DE60319576T2

DE60319576T2 - Verfahren und vorrichtung zur trocknung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE60319576T2
Application number: DE60319576T
Authority: DE
Inventors: Michael Howard Rayner-Brandes; Ian David Watkins; Julie Kay Jones
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2023-11-26
Also published as: AU2003292098A1; JP2006509513A; ATE388221T1; DE60319576D1; EP1570046A1; WO2004055171A1; US20060147662A1; EP1570046B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein vereinfachtes Verfahren für die im Wesentlichen trockene Lagerung von Mikroorganismen bei Temperaturen über dem Gefrieren, ohne dass man externes Trocknen/Vakuum auf das System anwenden muss. Das Verfahren beinhaltet das Einbringen einer kleinen Menge des Materials, das die Mikroorganismen enthält, in eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung, die trockenes wasserabsorbierendes Material mit einer viel größeren Masse enthält, wodurch die Mikroorganismen im Wesentlichen trocken und lagerungsbeständig gemacht werden.
Technischer Hintergrund
Sehr wenige Mikroorganismen sind natürlicherweise in der Lage, einer Lagerung im vegetativen Zustand ohne spezifische Labormanipulation zu widerstehen. Eines der ersten Laborverfahren, das zur Erhaltung von Mikroorganismen über lange Zeiträume entwickelt wurde, war das kontinuierliche Züchten und Subkultivieren der Zellen. Dies ist jedoch ein langwieriges, zeitraubendes Verfahren mit einer hohen Wahrscheinlichkeit der Kontamination durch fremde Organismen und kann zu einer signifikanten genetischen Veränderung (z. B. Verlust von Plasmiden und/oder anderen wichtigen genetischen Determinanten) führen. Es gibt viele andere etablierte Verfahren, die sämtlich auf einer Verringerung der Stoffwechselaktivität basieren, für die langfristige Lagerung von Mikroorganismen im vegetativen Zustand. Gemeinsam sind ihnen entweder

(i) eine sehr niedrige Lagerungstemperatur (oft –60°C oder darunter) und/oder
(ii) die Entfernung des Wassers aus den Mikroorganismen in einem verschließbaren Behälter durch Anwendung äußerer physikalischer Verfahren (Vakuum oder Wärme), gefolgt von Verschließen des Behälters vor einem späteren Eindringen von Wasserdampf während der Lagerung.

Eine Verbesserung gegenüber bestehenden Trocknungs- und Lagerungsverfahren wäre von bedeutendem Nutzen, wenn sie ohne die komplizierte Trocknungsausrüstung, die zur Entfernung des Wassers aus den Mikroorganismen durch Anwendung äußerer physikalischer Verfahren benötigt wird, und ohne Vorbehandlung der Zellen durchgeführt werden könnte und wenn sie getrocknete Mikroorganismen liefern würde, die bei Temperaturen gelagert werden können, die über dem Gefrieren liegen.
Es wurden einige Versuche unternommen, Zellen bei Raumtemperatur mithilfe austrocknender Chemikalien, wie P₂O₅, Silicagel oder CaCl₂, zu trocknen. Jedoch zeigen alle diese Verfahren, wie in der Literatur offenbart, große Nachteile.
B. Janning et al., Journal of Applied Bacteriology, 77 (1994), 319–324 untersuchten das Trocknen von Mikroorganismen, indem sie sie direkt mit Silicagel in Kontakt brachten. Von Janning et al. berichtete Daten zeigten einen breiten Schwankungsbereich hinsichtlich der Empfindlichkeit verschiedener Bakterienstämme gegenüber dem Trocknen durch dieses Verfahren, einschließlich Daten, die eine schlechte Lebensfähigkeit und Erholung von Escherichia-coli-Stämmen zeigen.
Wenn die Zellen direkt mit austrocknenden Chemikalien in Kontakt gebracht werden, wie bei diesem Verfahren, überleben nur einige der Mikroorganismen, weil die austrocknenden Chemikalien toxisch für die Mikroorganismen sein können. Zusätzlich erzeugt die Hydratisierung austrocknender Chemikalien, wie Silicagel, Wärme, die ebenfalls für Mikroorganismen letal sein kann. Bei dem Verfahren von B. Janning et al. muss eine Rehydratisierung der Proben aus diesem Grund sehr sorgfältig bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden.
J. Antheunisse et al., Antonie van Leeuwenhoek 47 (1981), 539–545, offenbaren das Trocknen von Mikroorganismen in einem Exsikkator, der CaCl₂ und Silicagel als austrocknende Chemikalien enthält. Ein direkter Kontakt zwischen den Mikroorganismen und den austrocknenden Chemikalien wird vermieden, indem die Mikroorganismen in Ampullen eingebracht werden, die einen gefalteten Filterpapierstreifen enthalten und mit Baumwollstopfen verschlossen sind. Das Trocknen konnte innerhalb einer Woche erreicht werden. Danach müssen die Ampullen aus der trockenen Umgebung des Exsikkators entnommen werden, wodurch die Kulturen dem Risiko einer Absorption von atmosphärischer Feuchtigkeit ausgesetzt werden, bevor sie für eine geeignete langfristige Lagerung mit Paraffinwachs verschlossen werden. J. Antheunisse et al. berichteten, dass unmittelbar nach dem Trocknen der logarithmische Exponent der Zahl an lebensfähigen Zellen um 2–3 Einheiten abgenommen hatte und dass in einigen Fällen diese anfängliche Abnahme der Lebensfähigkeit sogar noch größer war, was widerspiegelt, dass dieses Trocknungsverfahren für viele Bakterienstämme nicht optimal ist.
T. Popovic et al., Journal of Clinical Microbiology, 36(6) (1998), 1765–1766, berichten über die Verwendung von Folienhüllen, die steriles Silicagel enthalten. Die Mikroorganismen werden mit einem Polyester-Tupfer geerntet, und der Tupfer mit den geernteten Mikroorganismen wird in die Folienhülle eingebracht. T. Popovic et al. berichteten das Überleben von Neisseria meningitidis bei Raumtemperatur, wobei sie Erholung durch die Aussage beschreiben, dass alle Stämme ein starkes Wachstum für mindestens 4 Tage zeigten, aber auch, dass ein gemäßigtes Wachsen durchschnittlich bis zum Tag 9 andauerte, was auf eine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit in einem relativ kurzen Zeitraum bei Raumtemperatur hindeutet. Tabelle 1 in T. Popovic et al. veranschaulicht weiterhin eine signifikante Abnahme der Stamm-Lebensfähigkeit bei Lagerung unter Raumtemperatur für bis zu 90 Tage.
Verfahren, wie die von J. Antheunisse et al. und T. Popovic et al. offenbarten, bei denen die Mikroorganismen nicht direkt mit den austrocknenden Chemikalien oder einer beliebigen anderen wasserabsorbierenden Zubereitung in Kontakt gebracht werden, führen zu längeren Trocknungszeiten, komplizierteren Verfahren und zu einem komplizierteren Bau der Vorrichtung. Veröffentlichte Ergebnisse für diese Verfahren deuten auf Aspekte, unter denen die Abnahme der lebensfähigen Anzahl an Testmikroorganismen deutlich sichtbar ist, was zeigt, dass diese Verfahren zur Langzeitlagerung nicht optimal oder angemessen sind.
Es hat sich herausgestellt, dass trotz der Nachteile des Standes der Technik eine einfache und bequeme Vorrichtung und ein einfaches und bequemes Verfahren zum Trocknen von Mikroorganismen mithilfe austrocknender Chemikalien realisiert werden kann, wenn die Mikroorganismen direkt mit einer trocknen wasserabsorbierenden Zubereitung in Kontakt gebracht werden, die weitere schützende Substanzen enthält, die die Mikroorganismen während der gesamten Trocknung und Lagerung stabilisieren, während zusätzlich vorzugsweise austrocknende Chemikalien, wie Silicagel oder Molekularsiebmaterialien, in die Vorrichtung eingebracht werden, ohne dass sie in direktem Kontakt mit den Mikroorganismen stehen. Zusätzlich wird das Design der Vorrichtung derart gewählt, dass das Aufbringen der Mikroorganismen, das Trocknen, Lagern und Rehydratisieren so schnell und so bequem und effizient wie möglich durchgeführt werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung, die sich zum Trocknen und Lagern von lebensfähigen Mikroorganismen ohne Verlust der Lebensfähigkeit eignet, enthaltend

– einen Streifen enthaltend eine wasserabsorbierende Zubereitung, welche eine Menge mindestens einer wasserabsorbierenden Substanz enthält, die in der Lage ist, das in dem gewählten Volumen an zugesetzter Mikroorganismenzubereitung enthaltene Wasser so zu absorbieren, dass die Endmenge an Wasser in der/den Zubereitung(en) nach Zugabe der Zellen weniger als 10% w/w beträgt, und mindestens eine Schutzsubstanz
– einen wiederverschließbaren Behälter, der im verschlossenen Zustand ein geschlossenes, wasserundurchlässiges System um den Streifen bereitstellt.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die wasserabsorbierende Zubereitung Substanzen, die sowohl schützende als auch wasserabsorbierende Eigenschaften besitzen.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält die primäre wasserabsorbierende Zubereitung weiterhin ein oder mehrere absorbierende Schaumstoff- oder faserbasierende Polster oder andere Matrizes.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung befindet sich die wasserabsorbierende Zubereitung im Kontakt mit oder in der Nähe von einer sekundären wasserabsorbierenden Zubereitung.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung eine austrocknende Chemikalie, wie Silicagel oder Molekularsiebmaterialien.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung in Form von einer oder mehreren in der Streifenvorrichtung eingeschlossenen absorbierenden Perlen, Tabletten, Coupons, Etiketten, Polymerfilmen, Pfropfen, Schaumstoff- oder faserbasierenden Polstern vor.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der wiederverschließbare Behälter ein Folienbeutel.
Bei einer weiteren Ausführungsform enthält der wiederverschließbare Behälter ein oder mehrere Zugangsfenster, über denen sich jeweils eine wasserundurchlässige Abdeckung befindet, die so geöffnet und wieder verschlossen werden kann, dass die Vorrichtung nach dem Wiederverschließen ihre wasserundurchlässigen Eigenschaften zurückerhält.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist der wiederverschließbare Behälter ein Etikett auf, auf dem Einzelheiten der Mikroorganismenzubereitung notiert und/oder mithilfe einer Barcodierung aufgezeichnet werden können.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist der wiederverschließbare Behälter einen sekundären aufreißbaren oder abziehbaren Verschluss auf, der geöffnet werden kann, um den Streifen aseptisch zu entnehmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Trocknen und Lagern von lebensfähigen Mikroorganismen ohne Verlust der Lebensfähigkeit, durch

a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen wiederverschließbaren Streifenvorrichtung
b) Öffnen einer wiederverschließbaren Zugangs-(Beimpfungs-)fensterabdeckung im Behälter der Streifenvorrichtung, um Zugang zum Streifen zu erhalten
c) Zugeben der zu trocknenden Mikroorganismenzubereitung durch das Fenster auf die auf dem Streifen befindliche wasserabsorbierende Zubereitung
d) Verschließen der Streifenvorrichtung durch Schließen der wiederverschließbaren Fensterabdeckung am Behälter
e) Lagern der Streifenvorrichtung,

Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nach Schritt e) die Mikroorganismen wiedergewonnen durch

f) Öffnen der Streifenvorrichtung und Entfernen des Streifens aus dem Behälter
g) Rehydratisieren der Mikroorganismen.

Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt e) die Streifenvorrichtung bei einer Temperatur zwischen –70°C und 37°C gelagert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt e) die Streifenvorrichtung bei einer Temperatur zwischen 0°C und 30°C gela gert.
Die vorliegende Entfernung betrifft zudem ein Kit zum Trocknen und Lagern von Mikroorganismen, mindestens enthaltend eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das Kit kann auch jegliche erforderliche Information zu Verfahren und/oder Hilfsmaterialien, wie Behälter für relevante Lösungen, wie Puffer, oder Lösungen, die schützende Substanzen enthalten, beinhalten, die zur Optimierung der Verfahren benötigt werden, so dass eine maximale Effizienz der Konservierungsverfahren erzielt wird.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Beispiel für eine Form einer erfindungsgemäßen wiederverschließbaren Streifenvorrichtung.
2 zeigt eine Fließdiagrammdarstellung von einem Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren, das zur Konservierung von Zellen durch Lagern in einer wiederverschließbaren Streifenvorrichtung verwendet wird.
Eine eingehende Beschreibung der 3 ist im Beispiel 1 zu finden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Trocknen von Mikroorganismen zur langfristigen Lagerung. Dies wird erreicht, indem eine Zubereitung, die Mikroorganismen enthält (die Mikroorganismenzubereitung) in eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung eingebracht wird. Die Streifenvorrichtung beinhaltet einen wasserundurchlässigen wiederverschließbaren Behälter und einen Streifen innerhalb des Behälters. Der Streifen enthält einen festen Träger, an den eine oder mehrere wasserabsorbierende Zubereitung(en) gebunden ist/sind. Eine wasserabsorbierende Zubereitung beinhaltet mindestens eine oder mehrere wasserabsorbierende Substanzen und eine oder mehrere schützende Substanzen, wobei das Volumen der Mikroorganismenzubereitung und die Menge und die Zusammen setzung der wasserabsorbierenden Zubereitung so gewählt sind, dass nach der Zugabe der Mikroorganismenzubereitung auf die wasserabsorbierende Zubereitung und dem Wiederverschließen des Teststreifens die wasserabsorbierende Zubereitung in der Lage ist, das in der zugegebenen Mikroorganismenzubereitung enthaltene Wasser zu absorbieren und im Wesentlichen trocken zu bleiben, wodurch die Mikroorganismen darin im Wesentlichen trocken und lagerungsbeständig werden.
Der feste Träger ist gewöhnlich ein Material, das nicht wasserabsorbierend ist, häufig Kunststoff, wie Polyesterfolie. Die wasserabsorbierende Zubereitung wird gewöhnlich mittels Klebstoff an den festen Träger gebunden. Bei einer anderen Ausführungsform enthält die wasserabsorbierende Zubereitung weiterhin eine oder mehrere absorbierende saugfähige Schaumstoff- oder faserbasierende Polster oder Matrizes, die an den festen Träger gebunden sind und eine oder mehrere wasserabsorbierende Substanzen und eine oder mehrere schützende Substanzen enthalten.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "wiederverschließbare Vorrichtung" eine Vorrichtung, die vor der Verwendung so gegen das Eintreten von Wasser abgedichtet wird, dass in dem wasserundurchlässigen äußeren Behälter der Vorrichtung ein oder mehrere Löcher (Zugriffsfenster) vorhanden sind, welche durch die wasserundurchlässigen Abdeckungen überdeckt werden und die geöffnet werden können, so dass man Zugang in die Vorrichtung erhält, und die dann zur Wiederherstellung der Barriere gegenüber Wassereintritt wieder verschlossen werden können.
Die Mikroorganismen oder Zellen, die erfindungsgemäß getrocknet und gelagert werden können, beinhalten Bakterien, wie, aber nicht beschränkt auf, Enterobacteriaceae, wie Escherichia coli (einschließlich Stämmen, die für molekularbiologische Verfahren, einschließlich Transformation, verwendet werden, und einschließlich bereits transformierter Stämme), Vibrionaceae, wie Vibrio fischeri, Organismen von industrieller Bedeutung (Lactobacilli spp.), Organismen von medizinischer Bedeutung, Pseudomonadaceae usw. Die Zellen müssen nicht in der vegetativen Form, sondern können auch im Sporenzustand vorliegen.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung können Zellen, z. B. E. coli NovaBlue (Novagen Inc., Madison, USA), unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens getrocknet und dann, nach der Lagerung, so mit einer geeigneten Kompetenzinduzierenden Lösung rehydratisiert werden, dass es dann möglich ist, die Zellen direkt mit exogener DNA, wie Plasmidmolekülen, entsprechend dem Verfahren der WO 02/50252 zu transformieren.
Erfindungsgemäß wird die Probe von Mikroorganismen, die zu der Vorrichtung gegeben wird, als Mikroorganismenzubereitung bezeichnet, unabhängig davon, wie sie zugegeben wird (z. B. direkt oder nach Resuspendieren). Verschiedene Quellen für Mikroorganismen können verwendet werden, z. B. Kolonien, Flüssigkulturen, Feldproben, Blutproben usw. Die Mikroorganismenzubereitung kann z. B. durch Probennahme von einer Kolonie erhalten werden, die auf einem festen mikrobiologischen Wachstumsmedium wächst. Diese Mikroorganismenzubereitung kann direkt auf die wasserabsorbierende Zubereitung auf dem Streifen in der Vorrichtung gegeben oder vor Zugabe zu der Vorrichtung zuerst in einer geeigneten Lösung suspendiert werden, wobei Letzteres in der Fließdiagrammdarstellung in 2 dargestellt ist. Alternativ kann die Mikroorganismenzubereitung durch Probennahme von einer Flüssigkultur oder einer Suspension von Zellen erhalten werden. In allen obigen Fällen kann beispielsweise eine 1-μl-Öse zur Überführung der Mikroorganismenzubereitung in die Vorrichtung verwendet werden.
In allen Fällen kann die Mikroorganismenzubereitung vor der Zugabe zur Vorrichtung mit einer Lösung vorgemischt werden, die schützende Substanzen enthält. Dies kann durch Verdünnen mit einer solchen Lösung oder durch Zentrifugation der Mikroorganismenzubereitung, gefolgt von Resuspendieren in einer solchen Lösung erreicht werden. Man kann die gleiche(n) schützende(n) Substanz(en), die Teil der wasserabsorbierenden Zubereitung ist/sind, oder (eine) andere schützende Substanz(en) verwenden.
Als Beispiel kann eine Bakterienkultur in der späten logarithmischen oder stationären Phase etwa 10⁹ Zellen pro Milliliter, entsprechend 10⁶ Zellen pro Mikroliter, enthalten, so dass leicht sehr signifikante Zellzahlen in verhältnismäßig niedrigen Flüssigkeitsvolumina auf die Streifenvorrichtung aufgebracht werden können.
Das Volumen der Mikroorganismenzubereitung und die Menge und der Typ der wasserabsorbierenden Zubereitung oder Zubereitungen innerhalb der wiederverschließbaren Streifenvorrichtung werden so gewählt, dass nach der Zugabe der Mikroorganismen die wasserabsorbierende Zubereitung in der Lage ist, das in der zugegebenen Probe enthaltene Wasser zu absorbieren und so die Mikroorganismen im Wesentlichen zu trocknen. Es ist wichtig, dass dies ein geschlossenes System darstellt, das ohne externe physikalische Verfahren selbsttrocknend ist. Im Wesentlichen trocken bedeutet, dass die Endmenge an Wasser nach Zugabe der Zellen in de(r/n) Zubereitung(en) vorzugsweise kleiner als 10% w/w, stärker bevorzugt kleiner als 5% w/w und noch stärker bevorzugt kleiner als 2% w/w Wasser ist. Die Menge an benötigter wasserabsorbierender Zubereitung hängt von der Menge der Mikroorganismenzubereitung, die getrocknet werden soll, und von der Wasserabsorptionskapazität des Materials ab. Ein Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Menge an wasserabsorbierender Zubereitung herauszufinden, so dass sie nach der Zugabe der Mikroorganismenzubereitung im Wesentlichen trocken bleibt und dabei die Mikroorganismen im Wesentlichen trocknet.
Diese im Wesentlichen trockenen Bedingungen und die sorgfältige Auswahl der wasserabsorbierenden Zubereitung und der schützenden Substanzen darin verstärken die Langzeitstabilität der Mikroorganismen, sogar bei Temperaturen über dem Gefrieren.
Die wasserabsorbierende Zubereitung, die zum Trocknen der Zellen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, enthält mindestens eine wasserabsorbierende Substanz und eine schützende Substanz. Eine schützende Substanz ist eine Substanz, die aktiv die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen während und nach dem Trocknen fördert.
Die schützenden Substanzen, die vorzugsweise in die wasserabsorbierende Zubereitung eingebracht werden und die folglich mit den Mikroorganismen in Kontakt stehen, werden so gewählt, dass sie die Zellen während des Trocknungsvorgangs stabilisieren und einen Verlust der Lebensfähigkeit minimieren. Insbesondere tragen die schützenden Substanzen zur Beibehaltung der strukturellen Unversehrtheit der Zellen im getrockneten Zustand und auch besonders in den Übergangsstadien (Trocknen beziehungsweise Rehydratisierung) in den und aus dem getrockneten Zustand bei. Solche schützenden Substanzen können auch als wasserabsorbierende Substanzen wirken, wenn sie in die wasserabsorbierende Zubereitung eingebracht werden.
Beispiele für schützende Substanzen sind u. a. (entweder natürliche oder synthetische) Kohlenhydrate, z. B. Zucker (z. B. Saccharose, Lactose, Lactitol, Trehalose, Glucose, Cellobiose, Raffinose, Cyclodextrin) und Derivate davon, und/oder Polymere (auf Zucker- und nicht auf Zuckerbasis) und Derivate davon und/oder Aminosäuren, Peptide oder Proteine und Derivate davon und/oder proteinbasierende Zubereitungen und Fraktionen, wie Rinderserumalbumin Fraktion V. Diese Liste soll nicht umfassend sein, weil solche schützenden Substanzen dem Fachmann bekannt sind.
Die wasserabsorbierenden Substanzen können jede Substanz beinhalten, die in der Lage ist, Wasser zu absorbieren und deren Eigenschaften (z. B. Azidität, chemische Reaktivität) keinen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen in der Mikroorganismenzubereitung hat. Ein solches Material sollte zum Beispiel keine signifikante Wärme durch eine exotherme Reaktion während des Verfahrens zum Trocknen der Mikroorganismenzubereitung erzeugen.
Spezifische Beispiele für geeignete wasserabsorbierende Substanzen sind getrocknete Kohlenhydrate oder andere organische oder anorganische Polymere, wie Stärke, Dextrin, Dextran, Cellulose, Protein, Polypeptid, Agar, Agarose, Polyacrylamid, Sephadex, Sepharose oder Gemische davon.
Bei einer Ausführungsform zeigen die wasserabsorbierenden Substanzen zusätzlich die Eigenschaften schützender Substanzen, so dass die wasserabsorbierende Zubereitung nur eine Substanz enthalten kann, welche als wasserabsorbierende Substanz und als schützende Substanz wirkt. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist ein getrocknetes Kohlenhydrat, wie Trehalose oder Saccharose.
Zusätzlich kann die wasserabsorbierende Zubereitung so formuliert werden, dass sie andere biologisch kompatible Substanzen enthält, die dem Fachmann vertraut sind, wie biologisch kompatible Pufferkomponenten, z. B. HEPES [N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure], mikrobiologische Kulturmedien oder Komponenten solcher Medien, Aktivkohle, kompatible gelöste Stoffe, wie Ectoines (Bezugsstelle: Louis P et al., Appl. Microbiol Biotechnol. (1994) 41: 684–688), Vitamin C oder andere biologisch kompatible Reduktionsmittel oder Antioxidantien und Enzyme, wie Superoxiddismutase, Peroxidase, oder Chemikalien, die direkt oder indirekt freie Radikale neutralisieren oder Chemikalien neutralisieren, die leicht unter Bildung freier Radikale reagieren.
Vorzugsweise besteht die wasserabsorbierende Zubereitung aus Zuckern, wie Trehalose und/oder Saccharose, und einem oder mehreren biologisch kompatiblen Pufferkomponenten.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung hat die wasserabsorbierende Zubereitung die Form eines oder mehrerer absorbierender Schaumstoff- oder faserbasierender Polster oder Matrizes auf dem festen Träger, der in die Streifenvorrichtung eingebracht wird, und verwendet diese dadurch als Träger für die schützenden Substanzen. Geeignete Polstermaterialien sind u. a. Materialien, wie herkömmliches cellulosehaltiges Papier, Nitrocellulose oder Derivate davon. Glasfasermaterialien, faserförmige Kunststoffmaterialien, wie Porex^®-Folienmaterialien (Porex Corporation), Aktivkohletuch und Faservliesgewebe, die Materialien, wie Viskose und Polyester, umfassen, können ebenfalls verwendet werden. Diese vorstehenden Materialien sind sämtlich dem Fachmann bekannt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Streifen vorrichtung zusätzlich zur wasserabsorbierenden Zubereitung (im Folgenden zum leichteren Verständnis als "primäre wasserabsorbierende Zubereitung" bezeichnet) eine sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung. Die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung (die entweder direkt mit der primären wasserabsorbierenden Zubereitung in Kontakt steht oder sich entfernt davon und in jedem Fall innerhalb der Streifenvorrichtung befindet) verstärkt weiter die Effizienz des Trocknens der Mikroorganismenzubereitung innerhalb der Vorrichtung. Die primäre wasserabsorbierende Zubereitung wird direkt mit der Mikroorganismenzubereitung in Kontakt gebracht. Wenn die Menge der wasserabsorbierenden Zubereitung in Bezug zu der Menge der Mikroorganismenzubereitung zu niedrig ist, als dass die Mikroorganismen im Wesentlichen vollständig getrocknet werden oder schnelles Trocknen der Mikroorganismenzubereitung sichergestellt wird, wird die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung dazu verwendet, das überschüssige Wasser im System zu entfernen. Die Menge der sekundären wasserabsorbierenden Zubereitung ist ausreichend, dass das vollständige Gemisch im Wesentlichen trocken wird. Gewöhnlich ist für eine bestimmte Mikroorganismenzubereitung die Menge der primären und sekundären wasserabsorbierenden Zubereitung zusammen genommen äquivalent zu der Menge an wasserabsorbierender Zubereitung, die benötigt würde, wenn man keine Unterscheidung machen würde und die gesamte wasserabsorbierende Zubereitung direkt mit der Mikroorganismenzubereitung in Kontakt brächte.
Die primäre und sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung können aus den gleichen oder unterschiedlichen wasserabsorbierenden Substanzen hergestellt werden und gleiche oder unterschiedliche schützende Substanzen enthalten. Sie können die gleiche oder unterschiedliche physikalische Formen haben. Gewöhnlich muss die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung keine schützenden Substanzen enthalten, wenn sie nur einen begrenzten Kontakt mit der Mikroorganismenzubereitung hat.
Vorzugsweise hat die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung die Form eines oder mehrerer Perlen, Säckchen, Tabletten, Coupons, Etiketten, Polymerfolien oder Pellets, die an den Streifen gebunden sein können oder nicht. Es kann ein Vorteil einer solchen Kombination von Formen für die wasserabsorbierenden Zubereitungen sein, wenn nach dem Lagern und Öffnen des sekundären Verschlusses des wasserundurchlässigen schützenden äußeren Behälters der wiederverschließbaren Streifenvorrichtung der Streifen dann leicht von der sekundären wasserabsorbierenden Zubereitung vor dem Rehydratisieren der Mikroorganismenzubereitung aus der primären wasserbsorbierenden Zubereitung getrennt werden kann. Auf diese Weise wird für das Rehydratisieren der Mikroorganismenzubereitung aus der primären wasserabsorbierenden Zubereitung ein kleineres Volumen an Lösung benötigt als es für das Rehydratisieren sowohl der primären als auch der sekundären Trocknungszubereitung erforderlich wäre. Dies hat den weiteren Vorteil, dass die erhaltene Mikroorganismensuspension konzentrierter ist, weil weniger Rehydratisierungslösung verwendet werden kann.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können wasserabsorbierende Substanzen, die nicht biologisch kompatibel sein müssen (austrocknende Chemikalien), innerhalb der Vorrichtung in sekundären wasserabsorbierenden Zubereitungen, jedoch physikalisch getrennt von den Mikroorganismen vorliegen. Auf diese Weise können austrocknende Chemikalien, die ausgezeichnete Wasserabsorptionseigenschaften haben, in der Vorrichtung in sekundären wasserabsorbierenden Zubereitungen eingesetzt werden, ohne dass schädliche Effekte auf die Mikroorganismenzubereitung, z. B. durch eine exotherme Reaktion bei Hydratisierung, verursacht werden. Bevorzugte Beispiele für solche austrocknenden Chemikalien, die nicht biologisch kompatibel sein müssen, sind Molekularsiebe, wie Zeolith, anorganische Oxide, wie Aluminiumoxid oder Silicagel, Montimorillonit-Ton oder andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können wasserabsorbierende Substanzen oder austrocknende Chemikalien, die nicht biologisch kompatibel sein müssen, in der Vorrichtung vorliegen, indem diese Substanzen in das Material des festen Trägers des Streifens eingebracht werden.
Der wiederverschließbare Behälter der erfindungsgemäßen Streifenvorrichtung ent hält eine wasserundurchlässige schützende äußere Verpackung, wie einen Aluminiumfolienbeutel. Andere wasserundurchlässige schützende äußere Verpackungsmaterialien sind dem Fachmann bekannt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gibt es innerhalb des Behälters ein oder mehrere Zugangsfenster, über denen sich jeweils eine wasserundurchlässige Abdeckung befindet, die geöffnet und wieder verschlossen werden kann, so dass danach die Vorrichtung ihre wasserwasserundurchlässigen Eigenschaften zurückgewinnt. Gewöhnlich wird die wasserundurchlässige Abdeckung an der Vorrichtung durch einen geeigneten wiederverschließbaren Klebstoff an ihrer Peripherie befestigt. Die wasserundurchlässige Abdeckung kann in diesem Fall die Form eines abziehbaren Klebebandes annehmen.
Alternativ kann eine Scharniervorrichtung erdacht werden, bei der die Abdeckung einen integralen Teil der wasserundurchlässigen schützenden äußeren Verpackung der Vorrichtung bildet und folglich durch einen geeigneten wiederverschließbaren Klebstoff nur an einem Teil ihrer Peripherie befestigt ist.
Alternativ kann ein zweistufiger Mechanismus erdacht werden, bei dem die primäre Abdeckung über einem gegebenen Zugangsfenster abziehbar und entfernbar ist, und eine zweite Abdeckung, wie ein Klebeband, anschließend über dem Zugangsfenster angebracht wird, so dass die Vorrichtung ihre wasserundurchlässigen Eigenschaften wiedergewinnt.
Bei einer weiteren Ausführungsform verfügt der wasserundurchlässige schützende Behälter, wie ein Aluminiumfolienbeutel, über ein Etikett, auf dem Einzelheiten der Mikroorganismenzubereitung notiert und/oder durch Mittel, wie eine Barcodierung, aufgezeichnet werden können.
Bei einer weiteren Ausführungsform hat das Behälter einen sekundären aufreißbaren oder abziehbaren Verschluss, der nach Bedarf nach der Lagerung geöffnet werden kann, so dass der Streifen, der die Mikroorganismenzubereitung enthält, für die Rekonstitution der getrockneten Mikroorganismenzubereitung für den Gebrauch aseptisch entnommen werden kann.
Gewöhnlich muss der Inhalt der wiederverschließbaren Streifenvorrichtungen einschließlich der wasserabsorbierenden Zubereitung steril sein, bevor die Mikroorganismenzubereitung zugegeben wird. Die Komponenten der Vorrichtungen können vor dem Zusammenbau separat sterilisiert werden, oder die Vorrichtungen können daran anschließend, aber vor der Zugabe der Mikroorganismenzubereitung, z. B. mittels Gammastrahlung oder einer ähnlichen Behandlung, sterilisiert werden. So besteht kein Risiko einer Kontamination durch Mikroorganismen, die unabsichtlich während der Herstellung der Vorrichtungen in das System eingeführt werden.
1 zeigt ein Beispiel für eine Form einer erfindungsgemäßen wiederverschließbaren Streifenvorrichtung. Teil A zeigt den Streifen, Teil B den Behälter. Der Streifen enthält einen Kunststoffstreifen (1), auf dem die wasserabsorbierende Zubereitung (2) gebunden wird, die ein Polster mit mindestens einer wasserabsorbierenden Substanz und mindestens einer schützenden Substanz enthält. Eine sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung (3), die ein Polster mit mindestens einer wasserabsorbierenden Substanz umfasst, befindet sich weiter abwärts auf dem Streifen.
Der Behälter enthält einen Folienbeutel (4) mit einem wiederverschließbaren Zugangsfenster (5). Wenn das Zugangsfenster an dem abziehbaren Verschluss (5a) aufgezogen wird, erhält man Zugang zu der wasserabsorbierenden Zubereitung auf dem Streifen, so dass man in der Lage ist, die Mikroorganismenzubereitung auf die wasserabsorbierende Zubereitung zu überimpfen. Zum aseptischen Entnehmen des Streifens aus dem Behälter kann der Behälter durch Aufreißen an der Reißlinie (6) geöffnet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Trocknen und Lagern lebensfähiger Mikroorganismen durch

Die verschlossenen Streifenvorrichtungen mit den erfindungsgemäß getrockneten Mikroorganismen können bei Temperaturen zwischen –70°C und +37°C, vorzugsweise zwischen 0°C und +30°C, stabil gelagert werden. Zellen, die "stabil gelagert" werden, sind in der Lage, eine Lagerung für längere Zeiträume bei einer geeigneten Temperatur zu überstehen, ohne dass sie merklich ihre Lebensfähigkeit verlieren. Der Lagerungszeitraum kann von etwa 0 bis etwa 2000 Tagen, gewöhnlich von etwa 20 Tagen oder weniger bis zu etwa 500 Tagen reichen, obgleich sogar längere Lagerungszeiten bei Temperaturen von weniger als etwa –20°C verwendet werden können.
Nach der Lagerung werden die Mikroorganismen wiedergewonnen durch

f) Öffnen der Streifenvorrichtung und Entfernen der Streifen aus dem Behälter
g) Rehydratisieren der Mikroorganismen.

Die Rehydratisierung wird gewöhnlich entweder durch Zugabe einer geeigneten Rekonstitutionslösung zur wasserabsorbierenden Zubereitung, die die konservierte Mikroorganismenzubereitung enthält, oder durch Einbringen der Testvorrichtung in eine geeignete Lösung, wie ein mikrobiologisches Kulturmedium oder eine Pufferlösung, durchgeführt.
Ein Beispiel für das Vorgehen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist in 2 gezeigt. In Schritt 1 werden Zellen von einer Kolonie von Mikroorganismen auf einer Agarplatte entnommen. In Schritt 2 werden die Zellen in einer kleinen Menge sterilen flüssigen Mediums, das schützende Substanzen enthalten kann, suspendiert. In Schritt 3 wird die wiederverschließbare Fensterabdeckung auf der Streifenvorrichtung geöffnet, so dass Zugang zum Polster der wiederverschließbaren Streifenvorrichtung erhalten wird. In Schritt 4 wird ein kleines Volumen (1 μl bei diesem Beispiel) der zu trocknenden Mikroorganismenzubereitung aufgenommen und durch das Fenster auf die Vorrichtung auf die wasserabsorbierende Zubereitung in dem Polster auf der Streifenvorrichtung überimpft. In Schritt 5 wird die Streifenvorrichtung sofort durch Schließen der wiederverschließbaren Fensterabdeckung an der Teststreifenvorrichtung wieder verschlossen. In Schritt 6 werden die Einzelheiten der Mikroorganismenzubereitung auf dem Etikett auf der äußeren Verpackung der Streifenvorrichtung eingetragen. In Schritt 7 wird der Teststreifen vor Gebrauch gelagert (z. B. in einem Kühlschrank bei 4°C). In Schritt 8 wird die Streifenvorrichtung durch Öffnen eines sekundären Verschlusses, in diesem Beispiel eines abziehbaren Verschlusses, geöffnet, so dass man zu den konservierten Bakterien Zugang erhält. In Schritt 9 wird die Streifenvorrichtung dann aus ihrer Verpackung entfernt. In Schritt 10 werden die Zellen durch Zugabe einer geeigneten Rehydratisierungslösung entweder durch direkte Zugabe zum Polster (Schritt 10a) oder durch Einbringen des Polsters der Testvorrichtung in eine geeignete Rehydratisierungslösung (Schritt 10b) rehydratisiert. In Schritt 10a oder in Schritt 10b kann ein mikrobiologisches Kulturmedium als geeignete Rehydratisierungslösung dienen.
Bei einem weiteren Beispiel für das Vorgehen bei dem Verfahren kann Schritt 2 ausgelassen werden, so dass im folgenden Schritt die wiederverschließbare Fensterabdeckung auf der Streifenvorrichtung geöffnet wird, so dass man zum Polster der wiederverschließbaren Streifenvorrichtung Zugang erhält, und dann werden die von einer Kolonie von Mikroorganismen auf einer Agarplatte entnommenen Zellen direkt, ohne vorheriges Suspendieren in Flüssigkeit, durch das Fenster an der Vorrichtung auf die wasserabsorbierende Zubereitung in dem Polster auf der Streifenvorrichtung überimpft.
Bei einem anderen Beispiel für das Vorgehen bei dem Verfahren können die Schritte 1 und 2 ausgelassen werden, so dass im folgenden Schritt ein kleines Volumen (1 μl bei diesem Beispiel) einer Mikroorganismenzubereitung, die eine bereits bestehende flüssige Suspension, wie eine Brühekultur, ist, aufgenommen und durch das Fenster an der Vorrichtung auf die wasserabsorbierende Zubereitung in dem Polster auf die Streifenvorrichtung überimpft wird. Eine solche Suspension kann hinzugefügte schützende Substanzen enthalten. Alternativ kann eine solche Suspension durch vorherige Zentrifugation einer Brühekultur oder einer anderen Suspension von Mikroorganismen und Resuspendieren der Mikroorganismen in einer Lösung der Wahl, die schützende Substanzen enthalten kann, hergestellt werden. Diese zusätzlichen vorbereitenden Schritte des Zentrifugierens und Resuspendierens können dazu verwendet werden, die Konzentration der Mikroorganismen in der Suspension einzustellen, die durch das Fenster an der Vorrichtung auf die Streifenvorrichtung überimpft wird, gewöhnlich um die Mikroorganismen zu konzentrieren.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Kit zum einfachen und sofortigen Trocknen von Mikroorganismen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt. Das Kit enthält mindestens eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung, die mindestens eine erfindungsgemäße wasserabsorbierende Zubereitung enthält, die eine oder mehrere schützende Substanzen enthält. Vorzugsweise wird die wasserabsorbierende Zubereitung in Form einer oder mehrerer absorbierender Schaumstoff oder faserbasierender Polster oder anderer Matrizes konfiguriert, die auf den Streifen aufgebracht werden, der in der Streifenvorrichtung eingeschlossen ist, so dass der Verwender nur die Abdeckung des Zugangsfensters der Vorrichtung öffnen, die Mikroorganismenzubereitung, die Mikroorganismen enthält, zum Polster zugeben und das Zugangsfenster der Vorrichtung für die Lagerung wieder verschließen muss. Das Kit kann auch jegliche erforderliche Information zu Verfahren und/oder Hilfsmaterialien, wie Behälter für relevante Lösungen, wie Puffer, oder Lösungen, die schützende Substanzen enthalten, beinhalten, die zur Optimierung der Verfahren benötigt werden, so dass eine maximale Effizienz der Konservierungsverfahren erzielt wird.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren muss keine externe Trocknungsausrüstung nach der Zugabe der Mikroorganismen mehr angewendet werden. Das Trocknen der Zubereitung(en) in dem System erfolgt, bevor die Organismen zugegeben werden, so dass das System vorbereitet, sterilisiert (wenn erforderlich) und vor Gebrauch gelagert wird (ohne dass temperaturgeregelte Lagerungsbedingungen erforderlich sind). Das System unterliegt folglich sehr wenigen Beschränkungen dahingehend, wann und wo die Probe der Mikroorganismenzubereitung zugegeben wird, d. h. es ist sehr flexibel. Im Allgemeinen wird eine Lagerung bei 4°C oder darunter für die langfristige Lagerung nach der Zugabe der Mikroorganismenzubereitung empfohlen, obgleich dies vom Organismus abhängen kann.
Für den Benutzer ist eine Lagerung im Labor bei Temperaturen oberhalb von 0°C sowohl bequemer als auch benutzerfreundlicher und zudem ökonomischer. Ferner lässt solch der Versand der auf diese Weise erfindungsgemäß konservierten Zellen ohne Einfrieren erzielen und ist deshalb ebenfalls bequemer.
Verglichen mit herkömmlichen Lagerungsverfahren ist der hauptsächliche Vorteil der erfindungsgemäßen Selbsttrocknungsmethodik die Einfachheit und Bequemlichkeit der Verfahren deshalb, weil gewöhnlich der Benutzer nur eine kleine Menge an Mikroorganismensuspension (oder halbfestem Material, z. B. eine Kolonie) zugeben und sie dann für die Lagerung in einen Kühlschrank legen muss. Zum Beispiel ist es nicht notwendig, sterile Lösungen mit Glycerin herzustellen, eine Vorbedingung für die übliche Lagerung in Gefriertruhen, oder die Zellen über flüssigem Stickstoff zu lagern, somit ist das Verfahren einfacher, sicherer und schneller. Zusätzlich ist die Vorrichtung ein geschlossenes System, so dass es keinen signifikanten Zeitraum gibt, in dem die Vorrichtung während des Verfahrens zum Trocknen der Mikroorganismenzubereitung zur Atmosphäre hin offen ist. Dies steht zum Beispiel in deutlichem Kontrakt zu vielen Gefriertrocknungsverfahren, bei denen Aerosole während des Trocknungsvorgangs wahrscheinlich sind, so dass die vorliegende Erfindung das Verfahren zur Behandlung und zum Trocknen pathogener Organismen viel sicherer macht.
Es wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann ohne weitere Ausarbeitung unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten spezifischen Ausführungsformen und Beispiele sollen deshalb nur als veranschaulichend und nicht als in irgendeiner Weise beschränkend für die restliche Offenbarung aufgefasst werden.
Beispiele
Experiment 1 Nachweis des Zellüberlebens auf einem Teststreifen mit Schutzstoff auf dem Polster
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Verschlossene Teststreifen von HY-RISE^TM Farbige Hygiene-Teststreifen (Merck KGaA Art.-Nr. 1.31200.0001) wurden an die Herstellung selbsttrocknender Lagerungsstreifen angepasst. Unter Verwendung eines Skalpells wurde ein Zugangsfenster in den Folienbeutel geschnitten, der den Teststreifen umgab, so dass ein Zugriff zum Teststreifen-Polster ermöglicht wurde. Dies wurde durchgeführt, indem ein Schnitt auf 3 Seiten einer Fläche von 5 mm × 5 mm durchgeführt wurde. Der Folienbeutel wurde an dem am weitesten von dem Polster entfernten Ende aufgeschnitten, und der Streifen wurde entfernt. Etwa 1 cm des Kunststoffstreifens wurde von dem vom Polster ausgesehen distalen Ende abgeschnitten. Ein 86-μl-Aliquot des Schutzstoffs (50% (w/w) Saccharose (BDH Art.-Nr. 102745C) in Nutrient Broth NB (Nutrient Broth Nr. 2, Merck KGaA, Art.-Nr. 10136), sterilfiltriert) wurde auf das Polster abgegeben und der Streifen für 30 Minuten unter einen Heißluftventilator (Sunhouse 2000, hergestellt von T. I. Sunhouse Ltd.) platziert. Der Heißluftventilator wurde oberhalb der Bank derart befestigt, dass das Gitter, aus dem die heiße Luft geblasen wurde, abwärts zeigte. Der Abstand von der Bankoberseite zum Gitter betrug 350 Millimeter. Die Ventilator-Heizvorrichtung wurde auf maximale Hitze eingestellt und ergab einen Bereich von etwa 190 mm × 270 mm, in dem die erzielte Temperatur 75–95°C betrug. Die zu trocknenden Streifen wurden innerhalb dieses Bereichs auf einem Kunststoffgitter (Denleystor, cryostorage ABS plastic gridded rack, 150 mm × 150 mm mit 5 mm voneinander getrennten Gittern) platziert, wobei die Streifen 20 mm über die Bank angehoben wurden. Die Streifen wurden in Chargen von 36 hergestellt und getrocknet.
Selbstklebendes Trocknungsmittel (CSP Technologies, ACTIV-STRIP, M-0002-58) wurde aus dem schützenden Folienbeutel entfernt, in 3 Stücke von 44,0 mm × 12,6 mm × 0,60 mm geschnitten und sofort in eine Dose überführt, die Säckchen mit trockenen Siliciumdioxid-Trocknungsmittel-Perlen (Sigma, Siliciumdioxid-Perlen zum Trocknen, Typ II, Größe 1/8''-Perlen) enthielt. Nachdem die Polster auf den Streifen getrocknet waren, wurden die Trocknungsmittelstücke aus der Dose entfernt und an den Streifen befestigt (die Position siehe in 1). Die Streifen wurden dann wieder in die Folienbeutel überführt und die Beutel zur Zwischenlagerung in einer zweiten Dose platziert, die trockene Siliciumdioxid-Trocknungsmittel-Perlen enthielt. Die Beutel wurde aus dieser Dose entnommen, und ihre abgeschnittenen Enden wurden unter Verwendung eines Multivac-A300-Verpackungsgeräts folienversiegelt. Das Verpackungsgerät wurde so programmiert, dass es ein Vakuum von etwa 600 mbar bei einer Wärme/Druck-Versiegelungszeit von 3,5 Sekunden, Versiegelungsdruck 1 Atmosphäre, zog. Die Beutel wurden dann in eine dritte Dose platziert, die trockenes Siliciumdioxid-Trocknungsmittel enthielt. Die Beutel wurden aus der Dose entfernt, und ein Streifen selbstklebende Kunststofffolie (Tenza Clearview Folie Art.-Nr. 329111) wurde über dem Zugangsfenster platziert. Die Streifen wurden vor dem Beimpfen mindestens 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten.
Herstellung des Impfguts aus konzentrierten Zellen
Eine Primärkultur von E. coli JM109, einem K12-Derivat, (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM 3423) wurde wie folgt hergestellt: JM109-Zellen wurden auf eine LB-(10 g/l Trypton (Pepton von Casein – Merck KGaA, Art.-Nr. 1.07213), 5 g/l Hefe-Extrakt (Merck KGaA, Art-Nr. 1.03753), 10 g/l NaCl (BDH, Art.-Nr. 10241), 15 g/l Agar (Merck KGaA, Art.-Nr. 536025J), pH mit NaOH auf 7,5 eingestellt) Agarplatte ausgestrichen, und die Platte wurde für 72 Stunden bei 20°C inkubiert.
Davon wurde eine einzelne Kolonie in ein 30 ml Universalgefäß (Sterilin, Art.-Nr. 128A), das 3 ml SOB-Medium (20 g/l Trypton (Pepton von Casein – Merck KGaA, Art.-Nr. 1.07213), 5 g/l Hefe-Extrakt (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.03753), 0,5 g/l NaCl (BDH, Art.-Nr. 10241), 0,186 g/l KCl (BDH, Art.-Nr. 101984L)), angereichert mit 30 μl 2 M Mg²⁺-Lösung (1 M MgSO₄·7H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63138), 1 M MgCl₂·6H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63068)), enthielt, überimpft und bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Kultur (Primärkultur) wurde bis zu einer OD_650nm von 0,40 (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer im sichtbaren Bereich) gezüchtet, nach +4°C überführt und über Nacht aufbewahrt.
Zur Herstellung einer Beimpfungsstammlösung wurde ein 1-ml-Aliquot der Primärkultur zum Animpfen von 50 ml SOB-Medium, das mit 500 μl 2 M Mg²⁺-(1 M MgSO₄·7H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63138), 1 M MgCl₂·6H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63068)) Lösung angereichert war, in einer konischen 250-ml-Flasche (Pyrex, Art.-Nr. 1140/14) verwendet und bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Die OD_650nm wurde verfolgt, bis die Kultur 0,65 erreichte. Ein Aliquot von 35 ml SOB-Medium (20 g/l Trypton (Pepton von Casein – Merck KGaA, Art.-Nr. 1.07213), 5 g/l Hefe-Extrakt (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.03753), 0,5 g/l NaCl (BDH, Art.-Nr. 10241), 0,186 g/l KCl (BDH, Art.-Nr. 101984L)), angereichert mit 350 μl 2 M Mg²⁺-Lösung (1 M MgSO₄·7H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63138), 1 M MgCl₂·6H₂O (Fluka, Art.-Nr. 63068)), wurde zu der Flasche gegeben, die die Kultur enthielt, und zum Mischen leicht geschwenkt. Die Kultur wurde in 850-μl-Aliquoten in vorgekühlte Cryovial-Gefäße (NUNC, Art.-No. 3.68632) gegeben. Ein Aliquot von 150 μl Glycerin (Fluka, Art.-Nr. 49767) wurde zu jedem Gefäß gegeben, der Inhalt durch leichtes Umkehren gemischt und sofort auf Trockeneis platziert. Als der Inhalt jedes Gefäßes mit Beimpfungsstammlösung gefroren war, wurden sie in die Lagerung bei –70°C überführt.
Zur Herstellung des Impfguts wurde ein Gefäß der JM109-Beimpfungsstammlösung aus der –70°C-Lagerung entnommen. Mit einer 10-μl-Öse wurde eine Probe durch Abkratzen der Oberfläche des Inhalts des Gefäßes entfernt. Die Probe wurde auf einer Luria-Brühe-Agarplatte (10 g/l Trypton (Difco, Art.-Nr. 211705), 5 g/l Hefe-Extrakt (Difco, Art.-Nr. 212750), 10 g/l NaCl (Sigma, Art.-Nr. S7653), 15 g/l Agar (Merck, KGaA, 536025J), der pH wurde mit NaOH auf 7,5 eingestellt) unter Verwendung herkömmlicher Verfahren ausgestrichen, so dass das Wachstum einzelner getrennter Bakterieneinzelkolonien sichergestellt war. Die Platte wurde für 16 Stunden bei 37°C inkubiert und in die +4°C-Lagerung überführt.
Die obige Platte wurde aus der +4°C-Lagerung entnommen, und 3 Kolonien wurden in eine konische 1-l-Flasche (Pyrex, Art.-Nr. 1130/26) überführt, die 100 ml LB-Brühe (10 g/l Trypton (Difco, Art.-Nr. 212750), 5 g/l Hefe-Extrakt (Difco, Art.-Nr. 212750), 10 g/l NaCl (Sigma, Art.-Nr. S7653) – pH mit NaOH auf 7,5 eingestellt) enthielt. Zwei Flaschen wurden auf diese Weise hergestellt. Die Flaschen wurden bei 37°C unter Schütteln bei 180 U/min inkubiert. Nach etwa 16 Stunden erreichten die Kulturen eine OD_600nm (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht) von 1,49 und 1,45. Der Inhalt der Flaschen wurde vereinigt und sofort für 15 Minuten auf Eis platziert.
Aliquote von 45 ml der eisgekühlten Kultur wurden in 2 vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (Falcon, Art.-Nr. 352070) überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge 5804R unter Verwendung eines Rotors des Typs F34-6-38 und Einsätzen (Eppendorf, Art.-Nr. 5804 774000) bei 6000 U/min, 4°C für 5 Minuten gesammelt. Ein Aliquot von etwa 5 ml des Überstands (d. h. der verbrauchten Medien) wurde in ein Universalgefäß dekantiert und der Rest verworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Sediment nicht aufzuwirbeln. Das Universalröhrchen, das den Überstand enthielt, wurde auf Eis platziert. Die Sedimente wurden jeweils in 0,45 ml des Überstands durch vorsichtiges Ansaugen mit einer sterilen 1-ml-Kunststoff-Pasteurpipette resuspendiert. Die resuspendierten Sedimente wurden vereinigt und wieder auf das Eisbad gestellt. Diese konzentrierte Zellsuspension wurde als Impfgut verwendet.
Die Lebensfähigkeit der Zellen im Impfgut wurde zu diesem Punkt bestimmt. Eine Standardverdünnungsreihe wurde in NB hergestellt und in Doppelansätzen auf Nutrient Agar, NA (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.05450) plattiert. Die Platten wurden mindestens 18 Stunden lang bei 37°C oder mindestens 72 Stunden lang bei 20°C inkubiert und die Kolonien gezählt.
Beimpfen der Streifen
Die für das Impfgut verwendeten Zellen wurden während der Dauer dieses Verfahrens im Eisbad gehalten. Der Klebefilm, der das Zugangsfenster verschloss, wurde abgezogen, so dass Zugang zum Polster ermöglicht wurde. Ein Aliquot von 1 μl der Zellsuspension wurde unter Verwendung von Standardmikropipetten (MARKE TRANSFERPETTE 0,1–1 μl, PLASTIBRAND-Spitzen, 0,1–20 μ) auf das Polster abgegeben. Der Klebefilm wurde sofort nach dem Beimpfen wider angebracht und folglich das Zugangsfenster wieder verschlossen. Dieses Verfahren wurde für jeden der zu beimpfenden Streifen wiederholt. Die beimpften Streifen verblieben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (d. h. 20°C). Als Kontrollen wurden sechs Streifen zur Bestimmung der durchschnittlichen anfänglichen Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen entsprechend dem nachstehenden Verfahren getestet. Die restlichen Streifen wurden dann für definierte Zeiträume in eine Lagerung bei höherer (30°C) Temperatur überführt. Je nach Bedarf wurden nach festgelegten Zeiträumen bei der Lagerungstemperatur die Streifen, insgesamt 6 für jedem Zeitraum, aus dieser Inkubation entnommen, auf Raumtemperatur äquilibriert, dann getestet, um die verbleibende Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen entsprechend dem nachstehenden Verfahren zu bestimmen.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen
Der Folienbeutel wurde durch Aufreißen der Folie an dem Ende geöffnet, das dem beimpften Polster gegenüber lag. Der Streifen wurde aseptisch entfernt und in ein Bijou (Sterilin Art.-Nr. 129A), das 2 ml NB enthielt, überführt, wodurch das Polster eingeweicht wurde. Das Bijou und der Inhalt wurden leicht gerührt, und man ließ die Zellen/denSchutzstoff in einem Zeitraum von 5 Minuten aus dem Polster rehydratisieren. Eine Standardverdünnungsreihe wurde in NB hergestellt und in Doppelansätzen auf Nutrient Agar, NA (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.05450) plattiert. Die Platten wurden mindestens 18 Stunden lang bei 37°C oder mindestens 72 Stunden lang bei 20°C inkubiert und die Kolonien gezählt.
Kontrolle A – ohne Schutzstoff auf dem Polster hergestellte Streifen und kein Schutzstoff im Impfgut
Es wurden Streifenvorrichtungen hergestellt und getestet, wie bei dem obigen Verfahren beschrieben, ausgenommen dass die Abgabe und das Trocknen des Schutzstoffs auf dem Polster weggelassen wurde. Die Streifenvorrichtung wurde folglich auch nicht für 30 Minuten unter den Heißluftventilator gebracht.
Kontrolle B – ohne Schutzstoff auf dem Polster hergestellte Streifen. Schutzstoff im Impfgut
Es wurden Streifenvorrichtungen hergestellt und getestet, wie bei dem obigen Verfahren beschrieben, ausgenommen dass die Abgabe und das Trocknen des Schutzstoffs auf dem Polster weggelassen wurde und mit Ausnahme der folgenden Modifikation bei der Herstellung des Impfguts.
Das Impfgut wurde hergestellt, wie oben beschrieben, ausgenommen dass jedes Sediment in 0,45 ml Schutzstoff-Lösung (25% (w/w) Saccharose (BDH Art.-Nr. 102745C) in Nährbrühe (Nutrient Broth Nr. 2 Merck KGaA, Art.-Nr. 110136), sterilfiltriert) resuspendiert wurde.
Ergebnisse:

Das überraschende Ergebnis ist aus der nachstehenden Tabelle A ersichtlich, dass eine gute Stabilität (Überleben für mehr als 209 Tage (bei Lagerung bei erhöhter (30°C) Temperatur) nur bei Einbringen eines Schutzstoffs auf dem Polster der Vorrichtung erzielt wurde. Die auf die Vorrichtung überimpften Bakterien überlebten nicht für mehr als sieben Tage in Abwesenheit des getrockneten Schutzstoffs auf dem Polster. Tabelle A

	Zeit (Tage)	Schutzstoff auf Polster/KEIN Schutzstoff im Impfgut (cfu/Streifen)	Kontrolle A KEIN Schutzstoff auf Polster/KEIN Schutzstoff im Impfgut (cfu/Streifen)	Kontrolle B KEIN Schutzstoff auf Polster/Schutzstoff im Impfgut (cfu/Streifen)
Zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	4,60E + 08	4,60E + 08	4,45E + 08

Vom Lagerungs-streifen gewonnene Zellen	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	5,5E + 07	7,7E + 05	8,4E + 05
	7	3,4E + 06	Keine Kolonien beobachtet	Keine Kolonien beobachtet
	14	5,1E + 06	Keine Kolonien beobachtet	Keine Kolonien beobachtet
	21	2,2E + 06	Keine weiteren Tests durchgeführt	Keine weiteren Tests durchgeführt
	69	3,1E + 06
	209	6,1E + 05

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 3 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Kreise zeigen die Daten, die mit einem erfindungsgemäßen Teststreifen (Schutzstoff auf Polster/KEIN Schutzstoff im Impfgut) erhalten wurden, die Quadrate und Dreiecke zeigen die Daten, die mit Kontrolle A beziehungsweise Kontrolle B erhalten wurden.
Experiment 2 Nachweis des Zellüberlebens mit Campylobacter jejuni ss. jejuni ATCC 33560 auf dem Teststreifen unter Verwendung von 3 Impfgut-Typen: Kolonie, Kultur und konzentrierte Zellen.
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Herstellung der Impfgute
Etwa 6 ml Bolton-Brühe (Oxoid, Art.-Nr. CM983, bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert) plus 5% hämolysiertes Pferdeblut (SR0048C, zu der Brühe nach Abkühlen auf unter 50°C zugegeben) in einem 7-ml-Bijou wurden mit Zellen von Campylobacter jejuni ss. jejuni, ATCC 33560, beimpft und bei 37°C für 72 Stunden inkubiert. Diese Kultur wurde durch Überführen von 1 ml Kultur in 5 ml Bolton-Brühe plus 5% hämolysiertes Pferdeblut in einem Bijou als Serienkultur aufrechterhalten und bei 37°C für 48–72 Stunden inkubiert.
Ein Aliquot von 1 ml der obigen Kultur wurde zum Beimpfen von 5 ml Bolton-Brühe (ohne Blut) in einem Bijou verwendet und bei 37°C für 48–72 Stunden inkubiert. Diese Kultur wurde durch Überführen von 1 ml Kultur in 5 ml Bolton-Brühe (ohne Blut) in einem Bijou als Serienkultur aufrechterhalten und bei 37°C für 48–72 Stunden inkubiert.
Von dieser Kultur wurden Zellen auf einer Columbia-Blutagarplatte (39 g/l Columbia- Agarbasis, Oxoid CM331, bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert, und 5% hämolysiertes Pferdeblut, Oxoid SR0048C, das nach Abkühlen auf unter 50°C zugegeben wurde) ausgestrichen und bei 37°C für 48 Stunden in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert. Diese Platte wurde zum Beimpfen der Streifen mit Kolonien verwendet (das Kolonieimpfgut).
Aus der Serienkultur wurden Kulturen durch Beimpfen von 6 × 5 ml Bolton-Brühe (ohne Blut) in einem Bijou mit jeweils 1 ml Kultur angesetzt. Die Kulturen wurden bei 37°C für 48 Stunden gezüchtet.
Die Inhalte der Bijou wurden in einem 30-ml-Universalröhrchen (Sterilin, Art.-Nr. 128A) vereinigt und sofort für 15 Minuten auf Eis platziert. Die OD_600nm (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht) der vereinigten Kultur wurde zu 0,21 gemessen. Ein Aliquot von etwa 3 ml dieser Kultur wurde auf Eis gehalten und zum Beimpfen der Streifen verwendet (das Kulturimpfgut).
Aliquote von 2 × 13 ml der eisgekühlten Kultur wurden in 2 vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (Falcon, Art.-Nr. 352096) überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge 5804R unter Verwendung eines Rotors des Typs F34-6-38 und Einsätzen (Eppendorf, Art.-Nr. 5804 774000) bei 6000 U/min, 4°C für 5 Minuten gesammelt. Ein Aliquot von etwa 5 ml des Überstands (d. h. der verbrauchten Medien) wurde in ein Universalgefäß dekantiert und der Rest verworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Sediment nicht aufzuwirbeln. Das Universalröhrchen, das den Überstand enthielt, wurde auf Eis gestellt. Die Sedimente wurden jeweils mit 0,13 ml des eisgekühlten Überstands durch vorsichtiges Ansaugen mit einer sterilen 1-ml-Kunststoff-Pasteurpipette resuspendiert. Die konzentrierten Zellsuspensionen wurden vereinigt und zum Beimpfen der Streifen verwendet (das konzentrierte Zellimpfgut).
Die Lebensfähigkeit der Zellen im Kulturimpfgut und im konzentrierten Zellimpfgut wurde an diesem Punkt bestimmt. Standardverdünnungsreihen wurden in Bolton-Brühe (ohne Blut) hergestellt und in Doppelansätzen auf Columbia-Blutagar plattiert.
Die Platten wurden bei 37°C mindestens 48 Stunden lang in einer mit CO₂ angereicherten Umgebung inkubiert und die Kolonien gezählt.
Beimpfen der Streifen
Beimpfen unter Verwendung von Kolonien
Die Platte, von der Einzelkolonien verwendet werden sollten, wurde aus dem Brutschrank entnommen und auf die Arbeitsbank bei 20°C gestellt. Der Verschluss auf einem Streifen wurde abgezogen, so dass Zugang zu dem Polster über das Zugangsfenster möglich war. Die Kolonien wurden jeweils von der Agarplatte mit einer 1-μl-Öse (Marke Nunc, 1 μl klar, Art.-Nr. 254410) entfernt und auf das Polster/den Schutzstoff "gerieben". Der Verschluss wurde sofort wieder verschlossen. Dieses Verfahren wurde für jeden der zu beimpfenden Streifen wiederholt.
Die Zelllebensfähigkeit einer typischen Kolonie von der Platte wurde an diesem Punkt bestimmt. Die Kolonie wurde in 1 ml Bolton-Brühe (ohne Blut) resuspendiert, eine Standardverdünnungsreihe wurde in der gleichen Brühe hergestellt, in Doppelansätzen auf Columbia-Blutagar plattiert und bei der erforderlichen Temperatur und Dauer inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt, um die cfu pro Kolonie festzustellen.
Beimpfen unter Verwendung der Kultur und der konzentrierten Zellsuspension
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Dieses Verfahren wurde für jeden der Impfgut-Typen durchgeführt.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen.
Wie in Experiment 1 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen:
Bolton-Brühe (ohne Blut) wurde als Verdünnungsmittel und Columbia-Blutagar als Wachstumsmedium verwendet. Die Platten wurden bei 37°C mindestens 48–72 Stunden lang in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert.
Kontrolle C – wie oben beschrieben, ohne Beimpfen hergestellter Streifen
Es wurden Streifenvorrichtungen hergestellt und getestet, wie beim obigen Verfahren beschrieben, ausgenommen dass jegliche Art des Impfguts weggelassen wurde. Die Streifen, insgesamt 36, wurden wie vorstehend beschrieben zur Ermittlung der Zelllebensfähigkeit nach Lagerung getestet.
Ergebnisse:

Die nachstehende Tabelle B zeigt gute Stabilität (Überleben für mehr als 56 Tage) bei Lagerung unter erhöhter (30°C) Temperatur mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Tabelle B

	Zeit (Tage)	Mit Einzel kolonien beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit stationärer Kultur beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit konzentrierten Zellen beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Kontrolle C Keine Beimpfung (cfu/Streifen)
Zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	1,5E + 08	9,0E + 05	3,9E + 06	Keine Kolonien beobachtet

Vom Lagerungsgstreifen gewonnene Zellen	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	1,1E + 06	6,1E + 03	1,3E + 05	Keine weiteren Tests durcheführt
	7	6,5E + 04	2,7E + 03	1,4E + 05
	14	7,8E + 04	3,1E + 03	6,6E + 04
	21	6,5E + 04	2,4E + 03	1,1E + 05
	56	4,3E + 03	1,7E + 03	5,9E + 04

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 4 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Dreiecke, Quadrate und Rauten zeigen die Daten, die mit den Einzelkolonie-, Kultur- bzw. konzentrierten Zellimpfguten erhalten wurden.
Experiment 3 Nachweis des Zellüberlebens mit Candida albicans ATCC 10231 auf dem Teststreifen unter Verwendung von 3 Impfgut-Typen: Kolonie, Kultur und konzentrierte Zellen.
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Wie für Experiment 1 beschrieben, mit folgender Ausnahme:
Das selbstklebende Trocknungsmittel (CSP Technologies, ACTIV-STRIP, M-0002-58) wurde aus dem Schutzfolienbeutel entnommen und in Stücke von 44,0 mm × 12,6 mm × 0,30 mm geschnitten.
Herstellung der Impfgute
Candida albicans ATCC 10231 wurde als TWISTER 0006 erhalten, von dem eine Beimpfungsstammlösung hergestellt wurde. Der TWISTER wurde mit der mitgelieferten Rehydratisierungslösung rehydratisiert, auf Sabouraud-4%-Maltose-Agar (65 g/l Merck Art.-Nr. 105439) ausgestrichen und bei 25°C für 72 Stunden inkubiert.
Eine gut isolierte Kolonie wurde von der Agarplatte ausgewählt, in ein Gefäß überführt, das Cryobeads (Microbank, PROLAB Diagnostics, Art.-Nr. P1160) enthielt, und in dem schützenden Medium emulgiert. Das Gefäß wurde mehrmals umgekehrt und so viel von dem Schutzstoff-Medium wie möglich durch Absaugen entfernt. Das Gefäß wurde sofort nach dem Beimpfen nach –70°C überführt.
Der Organismus wurde von dieser Cryobead-Stammlösung mit herkömmlichen Verfahren auf eine Sabouraud-4%-Maltose-Agarplatte ausgestrichen, so dass das Wachstum einzelner getrennter Bakterieneinzelkolonien sichergestellt war, und bei 25°C für 72 Stunden inkubiert. Diese Agarplatte wurde dazu verwendet, einzelne Kolonien für das Beimpfen der Streifen (das Kolonieimpfgut) bereitzustellen und Brühe zu beimpfen, die für das Kultur- und das konzentrierte Zellimpfgut verwendet werden sollte.
Eine einzelne Kolonie von der vorstehend hergestellten Platte wurde zum Beimpfen von 50 ml Maltose-Brühe (10 g/l Pepton, Merck Art.-Nr. 107213, 40 g/l Maltose, Merck Art.-Nr. 291314H) in einem 100-ml-Sterilin-Gefäß (Sterilin Art.-Nr. 185AM) verwendet und bei 25°C für 72 Stunden inkubiert. Die optische Dichte, OD_600nm, (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht) wurde zu 0,86 gemessen. Die Kultur wurde für 15 Minuten auf Eis gestellt. Ein Aliquot von etwa 4 ml dieser Kultur wurde auf Eis gehalten und zum Beimpfen der Streifen verwendet (das Kulturimpfgut).
Ein Aliquot von 45 ml der eisgekühlten Kultur wurde in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen (Falcon, Art.-Nr. 352070) überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge 5804R unter Verwendung eines Rotors des Typs F34-6-38 und Einsätzen (Eppendorf, Art.-Nr. 5804 774000) bei 6000 U/min, 4°C für 5 Minuten gesammelt. Ein Aliquot von etwa 5 ml des Überstands (d. h. der verbrauchten Medien) wurde in ein Universalgefäß dekantiert und der Rest verworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Sediment nicht aufzuwirbeln. Das Universalröhrchen, das den Überstand enthielt, wurde auf Eis gestellt. Das Sediment wurde in 0,45 ml des Überstands durch vorsichtiges Ansaugen mit einer sterilen 1-ml-Kunststoff-Pasteurpipette resuspendiert. Das resuspendierte Sediment wurde vereinigt und wieder auf das Eisbad gestellt. Diese konzentrierte Zellsuspension wurde zum Beimpfen der Streifen verwendet (das konzentrierte Zellimpfgut).
Die Lebensfähigkeit der Zellen im Kulturimpfgut und im konzentrierten Zellimpfgut wurde an diesem Punkt bestimmt. Standardverdünnungsreihen wurden in Maltose-Brühe hergestellt und in Doppelansätzen auf Sabouraud-4%-Maltose-Agar plattiert. Die Platten wurden bei 25°C für mindestens 72 Stunden inkubiert und die Kolonien gezählt.
Beimpfen der Streifen
Beimpfen unter Verwendung von Kolonien
Wie im Experiment 2 beschrieben, mit folgenden Ausnahmen:
Maltose-Brühe wurde als Verdünnungsmittel verwendet und Sabouraud-4%-Maltose-Agar als Wachstumsmedium. Die Platten wurden bei 25°C für mindestens 72 Stunden inkubiert.
Beimpfen unter Verwendung der Kultur und der konzentrierten Zellsuspension
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Dieses Verfahren wurde für jeden der Impfgut-Typen durchgeführt.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen.
Wie in Experiment 1 beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen:
Maltose-Brühe wurde als Verdünnungsmittel und Sabouraud-4%-Maltose-Agar als Wachstumsmedium verwendet. Die Platten wurden bei 25°C für mindestens 72 Stunden inkubiert.
Kontrolle D – wie oben beschrieben, ohne Beimpfen hergestellte Streifen
Wie für Experiment 2 beschrieben.
Ergebnisse:

Die nachstehende Tabelle C zeigt gute Stabilität (Überleben für mehr als 56 Tage) bei Lagerung unter erhöhter (30°C) Temperatur unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Tabelle C

	Zeit (Tage)	Mit Einzelkolonien beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit stationärer Kultur beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit konzentrierten Zellen beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Kontrolle D Keine Beimpfung (cfu/Streifen)
Zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	1,2E + 07	7,0E + 04	3,4E + 06	Keine Kolonien beobachtet

Vom Lagerungsstreifen gewonnene Zellen	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	7,0E + 06	3,8E + 03	4,6E + 05	Keine weiteren Tests durchgeführt
	8	9,0E + 05	3,9E + 02	4,7E + 04
	14	1,0E + 06	7,4E + 02	4,3E + 04
	22	1,7E + 06	5,1E + 02	4,7E + 04
	56	1,1E + 06	2,0E + 03	2,4E + 05

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 5 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Dreiecke, Quadrate und Rauten zeigen die Daten, die mit den Einzelkolonie-, Kultur- bzw. konzentrierten Zellimpfguten erhalten wurden.
Experiment 4 Nachweis des Zellüberlebens mit Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 auf dem Teststreifen unter Verwendung von 3 Impfgut-Typen: Kolonie, Kultur und konzentrierte Zellen.
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Wie für Experiment 1 beschrieben, mit folgender Ausnahme:
Das selbstklebende Trocknungsmittel (CSP Technologies, ACTIV-STRIP, M-0002-58) wurde aus dem Schutzfolienbeutel entnommen und in Stücke von 44,0 mm × ~12,6 mm × 0,30 mm geschnitten.
Herstellung der Impfgute
Pseudomonase aeruginosa ATCC 27853 wurde als TWISTER 0026 (PROLAB Diagnostics) erhalten, von dem eine Beimpfungsstammlösung hergestellt wurde. Der TWISTER wurde unter Verwendung der mitgelieferten Rehydratisierungslösung rehydratisiert, auf Nutrient Agar (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.05450) ausgestrichen und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert.
Eine gut isolierte Kolonie wurde von der Agarplatte ausgewählt, in ein Gefäß überführt, das Cryobeads (Microbank, PROLAB Diagnostics, Art.-Nr. PL160) enthielt, und in dem schützenden Medium emulgiert. Das Gefäß wurde mehrmals umgekehrt, und so viel von dem Schutzstoff-Medium wie möglich wurde durch Absaugen entfernt. Das Gefäß wurde sofort nach dem Beimpfen nach –70°C überführt.
Der Organismus wurde von dieser Cryobead-Stammlösung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren ausgestrichen, so dass das Wachstum einzelner getrennter Bakterieneinzelkolonien sichergestellt war, und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Diese Agarplatte wurde dazu verwendet, einzelne Kolonien für das Beimpfen der Streifen (das Kolonieimpfgut) bereitzustellen und Brühe zu beimpfen, die für das Kultur- und das konzentrierte Zellimpfgut verwendet werden sollte.
Eine einzelne Kolonie von der vorstehend hergestellten Platte wurde zum Beimpfen von 50 ml Nährbrühe (Nutrient Broth Nr. 2, Merck KGaA, Art.-Nr. 110136 10 g/l) in einem 100-ml-Sterilin-Gefäß (Sterilin Art.-Nr. 185AM) verwendet und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Die optische Dichte, OD_600nm, (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht) wurde zu 0,48 gemessen. Die Kultur wurde für 15 Minuten auf Eis gestellt. Ein Aliquot von etwa 4 ml dieser Kultur wurde auf Eis gehalten und zum Beimpfen der Streifen verwendet (das Kulturimpfgut).
Ein Aliquot von 45 ml der eisgekühlten Kultur wurde in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen (Falcon, Art.-Nr. 352070) überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge 5804R unter Verwendung eines Rotors des Typs F34-6-38 und Einsätzen (Eppendorf, Art.-Nr. 5804 774000) bei 6000 U/min, 4°C für 5 Minuten gesammelt. Ein Aliquot von etwa 5 ml des Überstands (d. qh. der verbrauchten Medien) wurde in ein Universalgefäß dekantiert und der Rest verworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Sediment nicht aufzuwirbeln. Das Universalröhrchen, das den Überstand enthielt, wurde auf Eis gestellt. Das Sediment wurde in 0,45 ml des Überstands durch vorsichtiges Ansaugen unter Verwendung einer sterilen 1-ml-Kunststoff-Pasteurpipette resuspendiert. Das resuspendierte Sediment wurde vereinigt und wieder auf das Eisbad gestellt. Diese konzentrierte Zellsuspension wurde zum Beimpfen der Streifen verwendet (das konzentrierte Zellimpfgut).
Die Lebensfähigkeit der Zellen im Kulturimpfgut und im konzentrierten Zellimpfgut wurde an diesem Punkt bestimmt. Dies erfolgte wie im Experiment 1 beschrieben.
Beimpfen der Streifen
Beimpfen unter Verwendung von Kolonien
Wie im Experiment 2 beschrieben, mit folgenden Ausnahmen:
Nutrient Broth wurde als Verdünnungsmittel verwendet und Nutrient Agar als Wachstumsmedium. Die Platten wurden bei 37°C für mindestens 16 Stunden inkubiert.
Beimpfen unter Verwendung der Kultur und der konzentrierten Zellsuspension
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Dieses Verfahren wurde für jeden der Impfgut-Typen durchgeführt.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen.
Wie in Experiment 1 beschrieben.
Die Platten wurden bei 37°C für mindestens 16 Stunden inkubiert.
Kontrolle E – wie oben beschrieben, ohne Beimpfen hergestellte Streifen
Wie für Experiment 2 beschrieben.
Ergebnisse:

Die nachstehende Tabelle D zeigt gute Stabilität (Überleben für mehr als 56 Tage) bei Lagerung unter erhöhter (30°C) Temperatur unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Tabelle D

	Zeit (Tage)	Mit Einzelkolonien beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit stationärer Kultur beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit konzentrierten Zellen beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Kontrolle E Keine Beimpfung (cfu/Streifen)
zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	4,1E + 07	3,8E + 06	1,4E + 08	Keine Kolonien beobachtet

Vom Lagerungsstreifen gewonnene	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	8,4E + 06	1,7E + 05	1,3E + 07	Keine weiteren Tests durchgeführt
	6		2,4E + 03	6,6E + 05
	7	1,0E + 06
	14	5,0E + 05	2,3E + 03	1,8E + 06
	22	6,7E + 05	1,4E + 03	1,6E + 06
	56	3,6E + 04	5,3E + 02	1,8E + 05

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 6 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Dreiecke, Quadrate und Rauten zeigen die Daten, die mit den Einzelkolonie-, Kultur- bzw. konzentrierten Zellimpfguten erhalten wurden.
Experiment 5 Nachweis des Zellüberlebens mit Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 auf dem Teststreifen unter Verwendung von 3 Impfgut-Typen: Kolonie, Kultur und konzentrierte Zellen.
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Herstellung der Impfgute
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 wurde als TWISTER 0018 (PROLAB Diagnostics) erhalten. Der TWISTER wurde unter Verwendung der mitgelieferten Rehydratisierungslösung rehydratisiert und auf MRS-Agar (52,4 g/l MRS-Brühe, Merck Art.-Nr. 11066, 14 g/l Agar, Merck KGaA, Art-Nr. 101614) ausgestrichen. Die Agarplatte wurde bei 35°C für 72 Stunden in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert.
Diese Agarplatte wurde dazu verwendet, Einzelkolonien zum Beimpfen der Streifen bereitzustellen (das Kolonieimpfgut).
Ein Aliquot von 100 μl der rehydratisierten Zellen des TWISTER wurde in 50 ml MRS-Brühe (52,4 g/l MRS Broth, Merck KGaA, Art.-Nr. 110661) in einem 100-ml-Sterilin-Gefäß (Sterilin Art.-Nr. 185AM) überführt und bei 35°C für 72 Stunden inkubiert. Die optische Dichte, OD_600nm, (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht) wurde zu 0,97 gemessen. Die Kultur wurde für 15 Minuten auf Eis gestellt. Ein Aliquot von etwa 4 ml dieser Kultur wurde auf Eis gehalten und zum Beimpfen der Streifen verwendet (das Kulturimpfgut).
Ein Aliquot von 45 ml der eisgekühlten Kultur wurde in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen (Falcon, Art.-Nr. 352070) überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge 5804R unter Verwendung eines Rotors des Typs F34-6-38 und Einsätzen (Eppendorf, Art.-Nr. 5804 774000) bei 6000 U/min, 4°C für 5 Minuten gesammelt. Ein Aliquot von etwa 5 ml des Überstands (d. h. der verbrauchten Medien) wurde in ein Universalgefäß dekantiert und der Rest verworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Sediment nicht aufzuwirbeln. Das Universalröhrchen, das den Überstand enthielt, wurde auf Eis gestellt. Die Sedimente wurden jeweils in 0,45 ml des Überstands durch vorsichtiges Ansaugen unter Verwendung einer sterilen 1-ml-Kunststoff-Pasteurpipette resuspendiert. Das resuspendierte Sediment wurde vereinigt und wieder auf das Eisbad gestellt. Diese konzentrierte Zellsuspension wurde zum Beimpfen der Streifen verwendet (das konzentrierte Zellimpfgut).
Die Lebensfähigkeit der Zellen im Kulturimpfgut und im konzentrierten Zellimpfgut wurde an diesem Punkt bestimmt. Standardverdünnungsreihen wurden in MRS-Brühe hergestellt und auf MRS-Agar plattiert. Die Platten wurden bei 35°C für mindestens 72 Stunden in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert und die Kolonien gezählt.
Beimpfen der Streifen
Beimpfen unter Verwendung von Kolonien
Wie im Experiment 2 beschrieben, mit folgenden Ausnahmen:
MRS-Brühe wurde als Verdünnungsmittel verwendet und MRS-Agar als Wachstums medium. Die Platten wurden bei 35°C für mindestens 72 Stunden in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert.
Beimpfen unter Verwendung der Kultur und der konzentrierten Zellsuspension
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Dieses Verfahren wurde für jeden der Impfgut-Typen durchgeführt.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen.
Wie in Experiment 1 beschrieben, mit folgenden Ausnahmen:
MRS-Brühe wurde als Verdünnungsmittel verwendet und MRS-Agar als Wachstumsmedium. Die Platten wurden bei 35°C für mindestens 72 Stunden in einer mit CO₂ angereicherten Atmosphäre inkubiert.
Kontrolle F – wie oben beschrieben, ohne Beimpfen hergestellte Streifen
Wie für Experiment 2 beschrieben.
Ergebnisse:

Die nachstehende Tabelle E zeigt gute Stabilität (Überleben für mehr als 56 Tage) bei Lagerung unter erhöhter (30°C) Temperatur. Tabelle E

	Zeit (Tage)	Mit Einzelkolonien beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit stationärer Kultur beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Mit konzentrierten Zellen beimpfte Streifen (cfu/Streifen)	Kontrolle F Keine Beimpfung (cfu/Streifen)
Zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	9,6E + 06	4,7E + 05	2,2E + 07	Keine Kolonien beobachtet

Vom Lagerungsstreifen gewonnene Zellen	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	3,6E + 05	3,3E + 04	1,6E + 06	Keine weiteren Tests durchgeführt
	7	1,6E + 06	2,4E + 04	8,2E + 05
	15	2,2E + 05	5,7E + 03	3,8E + 05
	21	3,1E + 05	1,8E + 04	1,6E + 06
	56	6,4E + 05	8,8E + 03	5,2E + 05

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 7 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Dreiecke, Quadrate und Rauten zeigen die Daten, die mit den Einzelkolonie-, Kultur- bzw. konzentrierten Zellimpfguten erhalten wurden.
Experiment 6 Nachweis des Zellüberlebens auf dem Teststreifen mit im System vorhandenem Trocknungsmittel.
Herstellung der Streifenvorrichtungen
Wie für Experiment 1 beschrieben, mit folgenden Ausnahmen:
Die Trocknungsmittelstücke wiesen keinen Klebstoff auf. Der Folienbeutel wurde unter Verwendung von Löteisen (Weller WHS40) bei einer Temperatur von 350°C verschlossen.
Herstellung des Impfguts
E. coli ATCC 25922 wurde als TWISTER 0014 (PROLAB Diagnostics) erhalten, von dem eine Beimpfungsstammlösung hergestellt wurde. Der TWISTER wurde unter Verwendung der mitgelieferten Rehydratisierungslösung rehydratisiert und auf Nutrient Agar (Merck KGaA, Art.-Nr. 1.05450) bei 37°C für 16 Stunden ausgestrichen.
Eine gut isolierte Kolonie wurde von der Agarplatte ausgewählt, in ein Gefäß überführt, das Cryobeads (Microbank, PROLAB Diagnostics, Art.-Nr. PL160) enthielt, und in dem schützenden Medium emulgiert. Das Gefäß wurde mehrmals umgekehrt, und so viel von dem Schutzstoff-Medium wie möglich wurde durch Absaugen entfernt. Das Gefäß wurde sofort nach dem Beimpfen nach –70°C überführt.
Der Organismus wurde von dieser Cryobead-Stammlösung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren auf eine Nutrient-Agar-Platte ausgestrichen, so dass das Wachstum einzelner getrennter Bakterieneinzelkolonien sichergestellt war, und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert.
Eine einzelne Kolonie von der vorstehend hergestellten Platte wurde zum Beimpfen von 50 ml Nährbrühe (Nutrient Broth Nr. 2, Merck KGaA, Art.-Nr. 110136 10 g/l) in einem 100-ml-Sterilin-Gefäß (Sterilin Art.-Nr. 185AM) verwendet und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Die optische Dichte, OD_600nm, wurde zu 0,52 gemessen (Pharmacia LKB, Novaspec II Spektralphotometer für sichtbares Licht). Die Kultur wurde für 15 Minuten auf Eis gestellt. Diese Kultur wurde zum Beimpfen der Streifen verwendet.
Die Lebensfähigkeit der Zellen in der Kultur wurde an diesem Punkt bestimmt. Dies erfolgte wie im Experiment 1 beschrieben.
Beimpfen der Streifen
Beimpfen unter Verwendung der Kultur
Wie im Experiment 1 beschrieben, mit der folgenden Ausnahme:
Unmittelbar nach dem Beimpfen wurde der primäre Verschluss zum Verschließen des Zugangsfensters wieder verschlossen und ein sekundärer Verschluss aus Aluminiumfolienband, 50 Mikron, (RS Art.-Nr. 408-9574) wurde über diesem primären Verschluss angebracht.
Bestimmung der Zahl an lebensfähigen Zellen auf dem Streifen.
Wie für Experiment 1 beschrieben.
Kontrolle G – wie oben beschrieben, ohne Trocknungsmittel hergestellte Streifen
Es wurden Streifenvorrichtungen hergestellt und getestet, wie im vorstehenden Verfahren beschrieben, ausgenommen dass das Trocknungsmittel weggelassen wurde.
Ergebnisse:

Tabelle F: Das überraschende Ergebnis ist aus der nachstehenden Tabelle F ersichtlich, dass gute Stabilität (Überleben für mehr als 14 Tage (bei Lagerung unter erhöhter (30°C) Temperatur)) nur durch Einbringen des Trocknungsmittels in die Vorrichtung erzielt wurde. Die in die Vorrichtung überimpften Bakterien überlebten für nicht mehr als sieben Tage in Abwesenheit eines Trocknungsmittels in der Vorrichtung. Tabelle F

	Zeit (Tage)	Mit Trocknungsmittel hergestellte Streifen (cfu/Streifen)	Kontrolle G – Ohne Trocknungsmittel hergestellte Streifen (cfu/Streifen)
Zum Streifen zugegebenes Impfgut	0	2,1E + 06	2,1E + 06

Vom Lagerungsstreifen gewonnene Zellen	0 (1 Stunde nach Beimpfen)	2,4E + 04	2,2E + 04
	7	4,0E + 03	Keine Kolonien nachgewiesen
	15	7,5E + 03	Keine Kolonien nachgewiesen
	21	1,0E + 04	Keine weiteren Tests durchgeführt

Eine grafische Ansicht dieser Ergebnisse ist in 8 zu finden. Auf der X-Achse ist die Zeit in Tagen angegeben. Auf der Y-Achse sind die cfu pro Streifen dargestellt. Die Kreise zeigen die Daten, die für die mit Trocknungsmittel hergestellten Streifen erhalten wurden, und die Dreiecke die Daten für die Streifen ohne Trocknungsmittel.

Claims

Wiederverschließbare Streifenvorrichtung, die sich zum Trocknen und Lagern von lebensfähigen Mikroorganismen ohne Verlust der Lebensfähigkeit eignet, enthaltend – einen Streifen enthaltend eine wasserabsorbierende Zubereitung, welche eine Menge mindestens einer wasserabsorbierenden Substanz enthält, die in der Lage ist, das in dem gewählten Volumen an zugesetzter Mikroorganismenzubereitung enthaltene Wasser so zu absorbieren, dass die Endmenge an Wasser in der/den Zubereitung(en) nach Zugabe der Zellen weniger als 10% w/w beträgt, und mindestens eine Schutzsubstanz – einen wiederverschließbaren Behälter, der im verschlossenen Zustand ein geschlossenes, wasserundurchlässiges System um den Streifen bereitstellt.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserabsorbierende Zubereitung eine oder mehrere Substanzen beinhaltet, die sowohl schützende als auch wasserabsorbierende Eigenschaften besitzen.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die primäre wasserabsorbierende Zubereitung weiterhin ein oder mehrere absorbierende Schaumstoff- oder faserbasierende Polster oder andere Matrizes enthält.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die wasserabsorbierende Zubereitung im Kontakt mit oder in der Nähe von einer sekundären wasserabsorbierenden Zubereitung befindet.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die sekundäre wasserabsorbierende Zubereitung in Form von einer oder mehreren in der Streifenvor richtung eingeschlossenen absorbierenden Perlen, Tabletten, Pfropfen, Schaumstoff- oder faserbasierenden Polstern vorliegt.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der wiederverschließbare Behälter ein Folienbeutel ist.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der wiederverschließbare Behälter ein oder mehrere Zugangsfenster enthält, über denen sich jeweils eine wasserundurchlässige Abdeckung befindet, die so geöffnet und wieder verschlossen werden kann, dass die Vorrichtung nach dem Wiederverschließen ihre wasserundurchlässigen Eigenschaften zurückerhält.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der wiederverschließbare Behälter ein Etikett aufweist.
Wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der wiederverschließbare Behälter einen sekundären aufreißbaren oder abziehbaren Verschluss aufweist, der geöffnet werden kann, um den Streifen aseptisch zu entnehmen.
Verfahren zum Trocknen und Lagern von lebensfähigen Mikroorganismen ohne Verlust der Lebensfähigkeit, durch a) Bereitstellen einer wiederverschließbaren Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9; b) Öffnen einer wiederverschließbaren Zugangsfensterabdeckung im Behälter der Streifenvorrichtung, um Zugang zum Streifen zu erhalten; c) Zugeben der zu trocknenden Mikroorganismenzubereitung durch das besagte Fenster auf die auf dem Streifen befindliche wasserabsorbierende Zubereitung; d) Verschließen der Streifenvorrichtung durch Schließen der wiederverschließbaren Fensterabdeckung am genannten Behälter; e) Lagern der Streifenvorrichtung; wobei die Menge der Mikroorganismenzubereitung und die Menge der wasserabsorbierenden Zubereitung in der Vorrichtung so gewählt werden, dass die wasserabsorbierende Zubereitung nach der Zugabe der Mikroorganismenzubereitung in der Lage ist, das in der Mikroorganismenzubereitung enthaltene Wasser zu absorbieren und im Wesentlichen trocken zu bleiben, so dass die Endmenge an Wasser in der/den Zubereitung(en) nach Zugabe der Zellen weniger als 10% w/w beträgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass, nach Schritt e), die Mikroorganismen wiedergewonnen werden durch a) Öffnen der Streifenvorrichtung und Entfernen des Streifens aus dem Behälter; b) Rehydratisieren der Mikroorganismen.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass, in Schritt e), die Streifenvorrichtung bei einer Temperatur zwischen 0°C und 30°C gelagert wird.
Kit zum Trocknen und Lagern von Mikroorganismen, mindestens enthaltend eine wiederverschließbare Streifenvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9.