NO180796B - Fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein, TCF-II, samt cDNA som koder for proteinet - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein, TCF-II, samt cDNA som koder for proteinet.

Glykoproteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som viser cytotoksisk aktivitet mot en rekke tumorcellelinjer men ikke mot normale celler, er en ny tumorcytotoksisk faktor, differensieringsinduserende faktor for leukemiceller, celleimmunologisk stimulerende faktor, karendotelcellevekstfaktor og hepatocyttvekstfaktor. Forbind-elsen er anvendbar som antitumormedikament, antileukemimedikament, celleimmunologisk stimulerende medikament, sårhelende medikament, leverregenererende medikament osv., eller som biokjemisk eller farmakologisk reagens.

Bakgrunn for oppfinnelsen

p-interferon er en representant for biologisk aktive faktorer som f.eks. den tumorcytotoksiske faktor som produ-seres av fibroblaster av human opprinnelse. Denne er et glykoprotein som utskilles av fibroblastene når cellene etter dyrking høstes og stimuleres med poly I-poly C eller sendai-virus. Det er klarlagt at proteinet har en rekke fysiologiske aktiviteter i tillegg til sin antivirus- eller antitumorvirkning. Et tumorcytotoksisk glykoprotein kalt CBF fra fibroblaster er beskrevet i japansk publisert patentsøknad nr. 58146293. En tumorvekstinhiberende faktor (INF) med en mole-kyl vekt i området 35.000 til 45.000 renset fra dyrkingsmediet fra fibroblaster erholdt fra humant vev er beskrevet i japansk publisert patentsøknad nr. 671-33120. Videre er et tumor-nekrosefaktorlignende stoff renset fra dyrkingsmedium fra fibroblaster, en nekrosefaktor fra fibroblaster, FNF, og et biologisk aktivt stoff med cytotoksisk aktivitet produsert av dyrefibroblastceller, med en molekylvekt på mellom 40.000 og 50.000 og et isoelektrisk punkt på 5,0 ± 0,5 beskrevet i henholdsvis japansk publisert patentsøknad nr. 61-56131, japansk publisert patentsøknad nr. 61-1872 og japansk publisert patentsøknad nr. 62-103021. Videre er den fullstendige aminosyresekvens og cDNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen til en tumorcytotoksisk faktor erholdt fra dyrkingsmediet fra

fibroblaster av human opprinnelse, med en molekylvekt på 36.000 ± 1.000 og et isoelektrisk punkt høyere enn 10,5 beskrevet i japansk publisert patentsøknad nr. 64-10998.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnerne har undersøkt et biologisk aktivt stoff som forefinnes i dyrkingsmediet fra fibroblaster av human opprinnelse og har funnet et glykoprotein med en rekke biologiske aktiviteter som skiller seg fra tidligere beskrevne stoffer med hensyn til molekylvekt, isoelektrisk punkt osv.

Hovedhensikten med foreliggende oppfinnelse er følge-lig å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein, TFC-II, med de følgende fysikalsk-kjemiske egenskaper: a) molekylvekt: ved molekylvektbestemmelse ved SDS-gelelektroforese 78.000 ± 2.000 eller 74.000 ± 2.000 under ikke-reduserende betingelser, og med et fellesbånd A med molekylvekt 52.000 ± 2.000 og enten bånd B med molekylvekt 30.000 ± 2.000 eller bånd C med molekylvekt 26.000 ± 2.000 under reduserende betingelser,

b) isoelektrisk punkt: 7,4 til 8,6,

c) varmestabilitet: stabilt ved oppvarming ved 60 °C

i 10 minutter,

d) pH-stabilitet: stabilt i pH-området 6 til 9,

e) karbohydratkjede: adsorberes til en "Concanavalin

A (Con A)-Sepharose"-kolonne,

f) biologisk aktivitet: hemmer veksten av KB-celler, HeLa-celler og L-929-celler, men ikke IMR-90-celler, g) reaktivitet med antistoffer: den cytotoksiske aktivitet nøytraliseres ikke av anti-TNF-antistoff, anti-lymfotoksinantistoff og antiinterferon-p-antistoff, h) N-terminal aminosyresekvens: bånd B og bånd C nevnt ovenfor er underkjeder av bånd A, den N-terminale aminosyre i bånd A er blokkert, bånd B og bånd C har en felles N-terminal aminosyresekvens som følger: Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr- eller

Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-X-Met-Val-Ser-Leu-

hvor X står for en ikke-identifisert aminosyre, kjennetegnet ved at fibroblaster av human opprinnelse dyrkes i et konvensjonelt celledyrkingsmedium, dyrkingsmediet oppsamlet og det ønskede glykoprotein TFC-II renses fra dyrkingsmediet ved konsentrer ing, ionebytterkromatograf i, HPLC og affinitetskromatografi .

I tillegg til egenskapene beskrevet ovenfor (a-h) har TCF-II fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse følgende egenskaper:

i. Aminosyresammensetning: Etter hydrolyse med HC1 kan følgende aminosyresammensetning påvises:

Videre ble den fullstendige primærsekvens for TCF-II fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse utledet fra dens komplementær-DNA (cDNA). TCF-II-cDNA ble klonet ved screening av et cDNA-bibliotek fremstilt fra mRNA renset fra total-RNA ekstrahert fra humane embryonale fibroblastceller (IMR-90) ved følgende fremgangsmåte: (1) Ekstraksion av poly ( A)*- RNA fra IMR- 90- celler

Total-RNA ble fremstilt ved guanidintiocyanat-cesium-kloridmetoden (Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)) fra 2 x IO<8>IMR-90-celler som ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DME) med 5 % serum fra nyfødte kalver (NBCS). IMR-90-cellene ble oppslemmet i 28 ml 6 M guanidintiocyanat med 5 mM natriumsitrat, 0,5 % sarkosyl og 0,1 M p-merkaptoetanol og homogenisert. 4 ml 5,7 M cesiumklorid med 0,1 M EDTA ble plassert i sentrifugerør av polyallomer. 7 ml av homogenatet ble overlagt cesiumkloridløsningen og så sentrifugert ved 35.000 rpm ved 20 °C i 16 timer i en Beckman-sentrifuge med en 40TI-rotor. Etter sentrifugeringen ble bunnfallene vasket to ganger med 95 % etanol og løst i 200 ul 10 mM tris-HCl (pH 7,5) med 1 mM EDTA ved oppvarming ved 65 "C i 5 minutter. Dette utgjør total-RNA-løsningen. Poly (A)<+->RNA ble renset fra total-RNA ved hjelp av kromatografi på en oligo(dT)-cellulose-kolonne. Total-RNA-løsningen ble satt på en oligo(dT)-cellu-losekolonne ekvilibrert med 10 mM tris-HCl (pH 7,4) med 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl og 0,05 % SDS. Adsorbert materiale ble eluert med 10 mM tris-HCl, pH 7,4, med 1 mM EDTA og 0,05 % SDS og betegnet som poly (A)<*->RNA-løsningen.

(2) cDNA- syntese

Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert med poly (A )+-RNA fra (1) som templat ved hjelp av et cDNA-syntesesett (Pharmacia Co. Ltd.) og ble påsatt EcoRI-adaptorer. Syntesen ble ut-ført i henhold til protokollen fra Pharmacia Co. Ltd., bort-sett fra at revers transskriptase (40 enheter/reaksjonsbland-ing, Life Science Co. Ltd.) erholdt fra ikke-sfærisk sykdoms-virus fra benmarg hos fugl ble tilsatt for syntese av enkelt-trådet DNA.

(3) Fremstilling av cDNA- bibliotek

Den cDNA som ble oppnådd under (2) ble innsatt i EcoRI-armer fra fagvektor X gtlO. 3,3 ug cDNA syntetisert fra poly (A)<+->RNA ble løst i 150 ul kolonnebuffer: 66 mM tris-HCl (pH 7,6) med 1 mM spermidin, 10 mM magnesiumklorid, 15 mM di-tiotreitol og bovint serumalbumin (0,2 mg/ml). 5,2 ul av denne løsning ble blandet med 1 ug X gtlO EcoRI-arm og så felt med etanol. Rekombinant fag-DNA inneholdende k gtlO og cDNA ble fremstilt som følger: Bunnfallet ble løst i 9 ul kolonnebuffer og inkubert ved 16 °C over natten etter tilsetning av 1 ul 10 mM adenosintrifosfat og 1 ul T4-DNA-ligase (350 en-heter/ul ).

(4) Screening av cDNA- biblioteket

(i) Fremstilling av oligonukleotidprobe

For fremstilling av probe ble en blanding av komple-mentære 17-mere oligonukleotider (384 forskjellige sekvenser i blanding) tilsvarende aminosyresekvensen fra Val<1>til Pro<6>i den N-terminale aminosyresekvens til TCF-II-p-kjede syntetisert og merket i 5'-ende med T4 polynukleotidkinase (Takara Shuzo) og [y-<32>P]ATP(Amersham, Co. Ltd.). Proben har følgende sammensetning:

Komplementær tråd benyttet som probe:

(384 forskjellige sekvenser i blanding)

(ii) Screening av rekombinante fager

Tilnærmet 500.000 fag-"plaques" ble oppnådd ved

in vltro pakking av det rekombinante fag-DNA erholdt under (3) ved hjelp av Gigapack Gold (Stratagene) og infeksjon av E. coil C600hfl. Etter adsorpsjon av disse "plaques" til Hybond-N-filtre (Amersham) ble de denaturert med alkali, nøytralisert og bakt ved 80 °C i 2 timer. Hybridisering ble utført ifølge metoden til Bell et al. (Nature 310, 775-777, 1984). Den første screening ble utført ved hjelp av den blandede probe erholdt under (1). En klon som kunne inneholde TCF-II-fragment ble funnet blant de positive "plaques" påvist ved den første screening.

(5) Kloning av fullengde- cDNA for TCF- II

De interne aminosyresekvenser (i énbokstavkode) (a) NYMGNLSQTRSGL og (p) TSXSVYGWGYTGLINYDGLL (X: ikke identifisert) ble erholdt fra henholdsvis a- og p-kjeder av TCF-II ved kutting med lysylendopeptidase og påfølgende kartlegging av deres fragmenter. Den N-terminale aminosyresekvens for p-kjeden av TCF-II samsvarte med den for p-kjeden av en av de humane hepatocyttvekstfaktorer (hHGF). Videre finnes de ovenfor nevnte interne aminosyresekvenser (a) og (p) fra TCF-II i henholdsvis a- og p-kjedene hos begge hHGF. Det antas følgelig at TCF-II uttrykkes fra et medlem av en familie av hHGF-gener. Miyazawa et al. (BBRC 163, 967-973 (1989)) og Nakamura et al.

(Nature 342, 440-443 (1989)) har beskrevet cDNA for hHGF fra henholdsvis placenta- og lever-cDNA-biblioteker.

Sammenligning av de fullstendige primærsekvenser utledet for de to hHGF-cDNA viste aminosyreforskjeller i 14 posisjoner i sekvensene. Dette antyder forekomsten av en familie av hHGF-gener. Regioner som var identiske i hHGF-cDNA av placentatype og levertype, ble valgt som primersekvenser for polymerasekjedereaksjon (PCR). Oligonukleotider fra det 5' og 3' ikke-kodende område som var identiske i de to hHGF-cDNA, ble kjemisk syntetisert og TCF-II-cDNA screenet ved PCR med disse som primere. Sal-77-primer, som har et kløvingssete for restriksjonsenzymet Sali, og Sph2203-primer, som har et kløv-ingssete for restriksjonsenzymet SphI, ble syntetisert ved hjelp av en DNA-syntesemaskin (Applied Co. Ltd.). Disse primere hadde følgende sekvens:

Kloning med PCR-metoden ble utført som følger:

Etter sammenblanding av løsningene ovenfor i et

0,5 ml mikrosentrifugerør og overdekking av væskeoverflaten med 100 ul mineralolje (Sigma Co. Ltd.) ble PCR utført i "Quick Thermo System" (Japan Genetics Co. Ltd.). Etter for-behandling ved 94 "C i 7 minutter ble en tretrinns reaksjon bestående av annealing-reaksjon ved 55 °C i 3 minutter, poly-mer asereaksj on ved 72 °C i 2 minutter og denatureringsreaksjon ved 94 °C i 2 minutter gjentatt 35 ganger. Reaksjonsblandingen ble så oppvarmet ved 55 °C i 3 minutter og deretter ved 72 °C i 11 minutter, hvoretter den ble tilbakeført til romtemperatur (hvert tidsrom innbefatter tiden for temperaturforandring). Ved analyse av en del av reaksjonsblandingen ved agarosegelelektroforese ble et DNA-fragment på tilnærmet 2,3 kilobaser (kb) som ble antatt å være det tilsiktede TCF-II-cDNA påvist. DNA fra fire rør med reaksjonsblandingen beskrevet ovenfor ble så felt med etanol og kuttet med restriksjonsenzymene Sali og Sphl. Etter agarosegelelektroforese ble et DNA-fragment på tilnærmet 2,3 kb erholdt ved hjelp av DE81-papir (Whatman Co. Ltd.).

(ii) Subkloning

DNA-fragmentet på 2,3 kb fordøyd med restriksjonsenzymene Sali og Sphl erholdt under (1) ble satt inn i et vektorfragment erholdt ved kutting av plasmidvektoren pUC18 (Japan Gene Co. Ltd.) med restriksjonsenzymene Sali og Sphl ved hjelp av et ligeringssett (Takara Shuzo) og transfektert inn i Escherichla coli DH5a (i henhold til protokollen fra BRL Co. Ltd.). Mer enn 20 subkloner ble erholdt.

(iii) Bestemmelse av basesekvenser

Basesekvensene til de oppnådde subkloner ble bestemt ved dideoksymetoden (Sequenase Ver. 2.0, Toyobo). Nukleotider inkorporert feilaktig av Ampli Taq (Takara Shuzo) ble korri-gert ved analyse av basesekvensen til flere subkloner. Basesekvensen til TCF-II-cDNA oppnådd ved metoden gitt ovenfor og aminosyresekvensen utledet fra basesekvensen er vist i fig. 15. Den består av 2.172 basepar (bp) fra transskripsjons-initieringskodonet ATG til termineringskodonet TAG. Oversatt til aminosyrer består TCF-II av 723 aminosyrer. Aminosyresekvensen fra det første metionin (Met<1>) til det 29. alanin (Ala<29>) antas å være en signalsekvens. Som vist i fig. 15 syntetiseres TCF-II, som består av en a-kjede og en p-kjede sammenbundet med disulfidbroer, i utgangspunktet som en enkelt kjede. Da den N-terminale aminosyre i a-kjeden fra TCF-II var blokkert, ble den ikke identifisert. Den N-terminale aminosyresekvens til p-kjeden og noen få interne aminosyresekvenser i TCF-II ble imidlertid bestemt som beskrevet ovenfor og er vist i fig. 15.

Den erholdte basesekvens for TCF-II-cDNA er svært lik den til hHGF som er beskrevet av Miyazawa et al. (Biochemical and Biophysical Research Communication 163, 967-973 (1989)). I TCF-II-cDNA deleterer imidlertid fem aminosyrerester (F-L-P-S-S) fra Phe1<62>til Ser<166>i aminosyresekvensen til hHGF. Det kan følgelig slås fast at TCF-II-cDNA er et nytt medlem av familien av hHGF-gener. Sammenligningen mellom aminosyresekvensen til TCF-II dedusert fra den ovenfor beskrevne basesekvens og aminosyresekvensen til hHGF (Miyazawa et al.) er vist i fig. 16.

Fremgangsmåten for å tilveiebringe det nye glykoprotein TCF-II,karakterisert vedde ovenfor nevnte fysikalsk-kjemiske egenskaper, er beskrevet i det følgende.

Enhver fibroblast av human opprinnelse kan benyttes ved fremstillingen ifølge foreliggende oppfinnelse. Humane embryonale, lungederiverte fibroblastceller, humane embryonale, nyrederiverte fibroblastceller og humane embryonale, forhudderiverte fibroblastceller osv. kan nevnes som an-vendbare celler. I utførelsen av foreliggende oppfinnelse foretrekkes IMR-90-celler (ATCC, CCL 186) og WI-38-celler (ATCC, CCL 75) og lignende celler.

Disse celler dyrkes i serumanriket medium eller serumfritt medium som vanligvis benyttes for cellekulturer. Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 5 % bovint kalveserum kan nevnes som et representativt medium. Aminosyrer, transferin, fettsyrer og hormoner som insulin osv. kan tilsettes hvis nødvendig.

Ved dyrking av cellene kan stasjonære kulturer i T-flasker eller lignende, suspensjonskulturer med mikrobærere og kontinuerlige kulturer i hule fibrer eller keramiske bærere benyttes. Det foretrekkes at dyrkingen utføres i en atmosfære med 5 % C02ved 20-37 °C, og at mediet skiftes hver 2. eller hver 3. dag. Etter at celletettheten har oppnådd sitt maksi-mum, skiftes mediet hver 7. til hver 10. dag, og dyrkingsmediet oppsamles. Det ønskede glykoprotein renses fra de samlede dyrkingsmedier.

De samlede dyrkingsmedier konsentreres ved ultrafilt-rering (UF) med en membran med en porestørrelse på m.w. 6000. Det ønskede glykoprotein i UF-konsentratet adsorberes til kationbytterharpikser og elueres fra harpiksene med en buffer som inneholder 0,3-0,6 M NaCl. "CM Sephadex C-50" (Pharmacia) kan nevnes som et eksempel på en slik ionebytterharpiks. Fraksjonene med sterk cytotoksisk aktivitet slås sammen, hvoretter affinitetskromatografi rettet mot glykoproteiner utføres. "Con A-Sepharose" er spesielt anvendbar til affinitetskromatografi av det ønskede glykoprotein. Affinitetskolonnen ekvilibreres med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,5 M NaCl, og fraksjonen nevnt ovenfor settes på kolonnen. Etter vask av kolonnen med ekvilibreringsbuffer elueres det aktive stoff fra kolonnen med en elueringsbuffer som inneholder karbohydrat som tilsvarer karbohydratkjeden bundet til glykoproteinaffinitetskolonnen (eller gelen). Ved benyttelse av den ovenfor nevnte "Con A-Sepharose" elueres det aktive stoff med en buffer som inneholder a-metyl-D-mannopyranosid. Den eluerte aktive fraksjon dialyseres mot vann og frysetørkes. Det frysetørkede aktive stoff løses i 0,05 M tris-HCl, pH 6,0-7,0, med 0,2 M NaCl og renses videre ved HPLC med en sterk kationbytterkolonne. "Mono S" (Pharmacia) er spesielt anvendelig som den sterke kationbytterkolonne. Eluering av det aktive stoff fra "Mono S"-kolonnen utføres med en gradient fra 0 til 1,0 M NaCl, og de aktive fraksjoner samles.

Det ønskede aktive stoff elueres ved en saltkonsentrasjon fra 0,6 til 0,9 M. Den således erholdte aktive fraksjon renses videre ved affinitetskromatografi på "Heparin-Sepharose" (Pharmacia). Eluering av det aktive stoff fra "Heparin-Sepharose"-kolonnen utføres med en gradient fra 0,3 til 2,0 M NaCl, det ønskede stoff elueres ved en saltkonsentrasjon på mellom 1,0 og 1,5 M. Analyser for cytotoksisk aktivitet av TCF-II mot L929-18-celler fra mus og for vekststimulerende aktivitet av TCF-II mot hepatocytter beskrives nedenfor.

Analyse av cytotoksisk aktivitet

L929-celler fra mus (ATCC, CCL 1) ble subklonet, og en subklon med den høyeste sensitivitet for TCF-II fra foreliggende oppfinnelse ble utvalgt. Slik ble klonen L-929-18 med høy sensitivitet mot den tumorcellecytotoksiske faktor erholdt . L-929-18-celler ble dyrket til konfluens i DMEM med 10 % FCS, hvoretter cellene ble høstet ved trypsinbehandling. Cellene ble oppslemmet i DMEM med 10 % FCS og 1 ug/ml aktino-mycin D ved en celletetthet på 6 x 10<5>celler/ml. 50 pl DMEM med de samme tilsetninger som cellesuspensjonen ble utpipettert i hver brønn i en 96-brønners mikroplate (Falcon), og 50 ul prøveløsning med stoffet TCF-II løst i DMEM med de samme tilsetninger ble tilsatt den første fortynningsbrønn. Etter grundig blanding ble 50 ul av blandingen tilsatt den neste fortynningsbrønn. Seriefortynnet stoff ble oppnådd ved å gjen-ta fremgangsmåtene ovenfor. 50 ul cellesuspensjon ble inokulert i hver brønn med seriefortynnet stoff og dyrket ved 37 "C i 2 dager i en C02-inkubator. Etter dyrkingen ble mediet skånsomt fjernet og cellene vasket to ganger med fysiologisk saltvann. De levedyktige celler som var festet til hver brønn ble fiksert og farget ved tilsetning av 50 ul 0,5 % krystallfiolett i en blanding av metanol og vann (1:4) til hver brønn. Hver brønn ble vasket tre ganger med destillert vann og tørket, hvoretter krystallfiolett i hver brønn ble ekstrahert med Sorensons buffer (en blanding av 6,1 ml 0,1 M dinatriumsitrat, 3,9 ml 0,1 N HC1 og 10 ml etanol). Absorbansen ved 570 nm av ekstraktene ble bestemt i et spektrofotometer for mikrotiterplater.

Én enhet av TCF-II (u/ml) ble definert som det for-tynnelsesforhold som gir 50 % celledød.

Analyse av hepatocvttvekststimulerende aktivitet

Hepatocytter ble erholdt fra Wistar hannrotter ifølge fremgangsmåten til Seglen (Method in cell biology, Vol. 13,

s. 29, Academic Press, New York, 1976). De erholdte hepatocytter ble inokulert i 24-brønners plastbrett (Falcon) ved en celletetthet på 8,8 x IO<4>celler/0,5 ml/brønn og dyrket i nærvær av 5 % C02ved 37 °C. Williams E-dyrkingsmedium (Flow Laboratory) tilsatt 10 % føtalt bovint serum (Hyclone),

100 u/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin ble benyttet som dyrkingsmedium (forkortet nedenfor som basalt dyrkingsmedium). Etter dyrking ved 37 °C i 24 timer ble dyrkingsmediet utbyttet med basalt dyrkingsmedium som inneholdt analyseprøvene.

Hepatocyttene ble dyrket videre i 24 timer og så inokulert i basalt dyrkingsmedium med 4 uCi/ml (86 Ci/mmol)<3>H-thymidin (Amersham) i 2 timer, hvoretter DNA-syntese ble bestemt. Ved merking av hepatocyttene med<3>H-thymidin ble inkorporerte tellinger (dpm) bestemt som forskjellen i tellinger (dpm) målt 1 nærvær og fravær av 10 mM hydroksyurea for hver analyse-gruppe. Etter merking av cellene som beskrevet ovenfor ble cellene vasket to ganger med kald PBS, 2 % perklorsyre og 95 % etanol og lufttørket og deretter løst i 0,8 ml 2 % SDS med 2 mM EDTA og 20 mM NaHC03, fulgt av radioaktivitetsmåling i en flytende scintillasjonsteller.

Resultatet er vist i tabell 1.

hEGF (Wakunaga Pharmacy Co. Ltd.) ble benyttet som positiv kontroll for hepatocyttvekststimulerende aktivitet. Resultatene i tabell 1 viser at den hepatocyttvekststimulerende aktivitet av TCF-II er høyere enn den av hEGF.

Den biologisk aktive faktor TCF-II fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har følgende farmasøytiske aktiviteter :

1. Antitumoraktivitet:

TCF-II hemmer veksten av KB, HeLa, MCF-7 og BG-1, som alle er tumorceller av human opprinnelse, og viser cytotoksisk aktivitet overfor L-929-celler fra mus og mot tumorcellene sarcoma 180, Met A sarcoma og P388, men hemmer ikke veksten av IMR-90-celler som er normale celler av human opprinnelse.

2. Differensieringsinduserende aktivitet mot

leukemiceller:

TCF-II induserer differensiering av leukemicelle-linjen HL-60 til granulocyttlignende celler.

3. Celleimmunologisk stimulerende aktivitet:

TCF-II stimulerer vekst av humane cytotoksiske T-celler. 4. Karendotelcellevekststimulerende aktivitet: TCF-II stimulerer vekst av endotelceller erholdt fra blodkar i human navlesnor.

5. Hepatocyttvekststimulerende aktivitet:

TCF-II stimulerer vekst av hepatocytter fra voksen rotte.

Disse aktiviteter kan påvises ved svært små doser i området fra 1 til 1000 ng/ml.

TCF-II fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan ventelig anvendes i farmasøytiske produkter som antitumormedikament, antileukemimedikament, celleimmunologisk stimulerende medikament, sårhelende medikament og terapeutisk medikament mot leversykdom, innbefattet leverregenererende medikament osv.

Resultater som gjelder de farmakologiske aktiviteter av TCF-II vist i det følgende.

In vivo analyse av antitumoraktivitet mot sarcoma 180 av det nve humane cvtokin TCF- II

Materialer og metoder

1. Forsøksdyr

7 uker gamle ICR-hunnmus ble erholdt fra Charles River Japan Inc.

2. Tumorcellelini er

Sarcoma 180-celler ble erholdt fra National Cancer Center og videredyrket i mus én gang pr. uke i dette labora-torium.

3. Analyseprøver

Analyseprøver ble fremstilt ved å løse TCF-II i

0,01 M fosfatbuffer, pH 7,0, med 0,8 % NaCl, 0,01 % "Tween 80" og 0,25 % humant serumalbumin. To serier testprøver bestående av 0,2 ug TCF-II/0,2 ml og 1,0 ug TCF-II/0,2 ml ble fremstilt. For analyse av virkningen av pyrogener ble en analyseprøve (940 pikogram pyrogen/0,2 ml) som inneholdt standardpyrogen (Difco Inc.), som tilsvarer mengden pyrogen i 1 ug TCF-II, også fremstilt.

4. Analyse av akutt toksisitet

Analyse av akutt toksisitet ble utført i to muse-grupper. To doser 10 ug TCF-II/mus og 20 ug TCF-II/mus ble tilført ved injeksjon i musens halevene. Toksisiteten ble beregnet ut fra dyrenes dødelighet.

5.Antitumoranalyse

Antitumoranalyse ble utført med 7 mus pr. gruppe. Sarcoma 180 (IO<6>celler/mus) ble implantert under huden til ICR-mus. Musene ble delt i analysegrupper og analyseprøvene injisert i halevenen hver dag i 7 dager. Den hemmende virkning på tumorvekst ble bestemt fra hemmings-forholdet ( C- T x 100 %) beregnet fra den gjennomsnittlige

C

tumorvekt (MTW) i de injiserte grupper relativt til kontrollgruppen .

Analyseresultater

1.Analyse for akutt toksisitet

Toksisitet ble ikke påvist i doser på 10 ug og 20 ug TCF-II/mus.

2. Antitumoranalyse

Resultatene 3 uker etter injeksjonsstart er vist i tabell 4.

Da den optimale dose av TCF-II var ukjent, ble analyser ikke utført med tilpassede doser i analysen beskrevet ovenfor. Fra disse resultater ble det imidlertid funnet at en lav dose, snarere enn en høy dose, var mest effektiv.

Videre ble antitumorvirkning ved direkte injeksjon i tumoren undersøkt ved følgende fremgangsmåte.

Metoder

Sarcoma 180 (lx 10<6>celler/mus) ble implantert under huden hos ICR-mus. Mus med etablerte faste tumorer ble utvalgt 1 uke etter implantasjonen. 0,2 ug TCF-II ble injisert én gang pr. dag i 7 dager. Ved observasjon 2 uker etter avsluttet

injeksjon ble en bemerkelsesverdig antitumorvirkning som for-

årsaket nekrose av tumorområdet, som skiftet farge til svart, observert. Videre ble det påvist mus i hvilke tumoren hadde forsvunnet.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser elueringsprofiler for TCF-II og plasminogenaktivator fra dyrkingsmediet fra IMR-90-celler med 5 % kalveserum ved kromatografi på "CM-Sephadex C-50". (1) og (2) viser fraksjonene eluert med henholdsvis 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,3 M NaCl, og med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,6 M NaCl.~0~. _#_09 -3~viser henholdsvis absorbans ved 280 nm, plasminogenaktivatoraktivitet og cytotoksisk aktivitet mot L929-18-celler.

Fig. 2 viser resultater etter Con A-affinitetskromatografi av TCF-II-fraksjonen eluert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,6 M NaCl ved "CM-Sephadex C-50"-kromatografi av dyrkingsmediet fra IMR-90-celler. (1) og (2) viser henholdsvis fraksjonene oppnådd ved vasking med 0,05 M tris- HC1, pH 7,0, med 0,5 M NaCl og fraksjonene eluert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,5 M NaCl og 0,3 M a-metyl-D-mannopyranosid. -#- og~3~angir henholdsvis absorbans ved 280 nm og cytotoksisk aktivitet. Fig. 3 viser elueringsmønster ved "Mono S"-HPLC av TCF-II-fraksjonen oppnådd ved "Con A-Sepharose"-affinitetskromatografi. -O"angir cytotoksisk aktivitet. Fig. 4 viser elueringsprofilen av TCF-II ved "Heparin-Sepharose"-affinitetskromatografi av eluatet fra "Mono S"-HPLC. (1) og (2) angir henholdsvis fraksjonen oppnådd ved vasking med 10 mM tris-HCl, pH 7,5, med 0,3 M NaCl og fraksjonen eluert med en NaCl-gradient fra 0,3 til 2,0 M. -#- og angir henholdsvis absorbans ved 280 nm og cytotoksisk aktivitet. Fig. 5 viser SDS-elektroforese av TCF-II (reduserende og ikke-reduserende).

Fig. 6 viser varmestabiliteten av TCF-II.

Fig. 7 viser pH-stabiliteten av TCF-II.

Fig. 8 viser den cytotoksiske aktivitet av TCF-II mot humane tumorcellelinjer in vitro. Fig. 9 viser den cytotoksiske aktivitet av TCF-II mot sarcoma 180. Fig. 10 viser den cytotoksiske aktivitet av TCF-II mot henholdsvis Met A og P388. -#- og -0_ angir henholdsvis Met A og P388. Fig. 11 viser den cytostatiske aktivitet av TCF-II mot humane tumorcellelinjer. -#- og~0_ angir den cytostatiske aktivitet mot henholdsvis ovariekarsinomcellelinjen Bg-1 og brystkarsinomcellelinjen MCF-7. Fig. 12 og fig. 13 viser virkningen av TCF-II på inkorporering av<3>H-thymidin i lymfocytter i en blandet lymfo-cyttkultur etter henholdsvis dag 5 og dag 8. Seks prøver ble analysert ved henholdsvis dag 5 og dag 8. Resultatene er gitt som middelverdi ± SD. Fig. 14 viser den stimulatoriske virkning av TCF-II på vekst av karendotelceller, HUVEC. Fig. 15 (1) og (2) viser henholdsvis basesekvensen for TCF-II-cDNA og aminosyresekvensen for TCF-II utledet fra basesekvensen. Fig. 16 viser en sammenligning mellom aminosyresekvensen for TCF-II utledet fra den ovenfor nevnte basesekvens og aminosyresekvensen for hHGF beskrevet av Miyazawa et al.

Den foretrukne utførelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er videre beskrevet i eksemplene gitt nedenfor.

Eksempel 1

(1) Dyrking av den humane fibroblastcelle IMR- 90

Celler fra den humane fibroblastcellelinje IMR-90 (ATCC, CCL 186) (3 x 10<6>celler) ble inokulert i 1 liters rulleflasker med 100 ml DMEM med 5 % kalveserum (CS) og ble dyrket i 7 dager under rulling ved 0,5-2 rpm. Ved et celletall på 1 x IO<7>ble cellene høstet ved trypsinbehandling og oppsamlet i bunnen av flasken. Etter tilsetning av 250 ml friskt DMEM med 5 % CS til flasken ble 100 g autoklavert keramikk på 5-9 mesh (Toshiba Ceramic Co. Ltd.) tilsatt flasken med cellesuspensjonen. Stasjonær dyrking ble utført ved 37 °C i 24 timer. 250 ml DMEM med 5 % CS ble så tilsatt flasken (ende-lig mediumvolum 500 ml), og dyrkingen ble fortsatt. Hver 7. til 10. dag ble mediet (tilnærmet 500 ml) oppsamlet og friskt medium (500 ml) tilsatt. Fremstillingen ble fortsatt i 2 måneder på denne måte og 4 1 dyrkingsmedium oppsamlet pr. rulleflaske. Den spesifikke aktivitet i det således erholdte dyrkingsmedium var 32 U/ml.

(2) Rensing av glykoproteinet TCF- II

75 1 dyrkingsmedium beskrevet i (1) ble konsentrert tilnærmet 10 ganger ved UF-konsentrering med et Amicon membranfilter (porestørrelse m.w. 6000). Deretter ble 1,5 kg (våtvekt) "CM-Sephadex C-50" ekvilibrert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, tilsatt det konsentrerte medium og stoffet absorbert til harpiksen ved forsiktig røring ved 4 °C i 24 timer ved pH 6,5-7,0. Etter absorpsjonen ble harpiksen oppsamlet ved filt-rering gjennom et Whatman nr. 2 filterpapir. Den samlede harpiks ble vasket med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0. Tilnærmet 1500 g av den vaskede harpiks ble pakket i en kolonne (7 x 40 cm) og kolonnen eluert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,01 % "Tween 20" og 0,3 M NaCl. Eluering av protein ble fulgt ved absorbans ved 280 nm. Etter tilnærmet fullstendig eluering av protein ble videre eluering ved en saltkonsentrasjon på 0,6 M NaCl utført. Den cytotoksiske aktivitet mot L929-18-celler og aktiviteten av vevsplasminogenaktivator (t-PA) produsert av IMR-90-cellene ble målt i hver fraksjon. Det således oppnådde elueringsmønster er vist i fig. 1. Fraksjonen som ble eluert ved en saltkonsentrasjon på 0,6 M NaCl, viste kraftig cytotoksisk aktivitet. Denne fraksjon ble betegnet TCF-II-fraksjonen. "Con A-Sepharose CL-6B" (Pharmacia) ble så ekvilibrert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,5 M NaCl og gelen pakket i en kolonne (2,5 x 8 cm). Kolonnen ble vasket grundig med samme buffer, hvoretter TCF-II-fraksjonen eluert fra "CM-Sephadex"-kolonnen ble påsatt kolonnen. Etter vask av kolonnen med 10 ganger kolonnevolumet med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,5 M NaCl ble stoffet eluert med 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,5 M NaCl og 0,3 M a-metyl-D-mannopyranosid ved en strømningshas-tighet på 70 ml/time. Eluering av protein ble fulgt ved optisk tetthet ved 280 nm, og den cytotoksiske aktivitet i hver frak sjon ble bestemt. Det således oppnådde elueringsmønster er vist i fig. 2. Den først eluerte fraksjon ble oppsamlet og dialysert mot destillert vann i 48 timer. Den dialyserte fraksjon ble frysetørket, hvorved et hvitt pulver ble erholdt. Det frysetørkede pulver ble løst i et lite volum av 0,05 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,01 % "Tween 20" og 0,2 M NaCl og ble påsatt en "Mono S"-kolonne (Pharmacia) for HPLC ekvilibrert med 0,01 M fosfatbuffer, pH 7,0, med 0,01 % "Tween 20". Etter vask av søylen med 0,01 M fosfatbuffer, pH 7,0, med 0,01 % "Tween 20" i 20 minutter ved en strømningshastighet på 0,5 ml/minutt ble eluering utført med en NaCl-gradient fra 0 til 1,0 M på 60 minutter. Det oppnådde elueringsmønster er vist i fig. 3. Den aktive fraksjon ble eluert ved 0,76 M NaCl. Den aktive fraksjon ble oppsamlet, fortynnet med ekvilibreringsbuffer og påsatt "Mono S"-kolonnen for HPLC igjen. Eluering ble igjen utført med en NaCl-gradient fra 0 til 1,0 M NaCl i den samme buffer. "Heparin-Sepharose" (Pharmacia) ble ekvilibrert med 10 mM tris-buffer, pH 7,0 med 0,3 M NaCl og 5 ml gel pakket på en kolonne (1,0 x 7 cm). Den aktive fraksjon fra "Mono S"-HPLC ble oppsamlet, fortynnet med 0,01 M tris-HCl, pH 7,0, til en NaCl-konsentrasjon på 0,3 M og påsatt den ovenfor nevnte søyle. Deretter ble søylen vasket med 10 ganger søylevolumet av 0,01 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,3 M NaCl. Stoffet ble eluert ved en strømningshastighet på 20 ml/time med en NaCl-gradient fra 0,3 M til 2,0 M i samme buffer. Elueringsmønsteret er vist i fig. 4. På denne måte ble det rensede glykoprotein erholdt. Som vist i tabell 5 ble 0,12 mg av det aktive glykoprotein erholdt med 75 1 dyrkingsmedium som utgangsstoff. Dette glykoprotein var en tumorcytotoksisk faktor med spesifikk aktivitet 5.248.000 U/mg.

De fysikalskkjemiske egenskaper til TCF-II erholdt ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ble bestemt som følger.

1. Molekylvektbestemmelse ved SDS- gelelektroforese

Molekylvekten av TCF-II ble bestemt ved elektroforese i en polyakrylamidgel med 1 % SDS. Glykoproteinet gav to nær hverandre liggende bånd med molekylvekter på henholdsvis 78.000 og 74.000. Ved en tilsvarende elektroforese etter reduksjon av glykoproteinet med 2-merkaptoetanol ble tre bånd med molekylvekter på henholdsvis 52.000, 32.000 og 28.000 observert (fig. 5).

Disse resultater antyder at TCF-II er en heterodimer som består av en felles subenhet med molekylvekt 52.000 og enten en subenhet med molekylvekt 28.000 eller en subenhet med molekylvekt 32.000.

2. Isoelektrisk punkt

Det isoelektriske punkt for stoffet ble bestemt til å ligge mellom 7,4 og 8,55 ved isoelektrisk fokusering i "Phast Gel IEF3-9".

3. Varmestabilitet

TCF-II med aktivitet 51.200 u/ml ble fortynnet med 0,1 M tris-HCl, pH 7,0, med 0,01 % "Tween 20" til en TCF-II-konsentrasjon på 512 u/ml. Løsningen ble behandlet i 10 minutter ved 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 og 95 °C. Den gjen-værende cytotoksiske aktivitet (u/ml) etter behandling ved hver temperatur ble beregnet som aktiviteten i prosent relativt til aktiviteten (u/ml, 100 %) ved 25 °C (kontroll). Som vist i fig. 6 var stoffet stabilt opp til 60 °C.

4. pH- stabilitet

Buffere med 0,01 % "Tween 20" og med sammensetning som vist i tabell 6 ble fremstilt. En mengde TCF-II som svarer til 51.200 u/ml, målt ved pH 8, ble oppløst i hver buffer og inkubert ved 37 °C i 1 time. Aktiviteten i prosent relativt til aktiviteten i en kontroll som fikk stå ved romtemperatur i 1 time, ble bestemt. Som vist i fig. 7 var glykoproteinet stabilt i pH-området 6-9.

5. Den N- terminale aminos<y>resekvens til TCF- II

50 ug TCF-II ble redusert og tre polypeptider, A med molekylvekt 52.000, B med molekylvekt 32.000 og C med molekylvekt 28.000, ble separert ved elektroblotting. Aminosyresekvensen til hvert polypeptid ble bestemt med en Applied Bio-systems 477A proteinsekvensator. Den N-terminale aminosyresekvens til polypeptid A kunne ikke bestemmes da dets N-terminale aminosyre er blokkert. Polypeptidene B og C hadde følg-ende felles N-terminale aminosyresekvens:

hvor X står for en ikke-identifisert aminosyre.

Da polypeptidene B og C viste den samme N-terminale aminosyresekvens, ser TCF-II ut til å ha en dimer struktur i hvilken polypeptid A med molekylvekt 52.000 er bundet til polypeptid B med molekylvekt 32.000 eller til polypeptid C med molekylvekt 28.000 ved S-S-broer.

6. Aminosyresammensetning

10 ug TCF-II, bestemt med et proteinanalysesett fra BioRad, ble hydrolysert med HC1 og aminosyresammensetningen bestemt med en Hitachi aminosyreanalysator, modell L-8500.

Aminosyresammensetningen var som følger.

Eksempel 2

Den cytotoksiske aktivitet mot tumorceller av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 er gitt.

1. Vekstinhibering av tumorceller

De humane tumorcellelinjer HeLa og KB og de normale humane diploide celler IMR-90 ble oppslemmet ved en celletetthet på 1 x IO<5>celler/ml i DMEM med 10 % FCS. 50 ul av hver cellesuspensjon ble utpipettert i hver brønn i en 96-brønners mikroplate (Falcon). 50 pl av henholdsvis 10-, 20-, 40-, 80-og 160-gangers fortynning av en TCF-II-løsning (5.120 u/ml) i DMEM ble tilsatt hver brønn med cellesuspensjon og blandingen dyrket ved 37 °C i 3 dager i en C02-inkubator. De overlevende celler i hver brønn ble fiksert og farget ved tilsetning av 50 pl 0,5 % krystallfiolettløsning i en blanding av metanol og vann (1:4) til hver brønn. Hver brønn ble vasket med destillert vann og tørket og krystallfiolett i hver brønn ekstrahert med Sorensons buffer. Absorbansen av ekstraktene ved 570 nm ble bestemt med et spektrofotometer for mikrotiterplater.

Cellevekstinhibering (%) av TCF-II ble beregnet relativt til kontrollgruppen dyrket i fravær av TCF-II og fremstilt grafisk mot konsentrasjonen av TCF-II. Som vist i fig. 8 viste TCF-II kraftig hemming av veksten av KB- og HeLa-celler mens vekst av de normale celler IMR-90 ikke ble hemmet.

2. Reaksjon med antistoffer mot kjente forbindelser

TCF-II ble løst i DMEM med 10 % FCS ved en konsentrasjon på 320 u/ml. En titer av anti-LT-antistoff som nøytrali-serte 1000 u/ml LT ble tilsatt TCF-II-løsningen og blandingen inkubert ved 37 °C i 1 time. På samme måte ble anti-TNF-antistoff og anti-INF-p tilsatt TCF-II-løsning ved konsentrasjoner på henholdsvis 1 x 10<6>u/ml og 1000 u/ml. Hvert antistoff benyttet i dette forsøk er kommersielt tilgjengelig.

Etter reaksjonene ble den cytotoksiske aktivitet av TCF-II bestemt. Ingen av antistoffene nøytraliserte imidlertid aktiviteten.

Eksempel 3

Den cytotoksiske aktivitet mot en rekke musetumorcellelinjer av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 er vist.

Sarcoma 180-, Met A-sarcoma- og P-388-celler ble benyttet som musetumorcellelinjer.

Sarcoma 180-celler ble oppslemmet i DMEM med 10 % føtalt bovint serum, og Met A- og P-388-celler ble oppslemmet i RPMI 1640-medium med 10 % føtalt bovint serum ved en celletetthet på 2 x 10<4>celler/ml. 50 pl av hver cellesuspensjon ble inokulert i hver brønn i en 96-brønners mikroplate (Falcon). TCF-II ble løst i DMEM med 10 % føtalt bovint serum for sarcoma 180-cellene og i RPMI 1640-medium med 10 % føtalt bovint serum for Met A- og P-388-cellene. 50 pl av TCF-II-løsninger fremstilt slik at sluttkonsentrasjonen av TCF-II var 0, 2, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 og 1000 ng/ml, ble tilsatt brønnene med hver cellesuspensjon. Etter dyrking av hver cellelinje ved 37 °C i 3 dager i en C02-inkubator ble cellene i hver brønn farget med trypanblått og antall levedyktige celler telt i et hemacytometer. Antall levedyktige celler er gitt som middelverdien fra eksperimenter i duplikat. Den cytotoksiske

aktivitet (%) ble beregnet ved hjelp av følgende formel:

Den cytotoksiske aktivitet av TCF-II mot sarcoma 180-celler og mot Met A-sarcoma- og P-388-celler er vist i henholdsvis fig. 9 og fig. 10.

Alle cellelinjer var svært sensitive for TCF-II, og IC50-verdiene for cytotoksisk aktivitet av TCF-II mot sarcoma 180-, Met A- og P-388-celler var henholdsvis 6, 40 og 460 ng/ml.

Eksempel 4

Den hemmende virkning av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 på de humane tumorcellelinjer BG-1 (ovarie-carcinoma) og MCF-7 (brystcarcinoma) er vist i det følgende.

BG-1- og MCF-7-celler ble oppslemmet i henholdsvis McCoy-medium med 10 % FCS og i Eagles MEM med 10 % FCS, en blanding av ikke-essensielle aminosyrer, pyruvat og Eagles salter ved en celletetthet på 2 x 10<*>celler/ml. TCF-II ble oppløst i henholdsvis McCoy-medium med 10 % FCS for BG-1-cellene og i Eagles MEM med 10 % FCS for MC7-cellene og seriefortynnede TCF-II-løsninger fremstilt ved gjentatt to gangers fortynning av 4 ug TCF-II/ml med de samme medier.

50 ul av hver cellesuspensjon ble inokulert i hver brønn i en 96-brønners mikroplate (Falcon). 50 ul seriefortynnet løsning av TCF-II fremstilt for hver cellelinje ble tilsatt brønnene med hver cellesuspensjon. Dyrkingen ble ut-ført ved 37 °C i 5 dager i en C02-inkubator. Etter dyrkingen ble dyrkingsmediet fjernet og cellene vasket skånsomt to ganger med PBS. De overlevende celler festet til hver brønn ble fiksert og farget ved tilsetning av 50 ul 0,5 % krystall-f iolettløsning i en blanding av metanol og vann (4:1) til hver brønn. Hver brønn ble vasket med destillert vann og tørket og krystallfiolett i hver brønn ekstrahert med Sorensons buffer.

Absorbansen ved 570 nm av ekstraktene ble målt med et spektrofotometer for mikrotiterplater. Celleveksthemming (%) relativt til kontrollen dyrket i fravær av TCF-II ble beregnet for hver cellelinje ved hjelp av følgende formel.

Resultatene er vist i fig. 11. Resultatene viser at TCF-II hemmer veksten av de to tumorcellelinjer BG-1 og MCF-7.

Eksempel 5

Den differensieringsinduserende aktivitet av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 overfor celler fra promyelocyttleukemicellelinjen HL-60 er vist.

HL-60-celler ble oppslemmet i RPMI 1640-medium med 10 % føtalt bovint serum ved en celletetthet på 3,5 x 10<5>celler/ml. 100 ul cellesuspensjon ble utpipettert i hver brønn i en 96-brønners flatbunnet mikroplate (Falcon). 100 ul TCF-II -løsning i samme medium ble så tilsatt hver brønn med cellesuspensjon slik at sluttkonsentrasjoner på 15,6, 62,5, 125, 250, 500 og 1000 ng/ml ble oppnådd.

Cellene ble dyrket ved 37 "C i 3 og 7 dager og differensieringsinduserende aktivitet av TCF-II overfor HL-6-celler bestemt ved analyse av reduksjon av nitroblue tetrazolium (NBT). Videre ble morfologiske forandringer av cellene observert.

1) NBT- reduserende evne

Den NBT-reduserende evne er vist i tabell 7.

Verdiene gitt i tabell 7 angir prosent celler som inneholdt blåsvarte formazanavleiringer (gjennomsnitt fra to eksperimenter) etter telling av mer enn 200 celler.

(Når HL-60-celler differensierer til normale celler, erholder de NBT-reduserende evne og vil akkumulere blåsvart formazan intracellulært.)

Dette resultat viser at TCF-II induserer differensiering av promyelocyttleukemicellelinjen HL-60, og at den høyeste differensieringsinduserende aktivitet oppnås ved 250 ng/ml.

2) Morfologisk forandring

Det er kjent at HL-60 kan differensiere både til makrofager og til granulocytter ved behandling med differensieringsinduserende faktorer.

Morfologiske forandringer og kjerneforandringer i cellene som ble dyrket med TCF-II ved 37 °C i 7 dager, ble undersøkt etter lett Giemsa-farging. Resultatet viser at HL-60 differensierte til granulocyttlignende celler.

Eksempel 6

Den celleimmunologisk stimulerende effekt av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 er vist.

Virkningen av TCF-II på blastogen transformasjon av lymfocytter ble undersøkt ved dyrking av blandede lymfocytt-

kulturer i nærvær av TCF-II.

Lymfocytter ble isolert fra humant perifert blod ifølge metoden til Ficall-Conray og oppslemmet i RPMI 1640 med 10 % FCSI. Lymfocytter fra to personer ble blandet i forholdet 1:1 og utpipettert i brønner i 96-brønners rundbunnete mikro-plater med 1 x 10<5>celler/100 ul/brønn. TCF-II ble tilsatt i varierende konsentrasjon og cellene dyrket i RPMI 1640 med 10 % FCS i en C02-inkubator.<3>H-thymidin ble tilsatt med 0,25 uCi/brønn 16 timer før avslutning av dyrkingen. Etter dyrkingen ble cellene høstet med en cellehøster og vasket med PBS. Radioaktiviteten av<3>H-thymidin inkorporert i cellene ble bestemt med en scintillasjonsteller.

Resultatene er vist i fig. 12 og fig. 13. TCF-II viste ingen stimulerende effekt ved dag 5 av dyrkingen, som vist i fig. 12, men<3>H-thymidininkorporeringen ble signifikant stimulert i nærvær av TCF-II sammenlignet med kontrollen ved dag 8, som vist i fig. 13. Disse resultater viser at TCF-II stimulerer veksten av cytotoksiske T-celler, med andre ord har TCF-II en celleimmunologisk stimulerende effekt.

Eksempel 7

Den stimulerende effekt av glykoproteinet TCF-II erholdt i eksempel 1 på karendotelcellevekst er vist.

Veneendotelceller fra human navlesnor, HUVEC, ble benyttet som testceller. Endotelcellene HUVEC ble oppslemmet i E-GM-medium med 2 % føtalt bovint serum ved en celletetthet på 2,5 x IO<4>celler/ml. 50 ul cellesuspensjon ble utpipettert i hver brønn i en 96-brønners flatbunnet mikroplate (Falcon). Deretter ble 50 ul TCF-II-løsning i det samme medium tilsatt slik at sluttkonsentrasjoner på 0, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 og 1000 ng/ml ble oppnådd. Cellene ble dyrket ved 37 °C i 6 dager i en C02-inkubator. Etter dyrkingen ble dyrkingsmediet i hver brønn fjernet og cellene vasket skånsomt med PBS. Cellene ble fjernet fra brønnen ved trypsinbehandling og antall levedyktige celler telt i et hemacytometer.

Virkningen av TCF-II på normale humane karendotelceller er vist i fig. 14. Resultatet viser at TCF-II ikke viser cytotoksisk aktivitet mot de normale celler, men tvert imot stimulerer veksten. Den vekststimulerende aktivitet var

maksimal ved en konsentrasjon på 125 ug/ml.

De følgende eksempler viser sammensetninger av det farmasøytiske produkt i foreliggende oppfinnelse.

Industriell tilgiengelighet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et nytt glykoprotein. Glykoproteinet kan benyttes som en tumorcytotoksisk faktor, en differensieringsinduserende faktor for leukemicellelinjer, en celleimmunologisk stimulerende faktor og en karendotelcellevekstfaktor osv., og vil vanligvis gjøres tilgjengelig.

Videre kan glykoproteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes som et biokjemisk eller farmakologisk reagens.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein, TFC-II, med de følgende fysikalsk-kjemiske egenskaper: a) molekylvekt: ved molekylvektbestemmelse ved SDS-gelelektroforese 78.000 ± 2.000 eller 74.000 ± 2.000 under ikke-reduserende betingelser, og med et fellesbånd A med molekylvekt 52.000 ± 2.000 og enten bånd B med molekylvekt 30.000 ± 2.000 eller bånd C med molekylvekt 26.000 ± 2.000 under reduserende betingelser, b) isoelektrisk punkt: 7,4 til 8,6, c) varmestabilitet: stabilt ved oppvarming ved 60 °C i 10 minutter, d) pH-stabilitet: stabilt i pH-området 6 til 9, e) karbohydratkjede: adsorberes til en "Concanavalin A (Con A)-Sepharose"-kolonne, f) biologisk aktivitet: hemmer veksten av KB-celler, HeLa-celler og L-929-celler, men ikke IMR-90-celler, g) reaktivitet med antistoffer: den cytotoksiske aktivitet nøytraliseres ikke av anti-TNF-antistoff, anti-lymfotoksinantistoff og antiinterferon-p-antistoff, h) N-terminal aminosyresekvens: bånd B og bånd C nevnt ovenfor er underkjeder av bånd A, den N-terminale aminosyre i bånd A er blokkert, bånd B og bånd C har en felles N-terminal aminosyresekvens som følger: Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr- eller Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-X-Met-Val-Ser-Leu- hvor X står for en ikke-identifisert aminosyre, karakterisert ved at fibroblaster av human opprinnelse dyrkes i et konvensjonelt celledyrkingsmedium, dyrkingsmediet oppsamlet og det ønskede glykoprotein TFC-II renses fra dyrkingsmediet ved konsentrering, ionebytter-kromatografi, HPLC og affinitetskromatografi.

2. cDNA, karakterisert ved at det inneholder en basesekvens som koder for aminosyresekvensen vist i figur 15.