FI98641C - Fermentointiin liittyviä parannuksia - Google Patents

Description

98641

Fermentointiin liittyviä parannuksia - Förbättringar avseende fermentering Tämä keksintö koskee elintarvike-, eläinrehu- ja maatalousteol-5 lisuudessa käytettäviä fermentointimenetelmiä, erityisesti leivän valmistuksessa hapantaikinamenetelmällä. Keksinnön avulla saadaan myös parannettuja, tuettuja laktobasillikasvustoja käytettäväksi näissä menetelmissä.

10 Fermentoinnilla on olennainen merkitys monilla elintarviketeollisuuden aloilla, kuten eläinrehujen valmistuksessa. Erilaisia mikro-organismeja käytetään tarpeiden mukaan. Leipomoissa ja panimoissa käytetään esimerkiksi hiivasoluja.

15 Ennen kuin leipää leivotaan vehnäjauhoista, taikina josta se valmistetaan nostatetaan yleensä muodostamalla kaasua, joka on jäänyt kuplina taikinaan ja muodostunut biologisesti tai kemiallisesti. Tässä nostatuksessa käytetään yleensä leipomohiivaa. Paistettaessa kaasu laajenee edelleen samalla kun jatkuva kuu-20 muus lopettaa kaasunmuodostuksen ja kaasukuplia ympäröivät tai-kinakerrokset kovettuvat, jolloin paistettu leipä säilyttää olennaisesti kohonneen taikinan muodon. Hiiva on eukarioottinen organismi, joka selluloosasta muodostuvasta soluseinämästä johtuvan vankan rakenteensa ansiosta voidaan helposti valmistaa 25 pikakuivatuksi hiivaksi, jolla on pitkä säilymisaika ja joka voidaan helposti aktivoiva käyttöön.

Vaikka hiivan lisääminen vatkattuun taikinaan, josta leipätai-kina valmistetaan, on riittävä hiilidioksidin lähde fermentoin-30 nille nostatustarkoituksessa, tarvitaan joihinkin leipälajeihin happoa maku- ja/tai rakennesyistä. Erityisesti leivottaessa ruisleipää tai sekavehnä- ja ruisleipää, on hapon muodostus ja pH:n alentaminen erityisesti alle pH 5:n välttämätöntä amylaa-siaktiviteetin vaimentamiseksi taikinassa ja tuotteen maun 35 parantamiseksi. Hiiva ei kuitenkaan muodosta happoa ja ruisleivät leivotaan perinteisesti hapantaikinamenetelmällä. Siis 98641 2 samoin kuin monien maitotuotteiden ja muiden elintarvikkeiden valmistuksessa, riippuu tämä vaikutus bakteerikasvuston kehittymisestä, joka koostuu pääasiassa erilaisista maitohappobakteereista, jotka saavat aikaan fermentointivaikutuksen. Monissa 5 muissa tapauksissa elintarvike- ja eläinrehuteollisuudessa tuotteen säilöntäaine, maku ja fyysinen rakenne riippuvat aktiivisten maitohappobakteerien käytöstä.

Maitohappobakteerit eivät liity millään tavalla hiivaan. Ne 10 ovat prokariootteja, solut ovat huomattavasti pienempiä ja niillä on erilaiset kasvuvaatimukset ja soluseinämärakenne on oleellisesti erilainen. Yksi tekninen seuraamus on se, että maitohappobakteereja ei toistaiseksi ole saatavana samanlaisessa muodossa kuin kuivahiivaa tai puristettua hiivaa ja esimer-15 kiksi maitohappobakteerisolujen tiivistäminen erittäin tiiviiksi esimerkiksi linkoamalla on hyvin vaikeaa.

Näistä eroista johtuen perinteisessä hapantaikinaleivontamene-telmässä osa vanhasta hapantaikinasta edellisestä taikinaerästä 20 sekoitetaan kuhunkin seuraavaan taikinaerään. Tällainen peräkkäisten hapantaikinaerien käyttö aiheuttaa arvaamattomia vaihteluja fermentointia aiheuttavan laktobasillikasvuston koostumuksessa. Tämä vaikutus vain korostuu raaka-aineiden koostumuksen muuttuessa, ympäristön lämpötilan vaihdellessa ja huolimat-25 toman käsittelyn seurauksena. Fermentoinnin vaihteluilla saattaa olla epäedullinen vaikutus leivän makuun ja ulkonäköön ja koko menetelmä on epätarkoituksenmukaisempi.

Tavallisemmin maitohappobakteerifermentointi aloitetaan lisää-30 mällä niin kutsuttuja lähtöviljelmiä. Lähtöviljelmät ovat maitohappobakteerit iivisteitä, joita voidaan käyttää suoraan ruoan lisänä tai jatkoviljelyn ja moninkertaistamisen jälkeen tehtaassa. Lähtöviljelmiä on yleensä tarjolla kahdessa muodossa: 35 1) Syväjäädytettynä tiivisteenä, joka sisältää 1010 solua gram maa kohti tai enemmän. Tämä edellyttää jakelua ja säilytystä

II

98641 3 erittäin alhaisissa, alle -30°C lämpötiloissa. Lopullisen käyttäjän tiloissa on oltava tietyn tyyppinen pakastekaappi. Tämä rajoittaa laajamittaista käyttöä esimerkiksi uudenaikaisissa meijereissä.

5 2) Pakastekuivattuna jauheena. Pakastekuivaus eli lyofilisointi on kallis menetelmä ja soveltuu vain rajoitettuun määrään kantoja. Tämän vuoksi pakastekuivattuja jauheita käytetään vain raj oitetusti.

10

Suihkukuivaus on epätyydyttävää, sillä siinä käytetyt korkeat lämpötilat vahingoittavat tai tappavat bakteereja.

Käytännössä pakastekuivaus on aivan liian kallista tähän tar-15 koitukseen. Kuivaamisen hinta on vielä kriittisempi tekijä maitohappobakteerien kuin hiivan kohdalla, sillä niiden fysiologisten ominaisuuksien ja kasvuvaatimusten vuoksi tulee aina olemaan kalliimpaa kasvattaa sama määrä maitohappobakteeribio-massaa.

20 EPO-julkaisussa 131114 on esitetty märän maitohappobakteeritii-visteen sekoittaminen jauhemaiseen kantajaan, esimerkiksi kuorittuun maitojauheeseen tai jauhoihin ja jälkikuivaus kosteus-tason laskemiseksi riittävästi. Solut joutuvat tällöin joksikin 25 aikaan alttiiksi suhteellisen korkeille lämpötiloille. Alhaisempi lämpötila tämän vahingollisen vaikutuksen minimoimiseksi on epätaloudellinen, sillä ilmaa, jolla on erittäin alhainen kastepiste tarvitaan riittävän kuivaustehon synnyttämiseksi.

30 Tämän aiemmin esitetyn lähtöviljelmän käyttämiseksi hapantaiki-naleivän valmistuksessa kuvatun menetelmän mukaisesti, on ensin valmistettava koko viikoksi riittävä erä hapantaikinaa ennen kuin viikon leivontatyö voidaan aloittaa, jolloin päivittäinen annos fermentoitua hapantaikinaa otetaan sille viikolle aikai-35 semmin valmistetusta erästä. Tämä alkuvaihe on hidas kestäen jopa 48 tuntia ja vaatien erityisen fermentointiastian, joka on 98641 4 riittävän suuri viikottaisen hapantaikinaerän valmistamiseksi ja jossa fermentointiolosuhteita voidaan valvoa. Vaihteluja bakteerikasvustossa voi silti esiintyä sen kehittyessä viikon aikana, joilla vaihteluilla voi myös olla haitallisia vaikutuk-5 siä myöhemmin valmistettavien leipäerien laatuun.

Vesiaktiviteetilla on merkitystä kaikkien mikro-organismien kasvukäyttäytymiselle. Korkea vesiaktiviteetti edistää soluak-tiviteettia. Alhaisemmat vesiaktiviteetit hidastavat metabolis-10 ta aktiviteettia. Ääriolosuhteet tappavat soluja, jotka kuitenkin säilyvät pitkän aikaa, jos ne ovat todella kuivia. Näissä olosuhteissa solut ovat lepotilassa eikä metabolismia tapahdu.

Minkä tahansa kuivausprosessin aikana solut saatetaan hyvin 15 märästä tilasta hyvin kuivaan. Vesiaktiviteetin välivaiheilla on kielteinen vaikutus soluihin. Sen vuoksi on tärkeää, että siirtyminen hyvin märästä hyvin kuivaan tapahtuu niin nopeasti kuin mahdollista. Lisäksi tulisi muita haitallisia olosuhteita, kuten lämpötilan nousuja tai alhaisia lämpötiloja (kuten suih-20 kukuivauksessa) ja jääkiteiden muodostusta (pakastekuivaus) välttää.

Huolimatta suspensioon alunperin lisättävien elävien solujen korkeasta määrästä, aiheuttaa kuumassa ilmassa kuivaaminen 25 väistämättä elävien solujen määrän vähenemisen ja pakkaamisessa on noudatettava huolellisuutta ettei liiallista elinvoiman menetystä tapahdu ennen käyttöä.

Esillä oleva keksintö täyttää tarpeen aikaansaada kuivassa 30 ympäristössä stabiileja maitohappobakteerivalmisteita, jotka säilyvät varastointiolosuhteissa pienimuotoisissa elintarvikeyrityksissä maatilojen ja suurten leipomoiden lisäksi, ja erityisesti tarpeen aikaansaada stabiili, elinvoimainen, kuivattu inokulantti, jota on yhtä helppo käsitellä kuin nykyai-35 kaista leipomohiivaa leivän valmistuksessa hapantaikinamenetel-män mukaisesti.

Il 98641 5

Esillä olevassa keksinnössä esitetään sen vuoksi menetelmä tuettujen maitohappobakteerien ja muiden mikro-organismien valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan riittävästi väkevöityä vesipitoista suspensiota käytetään sellaisia määriä, että βυθέ pensio voidaan imeyttää kokonaan esikuivattuihin jauhoihin tai muuhun inerttiin jauhemaiseen aineeseen, jotta saadaan tuote, jolla on hyväksyttävän alhainen vesiaktiviteetti ilman lisä-kuivausta .

10 Esikuivauksen biologinen hyöty on se, että soluja, jotka ovat useimmissa tapauksissa mesofiilistä tyyppiä, ei missään mene-telmävaiheessa alisteta korkeille, yli noin 30°C:n lämpötiloille, ja välttyvät lämpövaurioilta, jotka eivät välttämättä ilmene solukuolemina, joilla on tappava vaikutus, vaan subletaalei-15 na vaikutuksina, jotka vähentävät solujen toimivuutta inakti-voimalla entsyymit ja vaikuttamalla kalvoläpäisevyyteen. Edullisesti jauhoja, esim. ruisjauhoja, tai muuta tukiainetta esi-kuivataan kunnes sen vesipitoisuus on alle 5%, parhaiten alle 1%.

20

Esillä olevassa keksinnössä menetelmän etuna on se, että tuettujen mikro-organismien ollessa erittäin pelkistysherkkiä elävien solujen määrän suhteen tavanomaisissa kuivausmenetelmissä jopa kohtalaisen korkeissa lämpötiloissa, jauhoja ja monia 25 muita jauhomaisia tukiaineita voidaan kuumentaa huomattavasti enemmän substraatin aikaansaamiseksi ilman, että sen koostumus tai fyysinen tila muuttuu. Esikuivausvaihe voi myös olla taloudellisempi korkeissa lämpötiloissa.

30 Käytännössä voidaan keksinnön mukaisissa tuotteissa saavuttaa jopa niin korkeat elävien solujen määrät kuin 1010 grammaa kohti. Aina noin 20%, parhaiten 2 - 10%, pitoisuudet suspensiossa esikuivatun tukiaineen painon mukaan ovat edullisimpia, yhdessä 109-2xl011/g elävien solujen määrän kanssa, erityisesti lakto-35 basillikantojen yhteydessä, jolloin saadaan kuiva, 0,1 - 20% mikrokasvustopitoisuus tuotteessa.

98641 6

Esillä olevassa keksinnössä käytetyt tuetut laktobasillit voivat sisältää kiihdytintä säilymisajan pidentämiseksi ja/tai fermentointiaktiviteetin lisäämiseksi, esimerkiksi entsyymipoh-jaisia leivän parannusaineita, sokereita, mukaan lukien maltoo-5 si, glukoosi, sakkaroosi ja sokeria sisältävät uutteet kuten mallasuute, dekstriini ja melassi. Kiihdytintä on parhaiten mukana 0,1 - 10 paino-% tuotteesta tai IM - 2M pitoisuutena ja se voidaan lisätä etukäteen tuetun viljelmän kanssa valmiiksi sekoitettuna seoksena. Tuettu viljelmä voi myös sisältää hiivo-10 ja ja esillä olevan keksinnön avulla saadaan tuettu kasvusto käytettäväksi hapantaikinan valmistuksessa, johon tällaisia kiihdyttimiä ja lisäaineita lisätään.

Keksinnön mukaisten tuettujen kasvustotuotteiden vesiaktivi-15 teetti on edullisesti 0,3 tai alle, parhaiten 0,2 tai alle.

Parempi säilymisaika saadaan arvoilla, jotka ovat 0,15 tai alle sekä yllättäen sokerin läsnäollessa, joka lisättäessä parantaa solujen säilyvyyttä sekoituksen ja uudelleenhydraation aikana.

20 Varastointia varten esillä olevan keksinnön mukaiset tuotteet pakataan parhaiten tiiviisiin pakkauksiin, parhaiten ilman poissa ollessa, vaikkakin hyvä säilymisaika aikaansaadaan myös käyttämällä ilmaa läpäiseviä, mutta kosteudelta suojattuja pakkauksia. Pakkaukset voivat olla mitattujen annosten kokoi-25 siä, jolloin päivittäinen käyttöönotto on helppoa.

Tällä tavoin saadaan olennaisesti vakiot fermentointiolosuhteet joka päivä ja esimerkiksi hapantaikinaleivän valmistukseen liittyvä fermentointi saadaan valmiiksi normaalin työpäivän ' 30 aikana, sillä vain suhteellisen pieni määrä tarvitaan, eikä enää tarvita erikoislaitteita suurten hapantaikinafermentoin-tien viikkoerien valmistukseen valvontaan käytettäessä tuettuja laktobasillikasvustoja.

35 Esillä olevalla keksinnöllä saadaan siis myös aikaan parannus hapantaikinafermentoinnin valvontaan leivottaessa ruisleipää I! 98641 7 menetelmällä, joka on tunnettu siitä, että fermentoidut hapan-taikinaerät valmistetaan tuoreeltaan päivittäin jokaista leipä-erää varten, joka leivotaan inokuloimalla käyttämällä tuettua laktobasillivalmistetta, parhaiten keksinnön mukaisella mene-5 telmällä valmistettua.

Fermentointivaihe suoritetaan parhaiten niin nopeasti kuin mahdollista. Tätä tarkoitusta varten kunkin hapantaikinaerän valmistuksessa käytetyn inokulantin määrän tulee olla olennaisesti 10 suurempi kuin tähän asti on suositeltu, jotta fermentointi saadaan valmiiksi 24 tunnissa. Esimerkiksi 1-20 paino-% kuivaa inokulanttlainetta lisätään jauhoihin, joita käytetään hapan-taikinan lähtöaineen valmistuksessa. Inokulantin elävien solujen määrän tulisi olla ainakin 109 tukiainegrammaa kohti, par-15 haiten yli 1010 grammaa kohti. Fermentointilämpötila tulisi parhaiten pitää välillä 25 - 40°C viljelmän lämpöherkkyyden mukaan. Hapantaikinan valmistuksessa käytettävän veden määrä on edullisesti 1-2 osaa jauhoja 1 osaa vettä kohti painon mukaan. Fermentointi suoritetaan edullisesti loppuun asti yhden 20 vaiheen aikana, jossa ainesosien suhteet on ennakolta määrätty ja lisätään yhdellä kertaa eli kaikki jauhot ja kaikki vesi lisätään kerralla yhdessä koko inokulanttimäärän kanssa. Tällä tavoin hapantaikinafermentointi on täysin valvottua ja toimenpide suoritettu korkeassa inokulanttipitoisuudessa yhdessä vai-25 heessa, jolloin lämpötilan valvonta on tehokkaampaa ja fermen-tointiin käytetty kokonaisaika saadaan lyhyemmäksi, noin 3-18 tunniksi.

Tuotteiden tällainen keksinnön mukainen käyttö siis tarkoittaa 30 uuden tuoreen inokulanttivalmisteen käyttöönottoa päivittäin, joka saa aikaan välittömän kasvun ja haponmuodostuksen samalla tavoin kuin leivän valmistuksessa sovelletaan leipomohiivafer-mentointia ja kuin meijeriteollisuudessa sovelletaan esimerkiksi jogurtin valmistuksessa.

35 98641 8

Esillä olevassa keksinnössä käytettävä laktobasillikanta voidaan valita leivän halutun aromin ja/tai sen maun ja säilyvyyden perusteella.

5 Keksinnön mukainen hapantaikinan valmistusmenetelmä soveltuu käytettäväksi yhdessä muiden tuettujen laktobasilliseosten kanssa tai jäädytettyjen tai pakastekuivattujen lähtöviljelmien kanssa, joita on nykyään saatavilla hapantaikinaleipomoiden käyttöön, vaikka laktobasilleja on vaikea pakastekuivata teol-10 lisessa mittakaavassa ja jäädytetyt aineet edellyttävät, että leipomon tiloissa on pakastuslaitteet.

Keksinnön mukainen tuettu tuote soveltuu myös käytettäväksi muissa elintarvikemenetelmissä kuten esimerkiksi pitkään säily-15 vien lihatuotteiden valmistuksessa, esim. mannermaisten makkaroiden kuten cervelatin, mortadellan ja salamin, sekä pikkelsin ja hapankaalin valmistuksessa. Muita maitohappobakteerien sovellutuksia, joissa voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisia tuotteita on esitetty teoksessa Steinkraus: Handbook 20 of Indigenous Fermented Foods. Muita sovellutuksia ovat esimerkiksi säilörehun valmistus, jossa käytetään maitohappobakteereita. Muita käytettäväksi sopivia maitohappobakteereja ovat esim. Pediococci-, Streptococci-, Leuconostics- ja Bifidobak-teerit. Sekakantoja, erityisesti hiivalajeja ja laktobasilleja 25 voidaan myös käyttää.

Esimerkki 1

Erä laktobasillikantaa (NRRL B-18,368 11. toukokuuta 1988) 30 inokuloitiin 500 ml:aan De Man, Rogosa ja Sharpe lientä.

Tätä inkuboitiin yön yli 30°C:ssa kunnes solutiheys oli 2 x 109 ml:aa kohti ja näin saatu ainemäärä käytettiin puolestaan inokuloimaan sekoitettu fermentointiaine, joka sisälsi laktobasilliväliainetta, jonka koostumus on annettu taulukos-35 sa 1, 32°C:n lämpötilassa inkuboimalla typessä ja pH:n ollessa li 98641 9 5,8, kun umax = 0,7 h1, jolloin saatiin 8 g/1 biomassaa, jossa elävien solujen määrä vaihteli välillä 5 x 109 - 2 x 1010/ml.

Näin saatu viljelmäliemi lingottiin, jolloin saatiin noin 20-5 kertainen lisäys solutiheyteen aina 2 x 101:L/g elävien solujen määrään asti. Jäähdytettynä 0 - 5°C:een tiiviste säilyi pilaantumattomana useita päiviä.

Tiivisteeseen lisättiin sokeria, jolloin lopulliseksi molaari-10 suudeksi saatiin noin 2 ja seokseen sekoitettiin ajoittain ruisjauhoja, jotka oli aiemmin kuivattu alle 1 % kosteuteen kierrekuivaimessa ja Werner Pfleidererin, Saksan Liittotasavalta kehittämässä jäähdytysyksikössä, jolloin tuotteen aw arvoksi saatiin 0,2. Tuote pakattiin tämän jälkeen ilmatiivii-15 siin muovipusseihin ja sen todettiin säilyvän tyydyttävän aktiivisena usean kuukauden ajan.

Taulukko 1

20 TjAKTQRÄ.STT-iLTVÄT.1 AINEEN KOOSTUMUS

2.

Glukoosi, vedetön 60 hiivauute 15 25 lihauute 30 diammonium sitraatti 6

MgS04.72o 0,3

MnS04.H20 0,2

Na2HP04.2H20 6,0 30 vesijohtovettä 1000 ml asti sterilointiolosuhteet 20 minuuttia 120°C:ssa

Saatu pH = 6,3 35 98641 10

Esimerkki 2

Erä hapantaikinaa valmistettiin 500 g:sta ruisjauhoja, joiden tuhkapitoisuus oli 1,1%, 200 g:sta kuivaa jauhettua laktobasil-5 lilähtöainetta, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja jonka elävien solujen määrä oli 6 x 109 ml:aa kohti, ja 560 g:sta vettä. Näin saatua taikinaa fermentoitiin 4 tunnin ajan 30 - 32°C:ssa nousutuskaapissa, kunnes alkuperäinen pH laski noin 6:sta noin 4:ään ja titrattava kokonaishappamuus 10 (TTA) nousi noin 2,5:stä noin 10:een. pH mitattiin dispergoi-malla 10 g taikinaa 100 ml:aan vettä ja titrattava kokonaishappamuus tarvittavalla 0,1N NaOH määrällä 100 mlraan vettä hajotetun 10 g taikinan titraamiseksi pH 8,5 reen.

15 Leipätaikina sekoitettiin seuraavista aineista; 1260 g edellä esitetyllä tavalla valmistettua hapantaikinaa 700 g ruisjauhoja 600 g vehnäjauhoja 20 30 g puristettua hiivaa 40 g suolaa 780 g vettä.

Taikinaa pidettiin 27 - 28°C:ssa ja vaivattiin yhtäjaksoisesti 25 8-14 minuuttia käytetyn seoksen mukaan ja seisotettiin ensim mäisessä nostatuskaapissa puolen tunnin ajan. Vaivaamisen, muotoilun ja leiviksi pyörittämisen jälkeen, jolloin leipä nostatettiin lopullisesti 30°C:ssa ja 70% suhteellisessa kosteudessa noin tunnin ajan, leipiä paistettiin 60 minuuttia lämpötilassa, 30 jota laskettiin vähitellen 260°C:sta 220°C:een paistamisen aikana .

Näin saadulla leivällä oli hyvä murekutous ja erinomainen ha-pahko maku, pH:n ollessa 4,4 ja TTA:n 7,5.

35

II

98641 11

Tyydyttäviä leipiä saatiin myös leivottua käyttämällä hapan-taikinassa aina puoleen ruisjauhon kokonaismäärästä asti tuotteelta vaadittavan happamuuden mukaan.

5 Esimerkki 3

Sakkaroosin vaikutusta keksinnön mukaisesti valmistettujen tuettujen solujen säilymiseen varastoinnin aikana tarkkailtiin tuotteen eri kosteustiloilla ja sakkaroosin määrinä suspensios-10 sa. Tuettu tuote valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Ruisjauhoja esikuivattiin l%:n kosteuteen tukiväliaineeksi, johon ruiskutettiin 2% saman laktobasillikannan vesipitoista suspensiota kuin esimerkissä 1 ja sakkaroosia lisättiin suspensioon eri molaarisuuksia solususpension eri pitoisuuksien mu-15 kaan. Kokeisiin sisällytettiin vertailusarja, johon ei lisätty sakkaroosia. Saatujen tuotteiden kosteuspitoisuus vaihteli 2%:sta alhaisemmilla sakkaroosi- ja solupitoisuuksilla, jotka vastasivat noin 0,1 vesiaktiviteettia, ja nousi asteittain 7%:n kosteuteen, joka vastasi ^=0,39.

20

Elävien solujen määrä suspensioissa vaihteli vähän vertailu-näytteen arvon 2,3 - 3,0 x 1011 ja koenäytteiden noin 1,3 - 3,0 x 1011 rajojen välillä. Solujen määrä tuetuilla näytteillä vaihteli välillä 4,5 - 13 x 109 vertailunäytteillä ja oli 25 2,5 - 28 x 109 sokeria sisältävillä näytteillä, jolloin jälkim mäisten sarojen asteittaista nousua seurattiin kohoavan solipi-toisuuden avulla.

Uusia solumääriä verrattiin tuotteille yhdeksän viikon säily-30 tyksen jälkeen 35°C:ssa ja 12 ja 26 viikon säilytyksen jälkeen 25°C:ssa toistuvasti suoritettuihin solumäärälaskentoihin ilmassa ja typessä. Vertailu ilmaistiin säilymisprosenttina kussakin tapauksessa. 50%:n luokkaa oleva tai korkeampaa säilyvyyttä pidetään tyydyttävänä. Tulokset on esitetty oheisessa 35 taulukossa 2.

98641 12 TAULUKKO 2

Sakka- Suspensio roosin johon sak- 5 molaari- karoosi on suus sus- lisätty Tuotteen solujen säilymisprosentti pensiossa_w/w_varastoinnin jälkeen (1%)_

Sakkaroosi- 9 vkon 12 vkon 26 vkon

10 korjauksen jälk., 35°C jälk., 25°C jälk., 25°C

jälkeen Ilma N2 Ilma N2 Ilma N2 0 2 19,2 - 2,1 - 1,0 38,1 5 * 6,3 12,5 - 0,94 16,9 15 7,5 * * 2,8 - * 6,0 1.0 1,5 58,3 66,7 58,3 - 17,5 69,4 3,8 22,7 40 31,8 - 7,9 84,5 5.7 5 30,833,8 - 6,5 84,0 7,6 5,9 15,9 28,2 - 13,5 52,9 20 9,5 * 1,1 10 - 0,897,9 1,5 1,3 64 76 44 - 92 N.D.

3,2 73,2 55,4 58,9 - 78,6 N.D.

4.8 53 31 42 - 24 78 6.4 41,8 87,3 37,3 - 51 61,8 25 7,9 25,9 41,5 34,1 - 70,6 88,2 9.5 13,2 43,2 25,9 - 24,5 59,1 2.0 1,0 58,1 90,3 26,1 - 64,5 64,5 2.6 64,4 72,9 50,8 - N.D. N.D.

3.8 69,3 79 62,9 - N.D. N.D.

30 5,2 68,9 68,9 52,7 - 87,8 N.D.

6,5 34 52 28 - 86,7 61,3 7.8 18,7 55,3 37,3 - 34 N.D.

10,4 26,7 47,9 40,7 - 62,8 N.D.

35 * - alle 0,1 N.D. - ei laskua 98641 13

Tuloksista voidaan tehdä seuraavat johtopäätökset:

Hyvän säilyvyyden varmistamiseksi 25°C:ssa ilman läsnäollessa on 1 mooli sakkaroosia selvästi riittämätön määrä, 1,5 M:11a 5 sakkaroosia saatiin hyvä säilyvyys aina 12,5%:n solu-sakkaroo-siseosannostuksiin asti, joka on 6,5% alkuperäisestä solusus-pensiosta, josta saadaan valmiste, joka sisältää 1010 solua/g.

Sakkaroosimolaarisuutta lisättäessä erot säilymisasteissa 10 N2:ssa ja ilmassa säilytettyjen näytteiden välillä pienenivät ja hävisivät kokonaan kun sakkaroosia käytettiin 2 M.

Jopa samoilla Aw arvoilla, säilymisprosentit kohosivat sakkaroosimolaarisuutta lisättäessä. Sakkaroosilla on siis muitakin 15 tehtäviä kuin toimia A^n alentamisaineena.

Esimerkki 4

Esimerkki 2 toistettiin niiden erilaisten menetelmien vaikutus-20 ten testaamiseksi, joilla sakkaroosia lisätään seokseen. Tämä suoritettiin seoksilla, joissa käytettiin 2 M sakkaroosia annostusten ollessa 7,5 ja 20%.

Testatut menetelmät olivat: ' 25 A. 2 moolia sakkaroosia (lopullinen pitoisuus solususpensios-sa) lisättiin solususpensioon, jonka jälkeen sekoitettu suspensio ruiskutettiin ruisjauhokantajaan.

\30 B. Solususpensiota ruiskutettiin ruisjauhoihin, jonka jälkeen kuivaa sakkaroosia sekoitettiin jauhoihin sellainen määrä, joka vastasi painon perusteella menetelmässä A lisättyä sakkaroosimäärää.

35 C. Painon perusteella menetelmässä A lisättyä sakkaroosimäärää vastaava määrä sakkaroosia sekoitettiin ruisjauhoihin, jon- 98641 14 ka jälkeen solususpensio ruiskutettiin jauho/sakkaroosise-okseen.

Tulokset osoittivat, että paras säilyvyys tuotteilla, jotka oli 5 valmistettu samalla määrällä sakkaroosia saatiin menetelmällä A. Kahdella muulla menetelmällä saadut säilymisprosentit olivat korkeammat kuin ilman sakkaroosia valmistettujen tuotteiden säilymisprosentit.

10 Esimerkki 5 Käyttämällä viljeltyä ja tiivistettyä laktobasillikantaa (kuten esimerkissä 1), testattiin seuraavat yhdisteet: glukoosi, laktoosi, maltoosi, sakkaroosi, mannitoli, sorbitoli, glyseroli, 15 dietyleeniglykoli (DEG) ja mononatriumglutamaatti (MSG). Tiivistettyihin soluihin lisättiin sopivat määrät, jotta saatiin tarvittavat moolivahvuudet. Testattavat moolivahvuudet olivat 1 M ja 2 M kaikilla ainesosilla paitsi mannitolilla ja laktoosilla, jotka testattiin ainoastaan 1 M vahvuudella niiden huo-20 non liukenevuuden vuoksi. Solu + yhdisteseosmäärät annosteltiin siten, että kaikissa tapauksissa 2% alkuperäisestä solutiivis-teestä sekoitettiin esikuivattuun ruisjauhoon. Kaikkien näytteiden kosteuspitoisuus ja mitattiin. Näytteitä säilytettiin, 25°C:ssa ja 35°C:ssa ilman läsnäollessa ja elävien solu-25 jen määrät määriteltiin 25°C:een osalta 12 ja 26 viikon kuluttua ja 35°C:een osalta 4 ja 9 viikon kuluttua.

Tulokset on esitetty taulukossa 3, jossa on esitetty elävien solujen määrä (V.C.) määritys sellaisenaan valmistuksen jälkeen 30 ja elävien solujen määrän määritys säilytyksen aikana ilmaistuna säilymisprosentteina, joissa V.C. valmistuksen jälkeen on ilmaistu 100%:na. 2 M:11a saatiin hyvä suoja (< 50%) glukoosilla, maltoosilla ja sakkaroosilla, vähäinen suoja saatiin sorbitolilla ja MSGilla (12,2 ja 18,9) kun taas glyserolilla ja 35 DEG:11a ei ollut lainkaan suojaavaa vaikutusta. Testattaessa

II

98641 15 1 M:11a oli mannitolilla ja laktoosilla jonkin verran suojaava vaikutus.

TAULUKKO 3 5 L. brevis var Lindnerin säilymisprosentit varastoinnin aikana ilman läsnäollessa

Elävien 10 solujen säilymis-%, Nt_o=100%

määrä valmistuksen 4 vkoa 9 vkoa 12 vkoa 25 vkoa jälkeen 35°C 35°C 25°C 25°C

15 Glukoosi 1,2 M 2,2 x 109 127,3 45,4 86,4 36,4 2.4 M 2,1 x 109 152,4 57,1 71, 76,2

Laktoosi 1,1 M 2,6 x 109 119,2 28, 69,2 9,6

Maltoosi 1,2 M 2,4 x 109 113,3 28,3 43,3 27,0 2,1 M 3,0 x 109 112,5 39,6 91,7 62,5 20 Sakkaroosi 1,1 M 3,3 x 109 113,8 46,1 51,5 43,1 2.4 M 3,2 x 109 116,1 64,5 64,5 63,1

Mannitoli 1,2 M 2,0 x 109 47,6 13,5 32,1 6,5

Sorbitoli 1,2 M 2,0 x 109 65,0 19,5 55,0 15,5 2.4 M 2,7 x 109 18,5 8,9 31,5 18,9 25 Glyseroli 1,2 M 2,4 x 109 34,2 4,1 26,7 3,7 2.4 M 1,6 x 109 0,4 9,4E-3 9,4E-1 l,2E-7 DEG 1,1 M 2,2 X 109 32,7 1,4 10,5 3,4E-2 2,3 M 1,7 x 109 5,1 2,1E-1 2,0 1,3E-1 MSG 1,2 M 2,7 x 109 70,4 22,2 48,1 7,4 30 2,4 M 2,7 x 109 96,3 36,7 92,6 12,2

Vesi 2,3 x 109 47,8 3,8 21,7 4,0E-1

Kaikissa näytteissä A„ = 0,1 98641 16

Esimerkki 6

Solutiivisteen valmistus: 2500 ml:aan steriiliä MRS-lientä inokuloitiin 2,5 ml yön yli seisonutta L. asidofiilus viljelmää 5 MRS:ssä, 35°C:ssa ja inkuboitiin yön yli 35°C:ssa. Viljelmä tiivistettiin linkoamalla 10 minuuttia 7000 rpm ja solut sus-pendoitiin osittain supernatantista, jotta saatiin 115 g solu-tiivistettä. Tiivisteen vesifaasi oli 90%.

10 Tuotteen valmistus. Käyttämällä Lödige-sekoitinta valmistettiin 3 erää keksinnön mukaista tuotetta seuraavasti: 1. 30 g solutiivistettä sekoitettiin 35,8 g sakkaroosia (noin 2 M sakkaroosia) ja 1 tunnin säilytyksen jälkeen 4°C:ssa 15 siihen sekoitettiin 1,5 kg esikuivattua maitojauhetta.

2. 30 g solutiivistettä sekoitettiin 1,5 kg esikuivattua maitojauhetta ja myöhemmin siihen sekoitettiin 35,8 g sakkaroosia .

20 3. 1,5 kg esikuivattua maitojauhetta sekoitettiin 35,8 g sakkaroosia, sen jälkeen siihen sekoitettiin 30 g solutiivistettä .

25 Säilytystestit: Näytteille suoritettiin säilytystestit 25°C:ssa ja 35°C:ssa sekä ilman läsnäollessa että typessä. Elävien solujen määrät (V.C.'t) määriteltiin valmistuksen jälkeen sekä 4, 12 ja 16 viikon säilytyksen jälkeen 25°C:ssa ja 4 ja 9 viikon säilytyksen jälkeen 35°C:ssa.

30

Tulokset (katso taulukko 3). L. asidofiilus säilyi parhaiten näytteessä 1 säilytettäessä 25°C:ssa ja 35°C*.ssa sekä ilman läsnäollessa että N2:ssa (>50% säilyneitä). Näytteissä 2 ja 3 säilyvyys oli parempi säilytettäessä N2:ssa kuin ilman läsnäol-35 lessa.

98641 17

Taulukko 3 4 12 26 4 9 viikkoa viikkoa viikkoa viikkoa viikkoa

25°C 25°C 25°C 35°C 35°C

5 Ilma Näyte 1 1,5x10® l,2xl08 1,4x10® l,2xl08 9,9xl07 2 1,1x10® 8,7xl07 2,5xl07 7,9xl07 107 3 1,2xl08 7,6xl07 Ι,ΟχΙΟ7 8,7xl07 l,7xl07 10 n2 Näyte 1 1,5x10® 1,5x10® 1,2x10® 1,5x10® 1,1x10® 2 1,3x10® 1,3x10® 9,5xl07 1,4x10® 6,3xl07 3 1,8x10® 1,4x10® 5,6xl07 1,2x10® 8,4xl07 15 Elävien solujen määrä heti valmistuksen jälkeen: Aw Näyte 1 1,7x10® 0,13 2 1,7x10® 3 1,7x10® 20

Esimerkki 7

Mikro-organismit: '25 1. Saccharomyces cerevisiae, Böcker lähtöisolaatti 2. Candida kruzoi, hapantaikinaisolaatti 3. S. cerevisiae, RZ-lähtöaine - DHW isolaatti 4. S. cerevisiae, leipomohiiva 30 Solutiivisteen valmistus. Jokaisella kannalla inokuloitiin 1 litra steriiliä hiivauute-glukoosi-mallasuute-lientä 105 solua/ml:11a. Liemi jaettiin kolmeen 1 litran erlenmeyerpulloon ja inkuboitiin 25°C:ssa samalla ravistaen. 48 tunnin kuluttua viljelmät tiivistettiin linkoamalla 10 minuuttia 6000 rpm ja 35 solut suspendoitiin osittain supernatantista, jotta saatiin 98641 18 80 g solutiivisteitä. Vesifaasit tiivisteissä olivat 83, 78, 84 ja 90% tässä järjestyksessä.

Tuotteen valmistus.

5 Tuotteet valmistettiin solutiivisteillä sekoittamalla 30 g solutiivistettä 1,5 kg esikuivattua ruisjauhoa, sekä ilman sokeria että 2 M sokerin kanssa, nimittäin Näyte 1: kanta nro. 1: 30 g tiivistettä 10 Näyte 2: kanta nro. l: 30 g tiivistettä + 33 g sakkaroosia Näyte 3: kanta nro. 2: 30 g tiivistettä Näyte 4: kanta nro. 2: 30 g tiivistettä + 31 g sakkaroosia Näyte 5: kanta nro. 3: 30 g tiivistettä Näyte 6: kanta nro. 3: 30 g tiivistettä + 28 g sakkaroosia 15 Näyte 7: kanta nro. 4: 30 g tiivistettä Näyte 8: kanta nro. 4: 30 g tiivistettä + 35,8 g sakkaroosia Säilytystestit: Säilytystestit suoritettiin 25°C:ssa ja 35°C:ssa sekä ilman läsnäollessa että typessä. Elävien solujen 20 määrät määriteltiin valmistuksen jälkeen 25°C:n osalta 12 ja 26 viikon säilytyksen jälkeen ja 35°C:n osalta 4 ja 9 viikon jälkeen .

Tulokset (katso taulukko 4): Tulokset on annettu elävien solu-25 jen määrinä, jotka on määritelty sellaisenaan valmistuksen jälkeen ja elävien solujen määrinä, jotka on määritelty säilytyksen aikana ilmaistuna säilymisprosentteina, joissa valmistuksen jälkeinen solujen määrä on ilmoitettu 100%:ksi.

• 30 Johtopäätös: Näiden tulosten perusteella on selvää, että sakka roosilla on positiivinen vaikutus hiivojen säilymiseen keksinnön mukaisessa menetelmässä ja säilytyksen aikana ympäristön lämpötilassa ja ilman läsnäollessa.

li 35 98641 19 TAULUKKO 4 HIIVOJEN SÄILYMINEN CDC-MENETELMÄSSÄ VC val- 5 mistuksen 12 vkoa 4 vkoa 9 vkoa

Kaasu jälkeen 25°C 35°C 35°C

Ilma Hapantaikinahiivat Böcker isolaatti 0 M sakka- 5,0xl06 2,6 E-l 4,2 E-l 2,8 E-4 10 roosia 2 M " 4,5xl07 88,9 71,1 93,3 C. kruzei (SD) OM " 2,8xl07 1,4 2,7 1,1 E-2 2 M " 9,8xl07 94,9 90,8 142 S. cerevisiae 15 (DHW) OM " 7,3xl06 8,6 E-2 6,8 E-2 1,9 E-3 2 M " 4,7xl07 72,3 51,1 59,6

Leipähiivat S. cerevisiae OM " 3,0xl05 <3,3 E-2 8,3 E-l 3,3 E-2 20 2 M 8,7x10® 35,6 17,2 3,0 N2 Hapantaikinahiivat Böcker isolaatti OM ” - 34,0 46,0 32,0 2 M - 97,8 68,9 86,7 25 c. kruzei (SD) OM" - 64,3 89,3 50,0 2 M - 102 99,0 112 S. cerevisiae (DHW) OM" - 21,9 63,0 27,4 2 M - 63,8 97,9 66,0 30 S. cerevisiae OM " - 6,3 3,3 1,1 E-l 2 M - 36,8 60,9 32,2 35

MENETELMÄT JA VÄLIAINEET

Vesifaasiprosentin määritys solutiivisteessä 40 Punnitse kolmeen lasipurkkiin 10 g solutiivistettä ja kuumenna mikroaaltouunissa samalla ravistaen kunnes kaikki kosteus on haihtunut, ilman että solut palavat.

98641 20 Määrittele vesifaasin määrä ja laske kolmen eri analyysin keskiarvo .

A,.,:ta alentavan yhdisteen määrän laskeminen solutiivisteen 5 säätämiseksi tiettyyn molaarisuuteen Määrittele solutiivisteen vesifaasi-% edellä esitetyn menetelmän mukaisesti, ilmoita W. 100 g tätä tiivistettä säätämiseksi tiettyyn molaarisuuteen (a) tarvittava liuotteen (S) määrä 10 voidaan laskea kaavalla:

W

S= - x a x M.W.

100 x S.W.- a x M.W.

15 jossa W = vesifaasi-% solutiivisteessä S.W. = ominaispaino a = liuotteen tarvittava molaarisuus M.W. = molekyylipaino 20 Titrattavan kokonaishappamuuden (TTA) määritys

Määritelmä: Tuotteen TTA on se ml-määrä 0,1 M NaOH liuosta, joka tarvitaan neutraloimaan 10 g:ssa tuotetta olevat hapot pH

8,5 reen.

: 25

Menetelmä: Punnitse noin 10 g taikinaa ja lisää niin paljon tislattua vettä, että saadaan 10'1 liuos. Homogenisoi 45 sekunnin ajan ja ota 50 g suspensiota ja lisää toiset 50 g tislattua vettä. Titraa suspensiota 0,1 N NaOH:11a kunnes pH on 8,5.

30 Ml 0,1 N NaOH x 2 on tuotteen TTA.

li

Claims (8)

98641

1. Tuettu stabiili bakteeriseos, joka soveltuu käytettäväksi inokulanttina, jonka ainesosiin kuuluu inertti, jaettu tukiaine 5 ja elinvoimaista mikrokasvustoa sisältävä vesipitoinen suspensio, tunnettu siitä, että kunkin ainesosan vesipitoisuus ja osuus on sellainen, että seoksen vesiaktiviteetti on korkeintaan 0,3, jolloin seos lisäksi sisältää 0,1 - 10 paino-% yhtä tai useampaa sokeria valittuna sakkaroosista, maltoosista, 10 glukoosista tai niiden uutteista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että tukiaineen vesipitoisuus on pienempi kuin 5 paino-%.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu sii tä, että tukiaineen vesipitoisuus on pienempi kuin 1 paino-%.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että suspension mikrokasvustopitoisuus on 2 - 10 paino-%. 20

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen seos, tunnettu siitä, että suspension elävien solujen määrä on 109 - 1012/g.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen seos, tun nettu siitä, että mikrokasvusto käsittää laktobasillikan-toja.

7. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 mukaista tuettua 30 mikrokasvustoseosta, tunnettu siitä, että (1) valmistetaan mikrokasvuston vesidispersio, jonka pitoisuus on 2 - 10 paino-%, (2) lisätään suspensioon (1) ainakin yhtä sokeria seuraavis-ta: sakkaroosi, maltoosi ja glukoosi, 35 (3) kuivataan tukiaine vesipitoisuuteen alle 5 paino-%. 98641 (4) sekoitetaan kohdan (3) tuki kohdan (2) vesisuspension kanssa, jolloin saadaan seos, jonka vesiaktiviteetti on 0,3 tai alle ja sokeripitoisuus on 0,1 - 10 paino-%.

8. Menetelmä valmistaa hapantaikina leivän valmistusta varten, tunnettu siitä, että valmistetaan tuoreita fermentoi-tuja taikinaeriä inokuloimalla patenttivaatimuksen 6 mukaisella tuetulla laktobasilliseoksella. l! 98641