FR2474489A1 - Carnitinamides d'aminoacides optiquement actifs, leur procede de preparation et leur application en therapeutique - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DES CARNITINAMIDES D'AMINOACIDES OPTIQUEMENT ACTIFS ET LEUR PREPARATION. CES CARNITINAMIDES REPONDENT A LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE X EST UN ANION D'HALOGENE, R EST L'HYDROGENE OU UN RADICAL ACYLE, Y EST LE RESTE D'UN AMINOACIDE ESTERIFIE, OPTIQUEMENT ACTIF, ET R EST UN RADICAL ALKYLE DE 1 A 4ATOMES DE CARBONE. CE SONT DES AGENTS THERAPEUTIQUES UTILES DANS LE TRAITEMENT DES TROUBLES CARDIAQUES, DE L'HYPERLIPIDEMIE ET DE L'HYPERLIPOPROTEINEMIE.

Description

7'da '.,-'2t-S5'' `r r ]B-.1Ctiave à une nouvel- FfSi=2sa,'Ji" ixr.

.:~`~'N~ -e ed 'acyl-car;nitine, à 'c5&i `..' C4 -t'" utli.sation comme agents théra- .~.2-;~'- ~- eh= t5, >.-a2 ~' -'r,~~,':aire t _.ans le dédoublement 2 r'.exTh::.-:- e. ---e de "obtention du chlorhydra- ;'ca. d =,m,~r.~ % Q2'; di- Vl..hj& ate. de D-carnitine. Lj -t, J-ei' ion .:e;ipporte plus particulièrement à ......' c'.'-i' S' .... : -lc' d' cv arnitine, dans les- ,;-7g , 5"," jma:oiricacide estérifié, Lu.....i ....._'11',' ...... e.-e,,.,tanrt représentés par la =5-1;--L,~~ . ... ;2 - i" t2 cî`r ,* !e lL.....'-r,._2 , r7_-,rztj- COY 1 _q i a;<-tyl.e, -propionyle, butyryle '-;- _,s''- ' a_ a inon aci. ce esterifié, optique*" -=i- à x formnule générale COO 2 .2 ' LfLj R rcn` re-R;C1I: 1,`n-: cI.i roupes suivants: C. . ? t,= "2i'i.-. Ci fS Ci,2CE ' iC F P '-1', ( '-!16iy tÉ ,,i_0l s fi~O 247448D9 -CH{(CH ) HCHC - (CH ) SH3 -C 6H 65 CH2C6 i5 5 -CH CONE2 2 2 - (CH2 2 COH2 - 2 2 2 / et -C 2y R est un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, 2 * - en étant de préference un radical méthyle, éthyle 10 ou isopropyle. I. doit atre entendu que les amides suivant la présente invention, représentés par la formule (I) en- globent à la fois les melances de diastéréoisomères et les antipodes optiques séparés que l'on peut obtenir au dé- 15 part de ces mëlanges par des procédés que l'on décrira par la suite. Les amides de formule générale (I) que l!on préfère particulièrement sont ceux dans lesquels le res- te amide est celui du diester méthylique, éthylique ou 20 isopropylique d'acide L-aspartique et d'acide L-gluta- mique, 'ainsi que de la L-cystine, le reste de l'ester méthylique ou éthylique de L-asparagine, de L-phénylala- nine, de L-glutamine, de L-phénylglycine, de L-leucine, de L-isoleucine, de L-méthionine, de L-histidine, de 25 L-valine et de L-alanine. On prépare les amides de formule (I) au départ de chlorhydrate de' D, L-carnitine ou de chlorhydrate d' d'acyl-D,L-carnit-ne, que, pour la brièveté, on désignera ci-après respectivremernt pas "carnitine et "acyl=carni- 30 tine". 2474489 3 Suivant l'invention, on prépare les amides de formule (I) en suivant deux voies distinctes de synthèse ; suivant l'une de ces voies, la carnitine ou l'acyl-carniti- ne est convertie en l'halogénure d'acide correspondant et 5 ce dernier composé est condensé avec l'ester désiré d'ami- noacide optiquement actif (Procédé A), tandis que, suivant la seconde voie de synthèse, la carnitine ou l'acyl-carni- tine est directement condensée avec l'ester de l'aminoacide optiquement actif en présence d'un agent de condensa- 10 tion approprié (Procédé B). Le Procédé A comprend plus particulièrement les phases opératoires suivantes : (a) on fait réagir le chlorhydrate de carnitine ou d'acyl-carnitine avec un excès d'agent halogénant à envi- 15 ron 25-60 C sur une période d'environ 0,3 à 24 heures et on sépare l'excès d'agent halogénant pour obtenir de la sorte l'halogénure d'acide correspondant de carnitine ou d'acyl-carnitine ; (b) on dissout l'halogénure d'acide de carnitine 20 ou d'acyl-carnitine de la phase (a) dans un solvant an- hydre inerte ; (c) on condense cet halogénure d'acide de carni- tine ou d'acyl-carnitine avec un aminoacide optiquement actif, estérifié avec des alcools alkyliques inférieurs 25 de 1 à 4 atomes de carbone, dissous dans un solvant an- hydre inerte, en maintenant le mélange de réaction sous agitation à la température ambiante sur une période d'environ 3 à 48 heures, pour obtenir de la sorte l'ami- de de formule (I) (mélange de diastéréoisomères) ; et 30 (d) on isole l'amide de formule (I) par concentra- tion du mélange de la phase (c) et on purifie par des cristallisations répétées. Le Procédé B comprend les phases opératoires 2474.489 4 suivantes : (a') on condense la carnitine ou l'acyl-carnitine en solution aqueuse avec un aminoacide optiquement ac- tif, estérifié avec des alcools alkyliques inférieurs 5 de 1 à 4 atomes de carbone dans une solution de sol- vants organiques, tels que de l'acétone et du dioxane, en présence d'une solution de dicyclohexylcarbodiimide dans le même solvant organique, en maintenant le mélange ain- si obtenu sous agitation à 15-40 -C pendant 20-48 heures, 10 pour obtenir de la sorte l'amide de formule (I) (mélange de diastéréoisoméres) et un précipité de dicyclohexyl urée, et"' (b') on sépare par filtration le précipité de di- cyclohexyl urée et on isole l'amide de formule (I) par 15 concentration du filtrat, dessiccation et cristallisa- tions répétées dans des solvants organiques. Le solvant organique de la phase (b') est de préférence de l'acétone. Le rapport molaire carnitine (ou acyl-carnitine)/ester d'aminoacide optiquement ac- 20 tif/dicyclohexylcarbodiimide est de préférence de 1/1/2. L'ester mentionné précédemment d'aminoacide optiquement actif s'obtient par estérification de l'ami- noacide optiquement actif, de préférence avec du métha- nol, de l'étnanol ou de l'isopropanol, en présence de 25 HC1 gazeux.

On isole ensuite l'ester sous la forme de chlorhydrate d'ester. Ensuite : (i) on dissout le chlorhydrate d'ester dans de 30 l'eau, on amène le.pH à neutralité avec une solution basique saturée, par exemple une solution de Na2CO3 ; la solution ainsi obtenue est extraite de manière répé- tée avec du chlorure de méthylène, du chloroforme ou de 2474489 5 l'éther éthylique, la phase organique est desséchée, con- centrée, puis on isole l'ester de l'aminoacide optique- ment actif sous forme de la base libre et on l'utilise tel quel dans la réaction avec l'halogénure de carnitine 5 ou d'acyl-carnitine (Procédé A) ou avec la carnitine ou l'acyl-carnitine (Procédé B) ; ou (ii) on met en suspension le chlorhydrate d'ester dans de l'éther éthylique et on ajoute de la triéthylami- ne ou de la pyridine en quantités équimolaires à 0 C ; 10 on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylami- ne ou de pyridine ainsi obtenu ; on concentre la solution éthérée et l'ester de l'aminoacide optiquement actif, iso- lé sous la forme de la base libre, est utilisé tel quel pour la condensation avec l'halogénure de carnitine ou 15 d'acyl-carnitine [phase (c) du Procédé A] ou avec la carnitine ou l'acyl-carnitine [phase (a') du Procédé B]. =.-. . Les Procédés A et B de préparation des amides de formule (I) sont illustrés par les schémas suivants de synthèse. % oa% co r-. c. (seamuosToaze:SMTP p eBuMTum) zHOOD Hdo HO -H-HHOO HO-HO- H- >_X\ 'HD EH; %0 EooD / (q) eseqd - H-HD N-H/ DeAn UOT. SUepUOD (, v) es-eqd '--oDa op eDouesgd ue zUOOQ \ ' IT Z -HDO- HN DeAe UOTlSUepUOD ú I ,do x c~5 TDOQ HO-HDO- HD-N -- HD ú+ 'úHO (e) esiqd (H . 'eIDA=a) SPTOU,p eanuub -oIuqI ep uoTIadgxa H0 x EHD HOOD HD-HD-HO-N HOú + H 'HD 2474489 7 L'amide de formule (I), tel qu'obtenu par les procédés précédents, est en réalité un mélange d'amides diastéréoisomères. A titre d'exemple, en faisant réagir l'acétyl-D,L-carnitine avec l'une ou l'autre des deux 5 formes optiquement actives de l'acide glutamique (diester), on obtiendra les diastéréoisomères suivants (les atomes de carbone asymétriques sont marqués par un astérisque) : (CH3)3 k-CH2-H-CH -CONH-H-CHC COOR _21 2 22 C1 OCOCH3 COOR 10 (D ,L) (L,L) ou (D,L) (D,D) 1,: 15 suivant que l'acide glutamique utilisé (diester) est dans sa forme lévogyre ou dans sa forme dextrogyre. Pour réaliser le dédoublement du mélange d'amides de la formule générale (I), afin d'isoler ainsi les diastéréoisomères distincts, on soumet le mélange à 20- une cristallisation fractionnée pour laquelle on utilise un mélange d'un agent solvant et d'un agent de précipi- tation. Des mélanges appropriés de ce genre sont des mélanges d'acétone/acétate d'éthyle et de méthanol/ acétone. 25 La phase solide qui précipite consiste essen- tiellement en l'un des diastéréoisomères, tandis que la phase liquide consiste essentiellement en l'autre dia- stéréoisomère. On peut obtenir des isomères pratique- ment purs par des cristallisations répétées. 30 Les quantités relatives de l'agent solvant et de l'agent de précipitation dépendront de l'amide parti- culier et de la concentration des isomères l'un par rap- port à l'autre. Ces quantités relatives de l'agent sol- 2474.489 8 vant et de l'agent de. précipitation seront aisément dé- terminées par une expertise quelconque, en tenant compte que, pour obtenir le meilleur dédoublement, on utilisera la plus petite quantité nécessaire de solvant et la plus 5 petite quantité d'agent de précipitation provoquant la formation d'une légère opalescence. La préparation de certains amides suivant l'invention sera illustrée plus complètement par les exemples non limitatifs suivants. 10 Exemple 1 Préparation de l'acétyl-carnitinamide du diester isopro- Pylique d"acide L-qlutamicue (Procédé A) (a) Préparation du chlorure d'acide de D,L-acétyl- carnitine. 15 A du chlorhydrate d'acétyl-carnitine (1,2 g ; 0,005 mole), on ajoute du chlorure d'oxaiyle (2,5 ml ; 0,029 mole) et on maintient le mélange résultant sous agitation à la température ambiante pendant 2 heures. On sèche ensuite le mélange sous vide et on lave le 20 reste trois fois avec de l'éther éthylique anhydre, pour obtenir de la sorte le chlorure d'acide d'acétyl- carnitine que l'on utilise tel quel dans la phase sui- vante. (b) Condensation du chlorure d'acide de D,Lacétyl-carnitine avec le diester isopropylique d'acide L-glutamique. Une suspension du chlorure d'acide préparé suivant la phase précédente (0,005 mole) dans 20 ml de chlorure de méthylène anhydre est ajoutée lentement 30 sous agitation au diester isopropylique d'acide L(+)- glutamique sous forme de la base libre, fa] = +19 (1,3 g ; 0,005 mole), dissous dans 20 ml de chlorure de méthylène anhydre. On maintient le mélange de réaction à la tem- pérature ambiante sous agitation pendant 3 heures, puis 2474489 9 on dessèche. Le reste est repris avec de l'isopropanol anhydre et l'acétyl-carnitine qui n'a pas réagi est pré- cipitée avec de l'éther éthylique anhydre. On concentre la solution et le reste obtenu est lavé avec de l'eau

5 que l'on a préalablement refroidie à 0 C, afin d'élimi- ner le diester isopropylique d'acide glutamique n'ayant pas réagi. Le reste (probablement un mélange des deux diastéréoisomères) est analysé par chromatographie en couche mince (gel de silice ; éluant : CHC13 : 55 ; 10 CH30H : 35 ; NH40H : 5 ; H20 : 5) et il apparaft sous forme-de deux taches, la première à un Rf supérieur et la seconde à un R inférieur. - f~R (c) Dédoublement des diastéréoisomères Le produit ayant un Rf inférieur avec une va- 15 leur [Ca i = -10 (1% dans H20) est isolé par des cristal- lisaticns répétées dans de l'acétone-acétate d'éthyle. Dans les liqueurs-mères la concentration du produit au Rf supérieur augmente. Par une analyse de résonance magnétique nucléaire du produit au Rf inférieur, il 20 s'est confirmé que le composé isolé est de l'acétyl- carnitinamide du diester isopropylique d'acide gluta- mique RDN ( 5,7 (m, 1H, -CH-) ; 5,0 (m, recouvert, (O-CHc ) ; 25 O_ CH3 4,2 (m, 1H, -NH-CH-) -; 3,5 (d,2H,-i-CH2-) ; 3,2 (s,9H, CH CH l) ; 2,9-2,2 (m, 9H, -CH2CO;CH2CH2;OCOCH3) ; 1,2 ~30 30 CH3 (d, 12H (CH 3)2 ;D20 U2 2 9H3 Un échantillon de comparaison de L-acétyl- 2474.489 10 carnitinamide de l'ester isopropylique d'acide L-gluta- mique a été préparé par le même procédé que ci-dessus en utilisant du chlorhydrate de L-acétyi-carnitine pur, La= -27 (1% dans H20). Le produit ainsi obtenu montrait une 5 valeur [a = -17 (1% dans H20). (d) Hydrolyse de la liaison amide ' sur le diasté- réoisomère. Les .diastéréoisomères isolés de la façon décri- te précédemment dans la phase (b) sont dissous dans de 10 l'eau et, à la solution résultante, on ajoute de l'acide oxalique (rapport amide/acide oxalique de 1/3). La so- lution est maintenue à la température de reflux pendant environ 7 heures, puis on la filtre et on concentre le filtrat jusqu'à siccité. On fait passer le reste con- 15 sistant en L-carnitine à travers une résine IRA 402 (activée sous la forme OH) pour éliminer toute trace quel- conque d'acide oxalique. L'éluat est acidifié jusqu'au pH de 2 avec du HCl concentré, puis lyophilisé. Le produit lyophilisé consistant en L-carnitine (ce qui 20 est vérifié par une chromatographie en couche m nce et par résonance magnétique nucléaire) montre une valeur ta L=-20 (1% dans H20). Exemple 2 Préparation de carnitinamide d'ester diméthylique 25 d'acide L(+)-aspartique (Procédé B) (a') Condensation de carnitine/ester diméthylique d'acide L(+)-aspartique en présence de dicyclohexylcarbodiimide. On ajoute de la triéthylamine (4,2 ml ; 0,03 30 mole) à une solution de chlorhydrate d'ester diméthyli- que d'acide L(+)-aspartique (6 g , 0,03 mole) dans de l'azétone (200 ml). On maintient le mélange pendant 0,5 heure sous agitation magnétique à la température ambian- 2474489 11 te. On enlève par filtration le précipité de chlorhy- drate de triéthylamine qui se sépare. A la solution filtrée, on agite sous agitation magnétique et à la température ambiante une solutionde dicyclohexylcarbo- 5 diimide (7 g ; 0,03 mole) dans de l'acétone (100 ml) et du chlorhydrate de D,L-carnitine (6 g ; 0,03 mole) dis- sous dans 10 ml de H20. On maintient le mélange de réaction sous agitation pendant la nuit. (b') Séparation du mélange de diastéréoisomères 10 Le précipité ainsi formé (dicylohexylurée) est séparé par filtration. Le filtrat est concentré- sous vide jusqu'à évaporation totale de l'acétone. La solution aqueuse résiduelle est lavée trois fois avec de petites quantités de CHC13 (pour éliminer tout résidu 15 quelconque de l'ester de départ et de triéthylamine pou- vant encore êtré présent). On évapore ensuite la phase aqueuse jusqu'à siccité. Le produit brut, analysé par chromatographie en couche mince (CHC13, MeOH, H20, NH40H: 55/35/5/5 ; gel de silice), consiste en deux taches ayant 20 des valeurs Rf voisines l'une de l'autre ; [a]D (matière brute) = -8,2 (1% dans H20) [mélange des deux diastéréoisomères]. L'analyse de résonance magnétique nucléaire (sulfoxyde de diméthyle) montre deux doublets dans 25 l'intervalle 6 de 9,15-8,72, dont l'un représente les 70% de l'ensemble (calcul sur l'intégrale). (c') Dédoublement des diastéréoisomères Les deux diastéréoisomères sont dédoublés par cristallisation fractionnée dans du méthanol-acétone. 30 Le produit ayant la valeur Rf la plus basse est le pre- mier à cristalliser, tandis que les liqueurs-mères de- viennent plus riches en produit de valeur Rf supérieure. Par une série de quatre cristallisations, il est possi- 2474489. 12 ble d'obtenir le diastéréoisomère pur au Rf inférieur ; et il s'agit d'une substance très hygroscopique et déli- quescente. [a 1=-13,5 (1% dans H20) 5 RMN (sulfoxyde de diméthyle), S : 9,00 (lH,d, -NHCO-) ; OCOCH3 NICO- 1 5,60 (1H,m, -CH- ) ; 4,66 (1H,m, -CH- ) ; 3,87 (2H, d, ---CH2-) 3,70 [6H, s, (-CoocH3)2] 3,23 CH31 10 (<9Hs, CH3 A- ; 2,90-2,46 (4H,m,-CH2-COOCH3/ ,CH3 -CH2-CONH-) ; 2,10 (3H, s, -OCOCH3) Pour vérifier les résultats-précédents, l'amide de l'ester diméthylique d'acide L(+)-aspartique a été

15 préparé au départ d'un échantillon de chlorhydrate de L(-)-carnitine pur en suivant les mêmes procédés que ceux décrits ci-dessus. Le produit ainsi obtenu a montré les mêmes ca- ractéristiques physico-chimiques que celles du diasté- 20 réoisomère précédemment isolé ayant la valeur Rf infé- rieure. Ce produit avait une valeur [a ≤-15 (1% dans H20). (d') Hydrolyse du groupe amide sur le diastéréo- isomère isolé 25 Une solution de l'amide précédemment préparé (2 g ; 0,006 mole) dans 15 ml de H20 et de l'acide oxa- lique (1,8 g ; 0,02 mole) sont maintenus pendant 6 heures à la température de reflux, puis on refroidit et on laisse reposer au réfrigérateur pendant la nuit. 30 Le mélange de réaction est filtré et le filtrat est lavé trois fois avec du CHC13, puis évaporé jusqu'à siccité. Le reste, repris avec du MeOH, filtré et pré- cipité avec du CH2C12, donne la L(-)-carnitine brute. 2474489 13 Ce produit est dissous dans de l'eau et on le fait pas- ser à travers une résine IRA 402 (résine fortement anio- nique) avec élution en utilisant de l'eau, puis on acidi- fie avec du HC1 6N et on lyophilise. 5 Cette L(-)-carnitine lyophilisée a une valeur [a]D =-23 (1% dans H20). Exemple 3 Préparation d'acétyl-carnitinamide d'ester éthylique de phénvlqlvcine (Procédé A) 10 On ajoute 10 g de phenylglycine à 150 ml d'éthanol absolu. On fait barboter du HC1 gazeux à la température ambiante sous agitation dans la solution résultante, jusqu'à dissolution de la totalité de la phénylglycine. On conserve la solution à la températu- 15 re de reflux pendant la nuit, puis on refroidit et on dessèche sous vide. Le reste est à nouveau dissous dans de l'eau et la solution résultante est neutralisée avec du NaHCO3. L'ester éthylique de phénylglycine est ex- trait sous forme de la base libre avec du CH2C12. 20 Une solution de chlorhydrate d'acétyl-carni- tine (10 mmoles dans du CH2C12),préparée comme illustré dans l'Exemple 1, est ajoutée à une solution de 1,8 g (10 mmoles) de la base libre d'ester éthylique de phényl- glycine, dissoute dans 10 ml de CH2Cl2. Le mélange est 25 conservé sous agitation pendant la nuit à 50 C et ensuite refroidi. On ajoute de l'éther éthylique (50 ml) au mé- lange. L'huile qui se forme est dissoute dans un mélan- ge d'éthanol et d'acétone (5/1) et précipitée avec de 30 l'éther. RMN (sulfoxyde de diméthyle) ~ = 1,1 (t, 3H, -CH2-CH3) ; 2,0 (s, 3H, -CO-CH3) ; 2,8 (d, 2H, -CH2-CO-) 3,2 (s, 9H, -(CH3)3-N) ; 3,5 (d, 2H, -N-CH2) ; 2474.489 14 4,0 (q, 2H, -CH2-CH3) ; 5,4 (s, 1H, -CH _t ) ; 5,5 (m, 1H, -CH2-CH-CH2-) ; 7,5 (s, 5H,O ) ; 9,2 (d, lI, CO-NH-) Analyse élémentaire : 5 Calculé pour : C = 56,92 ; H = 7,29 ; N = 6,99 ; C1 = 8,84 Trouvé : C = 56,84 ; H = 7,31 ; N = 6,89 ; Cl = 8,72 Exemple 4 Preparation de l'acétyl-carnitinamide d'ester méthylique de leucine _ 10 On prépare l'acétyl-carnitinamide de l'ester méthylique de leucine en suivant les procédés de l'Exem- ple 1. L'analyse de résonance magnétique nucléaire du produit ainsi obtenu a montré les résultats suivants : 68,8 (d, 1H, -NHCO-) ; 5,5 (m, 1H, -CH-) ; 4,4 (m, 1H, 15 0 -NH-CH-) ; 3,8 (m, 5H, _N-CH2, -OCH3) ; 3,2 (s, 9H, 3 CH3 CH3 "-") ; 2,9 (d, 2H, -CH2CO-) ; 2,2 (s, 3H, -COCH3); CH3 / CH3 CH3 20 1,5 (m, 3H, CH2-CH ) ; 1,0 (d, 6H, CH ) ; CH3 CH3 sulfoxyde de diméthyle. L-leucine : [%D =+12 (2,5% dans HCl 1N) Chlorhydrate d'ester méthylique de L-leucine : 25 [E]D = -13,4 (c = 5% dans H20) Exemple 5 Préparation de l'acétyl-carnitinamide d'ester méthylique d'isoleucine On prépare l'acétyl-carnitinamede d'ester méthy- 30 lique d'isoleucine en suivant les procédés de l'Exemple 2. 2474489. 15 L'analyse de résonance magnétique nucléaire du produit ainsi obtenu a donné les résultats suivants : 8,7 (d, 1H, -NHCO-) ; 5,5 (m, 1H, -CH-) ; O 0 5 4,3 (m, 1H, -NH-CH) ; 3,9 (s, 9H, 3NCH2) ; CH 3,7 (s, 3H, -OCH3) ; 3,2 (s, 9H, CH3 N ) ; CH3 2,7 (recouvert, -CH2-CO-) ; 2,1 (s, 3H, -COCH3) ; 10 1,4 (m, 3H, CH-CH-CH2) ; 0,9 (m, 6H, -CH-CH2-CH3) ; CH3 sulfoxyde de diméthyle. L-isoleucine : [c% = +35 (c = 5% dans HC1 1N) Chlorhydrate d'ester méthylique de L-isoleucine : 15 [a]D = +26,6 (c = 2% dans H20) Exemple 6 Préparation de l'acét l-carnitinamide d'ester méthylique de valine On prépare l'acétyl-carnitinamide d'ester mé20 thylique de valine en suivant les procédés de l'Exem- ple 2. L'analyse de résonance magnétique nucléaire du produit obtenu a donné les résultats suivants : 5,7. (m, 1H, -CH-) ; 4,4 (m, 1H, NH-CH-) ; O0 CH3 25 3,8 (m, 5H, 3_N-CH2-, OCH3) ; 3,2 (5, 9H, CE3- ) CH3 2,8 (d, 2H, -CH2-CO-) ; 2,2 (s, 3H, -COCH3) ; 2 ~~~~~~~~~3 " CH3 1,3-0,9 (m, 7H, -CH ) ; D20 CH 2 -~~~. ~2474-489 16 Chlorhydrate d'ester méthylique de L-valine : [X4 = +15,5 (C = 2% dans H20) L-valine : [a = +24 (c = 5% dans HCl 1N) Exemple 7 5 Préparation de carnitinamide d'ester méthylique de L- méthionine (Procédé B) On prépare la base libre d'ester méthylique de L-méthionine au départ de son chlorhydrate dissous dans l'acétone par addition d'une quantité équivalente 10 de triéhylamine (comme décrit en liaison avec l'ester

diméthylique d'acide aspartique). On met en suspension la base libre d'ester méthylique de méthionine (1,95 g ; 0,01 mole) dans un mélange d'acétone et de dioxane 1/1 (50 cm3) et on ajou- 15 te une solution de dicyclohexylcarbodiimide (7 g ; 0,03 mole) dans du dioxane (100 cm3) et une solution de - chlorhydrate de D,L-carnitine (1,97 g ; 0,01 mole) dans du H20 (5 cm3). On maintient le mélange de réaction sous agi- 20 tation pendant 24 heures à la température.ambiante. On sépare par filtration le précipité de dicyclohexylurée qui se forme. La solution est concentrée jusqu'à sicci- té. Le reste, analysé par chromatographie en couche min- ce (CHC13: MeTOH: CH3COONa. 0,01 M : 40/40/10), consiste, 25 d'après ce que l'on a constaté, en deux produits ayant des valeurs Rf très proches l'une de l'autre (agent de développement : iode). Par des cristallisations répétées avec de l'acétone-acétonitrile, le produit de la valeur Rf infé30 rieure estisolé et-il s'agit du L-carnitinamide d'ester méthylique de L-méthionine. RMN (sulfoxyde de diméthyle) 6 8,8 (d, 1H, -CONH-) ; 4;5 (m, 1H, -CH-) ; 4,3 (t, 1H, -CH-) I IN - 0 NH-- 2474489 17 3,8 (m, 5H, -COOCH3, 2-) CH3 3,2 (s, 9H, CH3- ) ; 2,7 (recouvert par sulfoxyde CH3 5 de diméthyle, -CH2CO-, -CH2S-) ; 2,2 (t, 2H, -CH2-CH); 2,1 (s, 3H, -CH3-S-) Hydrolyse de la liaison amide du diastéréoisomère isolé L'amide précédemment isolé (3,4 g ; 0,01 mole) est dissous dans une solution 2M d'acide oxalique dans -10 du H20 (15 cm3). On chauffe la solution jusqu'à 55"C pendant 10 heures: On refroidit ensuite la solution et on y ajoute 50 cm3 d'éthanol. On maintient le mélange résultant à 0OC pendant la nuit. Le précipité qui se forme est séparé par filtration et la solution aqueuse 15 est concentrée pour séparer l'alcool. Le concentré est repris avec de l'eau et on fait passer la solution à travers une résine Amberlite IRA 402 (résine fortement anionique). L'éluat est lyophilisé. Le produit lyophilisé, analysé par chromato- 20 graphie en couche mince et résonance magnétique nucléai- re, consiste, d'après ce que l'on a constaté, en un sel interne de L-carnitine, [a = -20 (c = 1% dans H20). Exemple 8 Préparation de carnitinamide d'ester éthylique de L(+)- 25 alanine (Procédé A) On fait passer une solution de chlorhydrate d'ester éthylique de L(+)-alanine dans de l'eau, à tra- vers une résine faiblement anionique (Amberlite IR 45). On lyophilise l'éluat pour obtenir la base libre d'ester 30 éthylique de L(+)-alanine, [La = +4 (c = 2% dans du HCl 5N). On dissout la base libre d'ester éthylique L(+)-alanine (1,5 g ; 12,5 moles) dans du chlorure de 2474489.. 18 méthylène et, à la solution résultante, on ajoute lente- ment sous agitation, à la température ambiante, une solu- tion du chlorure d'acide de D,L-acétyl-carnitine (12,5 mmoles, préparation de la façon décrite précédemment). 5 On conserve la solution à 40 C pendant la nuit. Après refroidissement à 0 C, on filtre la solution et on ajou- te de l'éther éthylique au filtrat, pour obtenir ainsi une huile. Ce reste huileux est purifié en le dissolvant 10 dans du H20, en traitant la solution aqueuse avec de 2 l'Amberlite XAD2 et en lyophilisant. Le produit lyophi- lisé, que l'on suppose être le mélange des deux diastéréo- isomères, est analysé par chromatographie en couche mince (CHC13: 55 ; C H : 55 ; NH40H : 5; H20: 5; développement:réactif de Dragendoff) et, d'après ce que l'on a constaté, il consiste en deux produits, respectivement d'un Rf supérieur et d'un Rf inférieur. Une analyse de résonance magnétique nucléaire dans du sulfoxyde de dimé- thyle a montré un multiplet dans l'intervalle 8 9-9,8, 20 créé par la présence des deux amides. On a réalisé des cristallisations répétées avec un mélange de solvants, comprenant du chlorure de méthylène, de l'acétone et de l'acétate d'éthyle, en isolant ainsi le produit au Rf inférieur; [ = -8. 25 RMN (sulfoxyde de diméthyle) S 8,9 (d, 1H, -CONH-) ; 5,5 (m, 1H, -CH-) ; 4,3-3,5 (m, 5H, -CH2CH3 ; o - O CH N-CH2 ; -CH-) : 3,2 (s, 9H, CH3 - ) ; 2,7 (recou- CH3 ~~~~~~~~~~~~~30 30 vert par sulfoxyde de diméthyle, -CH2CO) 2,1 (s, 3H, -COCH3) ; 1,5 (t, 3H, CH3CH2-) L'hydrolyse de la liaison amide de l'ester 2474489 19 sur le diastéréoisomère isolé et la séparation de la L- carnitine sont réalisées de la façon décrite précédemment pour l'acétyl-carnitinamide de diester isopropylique d'acide glutamique. 5 La L-carnitine isolée (vérification par chro- matographie en couche mince et résonancemagnétique nu- cléaire) a une valeur [a]D = -19 (1% dans H20). Les amides de formule générale (I) sont des agents thérapeutiques intéressants dans le traitement 10 de troubles cardiaques, d'hyperlipidémies et d'hyper- lipoprotéinémies. On peut les utiliser également pour obtenir, en partant de la D,L-carnitine ou d'une acyl-D,L-carni- tine (par exemple de l'acétyl-D,L-carnitine), les iso- 15 mères D et L séparés. L'intérdt du dédoublement des isomères optiques de carnitine est créé par le fait que les formes D et L montrent des actions thérapeutiques

différentes, parfois m6me antagonistes entre elles. Un procédé de préparation de chlorhydrate de 20 L-carnitine et de chlorhydrate'de D-carnitine a été décrit dans le brevet belge n 660039. Suivant ce procédé, on convertit du chlorhydrate de D,L-carnitine en chlorhydrate de D,L-carnitinamide que l'on fait réagir avec du D-camphorate d'argent, pour former ainsi le 25 D-camphorate de D,L-carnitinamide. Par cristallisation fractionnée au départ d'une solution alcoolique, de pré- férence une solution isopropanolique, de D-camphorate de D,L-carnitinamide, on obtient le D-camphorate de L-car- nitinamide qui est la première fraction à cristalliser 30 de la solution. On obtient ensuite le chlorhydrate de L-carnitine par des procédés traditionnels d'hydrolyse au départ du D-camphorate de L-carnitinamide. Ce procédé présente l'inconvénient sérieux, 2474489 20 qui rend difficile son application à l'échelle industriel- le, que le D-camphorate d'argent doit nécessairement être utilisé. On obtient ce D-camphorate d'argent en faisant réagir d'abord de l'acide D-camphorique avec de l'ammo- 5 niac et en faisant ensuite réagir le D-camphorate d'am- nonium ainsi obtenu avec du nitrate d'argent. Comme le D,L-carnitinamide est sous la forme d'un sel chlorhydra- te, la formation du sel d'argent a pour but la séparation de l'ion chlorure. Du fait de l'utilisation du nitrate 10 d'argent, ce procédé est coQteux et incommode étant don- né que les diverses phases opératoires doivent être réa- lisées à l'abri de la lumière pour empêcher un noircisse- ment des réacteurs en raison des grandes quantités de chlorure d'argent qui se forment. De plus, le produit 15 final peut être souillé par la présence d'ions d'ar- gent. Pour éviter ces inconvénients sérieux et en particulier pour éliminer totalement l'utilisation de sels d'argent, on a décrit, dans la demande de brevet 20 italien n 50222 A/78, un procédé dans lequel on fait réagir directement la base libre de D,L-carnitinamide (obtenue en faisant passer une solution de chlorhydrate de D,L-carnitinamide à travers une colonne de résine échangeuse d'ions) avec de l'acide D-camphorique, ce 25 qui donne le D-camphorate de D,L-carnitinamide. Bien que ce procédé constitue une amélioration remarquable par rapport au procédé du brevet belge mentionné précédemment, il est encore nécessaire suivant le procédé de cette demande de brevet italien de faire réagir le 30 carnitinamide avecun agent approprié de dédoublement (c'est-à-dire l'acide D-camphorique) qui doit ensuite être séparé. Inversement, les amides de la présente inven- 2474489. 21 tionprésentent l'avantage qu'ils peuvent être dédoublés directement en leurs diastéréoisomères par cristallisa- tion fractionnée dans des solvants alcooliques. cela signifie que ces amides permettent la séparation de la 5 L-carnitine à partir de la D-carnitine non seulement en évitant l'utilisation de sels d'argent mais en outre sans avoir recours à un agent quelconque de dédoublement, tel que l'acide D-camphorique. 2474489 22

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Carnitinamides répondant à la formule générale : CH3 5 CH3-i-CH2-CH -CH-CH -COY (I) 3~ ~2I 2 CH3 X OR dans laquelle : X est un anion halogène ; R est l'hydrogène ou un radical acyle choisi parmi 10 les groupes acétyle, propionyle et butyryle ; Y est le reste d'un aminoacide estérifié, optique- ment actif, répondant à la formule générale : -NH-CHR1 I (II) Àç ~ ~~COOR2 15 dans laquelle : R1 représente : -CH2 COOR2 2 2 2 (CH2) 2COOR2 -CH2S2CH2CH(NH2)COOR2 20 -CH3 -CH(CH3 ) 2 -CH2 CH (CH3) 2 -CH ( CH3) CH2CH3 -(CH2) 2SCH3 2 2 3 25 -C6H5 -CH2 C 6H5 -CH2 CONH2 2474.489 23 -(CH2)2CONH2 2-CH /\ , et R2 est un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone.

2. Carnitinamides suivant la revendication 1, 5 caractérisés en ce que le reste de l'aminoacide estérifié, optiquement actifest le reste d'un L-aminoacide.

3. Carnitinamides suivant la revendication 2, caractérisés en ce que le reste du L-aminoacide estéri- fié est le reste du diester isopropyliqué de l'acide L- 10 glutamique, du diester méthylique et du diester éthylique d'acide L-aspartique et de L-cystine,o oude l'ester méthyli- que ou éthylique de L-asparagine, de L-phénylalaline, de L-glutamine, de L-phénylglycine, de L-leucine, de L-iso- leucine, de L-méthionine, de L-histidine, de L-valine et 15 de L-alanine.

4. Procédé de préparation des carnitinamides répondant à la formule (I), caractérisé en ce qu'il com- prend les phases opératoires suivantes : (a) on fait réagir le chlorhydrate de carnitine ou 20 d'acyl-carnitine avec un excès d'un agent halogénant à environ 25-60 C pendant environ 0,3-24 heures et on sé- pare l'excès d'agent halogénant pour obtenir ainsi l'halogénure d'acide correspondant de carnitine ou d'acyl- carnitine ; 25 (b) on dissout l'halogénure d'acide de carnitine ou d'acyl-carnitine de la phase (a) dans un solvant an- hydre inerte ; (c) on condense cet halogénure d'acide de carnitine ou d'acyl-carnitine avec un aminoacide optiquement actif, 30 estérifié par des alcools alkyliques inférieurs de 1 à 4 atomes de carbone, dissous dans un solvant anhydre inerte, 2474489J 24 en conservant le mélange résultant sous agitation à la température ambiante pendant environ 3-48 heures, pour obtenir de la sorte l'amide de formule (I) (mélange des diastéréoisomères) ; et 5 (d) on isole l'amide de formule (I) par concentra- tion du mélange de la phase (c) et purification par des cristallisations répétées.

5. Procédé de préparation des carnitinamides de formule (I), caractérisé en ce qu'il comprend les 10 phases opératoires suivantes : (a'), on condense de la carnitine ou une acyl-carni- tine en solution aqueuse avec un aminoacide optiquement actif, estérifié par des alcools alkyliques inférieurs de 1 à 4 atomes de carbone dans une solution de solvants 15 organiques, tels que de l'acétone et du dioxane, en pré- sence d'une solution de dicyclohexylcarbodiimide dans le même solvant organique, et on maintient sous agitation le mélange ainsi obtenu à 15-40oC pendant 20-48 heures, pour obtenir de la sorte l'amide de formule (1) (mélange 20 des diastéréoisomères) et un précipité de dicyclohexyl urée ; et (b') on sépare par filtration le précipité de di- cyclohexyl urée et on isole l'amide de formule (I) par concentration du filtrat, dessiccation et cristailisa- 25 tions répétées dans des solvants organiques.

6. Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que le rapport molaire carnitine ou acyl- carnitine/ester d'aminoacide optiquement actif/dicyclo- hexylcarbodiimide est d'environ 1/1/2. 30

7. Procédé de dédoublement d'un mélange de diastéréoisomères d'amides répondant à la formule (I) en leurs diastéréoisomères séparés respectifs, carac- térisé en ce qu'il consiste à soumettre le mélange 2474489. 25 d'amides à une cristallisation fractionnée avec un mé- lange d'un agent dissolvant et d'un agent précipitant, par exemple un mélange constitué d'acétone et d'acétate d'éthyle ou de méthanol et d'acétone, pour obtenir ainsi 5 une phase solide comprenant essentiellement l'un des isomères optiques, et une phase liquide comprenant es- sentiellement l'autre isomère optique.

8, Médicament, utile notamment dans le traitement de troubles cardiaques, de l'hvperlipidémie et de l'hyperlipoprotéinémie, caractérisé en ce-qu'il est constitué par l'un quelconque des composés selon la revendication 1, 2 ou 3.

9. Composition pharmaceutique, caractéris6 en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque 15 des revendications 1 à 3, éventuellement en association avec un support pharmaceutiquement acceptable.