HU212513B - Process for producing human glycoproteine, and pharmaceutical composition containing it as active component - Google Patents

Description

A találmány humán eredetű fibroblasztok tenyészetéből előállított glükoprotein, a glükoproteint tartalmazó, biológiailag aktív faktor és a biológiailag aktív faktort hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására vonatkozik.

A találmány szerinti glükoprotein, amely citotoxikus aktivitást mutat különböző tumor sejtvonalaknál, de normál sejteknél nem, egy új tumor citotoxikus faktor, továbbá leukémia sejt differenciálódást indukáló faktor, sejtes immunitást fokozó faktor, vaszkuláris endoteliális sejt növekedési faktor és májsejt (hepatocita) növekedési faktor. Ez az anyag, mint tumor elleni gyógyszer, mint leukémia elleni gyógyszer, mint sejtes immunitást fokozó gyógyszer, mint seb-gyógyító faktor és mint máj regeneráló faktor, stb. használható, vagy pedig biokémiai vagy farmakológiai reagensként alkalmazható.

A humán eredetű fibroblasztok által termelt biológiailag aktív faktorok közül jellegzetes faktor a β-interferon és például a tumor citotoxikus faktor. Ezt a faktort, amely egy glükoprotein, a fibroblasztok szekretálják, ha tenyésztés után a sejteket learatjuk és polil-poliC-vel vagy Sendai vírussal stimuláljuk. Tisztázták, hogy e proteineknek vírusellenes és tumorellenes hatásán kívül különböző fiziológiai hatásai is vannak. A fibroblaszt eredetű tumor citotoxikus glükoproteint, amelynek jele CBF, az 58-146 293 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés ismerteti. A 35 000-45 000 molekulatömegű tumor növekedést gátló faktort (INF), amely humán szövet-eredetű fibroblasztok tenyészetéből állítható elő, a 671-33 120 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés írja le. Egy tumor nekrózis faktor-szerű anyagot, amelyet fibroblasztok tenyészetéből tisztítottak, egy fibroblaszt-eredetű nekrózis faktort, az FNF-et és egy citotoxikus aktivitású biológiailag aktív anyagot, amelyet állati fibroblaszt sejtek termelnek és molekulatömege 40 000-50 000, izoelektromos pontja pedig 5,ö±0,5, a 61-56 131 számon, a 61-1872 számon, illetve a 62-103 021 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés ismertet Ezenkívül minden olyan aminosav szekvencia és olyan cDNS szekvencia kódolta tumor citotoxikus faktor aminosav szekvencia, amely humán eredetű fibroblasztok tenyészetéből állítható elő, molekulatömege 36 000±1000, izoelektromos pontja pedig 10,5-nél nagyobb, a 64-10 998 számon nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés tárgyát képezi.

A feltalálók egy olyan biológiailag aktív anyagot vizsgáltak, amelyet humán eredetű fibroblasztok tenyészete tartalmaz és azt találták, hogy ez egy olyan glükoprotein, amely különféle biológiai hatásokat fejt ki és amely az előzőekben közölt anyagoktól molekulatömege és izoelektromos pontja, stb. tekintetében különbözik.

Ezért tehát a találmány fő célja, hogy rendelkezésre bocsássa az új glükoproteint, ezen glükoproteint tartalmazó biológiailag aktív faktort és ezen említett biológiailag aktív faktort tartalmazó gyógyszerkészítményt.

A találmány szerinti új humán fibroblaszt eredetű glükoproteint (tumor citotoxikus faktor a továbbiakban TCF-II) a következő fizikokémiai tulajdonságok jellemzik.

a) Molekulatömeg: SDS gél-elektroforézisben nemredukáló körülmények között 78 00(>±2000 vagy 74 00012000 molekulatömegű sáv jelenik meg. Redukáló körülmények között egy közös A sáv 52 00012000 és egy B sáv 30 00012000 vagy egy C sáv 26 00012000 molekulatömegű sáv látható.

b) Izoelektromos pont: 7,4-8,6.

c) Hőstabilitás: 10 percig 60 ’C-on melegítve stabil.

d) pH stabilitás: pH = 6-9 között stabil.

e) Szénhidrát lánc: Concanavalin-A (ConA)-Sepharose oszlopra adszorbeálődik.

f) Biológiai aktivitás: gátolja a KB sejtek, HeLa sejtek és az L-929 sejtek növekedését, de az IMR-90 sejtekét nem.

g) Kötődése antitestekkel: citotoxikus hatását nem semlegesíti az anti-TNF antitest, az anti-limfotoxin (LT) antitest és az anti^interferon (INF-β) antitest.

Ezenkívül, a találmány szerint előállított megfelelő

TCF-II tétel a fenti (a-g) fizikokémiai jellemzőkön felül az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

h) N-terminális aminosav szekvencia: a fent említett B és C sáv az A sáv al-láncait képviselik. Az A sáv N-terminálisa blokkolt. A B és a C sávnak közös N-terminális aminosav szekvenciája van:

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thrvagy

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-XMet-Val-Ser-Leuamelyben X nem azonosított aminosavat jelent.

i) Aminosav összetétel: ha sósavval hidrolizáljuk, az alábbi aminosav összetételt kapjuk:

Aminosav	nmól	mól%
Asp	10,375	12,97
Glu	7,750	9,69
Ser	5,000	6,25
Gly	7,250	9,06
His	3,000	3,75
Arg	5,375	6,72
Thr	5,125	6,41
Alá	2,625	3,28
Pro	5,625	7,03
1\r	3,875	4,84
Val	4,125	5,16
Met	1,875	2,34
Cys	nm	-
Ile	5,000	6,25
Leu	4,875	6,09
Phe	2,250	2,81
Trp	nm	-
Lys	5,875	7,34
összesen	80,000	100(99,99)

nm = nincs meghatározva

HU 212 513 Β

A fent említett fizikokémiai tulajdonságokkal jellemzett új glükoproteinnek, a TCF-ü-nek az előállítását a következőkben ismertetjük.

Bármilyen humán eredetű fibroblaszt sejt felhasználható a jelen találmány szerinti anyag előállítására. A humán embrionális tüdő eredetű fibroblaszt sejtek, a humán embrionális vese eredetű fibroblaszt sejtek, a humán embrionális praeputim (fityma) eredetű fibroblaszt sejtek stb., alkalmas sejteknek bizonyultak. A találmány kivitelezésében az 1MR-90 sejtek (ATCC CCL 186, Science, 196,60-63,1977), a WI-38 sejtek (ATCC CCL 75, Exp. Cell. Rés, 25,585,1961) stb. a leginkább alkalmasak

Ezek a sejtek a tenyésztéshez általánosan használt, szérummal dúsított táptalajban vagy szérummentes táptalajban növekednek. Egy ilyen táptalaj az 5% borjú szérumot tartalmazó Dulbecco által módosított Eagle táptalaj (DMEM). Ha szükséges, hozzáadhatunk aminosavakat, transzferint, zsírsavakat és hormonokat, például inzulint stb.

A sejteket a táptalajban vagy álló tenyészetben tenyésztjük, T palackok, stb. alkalmazásává!, vagy flotáló tenyészetben, mikrohordozők használatával vagy folyamatos tenyészetben, lyukacsos rostanyagok (hollow fiber) vagy kerámia hordozó alkalmazásával. Előnyös, ha a tenyésztést 5% CO₂ atmoszférában, 20-37 ’C hőmérsékleten végezzük - illetve ilyen tenyésztési körülményeket alkalmazunk - és ha a táptalajt két-három naponként cseréljük. Miután a sejt-sűrűség eléri az optimumot, a táptalajt 7-10 naponként cseréljük és tenyészleveket összegyűjtjük. A kívánt glükoproteint az összegyűjtött tenyésztőből tisztítjuk.

Az összegyűjtött tenyészlevet UF koncentrálással koncentráljuk, 6000 molekulatömegnek megfelelő pórusnagyságú membrán használatával. Az UF koncentrátumban lévő kívánt glükoproteint kationcserélő gyantára adszorbeáljuk, majd a gyantáról 0,3-0,6 M NaCl tartalmú pufferrel oldjuk le. Ioncserélő gyantaként használhatjuk a CM Sephadex G-50-et (Pharmacia), stb. Azokat a frakciókat, amelyek erős citotoxikus aktivitást mutatnak, összegyűjtjük, majd ezután affinitás kromatográfiát végzünk glükoproteinre. A ConA-Sepharose speciálisan alkalmas a kívánt glükoprotein affinitás kromatografálásához. Az affinitás oszlopot 0,5 M NaCl tartalmú 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) hozzuk egyensúlyba és ezután a fent kapott frakciót rávisszük az oszlopra. Az oszlopot a kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd az aktív anyagot egy olyan elúciós pufferrel eluáljuk az oszlopról, amely a glükoprotein affinitás oszlophoz (illetve gélhez) kötődött szénhidrát-láncának megfelelő szénhidrátot tartalmazza. Ha a fent említett ConA-Sepharose-t használjuk, az aktív anyagot olyan pufferrel eluáljuk, amely ametil-D-mannopiranozidot tartalmaz. A leoldott aktív frakciót vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk. A liofilizált aktív anyagot 0,2 M NaCl-t tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferben (pH = 6,0-7,0) oldjuk és tovább tisztítjuk HPLC-vel, erős kationcserélő oszlopot használva. A Mono S (Pharmacia) különösen megfelelő, mint erős kationcserélő oszlop. A Mono S oszlopról az aktív anyagot 0-1,0 M NaCl gradienssel eluáljuk és az aktív frakciókat összegyűjtjük.

A jelenlévő aktív anyag 0,6-0,9 M só-koncentrációnál oldódik le. Az itt leoldott aktív frakciót tovább tisztítjuk affinitás kromatográfiával, Heparin-Sepharose-t (Pharmacia) alkalmazva. A Heparin-Sepharose oszlopról az aktív anyag elúcióját 0,3-2,0 M NaCl gradienssel végezzük és a kívánt anyag 1,0-1,5 M só-koncentrációnál oldódik le. A találmány szerinti anyag ezt követő vizsgálatait, azaz a TCF-Π egér L929-18 sejtekre gyakorolt citotoxikus aktivitásának vizsgálatát és a TCF-II hepatocitákra ható növekedést stimuláló hatásának vizsgálatát az alábbiakban ismertetjük.

Citotoxikus aktivitás vizsgálata

Az egér L929 sejteket (ATCC CCL1) szubklónoztuk és a találmány szerint a TCF-ü-re legérzékenyebb szubklónt választottuk ki. így kaptuk az L929-18 kiónt, amely a legérzékenyebbnek bizonyult a tumor sejt citotoxikus faktorral szemben.

Az L929-18 sejteket összefolyásig tenyésztjük 10% FCS (fetal calf serum = fetális borjú szérum) tartalmú DMEM táptalajban, majd a sejteket tripszines kezeléssel aratjuk le. A sejteket 10% FCS és 1 gg/ml aktinomicin D tartalmú DMEM táptalajban szuszpendáljuk óxlO⁵ sejt/ml sűrűségben. Egy 96tartályos mikrotitráló lemez (Falcon) minden tartályába bemérünk 50 μΐ DMEM táptalajt - melyet úgy készítettünk el, mint a sejt-szuszpenziót - és a vizsgálandó oldatból, azaz ez esetben a TCF-II DMEM táptalajjal készített oldatából 50 μΐ-t mérünk az első tartályba. A két anyagot jól összekeverjük és ezután az elegyből 50 μΐ-t mérünk a második tartályba. Az anyag sorozat-hígítását ennek az eljárásnak az ismétlésével készítjük el.

Az anyag sorozathígítását tartalmazó tartályokat beoltjuk 50-50 μΐ sejt-szuszpenzióval és a tenyésztést 37 ’C-on 2 napon át CO₂ inkubátorban végezzük. Tenyésztés után a táptalajt óvatosan eltávolítjuk és a sejteket kétszer mossuk fiziológiás konyhasó-oldattal. Az élő sejteket, amelyek a tartályokhoz tapadtak, fixáljuk és megfestjük. A festést úgy végezzük, hogy minden tartályba bemérünk metanol és víz (1:4) elegyébe készített 0,5%-os kristályibolyából 50 μΐ-t. A tartályokat háromszor mossuk desztillált vízzel, megszárítjuk és a kristályibolyát minden tartályból Sorenson pufferrel (6,1 ml 0,1 M dinátrium-citrát, 3,9 ml 0,1 n HC1 és 10 ml etanol elegye) extraháljuk A kivonatok abszorpcióját mikrotiter-spektrofotométerrel, 570 nm-en határozzuk meg.

A TCF-Π egységét (E/ml) az a hígítási arány adja meg, ahol a sejtpusztulás 50%-os.

Hepatocita növekedést stimuláló aktivitás vizsgálata

Him Wister patkányból hepatocitákat különítünk el Segren módszerével [Method in Cell Biology, 13. kötet, 29. oldal, Academic Press, New York, (1976)]. A kapott hepatocitákat 24 tartályos műanyag lemezekre (Falcon) visszük 8.8Χ10⁴ sejt/0,5 ml/tartály sejt-sűrűség mellett és a sejteket 37 ’C-on, 0,5% CO₂ jelenlétében tenyésztjük. A használt táptalaj a Willi3

HU 212 513 Β ams E táptalaj (Flow Laboratory), amelyet 10% fetális marha szérummal (Hyclone), 100 E/ml penicillinnel és 100 pg/ml streptomicinnel egészítettünk ki (a továbbiakban rövidítve: alaptáptalaj). Az inkubálást 37 C-on 24 órán át végezzük, ezután a táptalajt kicseréljük a vizsgálandó mintákat tartalmazó alaptáptalajra. A hepatocitákat tovább tenyésztjük 24 órán át, majd ³H-timidinból 4 pCi/ml (86 Ci/mmol)mennyiséget tartalmazó alaptáptalajban tenyésztünk 2 órán át, s ezután meghatározzuk a DNS szintézist. Amikor a hepatociták jelzése a ³H-timidinnel megtörtént, a beépült beütési számot (dpm) minden vizsgált csoportban azon beütési számok különbségéből (dpm) határozzuk meg, amelyeket 10 mM hidroxi-karbamid jelenlétében és távollétében mértünk. Miután a sejteket a fenti eljárással jeleztük, a sejteket kétszer mossuk hideg PBS, 2% perklórsav és 95% metanol elegyével, levegőn szárítjuk, majd 0,8 ml 2 mM EDTA és 20 mM NaHCO₃ tartalmú 2%-os SDS-ben oldjuk. Ezután folyadék szcintillációs számlálóval végezzük a meghatározást.

Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Minta	Koncentráció (ng/ml)	Hepatocita növekedést stimuláló aktivitás (dpm/tartályxlO3)
Hozzáadás nélkül	-	21,719,2
hEGF	20	239,317,2
TCF-II	1	93,7129.7
10	378,5193,5
100	467,4177,3

A hEGF-et (WAKUNAGA Pharmacy Co., Ltd) a hepatocita növekedést stimuláló aktivitás pozitív kontrolljaként használtuk. Az 1. táblázatban szereplő eredmények azt mutatják, hogy a TCF-Π hepatocita növekedést stimuláló aktivitása erősebb, mint a hEGF-é (hEGF = humán epidermal growth factor).

A találmány a következőkben olyan gyógyszerkészítményeket ismertet, amelyek a TCF-H-t, mint biológiailag aktív faktort tartalmazzák hatóanyagként

Az említett biológiailag aktív faktor a jelen találmány szerint a következő gyógyszer-hatásokat fejti ki:

(1) Antitumor aktivitás:

A TCF-Π a KB, HeLa, MCF-7 és BG-1 humán eredetű tumor sejtek növekedését gátolja, citotoxikus aktivitást mutat egér L-929 sejtekkel szemben és a Sarcoma 180, Meth A szarkóma és P388 tumor sejtekkel szemben, de nem gátolja az IMR-90 sejtek növekedését, melyek normál humán sejtek.

(2) Leukémia sejt differenciálódást indukáló aktivitás:

A TCF-Π megindítja a HL-60 humán eredetű leukémia sejtvonal granulocita-szerű sejtekké való differenciálódását.

(3) Sejtes immunitást fokozó aktivitás:

A TCF-Π stimulálja a humán citotoxikus T sejtek növekedését.

(4) Vaszkuláris endoteliális sejt növekedést stimuláló aktivitás:

A TCF-Π stimulálja a humán köldökzsinór ér eredetű endoteliális sejtek növekedését.

(5) Hepatocita növekedést stimuláló aktivitás:

A TCF-Π stimulálja kifejlett patkányoknál a hepatociták növekedését.

A hatások 1-1000 ng/ml nagyon kis dózis tartományban megmutatkoznak.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény mint tumor elleni gyógyszer, mint leukémia elleni gyógyszer, mint sejtes immunitást fokozó gyógyszer, mint sebgyógyító szer és májbetegségek esetén mint terápiás szer, továbbá mint máj regeneráló szer, stb. jöhet számításba. A biológiailag aktív faktor (a továbbiakban: TCFΠ) azonban, amely egy nagy molekulatömegű glükoprotein, könnyen adszorbeálódik polipropilén tartályhoz és hasonlóhoz, mint amilyen egy injekciós fecskendő, továbbá üveg tartályhoz és hasonlóhoz.

A TCF-Π ezenkívül nem stabil anyag. A TCF-II aktivitását hőmérséklet vagy nedvesség, stb. jelentősen csökkenti és könnyen inaktiválódik. Evégett stabil gyógyszerkészítmény gyártására van szükség. Tehát a találmány szerinti gyógyszerkészítmény egy olyan TCF-Π, amely egy vagy több proteint és nem-ionos detergenst tartalmaz, amelyek meggátolják az adszorpcióját vagy egy vagy több proteint, szénhidrátot és aminosavat tartalmaz, stabilizálószerként, vagy inkább egy vagy több adszorpciógátló szer és egy vagy több stabilizálószer kombinációját tartalmazza.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény gyógyszerformája bármilyen lehet, például liofilizált forma vagy folyadék vagy por forma. A találmány szerinti hatóanyag, a TCF-Π, bármilyen eljárással előállítható vagy tisztítható. Az a TCF-Π, amelyet bármely TCF-II szekretáló sejt levestenyészetéből tisztítunk, ugyancsak használható. Felhasználható továbbá az a TCF-II is, amelyet rekombináns DNS technológiával állítunk elő, Escherichia coli, élesztő vagy emlős sejteknek - ilyen a kínai hörcsög petefészek sejt - mint gazdasejteknek az alkalmazásával és amelyet különböző módszerekkel tisztítottunk.

A találmány szerinti adszorpciógátló szerként használhatunk albumint és zselatint, stb., a proteinek közül és Tween 80-at és Tween 20-at, stb., a nem-ionos detergensek közül.

A jelen találmányban stabilizálószerként az albumin és a zselatin, stb. használható a proteinek közül; szorbit, mannit és xilit, stb. használható a szénhidrátok közül; glicin és alanin, stb. az aminosavak közül. Az adszorpciógátló proteinek megfelelő adagja nagyobb 0,1%-nál, előnyösen 0,1-20%, a nem-ionos detergensek megfelelő adagja 0,001 %-nál nagyobb, előnyösen 0,001-1,0%. A stabilizálószerként használt proteinek adagjának megfelelő mennyisége nagyobb, mint 0,1%,

HU 212 513 Β előnyösen 5-40%; az aminosavak adagjának megfelelő mennyisége több mint 1%. Abban az esetben, amikor egy vagy több adszorpciógátló szert és egy vagy több stabilizáló reagenst kombinációban alkalmazunk vagy amikor két vagy több stabilizálószert használunk kombinációban, az említett szerekből adagolt mennyiségek a fent említett tartományban megengedettek. Ezen adszorpciógátló és stabilizáló szerek indokolt mennyiségeit feloldjuk és megfelelő koncentrációjú és pH-jú vizes oldat formájában használjuk fel. Az oldatok permeabilitási nyomás hányadosai 0,1-3,1 tartományban vannak, az előnyös hányados 1,0. Minthogy a TCF-Πnek a pH-val szembeni stabilitása pH = 6-9 tartományban van, a gyógyszerkészítmény előállításához célszerű a vizes oldat pH-ját 6,0-9,0 közé beállítani.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményben lévő TCF-Π adszorpciójának gátlására és stabilizálására szolgáló eljárást részletesen ismertetjük az alábbi kísérleti részben.

1. kísérlet

Adszorpciógátlás vizsgálata

Humán embrionális tüdő fibroblaszt IMR-90 sejteket (ATCC, CCL 186, Science, 196, 60-63, 1977) 7 napon át tenyésztünk 5% fetális borjú szérumot tartalmazó DMEM tápoldatban. A tenyészléből tisztított TCF-Π 200 gg-ját 100 ml 0,15 M NaCl tartalmú 0,01 M foszfát pufferben (pH-7,0 PBS) oldjuk. A TCF-Π oldatból 0,5-0,5 ml-eket mérünk be üveg kémcsövekbe és polipropilén kémcsövekbe. A 2a, b és c táblázatban feltüntetett adalékanyagokból PBS-ben külön-külön kétszeres koncentrációjú oldatokat készítünk. Az adalékanyagok különböző koncentrációival készített fenti oldatokból 0,5 ml-eket adunk mindegyik kémcsőhöz (amelyek a 0,5 ml TCF-Π oldatot tartalmazzák), és jól összekeverjük. A TCF-Π végső koncentrációja 1 gg/ml és az adalékanyagok koncentrációját a 2a, b és c táblázat szerint állítjuk be.

Kontroll gyanánt 0,5 ml PBS-t mérünk a 0,5 ml TCF-Π oldatot tartalmazó üveg kémcsőbe vagy polipropilén csőbe.

Minden vizsgálatot két párhuzamos kísérletben végzünk és a TCF-Π aktivitást 37 ‘C-on 1 órás inkubáció után határozzuk meg. A kísérleti értékek a párhuzamos inkubációk középértékét jelentik.

A TCF-Π aktivitást a citotoxikus aktivitás segítségével határozzuk meg a következőképpen.

Célsejt gyanánt a TCF-II-re nagyon érzékeny L929-18 kiónt (J. Natl. Cancer Inst., 12, 133, 1951) használjuk, amelyet az egér L929 (ATCC CCL 1) sejt (J. Natl. Cancer Inst., 9, 229, 1948) szubklónozásával kaptunk.

Az L929-18 sejteket 10% FCS tartalmú DMEM táptalajban (Dulbecco által módosított Eagle-táptalaj) tenyésztjük összefolyásig, majd a sejteket tripszines kezeléssel és centrifugálással gyűjtjük össze. A kapott sejteket 10% FCS-t és 1 gg/ml aktinomicin D-t tartalmazó DMEM táptalajban szuszpendáljuk úgy, hogy sűrűsége óxlO⁵ sejt/ml legyen.

A vizsgálandó mintából sorozathígítást készítünk úgy, hogy a sejtszuszpenzió készítéshez használt DMEM tápoldattal végezzük a vizsgálandó minta ismételt hígításait. A sorozathígítások mindegyikéből 50 gl-t mérünk be 96 tartályos mikrotitráló lemez (Falcon) tartályaiba.

A vizsgálandó minták sorozathígításait tartalmazó tartályokat 50 gl sejtszuszpenzióval oltjuk be és a tenyésztést 37 'C-on 2 napon át CO₂ inkubátorban végezzük. Tenyésztés után a táptalajt óvatosan eltávolítjuk és a sejteket kétszer mossuk PBS-sel. Az élő sejteket, amelyek a tartályokhoz tapadtak, fixáljuk és megfestjük úgy, hogy minden tartályba 50 gl - metanol és víz (1:4) elegyében készített - 5%-os kristályibolyát mérünk be. A tartályokat desztillált vízzel mossuk, szárítjuk, és a kristályibolyát minden tartályból Sorenson pufferrel (6,1 ml 0,1 M dinátrium-citrát, 3,9 ml 0,1 n HC1 és 10 ml etanol elegye) extraháljuk. A kivonatok abszorpcióját 570 nm-en mikrotiter spektrofotométeren határozzuk meg.

A TCF-Π egységét (E/ml) az a hfgítási hányados adja meg, ahol 50%-os sejt pusztulás észlelhető. Az inkubálás utáni maradék citotoxikus aktivitást közvetlenül a vizsgálandó minta elkészítése után meghatározott aktivitással (100%) szembeni relatív aktivitás (%) fejezi ki.

A 2a, b és c táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a TCF-II könnyen abszorbeálódik üveg és polipropilén edényekhez és hogy a találmányban használt adszorpciógátló szerek hatékonyan akadályozzák a TCF-Π adszorpcióját.

2. táblázat (1) Üveg kémcső

a) Nagy molekulatömegű adalékanyagok hatása a TCF-Π adszorpciójára

Koncentráció (%)	Humán szérum albumin (HSA)	Kis molekulatömegű zselatin*	Zselatin	Polietilén-glikol 4000	Dextrán 40
maradék relatív aktivitás (%)
0	8,3	8,3	8,3	8,3	8,3
0,01	16,7	8,3	25,0	8,3	-
0,05	25,0	8,3	37,5	8,3	8,3
0,1	50,0	16,7	50,0	16,7	-
0,25	100,0	16,7	100,0	16,7	-
0,50	100,0	33,3	100,0	16,7	8,3
1,00	100,0	50,0	100,0	16,7	12,5
2,00	100,0	100,0	100,0	33,3	12,5
10,00	100,0	100,0	100,0	-	75,0
20,00	100,0	100,0	100,0	-	-

* átlag molekulatömeg = 6000 =NIPPI Co., Ltd)

HU 212 513 Β

b) Nem-ionos detergensek hatása a TCF-II adszorpciójára

Koncentráció (%)	Adagolt anyag
Tween 80	Tween 20
maradék relatív aktivitás (%)
0	8,3	8.3
0,0001	16,7	16,7
0,0005	25,0	25,0
0,001	50,0	50,0
0,005	100,0	100,0
0,01	100,0	100,0
0,05	100,0	100,0
0,10	100,0	100,0
1,00	100,0	100,0

(2) Polipropilén kémcső

c) Humán szérum albumin és Tween 80 hatása a TCF—II adszorpciójára

Adagolt anyag	Adagolt anyag
Koncentráció (%)	Humán szérumalbumin (HSA)	Koncentráció (%)	Tween 80
maradék relatív aktivitás (%)	maradék relatív aktivitás (%)
0	25,0	0	25,0
0,01	50,0	0,0001	33,3
0,10	75,0	0,0005	50,0
0,25	100,0	0,001	75,0
0,50	100,0	0,005	100,0
1,00	100,0	0,01	100,0
2,00	100,0	0,5	100,0
10,00	100,0	0,1	100,0
20,00	100,0	1,0	100,0

2. kísérlet

Stabilitási vizsgálat

Különböző adalékanyagok hatását vizsgáltuk a TCF-Π stabilitására olyan körülmények között, amelyek a TCF-II üveg kémcső felületére való adszorbeálódását gátolják IMR-90 sejtek levestenyészetéből tisztított TCF-II-ből 120 pg-ot feloldunk 30 ml 0,02% Tween 80-at tartalmazó PBS-ben. A TCF-II oldatot 0,22 p-os szűrőn átszűrve sterilizáljuk, ezután a steril TCF-Π oldatból 0,5-0,5 ml-eket mérünk steril kémcsövekbe.

A 2a, b és c táblázatban megadott adalékanyagokból kétszeres koncentrációjú oldatokat készítünk, majd ezeket 0,22 p-os szűrőn átszűrve sterilizáljuk. Az oldatokból 0,50,5 ml-eket mériink a 0,5 ml TCF-Π tartalmú üveg kémcsövekbe, jól összekeverjük, majd az üveg kémcsöveket lezáijuk, hogy meggátoljuk a baktériumos fertőződést Kontroll gyanánt minden 0,5 ml TCF-Π oldatot tartalmazó üveg kémcsőhöz Tween 80-at nem tartalmazó PBS-ből 0,5 ml-eket mérünk be. A TCF-Π végső koncentrációja pg/ml, a Tween 80 végső koncentrációja 0,01%, az adalékanyagok koncentrációit a 3a, b és c táblázat tartalmazza.

Minden vizsgálatot két párhuzamos kísérletben végzünk el. A TCF-Π aktivitását 1 hét 40 *C-on való inkubálás után határozzuk meg, s ennek értékét az inkubálás előtt meghatározott aktivitással (100%) szembeni relatív aktivitás (%) adja meg. A kísérleti eredmények a párhuzamos inkubációk középértékét jelentik.

A 3a, b és c táblázat eredményeiből megállapítható, hogy a találmányban használt stabilizálószer hatására az aktív TCF-II komponens aktivitása oldott állapotban megmarad.

3. táblázat

a) Nagy molekulatömegű adalékanyagok hatása a TCF-II stabilitására ♦

Protein	Adalékanyag koncentrációja (tömeg/térf.%)	A tárolás időtartama 40 C-on (nap)
0	3	7
maradék relatív aktivitás %
humán szérum	0,0	100,0	25,0	16,7
albumin	0,1	100,0	50,0	33,3
0,25	100,0	100,0	100,0
0,5	100,0	100,0	100,0
zselatin	0,0	100,0	25,0	16,7
0,1	100,0	25,0	25,0
0,25	100,0	100,0	100,0
0,5	100,0	100,0	100,0
kis molekulatömegű zselatin (átlag molekulatömeg: 6000)	0,0	100,0	25,0	16,7
0,5	100,0	25,0	16,7
2,5	100,0	33,3	25,0
polietilénglikol 4000	0,0	100,0	25,0	16,7
0,5	100,0	16,7	12,5
2,5	100,0	16,7	12,5

* Minden vizsgált minta 0,01% Tween 80-at tartalmaz, amely meggátolja a TCF-II adszorpcióját az Üveg kémcső felületén.

b) Szénhidrátok adagolásának hatása a TCF-II stabilitására*

Szénhidrát	Adalékanyag koncentrációja (tömeg/térf7%)	A tárolás időtartama 40 ’Con (nap)
0	3	7
maradék relatív aktivitás %
Dextrán 40	0	100,0	25,0	16,7
2	100,0	25,0	8,3
10	100,0	12,5	4.2
Szorbit	0	100,0	25,0	16,7
2	100,0	33,3	25,0
10	100,0	66,7	66,7
20	100,0	100,0	100,0
40	100,0	100,0	100,0

HU 212 513 B

Szénhidrát	Adalékanyag koncentrációja (tömeg/térf./%)	A tárolás időtartama 40 ’Con (nap)
0	3 7
maradék relatív aktivitás %
Mannit	0	100,0	25,0	16,7
2	100,0	33,3	16,7
10	100,0	66,7	50,0
20	100,0	100,0	95,0
40	100,0	100,0	100,0
Glükóz	2	100,0	16,7	8,3
10	100,0	12,5	4,2
20	100,0	25,0	16,7
Fruktóz	2	100,0	12,5	6,3
10	100,0	<2,0	<2,0
Mannóz	0	100,0	25,0	16,7
2	100,0	16,7	4,2
10	100,0	<2,0	<2,0
Xilit	0	100,0	25,0	16,7
2	100,0	33,3	16,7
10	100,0	100,0	66,7
20	100,0	100,0	96,5

* Minden vizsgált minta 0,01% Tween 80-at tartalmaz, amely meggátolja a TCF-II adszorpcióját az üveg kémcső felületén.

c) Aminosavak adagolásának hatása a TCF-I1 stabilitására*

Aminosav	Adalék- anyag koncentrá- ciója (tömeg/térf.%;	A tárolás időtartama 40 ’C-on (nap)
0	3	7
maradék relatív aktivitás %
Argini	0	100,0	25,0	16,7
1	100,0	25,0	16,7
5	100,0	50,0	33,3
Glicin	0	100,0	25,0	16,7
1	100,0	33,3	25,0
5	100,0	100,0	66,7
10	100,0	100,0	100,0
Lizin	0	100,0	25,0	16,7
1	100,0	25,0	16,7
5	100,0	66,7	16,7
Alanin	0	100,0	25,0	16,7
1	100,0	25,0	16,7
5	100,0	100,0	50,0
10	100,0	100,0	90,0

* Minden vizsgált minta 0,01% Tween 80-at tartalmaz, amely meggátolja a TCF-I1 adszorpcióját az üveg kémcső felületén.

Az alábbiakban a TCF-II farmakológiai hatásait ismertetjük.

Az új humán citokin, a TCF-II, in vivő anti-tumor vizsgálata Sarcoma J80-on Anyagok és módszerek (1) Kísérleti állatok

Hét hetes nőstény ICR egereket szereztünk be a Charles River Japan Inc. cégtől.

(2) Tumor sejtvonalak

A Sarcoma 180 sejteket a National Cancer Center (Nemzeti Rákkutató Központ) bocsátotta rendelkezésünkre. A sejteket ebben a laboratóriumban hetente egyszer oltottuk át egerekbe.

(3) Vizsgálandó minták

A vizsgálandó mintákat úgy készítettük, hogy a TCF-II-t feloldottuk 0,8% NaCl-t, 0,01% T\veen 80-at és 0,25% humán szérum albumint tartalmazó 0,01 M foszfát pufferben (pH = 7,0).

Két sorozat vizsgálandó mintát készítettünk: 0,2 gg TCF-II/0,2 ml és 0,1 gg TCF-II/0,2 ml. A pirogén hatás vizsgálatához annyi standard pirogént (Difco Inc.) tartalmazó mintát készítettünk (940 pg pirogén/0,2 ml), amennyi megfelelt az 1 gg TCF-II-ben lévő pirogén anyag mennyiségének.

(4) Akut toxicitásí vizsgálat

Az akut toxicitásí vizsgálatot két egér csoporton végeztük: 10 gg TCF-II/egér, illetve 20 gg TCFII/egér adatot oltottunk az egerek farok vénájába. A toxicitást az állatok elhullásából határoztuk meg.

(5) Anti-tumor vizsgálat

Az anti-tumor vizsgálatot hét egér csoporton végeztük el.

Sarcoma 180 sejteket ültettünk be az ICR egerek bőre alá (10® sejt/egér). Az egereket csoportokba osztottuk és a vizsgálandó mintákat 7 napon át minden nap egyszer beadtuk az egereknek, a farok vénába injiciálva. A tumor növekedést gátló hatást a gátlási hányadossal határozzuk meg:

C-T

-xl00%

C

A hányadost úgy kapjuk meg, hogy a beoltott csoportokban a tumor átlag súlyát (MTW = mean tumor weight) összevetjük a kontroll csoport átlag tumor súlyával.

A vizsgálatok eredménye (1) Akut toxicitásí vizsgálat

Toxicitás nem jelentkezett sem a 10 gg-os, sem a 20 gg-os dózisnál.

(2) Anti-tumor vizsgálat

Az injekciózás kezdetétől eltelt 3 hét utáni eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be.

HU 212 513 Β

4. táblázat

Minta	Dózis	MTW (mg)	C-T -xl00% c
Kontroll	0,0	3024,71	-
Pirogén	940 pg/egér	3036,00	-0,37
TCF-II	0,2 pg/egér	1787,71	49,92
TCF-II	1,0 pg/egér	1984,21	34,40

Minthogy a fenti vizsgálatban a TCF-Π optimális dózisa ismeretlen volt, a vizsgálatot nem a megfelelő dózisokkal végeztük. Azonban az eredményekből látható, hogy a kisebb dózis inkább hatásosabb, mint a nagy dózis.

Vizsgáltuk ezenkívül a tumorba adott direkt injekció anti-tumor hatását az alábbi módszerrel.

Módszerek:

Sarcoma 180 sejteket ültettünk be ICR egerek bőre alá (lxlO⁶ sejt/egér). Egy héttel a beültetés után kiválasztottuk azokat az egereket, amelyekben stabilan kemény tumor alakult ki. Ezekbe 7 napon át, minden nap egyszer 0,2 gg TCF-H-t injiciáltunk. Az injekciók beszüntetése után a megfigyelést még két hétig folytattuk, s ekkor jelentős anti-tumor hatást észleltünk, amely a tumoros helyen fekete színre változó nekrózisban nyilvánult meg. Ezenfelül olyan egereket is megfigyeltünk, amelyekben a tumor eltűnt

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetése következik.

Az 1. ábrán az IMR-90 sejtek 5% borjú szérumot tartalmazó tenyészlevéből származó TCF-Π és plazminogén aktivátor CM-Sephadex C-50 kromatográfiás elúciós profilja látható. Az (1) és (2) jelek azokat a frakciókat mutatják, amelyek 0,3 M NaCl-t tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), illetve 0,6 M NaCl-t tartalmazó 0,005 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) oldódnak le.

A -O- jel a 280 nm-en mért abszorpciót, a -·-, illetve jel a plazminogén aktivátor hatást, illetve az L929-18 sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitást jelenti.

A 2. ábra azon TCF-Π frakció ConA affinitás kromatográfiás eredményét mutatja be, amelyet az IMR-90 sejtek tenyészlevének CM-Sephadex C-50-nel való kromatografálásánál 0,6 M NaCl-t tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) oldódott le. Az (1) és (2) jelek a 0,5 M NaCl tartalmú 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) kimosott frakciókat illetve a 0,5 M NaCl és 0,3 M a-medl-D-manno-pironazidot tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) eluált frakciókat jelzik.

A -·- jel a 280 nm-en mért abszorpciókat és a O-jel a citotoxikus aktivitást ábrázolja.

A 3. ábrán a ConA Sepharose affinitás kromatográfiával kapott TCF-Π frakció Mono S-HPLC-val kapott elúciós profilja látható.

A-•-jel a citotoxikus aktivitást ábrázolja.

A 4. ábrán a Mono S-HPLC-vel kapott eluátum Heparin-Sepharose affinitás kromatografálásával kapott TCF-Π elúciós profilja látható. Az (1) és (2) jelek a 0,3 M NaCl-t tartalmazó 10 nM trisz-HCl pufferrel (pH = 7,5) kimosott frakciót, illetve a 0,3-2,0 M NaCl gradienssel eluált frakciót jelentik.

A -·- jel a 280 nm-en mért abszorpciót, a - Ojel a citotoxikus aktivitást ábrázolja.

Az 5. ábra a TCF-Π (redukált és nem redukált) SDS-elektroforézist ábrázolja.

A 6. ábra a TCF-Π hőstabilitását mutatja be.

A 7. ábra a TCF-Π pH stabilitását mutatja be.

A 8. ábra a TCF-Π citotoxikus aktivitását mutatja be in vitro humán tumor sejtvonalakkal szemben.

A 9. ábra a TCF-II citotoxikus aktivitását mutatja be Sarcoma 180 sejtekkel szemben.

A 10 ábra a TCF-Π citotoxikus aktivitását mutatja be a Meth A és P388 sejtekkel szemben. A -· - és -jel a Meth A, illetve a P388 sejteket ábrázolja.

A 11. ábra a TCF-Π humán tumor sejtvonalakra kifejtett citotoxikus aktivitását mutatja be.

A -· - jel a BG-1 petefészek karciómára, a -O -jel az MCF-7 emlő karciómára kifejtett citosztatikus aktivitását ábrázolja.

A 12. és a 13. ábra a TCF-Π hatását mutatja be a ³H-timidin limfocitákba való beépülésére, kevert limfocita tenyészetben, az 5., illetve a 8. napon. Az 5., illetve 8. napon 6 mintát határoztunk meg. Az eredmények középértékét (± standard eltérés) adjuk meg.

A 14. ábra a TCF-Π stimuláló hatását mutatja be a vaszkuláris endoteliális sejtek (HUVEC) növekedésére.

A 15. (1) és (2) ábrán a TCF-Π cDNS bázis szekvenciája és a TCF-Π bázis szekvenciából levezetett aminosav szekvencia látható.

A 16. ábrán a TCF-Π fenti bázis szekvenciájából levezetett aminosav szekvenciát és a hHGF Miyazawa és munkatársai szerinti aminosav szekvenciát hasonlítjuk össze.

A találmány legjobb kiviteli módját a következő példák ismertetik, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa (I)Az IMR-90 humán fibmblaszt sejtek tenyésztése

IMR-90 humán fibroblaszt sejteket (ATCC CCL 186, Science, 196, 60-63, 1977.) oltunk 3X10⁶ sejt) 1 literes henger alakú palackokba, amelyek 100 ml 5% borjú szérummal (CS = calf serum) kiegészített DMEM táptalajt [Virology, 1., 396, (1959.) és Virology, 12., 185. (1960)] tartalmaznak és a sejteket 7 napon át tenyésztjük a palackok hengergetése (0,52 fordulat/perc) mellett. Amikor az ossz sejt-szám eléri az lxlO⁷ értéket, a sejteket tripszin kezelés segítségével learatjuk és összegyűjtjük a palack alján. Ezután 250 ml 5% CS tartalmú friss DMEM táptalajt és 100 g autoklávozott 5-9 mesh kerámia szemcsét (Toshiba Ceramic CO., Ltd) adunk a sejt szuszpenziót tartalmazó palackokhoz. Az álló tenyésztést 37 *C-on végezzük 24 órán át. Ezután 250 ml 5% CS-t tartalmazó DMEM táptalajt adunk a palackokhoz (a táptalaj végső menynyisége 500 ml) és folytatjuk a tenyésztést. Minden

7-10. napon a táptalaj teljes mennyiségét (körülbelül

HU 212 513 Β

500 ml-t) összegyűjtünk és friss táptalajról (500 ml) gondoskodunk. Ha a termelést 2 hónapon át így folytatjuk, 4 liter tenyészlevet gyűjthetünk össze hengeres palackonként. Az így kapott tenyészlé specifikus aktivitása 32 E/ml volt.

(2) A TCF-II glükoprotein tisztítása

Az (1) pontban leírtak szerint kapott 75 liter tenyészlevet körülbelül lö-szeresére koncentráltuk UF koncentrálással, Amicon membrán szűrőt (pórus nagyság: molekulatömeg határ 6000) használva. CM-Sephadex C-50et (beszerezhető a Pharmacia KLB Biotechnology cégtől) hozunk egyensúlyba 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), ezután a gyantából 1,5 kg-ot (nedves tömeg) adunk a fenti UF koncentrált léhez és az anyagot a gyantára adszorbeáljuk 4 ’C-on óvatos keveréssel 24 órán át, pH = 6,5-7,0 mellett. Adszorbeálás után a gyantát Whatman No. 2. szűrőpapíron átszűrve gyűjtjük össze. Az összegyűjtött gyantát 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) mossuk. Egy oszlopot (7x40 cm) körülbelül 1500 g mosott gyantával töltünk meg és az oszlopot 0,01% Tween 20 és 0,3 m NaCl tartalmú 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) eluáljuk. A protein leoldását a 280 nmen mért abszorpciók segítségével követjük. Amikor a protein majdnem teljesen leoldódott, a további elúciót 0,6 M NaCl sókoncentráció mellett végezzük. Minden frakcióban meghatározzuk az L929-18 sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitást és az IMR-90 sejtek által termelt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA = tissue plasminogen activator) hatást. Az itt kapott elúciős képet az

1. ábra mutatja be. A 0,6 M NaCl sókoncentráciőnál eluálódott frakció erős citotoxikus hatást fejtett ki. Ezt a frakciót TCF-H-nek neveztük. Ezután ConA-Sepharose CL-őB-t (Pharmacia) hozunk egyensúlyba 0,5 M NaCl-t tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), majd a gélt oszlopba (2,5x8 cm) töltjük. Az oszlopot jól kimossuk ugyanezen pufferrel és a CM-Sephadex oszlopról leoldott TCF-Π frakciót az oszlopra visszük. Az oszlopot újra mossuk 10-szeres oszlop-töltet mennyiségű 0,5 M NaCl és 0,3 M α-metil-D-mannopiranozid tartalmú

0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), s ezután az anyagot 0,05 M NaCl és 0,3 M α-metil-D-mannopiranozid tartalmú 0,05 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), 70 ml/óra átfolyási sebesség mellett eluáljuk.

A protein leoldást a 280 nm-en mért abszorpcióval követjük, majd meghatározzuk minden frakcióban a citotoxikus aktivitást. Az így kapott elúciós kép a 2. ábrán látható. Az először leoldődó frakciót összegyűjtjük és desztillált vízzel szemben dializáljuk 48 órán át. A dializált frakciót liofilizáljuk, s ekkor fehér port kapunk. A liofilizált port kis mennyiségű 0,01% T\veen 20-at és 0,2 M NaCl-t tartalmazó 0,05 M trisz-HCl pufferben oldjuk és Mono S oszlopra (Pharmacia) visszük fel, HPLC-hez. Az oszlopot előzőleg 0,01% T\veen 20-at tartalmazó 0,01 M foszfát pufferrel (pH = 7,0) hoztuk egyensúlyba. Az oszlopot ezután 0,01% Tween 20 tartalmú 0,01 M foszfát pufferrel (pH = 7,0) mossuk 20 percig 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett Az elúciót 0-1,0 M NaCl gradiensben végezzük 60 perc alatt. A kapott elúciós kép a 3. ábrán látható. Az aktív frakció 0,76 M NaCl-nél oldódik le. Az aktív frakciót összegyűjtjük, a kiegyensúlyozó pufferrel meghígítjuk, és HPLC-hez újra felvisszük Mono S oszlopra. Az elúciót ugyancsak 0-1,0 NaCl gradienssel (ugyanazon pufferben) végezzük el. Heparin-Sepharose-t (Pharmacie) hozunk egyensúlyba 0,3 M NaCl-t tartalmazó 10 nM trisz pufferrel (pH = 7,0) és a gélből 5 ml-t beteltünk egy 1,0x7 cm-es oszlopba. A Mono S-HPLC-vel kapott aktív frakciót összegyűjtjük és úgy hígítjuk 0,01 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0), hogy NaCl koncentrációja 0,3 M legyen, majd a fent említett oszlopra visszük fel. Ezután az oszlopot 10-szeres oszlop-töltetnek megfelelő mennyiségű 0,3 M NaCl tartalmú, 0,01 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0) mossuk. Az anyagot 20 ml/óra átfolyási sebesség mellett eluáljuk azonos pufferrel készített 0,3-2,0 M NaCl gradiensben. Az elúciós képet a 4. ábrán mutatjuk be. így kapjuk a tisztított glükoproteint. Amint azt az 5. táblázat mutatja, 0,12 mg aktív glükoproteint kaptunk a kiindulási anyagból, azaz 75 liter tenyészléből. Ez a glükoprotein tumor citotoxikus faktornak bizonyult, 5 248 000 E/mg specifikus aktivitással.

5. táblázat

IMR-90 sejtek tenyészetéből (5% CS-t tartalmaz) előállított tumor citotoxikus faktor tisztítása TCF-II: Sephadex C-50 kromatografáló oszlopról 0,6 MNaCl-al leoldott A frakció

Tisztítási lépés	Mennyiség (ml)	Protein (mg/ml)	Össz Protein (mg)	Citotoxikus aktivitás (E/ml)	Össz aktivitás (xKX’E)	Specifikus aktivitás (E/mg)	Tisztítási faktor	Kitermelés (%)
Tenyészlé	75 000	3,30	274 500,0	32,0	24,0	9,7	1,0	100,0
UF koncentrálás	10000	23,40	234000,0	192,0	192,0	8,2	0,9	80,0
CM-Sephadex kromatográfia (0,6 M NaCl-al leoldott frakció)	894	0,32	205,6	2048,0	183,1	8904,3	918,0	76,3
ConA Sepharose kromatográfia	244	0,26	63,4	5 120,0	124,9	19 692,3	2 030,0	52,0
Mono S-HPLC	13	0,26	2,1	80 000,0	104,0	500 000,0	51 546,4	43,4
Heparin-Sepharosa kromatográfia	6	0,02	0,12	104960,0	56,0	5 248 000,0	541 030,9	23,3

HU 212513 Β

A fent ismertetett eljárással kapott TCF-II fizikokémiai tulajdonságai (1) Molekulatömeg meghatározás SDS gél-e lektmforézissel

A TCF-II molekulatömegét elektroforézissel határoztuk meg, 0,1% SDS-t tartalmazó poliakrilamid gél használatával. A glükoprotein két egymás melletti, 78 000 és 74 000 molekulatömegnek megfelelő sávot adott. Amikor a glükoproteint 2-merkapto-etanollal redukáltuk és hasonló elektroforézist végeztünk, három sávot figyeltünk meg, amelyek 52 000,

000 és 28 000 molekulatömegnek feleltek meg (5. ábra).

Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy a TCF-II 15 egy heterodimer, amely egy 52 000 molekulatömegű közös alegységből és egy 28 000 molekulatömegű alegységből vagy egy 32 000 molekulatömegű alegységből áll.

(2) Izoelektromos pont

Az anyag izoelektromos pontját izoelektromos fokuszálással, Phast Gél IEF3-9 használatával határoztuk meg. Eredmény 7,4-8,55.

(3) Hőstabilitás

Egy 51 200 E/ml aktivitású TCF-H-ből 512 E/ml TCF-Π oldatot készítünk 0,01% Tween 20 tartalmú 0,1 M trisz-HCl pufferrel (pH = 7,0). Az oldatot 10 percig kezeljük 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 és 95 ’C-on. 30 A különböző hőmérsékleteken való kezelés után kapott maradék citotoxikus aktivitást (E/ml) a kontroll 25 ’Con mért aktivitásával (E/ml: 100%) szembeni relatív aktivitás (%) adja meg. A 6. ábrából látható, hogy az anyag 60 ’C-ig stabil volt.

(4) pH stabilitás

Elkészítjük a 6. táblázatban bemutatott összetételű puffereket, melyek mindegyike 0,01 % Tween 20-at tartalmaz. A TCF-II-ből 51 200 E/ml-nek megfelelő mennyiséget - ha az oldatot pH = 8-on készítjük el oldunk fel minden pufferben és az oldatokat 1 órán át 37 ’C-on állni hagyjuk. A relatív aktivitásokat (%) az 1 órán át szobahőmérsékleten tartott kontroliéval összehasonlítva határozzuk meg. A 7. ábra mutatja, hogy a glükoprotein pH = 6-9 tartományban stabil volt.

6. táblázat A pufferek készítése

pH = 1-3	1/10 M glicin-HCl
pH = 4-6	1/10 M acetát puffer
pH = 7-8	1/10 M trisz-HCl
pH = 9-12	1/10 M glicin-NaOH

(5) A TCF-II N-terminális aminosav szekvenciája A TCF-II 50 gg-ját redukáltuk és a három polipeptidet - az 52 000 molekulatömegű A-t, a 32 000 molekulatömegű B-t és a 28 000 molekulatömegű C-t elektroblot módszerrel választottuk el. Mindegyik polipeptid aminosav szekvenciáját az Applied Biosystems 477A típusú protein szekvenátorával analizáltuk. A polipeptid N-terminális aminosav-szekvenciáját nem lehetett meghatározni, mivel N-terminusza blokkolt. A B és C polipeptidnek közös N-terminális aminosav szekvenciája volt, s ez a következő:

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-X-Met-Val-Ser-Leu1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

X egy nem azonosított aminosavat jelent.

Minthogy a B és C polipeptid azonos N-terminális aminosav szekvenciát mutat, úgy tűnik, hogy a TCF-II dimer szerkezetű, amelyben az 52 000 molekulatömegű A polipeptid a 32 000 molekulatömegű B polipeptidhez vagy a 28 000 molekulatömegű C polipeptidhez

S-S híd révén kapcsolódik.

(6) Aminosav összetétel

A TCF-H-ből 10 gg-ot, amelyet a BioRad cég által gyártott Protein Assay Kittel határozatunk meg, sósavval hidrolizáltunk, majd aminosav összetételét egy Hitachi féle aminosav analizátorral (Model L-8500) határoztuk meg.

Az anyag aminosav összetétele a következő:

Aminosav	nmol	mol%
Asp	10 375	12,97
Glu	7 750	9,69
Ser	5000	6,25
Gly	7 250	9,06
His	3000	3,75

Aminosav	nmol	mol%
Arg	5 375	6,72
Thr	5 125	6,41
Alá	2 625	3,28
Pro	5 625	7,03
Tyr	3 875	4,84
Val	4 125	5,16
Met	1 875	2,34
Cys	ND	-
He	5000	6,25
Leu	4 875	6,09
Phe	2 250	2,81
Trp	ND	-
Lys	5 875	7,34
összesen:	80 000	100(99,99)

ND = nincs meghatározva

HU 212 513 Β la példa

A találmány szerinti TCF-Π alapszekvenciájának komplementer DNS-éből (cDNS) történő levezetése A TCF-Π cDNS-t egy olyan cDNS tár szűrése révén klónoztuk, amelyet humán embrionális fibroblaszt sejtekből (IMR-90) kivont össz-RNS-ből tisztított mRNS felhasználásával állítottunk elő, a következő eljárással.

(1) Poli(A)⁺RNS előállítása IMR-90 sejtekből

Az össz-RNS-t guanidin-tiocianát-cézium-klorid módszerrel [Biochemistry, 18., 5294-5299 (1979.)] állítjuk elő 5% újszülött borjú szérumot (NBCS = new bőm calf serum) tartalmazó Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajban (DNEM) tenyésztett 2x10® IMR-90 sejtből. Az IMR-90 sejteket 5 mM nátriumcitrát, 0,5% Sarcoseal és 0,1 M β-merkapto-etanol tartalmú 6 M guanidin-tiocianát oldatban szuszpendáljuk, majd homogenizáljuk. Poliallomer centrifúgacsövekbe bemérünk 0,1 M EDTA tartalmú 4 ml 5,7 M céziumklorid oldatot A cézium-klorid oldatra 7 ml homogenizált oldatot viszünk, majd 35 000 fordulat/perc mellett, 20 C-on 16 órán át centrifugáljuk, Beckman centrifugában, 40T1 rotort használva. Centrifugálás után az üledéket kétszer mossuk 95%-os etanollal, majd feloldjuk 200 μΐ 1 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM trisz-HCl pufferben (pH = 7,5) 5 percig 65 C-on való melegítéssel, s így kapjuk az össz-RNS oldatot. A poli(A)⁺RNS-t az össz-RNS-ből tisztítjuk oligo(dT)cellulóz oszlop kromatográfiás módszerrel. Az össz-RNS oldatot 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl és 0,05% SDS tartalmú 10 mM trisz-HCl pufferrel (pH = 7,4) kiegyensúlyozott oligo(dT) cellulóz oszlopra visszük fel. Az adszorbeált frakciót 1 mM EDTA-t és 0,05% SDS-t tartalmazó 10 mM trisz-HCl pufferrel (pH = 7,4) eluáljuk. Az eluátumot poli(A)⁺RNS oldatnak tekintjük.

(2) A cDNS-tár szintetizálása

Az (1) pont szerint kapott poli(A)⁺RNS-t templátként használjuk a kétszálú cDNS szintetizálásához, felhasználunk továbbá egy cDNS szintézis kit-et (Pharmacia Co., Ltd), majd EcoRI adapterhez kapcsoljuk. A szintetizálást eljárást a Pharmacia Co., Ltd. előirata szerint végezzük, kivéve, hogy az egyszálú DNS szintéziséhez madár csontvelő betegség nem-szferikus vírus eredetű reverz transzkriptázt (40 egység/reakcióelegy; Life Science Co., Ltd) használunk.

(3) A cDNS-tár elkészítése

A (2) pont szerint kapott cDNS-t a XgtlO fág vektor (Promega Co., Ltd) EcoRI karjába építjük be. A poli(A)⁺RNS-ből szintetizált cDNS 3,3 gg-ját 150 μΐ oszlop-pufferben (66 mM trisz-HCl puffer; pH = 7,6) oldjuk fel, amely 1 mM spermidint, 10 mM magnéziumkloridot, 15 mM ditiotreitolt és marha szérum albumint (0,2 mg/ml) tartalmaz. A kapott oldat 5,2 μΙ-ét a XgtlO EcoRI kar 1 gg-jával keverjük el, majd etanollal kicsapjuk. A rekombináns fág DNS-t, amely mind a XgtlO-et, mind a cDNS-t tartalmazza, a következőképpen állítjuk elő. A kapott csapadékot 9 μΐ oszlop-pufferben oldjuk fel és 16 C-on egy éjszakán át inkubáljuk, miután hozzáadtunk 1 μΐ 10 mM ATP-t és 1 μΐ T4 DNS ligázt (350 E/μΙ).

(4) A cDNS-tár szűrése (i) Oligonukleotid szonda előállítása

A szonda előállításához olyan 17-mer komplementer oligonukleotid keveréket (384 species mix) szintetizálunk, amely a TCF-Π β-lánc N-terminális aminosav szekvenciájában a Val’-től Pro⁶-ig terjedő aminosav szekvenciának felel meg és az 5'-terminálist T4 polinukleotid-kinázzal (TAKARA SHUZO) és γ-³²Ρ/ΑΤΡvel (Amersham Co., Ltd) jelezzük. A szonda a következő képet mutatja.

A használt komplementer szál:

(384 species mix) ' -CACCACTTACCGTAGGG-5'

G G G C A

A A AT

T T T (ii) A rekombináns fág szűrése

A (3) pontban leírtak szerint előállított rekombináns fág DNS in vitro pakolása - Gigapack Gold (Stratagene) használatával - majd E. coli C600 hfl sejtek (Huynh és munkatársai, DNA cloning, /., D. Glover Ed., 56-110. old. 1985. beszerezhető a Molecular Biology reagens rendszerekből) megfertőzése révén körülbelül ötszázezer fág plakkot kaptunk. A plakkokat ezután Hybond-N (Amersham) szűrőre adszorbeáljuk, lúggal denaturálunk, majd semlegesítés következik, ezután a szűrőket 80 C-on 2 órán át hevítjük. A hidridizálást Bell és munkatársai [Natúré, 310., 775-777. (1984.)] módszerével végezzük. Az első szűrést az (i) pont szerint készített szonda-mix használatával végezzük. Az első szűréssel meghatározott pozitív platótokból egy olyan kiónt találtunk, amely feltehetően TCFII fragmentumot tartalmaz.

(5) A TCF-II cDNS teljes hosszának klónozása

A TCF-II a-, illetve β-láncából Iizil-endopeptidázos emésztéssel, s ezután a fragmentumok térképezésével a következő belső aminosav szekvenciákat kaptuk (egy-betűs kőd) (a) NYMGNLSQTRSGL és (β) TSXSVYGWGYTGLINYDGLL (X = nem azonosított). A TCF-II β-láncának N-terminális aminosav szekvenciája egy humán hepatocita növekedési faktor (hHGF) β-láncának N-terminális aminosav szekvenciájával egyezett meg. Ezenkívül a TCF-U-ben lévő fent említett (a) és (β) belső aminosav szekvenciák a hHGF-ben mind az α-, min a β láncban megtalálhatók. Ennélfogva azt gondoltuk, hogy a TCF-II-t a hHGF gén-család egy tagja fejezi ki. MIYAAWA é s munkatársai [BBRC, 163., 967-973 (1989)] és NAKAMURA és munkatársai [Natúré, 342., 440-443 (1989.)] ismertették a placenta és máj cDNS-tárból származó hHGF cDNS szekvenciákat.

A két hHGF cDNS-ből levezetett elsődleges szekvencia összehasonlítása alapján kitűnt, hogy szekvenciáikban 14 helyen különböznek az aminosavak. Ezen

HU 212 513 Β eredmények alapján egy hHGF gén-család jelenlétét feltételeztük. A placenta típusú és máj típusú hHGF cDNS-ekből az azonos szakaszokat választottuk ki mint primer szekvenciákat a polimeráz lánc-reakcióhoz (PCR = polymerase chain reaction). A két hHGF 5 cDNS 5'- és 3'- nem kódoló szakaszánál lévő azonos oligonukleotidokat kémiailag szintetizáltuk és a TCFII cDNS-ra való szűrést úgy végeztük PCR-rel, hogy ezeket használtuk primerek gyanánt. A Sal-77 prímért, amely egy Sáli restrikciós enzim hasítási helyet tartalmaz és az Sph2203 prímért, amely egy Sphl restrikciós enzim hasítási helyet tartalmaz, DNS szintetizátorral (Applied Co., Ltd) szintetizáltuk. A primerek a következők:

Sal-77 primer: 5 '-GGTCGACTAGGCACTGACTCCGAACAGGATTC-3' Sál I

Sph2203 primer: 5 ' -GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3' Sph I

A PCR módszerrel való klónozást a következőképpen végezzük:

(i) PCR a (2) pont szerint szintetizált cDNS 1 μΐ (150 μΐ oszlop-pufferben oldva) μΜ Sal-77 primer 2,5 μΐ μΜ Sph2203 primer 2,5 μΐ

OxPCR reagens oldat 10 μΐ [500 mM KC1, 15 mM MgCl₂ és 0,1% (tömeg/térf) zselatin tartalmú 100 mM trisz-HCl puffer (pH = 8,3)]

1,25 mM dGTP, dATP, dCTP keverék 16 μΐ Ampli Taq (5 e/μΐ; TAKARA SHUZO) 0,5 μΐ

Desztillált víz 67,5 μΐ

A fenti oldatot 0,5 ml-es mikro-centrifugacsőben keveijük össze és a folyadék felületét 100 μΐ ásványolajjal (Sigma Co., Ltd) fedjük be. A PCR-t Quick Thermo System (Japan Genetics Co., Ltd) használatával végeztük el. Egy 94 C-on 7 percig tartó előkezelés után 35-ször ismételünk meg egy három-lépéses reakciót, amely a következőkből áll: illesztési (annealing) reakció 55 *C-on 3 percig; polimeráz reakció 72 ’C-on 2 percig; és denaturálási reakció 94 ’C-on 2 percig. Ezután a reakcióelegyet 3 percig 55 ’C-on, majd 11 percig 72 ’C-on kezeljük, végül szobahőmérsékletre hűtjük le. (Az időtartamok magukba foglalják a hőmérséklet változtatás idejét.) Amikor a reakcióelegy egy részét agaróz gél elektroforézissel analizáltuk, egy 2,3 kb DNS fragmentumot DE81 papír (Whatman Co., Ltd) segítségével nyeljük ki.

(ii) Szubklónozás

Az (i) szerint kapott, Sáli és Sphl restrikciós enzimmel emésztett 2,3 kb DNS fragmentumot ligációs kit (TAKARA SHUZO) használatával egy vektor fragmentumba építjük be, melyet úgy kaptunk, hogy a pUC18 plazmid vektort (Japan Gene Co., Ltd) Sáli és Sphl restrikciós enzimmel emésztettük. A vektorral Esherichia coli DH5a sejteket (Molecular Cloning, Spring Harbor Laboratory Press, A. 10,1989) transzficiálunk a BRL Co., Ltd. előírása szerint. így több mint 20 szubklónt kaphatunk.

(iii) A bázis szekvencia meghatározása

A kapott szubklónok bázis szekvenciáit didezoxi módszerrel határoztuk meg (Sequeanase Ver. 2,0 TOYOBO). A nukleotid beépülés hibáit Ampli Taq-on (TAKARA SHUZO) több szubklón bázis-szekvenciájának az analízise alapján korrigáltuk. A fent említett eljárással a TCF-II cDNS-re kapott bázis-szekvenciát és a bázis-szekvenciából levezetett aminosav-szekvenciát a 15. ábrán mutatjuk be. Ez a szekvencia az ATG transzkripciós iniciációs kodontól a TAG terminációs kodonig teljed és 2172 bázispártról (bp) áll. Aminosavra transzlatálva, a TCF-II 723 aminosavből áll Az első metionin csoporttól (Met¹) a 29. alanin csoportig (Ala²⁹) tartó aminosav szekvenciáról feltételezzük, hogy ez egy szignálszekvencia. A TCF-II, amelyben két polipeptid - az α-lánc és a β-lánc - diszulfid kötéssel kapcsolódik össze, először mint egyszeres lánc szintetizálódik. Minthogy a TCF-II-ben az a-lánc N-terminális a blokkolt, így nem volt azonosítható. Azonban, a β-lánc N-terminális aminosav szekvenciáját és a TCF-II néhány belső aminosav szekvenciáját mint fent említettük - meghatároztuk és a 15. ábrán bemutatjuk.

A TCF-II cDNS bázis-szekvenciája nagyon hasonló a hHGF-éhez, amelynek szekvenciáját MIYAZAWA és munkatársai [Biochemical and Biophysical Research Communication, 163., 967-973. (1989.)] határozták meg. A TCF-II cDNS-ből azonban kiesett öt aminosav csoport (F-L-P-S-S), amely kiesés a hHGF aminosav-szekvenciában Phe¹⁶²-től Ser¹⁶⁶-ig tart. Ennélfogva beigazolódott az a tény, hogy a TCF-II cDNS a hHGF gén-család egy új tagja. A TCF-II aminosavszekvenciának - amely a fent említett bázis-szekvenciából van levezetve - a hHGF aminosav-szekvenciával (MIYAZAWA és munkatársai) való összehasonlítását mutatja be a 16. ábra.

2. példa

Az 1. példa szerint kapott TCF-II glükoprotein citotoxikus hatása tumor sejtekre (1) A tumor sejtek növekedésének gátlása

HaLa (ATCC CCL2, Camcer Rés., 12, 264, 1952) és a KB (ATCC CCL17, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 89, 362, 1955) humán tumor sejtvonalat, illetve IMR90 humán normál diploid sejteket lxlO⁵ sejt/ml sűrűségben 10% FCS tartalmú DMEM táptalajban szuszpendálunk. Egy 96 tartályos mikrotitráló lemez (Falcon) minden tartályába az egyes sejt szuszpenziókból 50 μΐ-eket mérünk be a TCF-II oldat (5120 E/ml) 10-, 20-, 40-, 80- és 160-szoros hígításaiból és a sejteket 3 napon át tenyésztjük 37 ’C-on CO₂ inkubátorban. A tartályokban a túlélő sejteket fixáljuk és a tartályokhoz

HU 212 513 Β adott 50-50 μΐ 0,5%-os kristályibolya oldattal (metanol és víz 1:4 elegyében oldva) megfestjük. A tartályokat desztillált vízzel mossuk, szárítjuk és a tartályokból a kristályibolyát Sorenson pufferrel vonjuk ki. A kivonatok abszorpcióját mikrotiter spektrofotométerrel, 5 570 nm-en határozzuk meg.

A TCF-II sejt növekedést gátló hatását (%) a TCFII-t nem tartalmazó kontroll csoporttal való összehasonlításból számítjuk ki és a kapott értéket felvisszük a TCF-Π koncentrációval szemben. A 8. ábrán látható, hogy a TCF-II hatékonyan gátolja a KB és HeLa sejtek növekedését, míg a normál, IMR-90 sejtek növekedését nem gátolja.

(2) Reaktivitás ismert anyagok elleni antitestekkel

TCF-ü-t oldunk fel 10% FCS tartalmú DMEM-ben úgy, hogy koncentrációja 320 E/ml legyen. Anti-LT antitestből 1000 E/ml LT-t neutralizáló ütemek megfelelő mennyiséget adunk a TCF—Π oldathoz és az elegyet 37 ’C-on 1 órán át állni hagyjuk. Ehhez hasonlóan anti-TNF antitestet és anti-INF-β antitestet adunk lxl0⁶ E/ml, illetve 1000 E/ml koncentrációban az oldathoz. A példában használt antitestek mindegyike beszerezhető a Clonetics Corporation-tól.

A reakció után meghatároztuk a TCF-II citotoxikus 25 aktivitását. Egyik antitest sem neutralizálta az aktivitást.

3. példa

Az 1. példa szerint kapott TCF-Η glükoprotein citotoxikus hatása különböző egér tumor sejtvonalra A Sarcoma 180 (ATCC TIB66, J. Natl. Cancer Inst., 13, 1299-1377, 1953), Meth A szarkóma (RCB 464, beszerezhető a Rikken Cell Bank-tói) és P-388 egér tumor sejteket (ATCC TIB63, J. Immunoi., 114, 894897, 1975) használtunk a vizsgálathoz.

Sarcoma 180 sejteket szuszpendálunk 10% fetális marhaszérumot tartalmazó DMEM táptalajban, illetve Meth A és P-388 sejteket szuszpendálunk 10% fetális marhaszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban, 210⁴ sejt/ml koncentrációban. A sejtszuszpenziókból 50pl-eket mérünk be 96 tartályos mikrotitráló lemez 15 (Falcon) tartályaiba. TCF-ü-t oldunk fel 10% fetális marhaszérumot tartalmazó DMEM-ben a Sarcoma 180 sejtekhez és 10% fetális marhaszérumot tartalmazó RPMI táptalajban a Meth A és P-388 sejtekhez. Ezután 0, 2, 4, 8, 16, 31,62, 125,250, 500 és 1000 pg/ml TCF-II koncentrációjú oldatokat készítünk és ezekből 50-50 μΙ-t mérünk a tartályokban lévő szuszpenziókhoz. A sejtvonalakat 37 ’C-on 3 napon át tenyésztjük CO₂ inkubátorban. A tartályokban lévő sejteket tripánkékkel festjük meg és az élősejt-számot hemacitométer használatával számoljuk meg. Az élősejt-számot két párhuzamos kísérlet középértéke adja meg. A citotoxikus aktivitást (%) az alábbi egyenlet szerint számítjuk ki:

kontroll csoportban a túlélő sejtszám átlaga OriVínl) TCF-Π csoportban a túlélő sejtszám átlaga (^scikml) kontroll csoportban a túlélő sejtszám átlaga (“iVml)

A TCF-H-re mindegyik sejtvonal erősen érzékeny volt A TCF-Π citotoxikus aktivitás ICjQ-értéke Sarcoma 180-nál 6, Meth A-nál 40 és P-388 sejtnél 460 pg/ml volt

4. példa

Az I. példa szerint előállított TCF—II glükoprotein gátló hatása BG—1 petefészek karcióma és MCF-7 emlő karcióma humán sejtvonalakra BG-1 [beszerezhető a Department of Pathology, Wake Forest University-től, N. Carolina, lásd Cancer, 63., 280-288. (1989.) Geisinger és munkatársai] és MCF-7 sejteket (ATCC HTB22, Soule és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst, 51,1409-1416,1973) szuszpendálunk 10% FCS-t nem esszenciális aminosav keveréket piruvátot és Eagle sókat tartalmazó Eagle MÉM táptalajban (Eagle, H„ Science, 130., 432. oldal, 1959.), 2X10⁴ sejt/ml sűrűségben. A TCF-II-t 10% FCS tartalmú McCoy táptalajban oldjuk a BG-1 sejtekhez és 10% FCS tartalmú Eagle MÉM táptalajban az MCF-7 sejtekhez, majd a TCF-Πből sorozat hígítást készítünk a 4 pg TCF-ü/ml koncent35 rációjú oldat ugyanazon táptalajokkal készített kétszerező hígításával.

A sejt szuszpenziókhoz 50-50 μΙ-eket mérünk be 96 tartályos mikrotitráló lemez (Falcon) tartályaiba. Az egyes sejtvonalakhoz készített sorozathfgftású TCF-II oldatokból 50 μΙ-eket adunk a sejt szuszpenziókat tartalmazó tartályokhoz. A tenyésztést 37 ’Con 5 napon át végezzük CO₂ inkubátorban. Tenyésztés után eltávolítjuk a tápoldatot és a sejteket óvatosan kétszer mossuk PBS-sel. A túlélő sejteket, amelyek a tartályokhoz tapadtak, fixáljuk és metanol-víz 1:4 elegyével készített 0,5%-os kristályibolya oldatból 50 μΐ hozzáadásával megfestjük. A tartályokat desztillált vízzel mossuk, szárítjuk és a kristályibolyát a tartályokból Sorenson pufferrel extraháljuk. A kivonatok abszorpcióját mikrotiter spektrofotométerrel 570 nm-en határozzuk meg. A sejt növekedés gátlását (%) az alábbi egyenlet szerint számítjuk ki úgy, hogy a sejtvonalak hatását összehasonlítjuk a TCF-II-t nem tartalmazó kontroll hatásával.

Sejt növekedés gátlás (%) = kontroll OD57Q nm — TCF-Π csoport OD57Q nm kontroll OD570 nm xlOO

HU 212 513 Β

Az eredményeket all. ábra mutatja be. Az eredmények szerint a TCF-II mindkét tumor sejtvonal - BG-1 és MCF-7 - növekedését gátolja.

5. példa

Az 1. példa szerint előállított TCF-II glükoprotein indukciós hatása a HL-60 promielocita leukémia sejtvonal sejtjeinek differenciálódására HL-60 sejteket (ATCC CCL240, Natúré, 270, 347349, 1977) szuszpendálunk 10% fetális marha szérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban 3,5x1ο⁵ sejt/ml sűrűségben. Lapos fenekű 96 tartályos mikrotitráló lemez (Falcon) tartályaiba 100-100 ml sejt-szuszpenziót mérünk be. Ezután az ugyanezen táptalajjal készült TCF-Π oldatból 100 μΐ-eket mérünk a sejt-szuszpenziót tartalmazó tartályokba úgy, hogy végső koncentrációja 15,6, 62,5, 125,250,500 és 1000 ng/ml legyen.

A sejteket 37 *C-on 3 és 7 napon át tenyésztjük és a TCF-Π HL-60 sejtekre gyakorolt sejt-differenciálódást indukáló hatását nitro-kék-tetrazolium (NBT = nitroblue-tetrazolium) redukciós módszerrel határozzuk meg. Ezenkívül megfigyeljük a sejtek morfológiai változását.

(1) NBT redukáló képesség

Az NBT redukáló képességet a 7. táblázat mutatja be.

7. táblázat

TCF-Π koncentráció (ng/ml)	NBT redukáló képesség (%) Tenyésztési napok
3	7
0	7,4	11,7
15,6	10,6	20,4
62,5	11,1	24,5
125	12,4	28,3
250	16,9	45,2
500	12,4	29,6
1000	12,1	26,8

A 7. táblázat adatai a kék-fekete formazán lerakódást tartalmazó sejtek százalékát (2 kísérlet átlagában) képviselik, ha legalább 200 sejtet számoltunk le.

(Ha a HL-60 sejtek normál sejtekké differenciálódnak, NBT redukáló képességet nyernek és kék-fekete formazán halmozódik fel bennük.)

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TCF-II megindítja a HL-60 promielocita leukémai sejtvonal differenciálódását, és hogy a differenciálódás indukciójának 250 ng/ml-nél van a legnagyobb aktivitása.

(2) Morfológiai változás

Ismeretes, hogy a HL-60 sejtek két úton differenciálódnak makrofágokká és granulocitákká a differenciálódást indukáló faktorok révén.

A TCF-II-vei 37 ’C-on 7 napon át tenyésztett sejtek morfológiájának és sejtmagjának változásait Giemsa festési módszerrel [Wright, J. H., J. Med. Research, 7., 138. (1902.)] vizsgáltuk. Az eredmények arra utaltak, hogy a HL—60 sejtek granulocita-szerű sejtekké differenciálódtak.

6. példa

Az 1. példa szerint előállított TCF-II glükoprotein stimuláló hatása a sejtes immunitásra

Ha kevert limfocita tenyésztést végzünk TCF-II jelenlétében, megfigyelhető, hogy a TCF-II hatással van a limfociták blasztos transzformációjára.

A limfocitákat humán perifériás vérből izoláljuk Ficall-Conray módszerrel [Boyum A., Scand. J. Clin. invest., 21., 77. (1968.)] és 10% FCS tartalmú RPMI 1640 táptalajban szuszpendáljuk. Két személy limfocitáit keverjük 1:1 arányban és gömbölyű fenekű 96 tartályon mikrotitráló lemezek tartályaiba mérünk a keverékből lxlO⁵ sejt/100 μΐ/tartály mennyiséget. A tartályokhoz különböző koncentrációjú TCF-Π oldatot kapunk és a sejteket 10% FCS tartalmú RPMI 1640 táptalajban tenyésztjük, CO₂ inkubátorban. A tenyésztés befejezése előtt 16 órával 0,25 pCi/tartály mennyiségű ³H-timidint adagolunk. A tenyésztés végén a sejteket egy sejt-arató (cellharvester) készülékkel aratjuk le és PBS-sel mossuk. A sejtekbe beépült ³H-timidin radioaktivitását szcintillációs számlálóval határozzuk meg.

Az eredményeket a 12. és 13. ábrán mutatjuk be. Amint ez a 12. ábrán látható, a tenyésztés 5. napján a TCF-II nem mutat stimuláló hatást, de - mint ahogy ezt a 13. ábra mutatja - a 8. napon, összehasonlítva a kontrollal, a ³H-timidin beépülését jelentősen stimulálja a TCF-II jelenléte. Az eredmények area utalnak, hogy a TCF-II stimulálja a citotoxikus T sejtek növekedését, azaz a TCF-II hatása erősíti a sejtes immunitást.

7. példa

Az 1. példa szerint előállított TCF-II glükoprotein stimuláló hatása a vaszkuláris endoteliális sejt növekedésére

Teszt sejtekként humán köldök-véna endoteliális sejteket (HUVEC = humán umbilical endothelial cell) használunk (beszerezhető a Clonetics Corporation-től). Az endoteliális sejteket (HUVEC) 2% fetális marha szérumot tartalmazó E-GM táptalajban szuszpendáljuk 2,5x1ο⁴ sejt/ml sűrűségben. Lapos fenekű 96 tartályos mikrotitráló lemezek (Falcon) tartályaiba 50 μΐ-eket mérünk a sejt szuszpenzióból. Ezután a tartályokhoz 50-50 μΐ TCF-Π oldatot adunk, amelyet azonos táptalajjal készítünk úgy, hogy a végső koncentráció 0, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 és 1000 ng/ml legyen. A sejteket 37 ’C-on 6 napon át tenyésztjük CO₂ inkubátorban. Tenyésztés után minden tartálytól eltávolítjuk a táptalajt és a sejteket óvatosan mossuk PBS-sel. A sejteket tripszines kezeléssel távolítjuk el a tartályokból és az élősejt számot haemacitometerrel állapítjuk meg.

A 14. ábra mutatja be a TCF-II hatását humán normál vaszkuláris endoteliális sejtekre. Az eredmé14

HU 212513 Β nyékből látható, hogy a TCF-II nem mutat citotoxikus aktivitást a normál sejtekkel szemben, de növekedésükre stimulálólag hat. A sejt növekedésére gyakorolt stimuláló hatás 125 pg/ml koncentrációnál volt maximális.

8. példa

TCF-II 20 pg

Humán szérum albumin 100 mg

Fenti komponenseket 0,15 M NaCl tartalmú

0,01 M foszfát pufferben (pH = 7,0; PBS) oldjuk fel és a kapott oldatot 20 ml-re töltjük fel PBS-sel. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

9. példa

TCF-II 40 pg

Tween 80 1 mg

Humán szérum albumin 50 mg

Fenti komponenseket fiziológiás sóoldatban (0,8%os NaCl) oldjuk fel és az oldatot 20 ml-re töltjük fel ugyanezen oldószerrel. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

10. példa

TCF-II 20 μg

Tween 80 2 mg

Szorbit 5 g

Fenti komponenseket PBS-ben oldjuk és a kapott oldatot 20 ml-re töltjük fel PBS-sel. Az oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezáijuk.

11. példa

TCF-II 40 pg

Tween 80 2 mg

Glicin 2 g

Fenti komponenseket fiziológiás sőoldatban (0,8%os NaCl) oldjuk fel és az oldatot 20 ml-re töltjük fel ugyanezen oldószerrel. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

12. példa
TCF-II	40 pg
Tween 80	1 mg
Szorbit	2g
Glicin	1 g
Fenti komponenseket fiziológiás sóoldatban (0,8%-

os NaCl) oldjuk fel és az oldatot 20 ml-re töltjük fel ugyanezen oldószerrel. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

13. példa

TCF-II 40 pg

Szorbit 4 g

Humán szérum albumin 50 mg

Fenti komponenseket PBS-ben oldjuk és a kapott oldatot 20 ml-re töltjük fel PBS-sel. Az oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

14. példa

TCF-II 40 pg

Glicin 2 g

Humán szérum albumin 50 mg

Fenti komponenseket fiziológiás sóoldatban (0,8%os NaCl) oldjuk fel és az oldatot 20 ml-re töltjük fel ugyanezen oldószerrel. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk, 0,22 μ-os szűrőt használva. A sterilizált oldatból 2-2 ml-eket töltünk csőampullákba, majd liofilizáljuk, ezután az ampullákat lezárjuk.

Ipari alkalmazás

A találmány egy új glükoproteint ismertet. A találmány szerinti glükoprotein többek között mint tumor citotoxikus faktor, leukémia sejtvonal differenciálódását indukáló faktor, sejtes immunitást fokozó faktor, vaszkuláris endoteliális sejt növekedési faktor használható és a szokásos módon alkalmazható.

A találmány szerinti glükoprotein ezenkívül biokémiai vagy farmakológiai reagensként is alkalmazható.

Claims (11)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) anti-tumor aktivitás:

gátolja a KB (ATCC CCL17), HeLa (ATCC CCL2),

MCF-7 (ATCC HTB22) és BG-1 humán eredetű tumor sejtek növekedését, citotoxikus aktivitást mutat egér L929 sejtekkel szemben és a Sarcoma 180 (ATCC ΊΊΒ66), Meth A szarkóma (RCB 464) és P-388 (ATCC TIB63) sejtekkel szemben, amelyek egér tumor sejtvonalak, de nem gátolja az IMR-90 (ATCC CCL186) sejtek növekedését, amelyek normál humán sejtek;

1. Eljárás az alábbi fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkező TCF-II glükoprotein előállítására:

a) molekulatömege: SDS gél-elektroforézissel meghatározva nem-redukáló körülmények között 78 000±2000 vagy 74 00012000 redukáló körülmények között egy közös 52 00012000 (A), és egy 30 00012000 (B) vagy egy 26 00012000 (C) molekulatömegű láncot tartalmaz;

b) izoelektromos pontja: 7,4-8,6;

c) hőstabilitása: 10 percig 60’C-on melegítve stabil;

d) pH stabilitás: pH = 6-9 tartományban stabil;

e) szénhidrát lánc: Concanavalin-A (ConA)-Sepharose oszlopra adszorbeálódik;

f) gátolja a KB sejtek, HeLa sejtek és az L-929 sejtek növekedését, de az IMR-90 sejtekét nem;

g) kötődése antitestekkel: citotoxikus aktivitását nem neutralizálja az anti-TNF antitest, az anti-LT antitest és az anti-INF-β antitest;

h) N-terminális aminosav szekvencia: a fent említett B és C lánc az A lánc al-láncait képviselik, az A lánc N-terminálisa blokkolt, a B és C Ián közös N-terminális aminosav szekvenciája:

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thrvagy

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-XMet-Val-Ser-Leu-,

HU 212 513 Β amelyben X nem azonosított aminosavat jelent, azzal jellemezve, hogy

i) humán eredetű fibroblaszt sejteket tenyésztünk, ii) összegyűjtjük a táptalajt, iii) kívánt esetben az összegyűjtött táptalajból elkülönítjük és ultraszűréssel, ioncserélő kromatográfiával, affinitás kromatográfiával és/vagy dialízissel tisztítjuk a glükoproteint. (Elsőbbsége: 1989.03.10.)

2) leukémia sejt differenciálódást indukáló aktivitás: indukálja a HL-60 (ATCC CCL240) humán eredetű leukémia sejtvonal granulocita-szerű sejtekké való differenciálódását;

2. Eljárás az alábbi biológiai hatású glükoproteint tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására:

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükoproteinhez adszorpciógátló proteinként albumint vagy zselatint adunk. (Elsőbbsége: 1990. 03.09.)

3) sejtes immunitást fokozó hatás:

stimulálja a humán citotoxikus T sejtek növekedését;

4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükoproteinhez adszorpciógátló nem-ionos detergensként oxi-etilezett anhidroszorbit-monolaurátot adunk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

4) vaszkuláris endoteliális sejt növekedést stimuláló aktivitás:

stimulálja a humán köldökzsinór véna endoteliális sejtjeit (HUVEC);

5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv e, hogy a glükoproteinhez stabilizálószerként alkalmazott proteinként albumint vagy zselatint adunk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

5) hepatocita növekedést stimuláló aktivitás: kifejlett patkányokon stimulálja a hepatociták növekedését, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított TCF-II glükoproteinhez 0,001-20% mennyiségben egy vagy több proteint vagy nem ionos detergenst mint adszorpciógátló szert és/vagy 0,1-40,0% mennyiségben egy vagy több proteint, szénhidrátot és/vagy aminosavat mint stabilizálószert adunk és gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a glükoproteinhez stabilizálószerként alkalmazott szénhidrátként szorbitot, mannitot vagy xilitet adunk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükoproteinhez stabilizálószerként alkalmazott aminosavként glicint vagy alanint adunk. (Elsőbbsége:

1990. 03. 09.)

8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezt e, hogy a glükoproteinhez adszorpciógátló szerként egy vagy több protein vagy nem-ionos detergens és stabilizálószerként egy vagy több protein, szénhidrát vagy aminosav különböző kombinációit adjuk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

9. Eljárás TCF-II-t kódoló bázis szekvenciát tartalmazó DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy humán fibroblaszt sejtekből mRNS-t izolálunk, az mRNS-ből cDNS-t szintetizálunk, cDNS-tárt készítünk, a cDNS-tárt szűrjük és a TCF-II DNS teljes hosszát klónozzuk. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás a 15. ábra szerinti aminosav szekvenciát kódoló bázis szekvenciát tartalmazó DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körnek megfelelő DNS-t szűrjük. (Elsőbbsége: 1990. 03. 09.)

11. A9. igénypont szerinti eljárás a 15. ábra szerinti aminosav szekvenciát kódoló bázis szekvenciát tartalmazó cDNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körnek megfelelő cDNS-t szűrjük. (Elsőbbsége: 1990.03. 09.)