) képletű vegyület kimutatása

Λ (II) képletű vegyület kimutatását egy kétlépcsős kompetitiv ELISA-teszt segítségével végezzük.

Λ BSA-hoz konjugált haptént, melyet az 1.2.1. példa szerint állítunk elő, első lépésben 50 mM nátrium-karbonát-pufferben (pH 9,6) (200 ng BSA-haptén-konjugátum/100 /ul 50 mM nátrium-karbonát-puffer) mikrotiter lemezekre (pl. Dynatech, Typ Μ 129A) adszorbeáljuk és éjszakán át 4 °C-on inkubájuk.

A lemezeket ezt követően 5x PBS-pufferrel mossuk,

- 56 amely 0,1 % (tf/tf) poliszorbátot 20 (Tween 20) is tartalmaz (PBS-Tween).

A szilárd hordozó maradék szabad kötőhelyeit PBS-BSA (1 %-os (t/tf) oldat formájában) hozzáadásával blokkoljuk. 2 órai 22 °C-on történő inkubálás után a lemezeket újból mossuk 0,1 %-os PBS-Tween-nel.

Az előzőleg klónozott hibridómasejtek felülúszójának 50 /ul-t (1:1000-től 1:2000-ig hígításban) vagy pedig az előzőleg tisztított monoklonális antitestek 50 /ul-ét (40-120 ng/ml) a/ 950 /J1 standard-oldattal, amely az antigént /(II) képletü vegyület/ vagy az antigén-analógot felismeri vagy víz b/ antigén-tartalmú mintával vagy c/ antigén-tartalmú talajmintával inkubáljuk. (Minden hígítás 0,1 %-os PBS-Tweennel történik).

Egy órás inkubálás után szobahőmérsékleten (22 °C) az antigén/antitest keverék 200 /ul-t hozzáadjuk a mikrotiterlemez minden mélyedéséhez és az egész keveréket további egy órán át inkubáljuk. A mélyedéseket ezután 5x 0,1 %os PBS-Tween-nel mossuk és mélyedésenként 100 /ul kecske anti-egér IgG antitesttel, amelyet alkálikus foszfatázra konjugáltunk (hígítás 1:1500), bevonunk és 1,5 órán át inkubálunk.

Ismételt mosás után mélyedésenként 150 /ül mg/ml dietanol-amin-pufferben (1 mM, pH 9,8, dúsítva 0,5 mM Mg, 01_Λχ 6 H^O) oldott p-nitrofeni1-foszfát szubsztrátot adunk minden mélyedéshez. Két órás, 22 °C-on történő inkubálás után egy változás figyelhető meg, amely arányos az antitest mennyiségével, amely a szilárd fázisra kötött antigén mennyiségével

- 57 reagál. A fellépő szinreakció intenzitását 405 nm hullámhoszszon határozzuk meg. Az egyes próbák hígításait úgy választjuk, hogy inhibitor (Bo) hozzáadása nélkül az abszorpciós érték 0,3-0,5 tartományban legyen. A kontrollokra (antitest nélkül) az A^qsÚO.OI érték adódik. Minden mintát párhuzamos mérésben határozunk meg.

Az egyes mintákban lévő antigén-mennyiség /(II) képletű vegyület/ kiértékeléséhez először egy összehasonlító görbét veszünk fel, ahol a B/Bo x 100 az inhibitor különböző koncentrációnál van felvéve. (Bo azt az abszorpciós képességet jelenti, melyet az antigén-inhibitor hozzáadása nélkül mértünk és B azt az abszorpciós képességet, melyet az antigén-inhibitor különböző koncentrációinak a hozzáadásakor mértünk). Az I^-érték az antigén azon koncentrációját jelenti, amelynél az antitestek kötődése a szilárd fázisra 50 %-ban gátolt. Az I₅₀-értéket egy, a meglévő arányokhoz speciálisan hozzáigazított ENZFITTER (Leatherbarrow, Elsevier-Biosoft) görbe kalkulációs-program segítségével határozzuk meg, a logaritmikus görbe 4 paramétere egyikének alapján /Raab GM., Clin. Chem. 29, 1757-1761 (1903)/. A kvantitatív antigén-meghatározást is a talaj- és vízmintákban ELISA és ENZFITTER-program segítségével végezzük, melynek során a görbét a standarddal hasonlítjuk össze, melyet minden mikrotiterlemezre felveszünk.

8.1. példa: Talajminták analízise

A különböző eredetű standardizált talajminták aliquotjait (2 g) az alábbiakban leirt eljárás szerint extraháljuk:

- 58 Metód (A) Iwanzik és Egli szerint (1989):

Egy 100 g-os mintát 2 órán keresztül extraktorban 300 ml metanol és vizes foszfátpuffer (PB, pH 7,0, összes foszfát-koncentráció 0,07M) 2:1 térfogatarányú elegyével extrahálunk. Szűrés és foszforsavval történő savanyítás után a szulfoni 1-karbamid-származékot 3 x 75 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az oldószer lepárlása után oldjuk a mintát 10 ml P3-pufferben és szűréssel tisztítjuk.

Metód (B):

A metód (A) szerint végzett extrakciót két további mintával megismételjük és az utolsó szerves fázist vizes hidroqén-karbonát-oldattal (5 %-os) történő kirázással tovább tisztítjuk /Iwanzik és Egli (1989)/. A szulfoni1-karbamid-származékhoz tetrabutil-ammónium-hidrogén-karbonátot adunk, majd diklórmetán-n-hexán 80:20 arányú elegyével ismét extrah_áljuk. A szerves fázis bepárlása után a szulfoni1-karbamid-származékot 10 ml PB-pufferben felvesszük. Mielőtt a mintát ELISA-tesztben felhasználjuk, PBS-Tween-nel (0,1 %) 1:20 vagy 1:40 arányban hígítjuk.

Metód (C):

Ebben az esetben a tetrabuti1-ammónium-hidroxidos kirázást közvetlenül a metanol/PB extraktummal végezzük. A vizes fázist ez követően egy folyadék-folyadék Partitioning Castridge-re /Clin Elut^R^1010, Analytichem International, Harbor City, CA/ visszük rá és 30 ml n-hexánnal mossuk. A szulfoni 1-karbamid-származékot diklórmetán/n-hexán 60:40 arányú elegyével eluáljuk. A szerves fázist bepároljuk és visszamaradó anyagot PBS-ben felvesszük.

8.2. példa: Vízminták analízise

850 /ul vízmintához 100 /ul 10-szeresen koncentrált PBS-Tween puffért adunk kompetitiv ELISA teszt végzése céljából. A kapott oldatot végül 50 /ul antitesttel inkubáljuk.

9. példa: Immunopurification

A 7. példa szerint előállított monoklonális antitesteket egy szilárd hordozóra immobi1izáljuk. Erre a célra előnyösen egy cianbromiddal (CN-Br) aktivált SEPHAROSE 4B gélt használunk, amelyet ezt követően a tisztítási eljárások során rutinszerűen alkalmazott minioszlopok egyikébe töltünk.

Az analizálandó talajminta felvitele előtt az oszlopot 5-10 ml PBS-pufferral történő mosással kondicionáljuk.

A vizes talajminta-extraktumot 50 ml pufferoldatban felvesszük és cseppenként az oszlopra rávisszük. Ezt követően az oszlopot egyszer vagy többször 20 ml vizes oldattal mossuk, amely vízből vagy víz és acetonitril 9:1 arányú elegyéből áll.

Az analizálandó anyag leoldását acetonitri1-eluciós oldattal végezzük, amely előnyösen 5 % foszforsavat is tartalmaz. Erre a folyamatra érvényes, hogy az eluciós folyamat hatékonysága az eluátum csökkenő átfolyási rátájával nő.

Az optimális átfolyási ráta <0,5 %.

- 60 II. Eredmények

1. Monoklonális antitestek előállítása (a) Négy fúzió eredményéből kiindulva, melyeket az

1.2.1. példa szerint előállított KLH-konjugáttal immunizált egerek felhasználásával nyerünk, egy hibridómát kapunk, amely a (II) képletű vegyület elleni nagy affinitást! monoklonális antitestet termeli /MAb 4197-70-12/. A fúziós efficiens kb.

%.

Ennek a MAb-nak a kötött keresztreaktivitása az

1. táblázatban megadott vegyületekkel szemben 0,1 % alatt van. Emellett különösen figyelemreméltó, hogy a nevezett MAb semmiféle keresztreaktivitást nem mutat a struktúráiisan nagyon közeli rokon Triasulfuron-nal.

A célvegyület /a (II) képletű vegyület/ kimutatási határa a találmány szerinti monoklonális antitest (MAb) pufferben történő alkalmazása esetén 0,1 ng/ml puffer. Az MAb 4197-70-12-nek megfelelő I_í0-érték 0,8 ng/ml.

III. Deponálás

A találmány keretében előállított és alkalmazott hibridóma-sejtvonalat 1991. december 6-án helyeztük letétbe a nemzetközi letéteményes szervként elismert European Collection of Animál Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK) letéteményes szervnél a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezésének nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Szerződés követelményeinek és előírásainak megfelelően, ECACC 911 20619 deponálási számon. A deponált minta életképességi bizonylatát a nemzetközi letéteményes szerv kiál1itotta.

Sejtvonal Deponálás Deponálási Életképességi bizonylat dátuma szám dátuma

Hibridóma 1991.12.06. 911 20619 klón 4197-70-12

1991.12.06.

- 62 IV. Tápközegek és pufferek (A) RPMI 1640-Tápközeg

RPMI 1640 (Seromed) összetétele a következő:

Borjúszérum %

L-Glutamin mM

Géntamicin

0,01 %

Nátrium-piruvát mM

2-Merkaptoetanol /uM

Inzulin

Transzferrin /jM

Szelén (ITS) /jM (B) HAT-tápközeo liter RPMI 1640 tápközeg 20 ml Boehringer-féle HAT-konc.

(50 x) hozzáadása után a következő összetétellel rendelkezik:

Hipoxantin 680

Aminopterin

8,8 mg/1

T írni din

mg/1 (C) HT-tápközeg liter RPMI 1640 tápközeg 20 ml Boehringer-féle HT konc. (50 x) hozzáadása után a következő összetétellel rendelkezik:

Hipoxantin 680

Timidin

5,0 mg/1

193,8 mg/1

- 63 ♦ << ♦ ··· * < * ♦ ♦» · · * · « « · · * *

(D) BSS-puffer	(Earle-féle sóoldat,
KC1	7,3 mM
NaCl	116,0 mM
NaHCOj	26,0 mM
NaH2P04.2H20	1,0 mM
Glükóz	5,5 mM
Fenolvörös
1 %-os (tf/tf)	peni c i11i n/sztreptom
m9/ml
penicillin, 10	sztreptomicin/
(E) Nátriumkarbonát-puffer pH 9,6
Na2C03	477,0 mg
NaHC03	879,0 mg
NaNj	1,8 mg
ad 300 ml H20
(F)PBS-puffer	/pH 7,0/
NaCl	8,5 g
Na2.HPO4.2H2O	1,28 g
NaH2P04.2H20	0,436 g
ad 1000 ml H20
(G) P8S-TWEEN-I	20 /0,1 %/

ml Tween-20 (Serva) + 1000 ml PBS

Ca és Mg nélkül, pH 7,4) icin-oldat /Seromed/ 10 000E

- 64 ♦ ·

(H) PBS-BSA /1 V

BSA

NaN₃ (0,5 M) ad 500 ml PBS

5,0 g

3,0 ml (I) Szubsztrát-puffer /dietanolamin-puffer, pH 9,8/

Dietanolamin 97,0ml

NaN₃ (0,5 M) 6,0ml

MgCl₂.6H₂0 100,0mg ad 1000 ml H^O, a pH-értéket 9,8-ra cc. HCl-lel állítjuk be.

Λ szubsztrát előállítása: felhasználás előtt közvetlenül egy p-nitro-fenil-foszfát szubsztrát-tablettát (= 5 mg, Sigma 104) ml szubsztrát-pufferben feloldunk.

- 65 .:

» «*· »·*«

V. Táblázatok

1. táblázat: a (II) képletű vegyület különböző analógjainak keresztreaktivitása

MAb 4197-70-12

(a) JSO Vegyület (ng/ml)	(b) keresztre aktivitás (%)
(H)	képletű 0,8	100
A	>1000	<0,1
B	>1000	<0,1
C	>1000	<0,1
D	>1000	<0,1

a) Inhibitor-koncentráció, amely az ELISA jelet 50 %-ban csökkenti a kontrolihoz viszonyítva.

Az 50 %-os gátlás eléréséhez szükséges antigénkoncentráció

b) --x 100 az 50 %-os gátlás eléréséhez szüséges antigénanalóg-konc.

····

- 66 A /11/ képletű vegyület A-D jelű analógjainak szerkezeti képlet alapján való összehasonlítása (D

A-SO2-NH-CO-NH-B

	Y	E	R1	R2	X
(A)	-OCH2CH2C1	-N	-OCH3	-ch3	-OH
(B) Triasulfuron	-och2ch2ci	-N	-OCH3	-ch3	-H
(C) Óínosulfuron	-OCH2CH2OCH3	-N	-OCH3	-och3	-H
(D) Primisulfuron	-cooch3	-C	-ochf2	-ochf2	•H

Claims (50)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás monoklonális antitest előállítására, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik az (A) általános képletű egy vagy több vegyülettel szemben, amely képletben

   X jelentése szénatomon keresztül kapcsolódó, egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált, 1-3 nitrogénatomot tartalmazó, hattagú heterociklus, és n 0 és 4 közötti egész szám, azzal jellemezve, hogy a/ egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll, egy megfelelő, nagy molekulájú hordozó molekulához konjugáljuk, b/ az a/ lépés szerint előállított konjugátummal egy donor-állatot immunizálunk, c/ az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, d/ a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fuzionáljuk, e/ a kapott fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitestet termelik, és f/ a nevezett hibridómasejteket a monoklonális antitestek előállítására in vitro vagy in vivő tenyésztjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy X jelentése egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált triazin vagy pirimidin.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás monoklonális antitest előállítására, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik egy vagy több (I) általános képletű vegyülettel szemben, amely képletben

   R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, 1-4 szénatomos alkil- vagy halogén-alki1-csoport, 2-4 szénatomos halogén-alkoxi-csoport, 1-4 szénatomos alkiltio- vagy halogén-a 1ki1tio-csoport, 2-4 szénatomos alkoxi-alkilesöpört, metoxi-, etoxi- vagy -MR³ R^ -csoport, ahol

   R³ és R⁴ egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy

   1-4 szénatomos alkilesoportot jelent,

   E jelentése nitrogénatom vagy metin-hid, és n egy 0 és 4 közötti egész számot jelent azzal jellemezve, hogy a/ egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll egy megfelelő, nagy molekulájú hordozó molekulához konjugáljuk, b/ az a/ lépés szerint előállított konjugátummal egy donor-állatot immunizálunk, c/ az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, d/ a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fúzionáljuk,

   - 69 e/ a kapott fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitestet termelik, és f/ a nevezett hibridómasejteket a monoklonális antitestek előállítására in vitro vagy in vivő tenyésztjük.
4. 4. Eljárás a (II) képletű vegyület elleni nagy specifitású és affinitású monoklonális antitest előállítására,azzal jellemezve, hogy a/ egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll, egy megfelelő, nagy molekulájú hordozó molekulához konjugáljuk, b/ az a/ lépés szerint előállított konjugátummal egy donor-állatot immunizálunk, c/ az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, d/ a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fúziónáljuk, e/ a kapott fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitestet termelik, és f/ a nevezett hibridómasejteket a monoklonális antitestek előállítására in vitro vagy in vivő tenyésztjük.

   - · · ·
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kapcsoló komponensként egy (III) általános képletű vegyületet használunk, ahol

   R jelentése -COOH, -NHj. vagy -SH-csoport, és n’ 1 és 10 közötti egész számot, n pedig 0 és 4 közötti egész számot jelent.
6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R jelentése -NH₂ és n 2 és 6 közötti egész számot jelent.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jel lemezve, hogy R jelentése -NH₂ és n* 3-at jelent.
8. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy R jelentése -COOH és n^} 1 és 6 közötti egész számot jelent.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy R jelentése -COOH és n^J 2-t jelent.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy n 1-et jelent.
11. 11. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozó molekula ként makromolekulájú vagyületeket használunk, amelyek szabad hozzáférhető reaktív csoportokat tartalmaznak a szulfoni1-karbamid-kapcsoló-komponenssel történő kapcsolási reakcióhoz és képesek immunogén képességet kölcsönözni a szulfoni1-karbamid-komponensnek.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy hordozó molekulaként egy

    10 000 - 1 500 000 molekulatömegű, 1izinben-gazdag fehérjét alkalmazunk.
13. 13. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szulfoni1-karbamid-kapcsoló komponens konjugálását a hordozó molekulára közvetlenül vagy egy hid-tagon (spacer) keresztül végezzük, amely egy vagy több reaktív csoporttal rendelkezik, amelyek képesek a hordozó molekula reaktív csoportjaival helyettesítési reakcióba lépni.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy az említett reaktív csoportok karboxi1-, amino- vagy -SH-csoportok lehetnek.
15. 15. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a donor-állatok immunizálását a konjugátum, amely a kapcsoló komponensből és a hordozó molekulából áll, egyszeri vagy többszöri beadásával végezzük.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e, hogy a beadást intravénás, intraperitoneá lis vagy szubkután injekció vagy ezek kombinációjának formájában végezzük.
17. 17. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fuzionált hibridsejtek szelekciójára HAT-szelekciós tápközeget használunk.
18. 18. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pozitív, monoklonális antitestet termelő hibridtenyészeteket csökkenő higitásos eljárás segítségével elválasztjuk és ezt követően az igy kapott tiszta tenyészetet egy megfelelő tenyésztőközegben klónozzuk.
19. 19. Az 1-4. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti eljárással klónozott hibridóma-sejtklónokat megfelelő monoklonális antitestek képzésével történő immunoassay segítségével átvizsgáljuk.
20. 20. Monoklonális antitestek, azzal jellemezve, hogy az 1-19. igénypontok egyike szerinti eljárással lettek előállítva.
21. 21. Monoklonális antitest és származékai, azzal jel lemezve, hogy a nevezett antitest nagy specifitással és affinitással rendelkezik a (II) képletu vegyülettel szemben és lényegében semmilyen keresztreaktivitást nem mutat a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel.
22. 22. A 21. igénypont szerinti monoklonális antitest és származékai, azzal jellemezve, hogy a nevezett antitest nagy specifitással és affinitással rendelkezik a (II) képletű vegyülettel szemben és lényegében nem mutat keresztreaktivitást a szerkezetileg rokon vegyületek csoportjával, mely a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban szereplő A jelű vegyületből áll.
23. 23. A 22. igénypont szerinti monoklonális antitest és származékai, azzal jellemezve, hogy a nevezett antitest nagy specifitással és affinitással rendelkezik a (II) képletű vegyülettel szemben és a szerkezetileg rokon vegyületekkel, mint a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban szereplő A jelű vegyület, szemben <1 % keresztreaktivitást mutat.
24. 24. A 23. igénypont szerinti monoklonális antitest és származéka, azzal jellemezve, hogy a nevezett antitest <0,1 % keresztreaktivitást mutat.
25. 25. A 24. igénypont szerinti monoklonális antitest, amelyet az ECACC 911 20619 jelű hibridóma-sejtvonalból kaptunk és a nevezett monoklonális antitest származékai.
26. 26. Monoklonális antitest, amely nagy specifi* * *

    - 74 tással és affinitással rendelkezik egy vagy több (A) általános képletű vegyülettel szemben, mely képletben

    X jelentése szénatomon keresztül kapcsolódó, egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituáltl-3 nitrogénatomot tartalmazó, 6-tagú heterociklus, és n egy 0 és 4 közötti egész számot jelent, és amelyet az alábbi eljárással állítunk elő, melyre jel 1 e m z ő, hogy a/ egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll, egy megfelelő, nagy molekulájú hordozó molekulához konjugáljuk, b/ az a/ lépés szerint előállított konjugátummal egy donor-állatot immunizálunk, c/ az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, d/ a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fuzionáljuk, e/ a kapott fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitestet termelik, és f/ a nevezett hibridómasejteket a monoklonális antitestek előállítására in vitro vagy in vivő tenyésztjük.
27. 27. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy nagy specifitással és affinitással rendelkezik egy vagy több (I) általános képletű vegyülettel szemben, mely képletben

    4 2

    R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, 1-4 szénatomos alkil- vagy halogén-alkil-csoport, 2-4 szénatomos halogén-alkoxi-csoport, 1-4 szénatomos alkiltio- vagy halogén-alki1tio-csoport, 2-4 szénatomos alkoxi-alkilesöpört, metoxi-, etoxi- vagy -NR³ R⁴ -csoport, ahol

    R³ és R⁴ egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy

    1-4 szénatomos alkilcsoportot jelent,

    E jelentése nitrogénatom vagy metin-hid, és n egy 0 és 4 közötti egész számot jelent.
28. 28. A 27. igénypont szerinti monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy nagy specifitással és affinitással rendelkezik egy (II) képletű vegyülettel szemben.
29. 29. Hibridómasejtvonal, amely egy olyan monoklonális antitestet termel, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik a (II) képletű vegyülettel szemben és lényegében nem mutat keresztreaktivitást a nagyszámú szerkezetileg rokon vegyülettel.
30. 30. A 29. igénypont szerinti hibridómasejtvonal, amely egy olyan monoklonális antitestet termel, amely nagy spécititással és affinitással rendelkezik a (II) képletű vegyülettel szemben és lényegében nem mutat keresztreaktivitást a szerkezetileg rokon vegyületek csoportjával, mely a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinősülfúrón, valamint a 2. táblázatban szereplő A jelű vegyületből áll.
31. 31. A 30. igénypont szerinti hibridómasejtvonal, mely egy olyan monoklonális antitestet termel, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik a (II) képletű vegyülettel szemben és a szerkezetileg rokon vegyületekkel, mint a Triasulfuron, Primisulfuron és Chinosulfuron, valamint a 2. táblázatban szereplő A jelű vegyülettel, szemben <1 % keresztreaktivitást mutat.
32. 32. A 31. igénypont szerinti hibridómasejtvonal, amely olyan monoklonális antitestet termel, melynek keresztreaktivitása <0,1%.
33. 33. A 32. igénypont szerinti hibridómasejtvonal, mely az ECACC 911 20519 jelzéssel rendelkezik, valamint ennek kiónjai és szubklónjai.

    V · ··
34. 34. Hibridömasejtvonal, amely egy olyan antitestet termel, amely nagy specifitással és affinitással rendelkezik egy vagy több (A) általános képletü vegyülettel szemben, mely képletben

    X jelentése szénatomon keresztül kapcsolódó egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált 1-3 nitrogénatomot tartalmazó 6-tagú heterociklus, és n egy 0 és 4 közötti egész számot jelent, és amelyet az alábbi eljárással állítunk elő, melyre jel 1 e m z ő, hogy a/ egy kapcsoló komponenst, amely lényegében a célmolekula szulfonamid-részéből áll, egy megfelelő; nagy molekulájú hordozó molekulához konjugálunk, b/ az a/ lépés szerint előállított konjugátummal egy donor-állatot immunizálunk, c/ az immunizált donor-állatból az immunkompetens B-sejteket izoláljuk, d/ a nevezett immunkompetens B-sejteket folyamatos sejtosztódásra képes tumorsejtekkel fuzionáljuk, e/ a kapott fúziósterméket izoláljuk és szelekció után azokat a hibridómasejteket klónozzuk, amelyek a kívánt antitestet termelik.
35. 35. A 29. igénypont szerinti hibridömasejtvonal mutánsai és variánsai, amelyek spontán keletkeznek vagy amelyeket egy ismert mutációs eljárás segítségével állítottunk elő,

    - 78 azzal jellemezve, hogy a nevezett mutánsok és variánsok még mindig képesek olyan monoklonális antitestet vagy ennek származékait termelni, amely a találmány szerinti tulajdonságokkal rendelkezik.
36. 36. Eljárás az (I) általános képletű szulfonil-

    -karbamid-herbicidek immunológiai kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy 20. valamint 26-27. igénypont szerinti monoklonális antitestet egy ismert immunoassay-ben alkalmazunk.
37. 37. Eljárás a (II) képletű vegyület immunológiai kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy 21-25. valamint a 28. igénypont szerinti monoklonális antitestet egy ismert immunoassay-ben alkalmazunk.
38. 38. Eljárás a (II) képletű vegyület immunológiai kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy olyan monoklonális antitestet használunk fel, amelyet az ECACC 911 20619 jelű hibridómasejtvonalból vagy annak kiónjaiból vagy szubklónjaiból kaptunk.
39. 39. A 36-38. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett immunoassay egy kompetitiv immunoassay.
40. 40. Eszköz az (I) általános képletű szulfoniI-kar-

    - 79 bamid-herbicidek immunológiai kimutatásához felhasználásra kész teszt-kit formájában, azzal jellemezve, hogy a nevezett tesztkit a szokásosan alkalmazott vivőanyagok, reagensek és egyéb adalékok mellett legalább egy 20. illetve 26-27. igénypont szerinti monoklonális antitestet, mint reagenst, tartalmaz.
41. 41. Eszköz a (II) képletű vegyület immunológiai kimutatásához felhasználásra kész teszt-kit formájában, azzal jellemezve, hogy a nevezett tesztkit a szokásosan alkalmazott vivőanyagok, reagensek és egyéb adalékok mellett legalább egy 21-25. illetve 28. igénypont szerinti monoklonális antitestet, mint reagenst, tartalmaz.
42. 42. Eszköz a (II) képletű vegyület immunológiai kimutatásához felhasználásra kész 37. igénypont szerinti teszt-kit formájában, azzal jellemezve, hogy a nevezett teszt-kit a szokásosan alkalmazott hordozóanyagok, reagensek és egyéb adalékok mellett legalább egy monoklonális antitestet tartalmaz, amelyet az ECACC 911 20619 jelű hibridómasejtvonalból vagy ennek kiónjaiból vagy szubklónjaiból kaptunk.
43. 43. A (III) képletű kapcsoló komponens, ahol

    R jelentése -COOH, -NH₂ vagy -SH-csoport, n egy 1 és 10 közötti egész szám, és n egy 0 és 4 közötti egész számot jelent.
44. 44. A 43. igénypont szerinti kapcsoló komponens, azzal jellemezve, hogy R jelentése aminocsoport és n’egy 2 és 6 közötti egész számot jelent.
45. 45. A 44. igénypont szerinti kapcsoló komponens, azzal jellemezve, hogy R jelentése aminocsoport és n’= 3.
46. 46. A 43. igénypont szerinti kapcsoló komponens, azzal jellemezve, hogy R jelentése karboxilcsoport és n’ egy 1 és 6 közötti egész számot jelent.
47. 47. A 46. igénypont szerinti kapcsoló komponens, azzal jellemezve, hogy R jelentése karboxilcsoport és n^J = 2.
48. 48. K 43-45. igénypontok bármelyike szerinti kapcsoló komponens, azzal jellemezve, hogy n = 1.
49. 49. Egy 20. valamint 26-27. igénypont szerinti monoklonális antitest felhasználása immun-tisztitásos eljárásban, azzal jellemezve, hogy a/ a nevezett antitestet egy szilárd hordozóra immobi1izáljuk, b/ a nevezett hordozót mini oszlopba töltjük, c/ a pufféróldatot, amely a tisztítandó vagy analizálandó mintát tartalmazza, az oszlopra rávisszük, d/ adott esetben egy vagy több mosási lépést közbeiktatunk, és e/ az analizálandó anyagot egy alkalmas eluáló oldattal az oszlopról eluáljuk.
50. 50. Egy 21-25. illetve 28. igénypont szerinti monoklonális antitest felhasználása immun-tisztitásos eljárásban, azzal jellemezve, hogy a/ a nevezett antitestet egy szilárd hordozóra immobi1izáljuk, b/ a nevezett hordozót mini oszlopba töltjük, c/ a pufferoldatot, amely a tisztítandó vagy analizálandó mintát tartalmazza, az oszlopra rávisszük, d/ adott esetben egy vagy több mosási lépést közbeiktatunk, és e/ az analizálandó anyagot egy alkalmas eluáló oldattal az oszlopról eluáljuk.

    A meghatalmazott; r